CN1966675A - 适于细胞移植的非人哺乳动物胚胎组织细胞、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及适于细胞移植的非人哺乳动物胚胎组织细胞、其制备方法和用途。

Description

适于细胞移植的非人哺乳动物胚胎组织细胞、 其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及适于细胞移植以改善个体健康状况的非人哺乳动物胚胎细胞、其制备方法和用途。

背景技术

自古以来，人类一直期望能够有很好的方法用于改善健康状况、延缓衰老、永葆青春，并因此进行了很多尝试，取得了很大的进展。器官移植就是其中一种有效的治疗方法。

目前，器官移植疗法早已成功用于治疗多种疾病。但是，由于许多器官疾病不适于采用全器官移植进行治疗，例如中枢神经系统的损伤就无法采用全器官移植体来代替受损伤组织。在此基础上发展出了细胞移植疗法。

细胞移植疗法就是向哺乳动物机体注射、移植或以其它方式放置细胞以改善个体健康状况或进行疾病治疗的方法。这一技术早在二十世纪三十年代就已发现。在一例急诊外科手术中，瑞士Niehans医生采用取自动物甲状旁腺的细胞对一位濒危病人进行注射，成功地延长了病人的生命。细胞疗法发展到二十一世纪的今天，已经可以采用从动物母体的子宫中提取的发育过程中的胚胎的细胞。由于这样的脏器处于发育和形成阶段，被提取出来并给予人体后，很容易适应人体环境，为人体所接受。被移植的细胞可能通过几种方式起作用。一种方式是被移植细胞取代人体细胞，自身合成、释放天然生物活性化合物，例如生长因子、激素、神经递质等。但是，不局限于任何特定的理论，推测“活细胞疗法”的作用方式并不仅是如此，它还可诱发人体内现有机体的功能和生长。也就是说，动物的活细胞只是一种手段，用来“唤醒”病人体内处于“休眠”的细胞，以补充相应的细胞类型。德国一些大学的研究结果显示，在将标记了放射性同位素的细胞注射到人体后，这样的细胞将迁移到人体内与所述动物细胞来源的动物器官相应的器官处。根据疾病的不同，也根据病人本身状况的不同，疗效会有快慢，一般在6至8周之间。通过细胞疗法，可以帮助健康人或病人恢复或增强本身脏器的机能，对付各种疾病的入侵。例如，细胞疗法可以减缓衰老，包括记忆力减退和性功能障碍，活化机体内特定器官，并治疗一些特定的疾病和障碍，包括例如慢性皮肤病如湿疹、过敏、牛皮癣等，关节炎，动脉硬化，肌肉萎缩，狼疮，癌症，HIV感染，心血管和神经性障碍，各种先天性缺陷，思维和行动障碍，免疫系统疾病，以及帕金森病等。活细胞疗法与器官移植相比有很大不同。例如，在活细胞疗法中，细胞是以悬浮的形态进入人体，因而可以迅速地融入人体的新陈代谢过程中，而器官移植手术中常常会因失血导致器官移植后的坏死。尤其是，在众多脏器中，有些不能移植，例如脑或其它内分泌腺，另有一些则很难移植，例如肾、心和肝等。对于这样的脏器，采用细胞疗法则在操作上比较容易。但是，活细胞疗法有一个非常不利的缺点，即机体可能会对所注射的动物细胞产生过敏反应。一些现有技术中的“活细胞疗法”尝试采用动物胚胎细胞，因为推测这种细胞更容易为受体所接受，被移植细胞通过天然地释放生物活性因子、例如生长因子、激素而弥补人的不足，实现抗衰老效果。

但是，在现有的细胞移植技术中，即使是采用胚胎细胞，其有效期常常仍较短，因而存在不能长期有效的缺点。这种有效期短推测有可能是由于异源细胞在移植到人体内后常常仍会引起较强的免疫排斥反应所致。现有技术中对于降低移植排斥反应进行了诸多尝试，并已开发出了一些新技术，取得了一些效果。例如，可以对宿主使用免疫抑制剂，但是全身性地施用免疫抑制剂会非特异性地抑制免疫系统，从而给机体带来严重的副作用和并发症。后来发展出了抑制包裹细胞疗法，其中采用膜屏障物理性地保护被移植的细胞不受宿主免疫系统的影响。这种包裹细胞疗法明显优于免疫抑制剂疗法。WO2004058305中就公开了这样一种包裹细胞疗法。另外，一些大型的生物医药公司目前正在开展一种新的降低免疫排斥反应的研究。在这样的研究中，科学家们尝试向猪的受精卵注射人体基因，使猪体内出现人体特有基因以及由此表达的蛋白质。因此，在将这种转基因动物来源的组织细胞移植到人体后有望使移植组织受到的人受体免疫系统排斥作用显著降低。

但是，现有技术中降低细胞移植疗法中的免疫排斥作用的措施均比较麻烦，实施起来需要有复杂的设备，耗时也较长。本发明致力于提供一种简便的制备移植细胞的方法，以便提供能在受体内较长时间发挥活性的细胞。

发明内容

在本发明中，发明人出乎意料地发现了，通过对怀孕的非人哺乳动物注射来自与待接受细胞移植的受体属相同物种的动物的组织细胞，然后从该怀孕动物体内取出胚胎，由此制备的胚胎细胞在移植到所述受体动物之后可以延长移植细胞的活性期，并显著地改善该受体动物的健康、美容状况。

因此，在一方面，本发明提供了一种获得适于移植的非人哺乳动物胚胎组织细胞的方法，包括以下步骤：(1)将预处理组织细胞注射到怀孕的非人哺乳动物体内；(2)在进一步喂养该怀孕非人哺乳动物后从中取出胚胎；和(3)分离、消化胚胎组织器官，获得非人哺乳动物胚胎组织细胞。

在另一方面，本发明涉及由上述方法获得的非人哺乳动物胚胎细胞及其提取物。

本发明进一步涉及改善受试者健康状况的方法，包括将本发明的非人哺乳动物胚胎细胞或提取物施用于受试者的步骤。

本发明进一步涉及一种美容方法，包括将本发明的非人哺乳动物胚胎细胞或提取物施用于受试者的步骤。

本发明还涉及本发明的非人哺乳动物胚胎细胞或提取物在改善个体健康状况、美容和/或疾病治疗中的用途。

具体实施方式

术语“培养基”和“细胞培养基”可以互换，指培养过程中哺乳动物细胞生长其中的水性微环境。培养基包含物理化学、营养、和激素微环境。

“已知成分培养基”、“基本细胞维持培养基”、“营养培养基”、和“基本营养培养基”在本文中可以互换，指包含培养过程中细胞存活和/或生长所必需的营养和激素需求且其成分已知的培养基。通常通过加入生长和/或存活所必需的营养物和生长因子来配制已知成分培养基。已知成分培养基通常提供至少一种来自下列一项或多项的成分：1)所有必需氨基酸，通常是基本的一套20种氨基酸加胱氨酸；2)能源，通常是碳水化合物的形式，诸如葡萄糖；3)维生素和/或有低浓度需要的其它有机化合物；4)游离脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素定义为通常有很低浓度(通常是微摩尔级范围)需要的无机化合物或天然存在元素。已知成分培养基还可任选的添加一种或多种来自下列任何项的成分：1)一种或多种促有丝分裂剂；2)盐和缓冲液，例如钙、镁、和磷酸；3)核苷和碱基，诸如腺苷、胸苷、次黄嘌呤；和4)蛋白质和组织水解物。

“标准保温条件”指在放置细胞的保温箱中为了组织培养而设计的物理化学条件。标准保温条件通常是大约37℃和大约5％CO₂及增湿。应当在无菌条件下执行所有组织培养技术和设备。

“预处理组织细胞”是指用于对作为被移植胚胎细胞供体的怀孕非人哺乳动物进行注射的组织细胞，其来自与该怀孕动物不同的动物个体，并且该动物个体通常与所述怀孕动物属不同物种。一般地，预处理组织细胞的来源由待接受细胞移植的受体动物确定，即在细胞移植受体明确的情况下，预处理组织细胞来自与待接受细胞移植的受体动物属相同物种的动物个体，优选来自该受体动物自身。

在本发明中，待接受细胞移植的受体动物可以是任何哺乳动物，优选灵长类，更优选人类。

本发明涉及一种制备适于细胞移植的非人哺乳动物胚胎细胞的方法，包括以下步骤：(1)将预处理组织细胞注射到怀孕的非人哺乳动物体内；(2)在进一步喂养该怀孕动物后从中取出胚胎；和(3)分离胚胎组织器官，获得非人哺乳动物胚胎细胞。

在本发明中，适用于作为细胞移植供体的怀孕“非人哺乳动物”包括各种大型或小型的哺乳动物，例如猪、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠等。通常处于任何合适孕期、例如怀孕2-12周的非人哺乳动物均可用于本发明中进行预处理组织细胞的注射。正如本领域普通技术人员所熟知的，不同物种的哺乳动物，其整个妊娠期的长短会有所不同。因此，哺乳动物的合适孕期依具体动物物种而定。但是，该动物优选地处于怀孕早期，例如3-10周，更优选处于怀孕4-8周。至于该雌性非人哺乳动物的年龄，则没有特别的限制，只要其已怀孕即可，但是一般采用年轻动物比较有利，因为胎儿的发育状况可能会更好。

在本发明中，可以用于注射细胞移植供体动物的组织细胞(在本文中有时简称为“预处理细胞”)应理解为可来源于与待接受细胞移植的受体动物属相同物种的任何动物个体的各种组织或器官细胞，包括例如血液、肌肉细胞、上皮细胞等，优选血液。在采用组织细胞时，通常比较有利的是组织的消化细胞，例如单细胞混悬物，或者可以是各由少数细胞组成的团块。虽然采用原代细胞比较有利，但是经过组织培养的细胞也可以用于本发明中。这样的细胞可以一次性注射到怀孕非人哺乳动物的体内，或者可以分成两份或多份进行注射，或者可以采用输注的方式。可以采用静脉内、皮下、腹膜内等注射方式。注射细胞的总数可由本领域普通技术人员很容易地加以确定，一般是10²-10⁸，优选10³-10⁷，更优选10⁴-2×10⁶，尤其优选10⁴-10⁶，注射体积一般在10ml以内，优选1-8ml，更优选4-8ml。

在注射预处理组织细胞时，优选根据怀孕哺乳动物中胎儿的性别而确定所采用的预处理组织细胞来源，即如果胎儿是雄性的，则对怀孕哺乳动物注射来自雄性动物的预处理组织细胞样品，如果胎儿是雌性的，则对怀孕哺乳动物注射来自雌性的预处理组织细胞样品。胎儿的性别可以很容易加以确定，例如借助超声波检测法。最优选地，采用个性化设计的方式制备待移植细胞，即将来自待进行细胞移植的受体动物自身的组织细胞注射到细胞移植供体动物(即怀孕动物)体内。

在对怀孕非人哺乳动物注射预处理细胞后，使该动物继续其孕期。通常在怀孕8-20周对该哺乳动物解剖而取出胎儿，更优选在怀孕10-18周，最优选在12-15周。也可通过注射预处理组织细胞样品后继续怀孕的周数来确定获取胎儿的时机。优选地，在注射预处理细胞4-10周后获得胎儿，更优选在注射人细胞6-8周后获得胎儿。一般地，监测雌性哺乳动物的怀孕状况，并选择在其足月生产前取出胎儿。

在将胎儿取出之后，从中取出适用的器官组织。可以通过大体解剖、外观、和在胎儿中的定位来鉴定感兴趣的器官组织，例如卵巢、睾丸、肝脏、肾脏、胰腺等。一旦进行了鉴定，即首先通过合适的洗涤液、例如生理盐水或基本营养培养基的清洗来清理胎儿器官组织。洗涤液的温度一般控制在37℃以下，优选25℃以下，更优选10℃以下，最优选4℃以下。当然应控制温度，使之不会处于冰点以下。在本发明中，合适的器官组织有很多种，包括例如性腺如睾丸和卵巢等，或者可以是肝脏、心脏等。然后进行显微解剖。显微解剖的目的是除去与感兴趣的器官组织相连的组织，将实体器官组织块分成完整组织块的小块使得基本营养培养基更多的接触组织块中的细胞。显微解剖的非限制性范例包括实施机械剪切强制的装置(即匀浆器、钵与杵、捣碎机、等)、实施切割或撕裂的装置(即解剖刀、注射器、镊子、等)、或超声装置。或者，显微解剖胎儿器官组织的另一种方法是使用酶处理。本领域众所周知用于显微解剖组织的多种酶，例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶等。一种方法包括在维持由感兴趣的器官组织分离的细胞存活的缓冲培养基中使用胶原酶-分散酶消化经部分剪切的器官组织。酶量取决于胎儿的年龄和所取器官组织的大小。在一个实施方案中，使用胶原酶-分散酶的酶处理可能降低总的细胞产量。因此，应降低酶的用量，或者根本不用。在其它实施方案中，酶处理可能增加总的细胞产量。因此，可以单独使用酶处理，或者联合显微解剖方法使用。有很多种基本细胞维持培养基可用于将液体的pH维持在促进细胞存活的范围内，并提供能够在其中进行酶促消化的额外体积。非限制性范例包括F12/DMEM、Ham氏F10(Sigma)、CMRL-1066、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)、和Iscove氏修改Eagle氏培养基(IMEM)。另外，可以使用Ham和Wallace，1979，Meth.Enz.，58：44；Barnes和Sato，1980，Anal.Biochem.，102：225；或Mather J.P.和Roberts P.E.，1998，《Introduction to Cell and Tissue Culture》即细胞和组织培养导论，Plenum出版社，纽约中描述的任何基本营养培养基。这样的培养基在市场上有销售，或者普通技术人员可以根据各种现有技术文件或生产商公开的说明书配制。本发明中并不局限于任何特定的培养基。

然后将分离自感兴趣器官组织的细胞或细胞簇置于细胞维持培养基中。可以使用本领域中的多种常规培养基。范例包括但不限于DMEM培养基、MEM培养基、Ham氏F12培养基、RPMI-1640、和CMRL-1066。

为了获得促进细胞存活和生长的更佳条件，可以向培养基中添加多种营养物。范例包括但不限于生长因子、胎牛血清、和牛血清清蛋白等。

获得上述细胞悬液之后，可以直接用这些细胞来注射受试者。或者，可以先在合适的培养基中扩大培养这些细胞。细胞的培养可以在不同底层上进行。可以使用的底层的非限制性范例包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、聚赖氨酸、硝酸纤维素、尼龙、和聚四氟乙烯。

细胞的培养依常规方法进行，例如可以在标准条件下进行。“标准保温条件”指在放置细胞的保温箱中为了组织培养而设计的物理化学条件。标准保温条件通常是大约37℃和大约5％CO₂及增湿。应当在无菌条件下执行所有组织培养技术和设备。培养时间依具体情况而定，通常2-14天，优选地3-10天，更优选5-8天，尤其优选6-7天。在培养过程中细胞将发生增殖。当细胞达到一定的密度后，可以对细胞进行传代培养一次或多次，例如1-5次，优选2-4次。细胞的传代培养技术是本领域普通技术人员所熟知的。

可以将经过培养或传代培养所得的细胞培养物直接施用于受试者，优选在施用前通过合适的方法富集细胞，例如酶促消化和离心等方法。或者，可以将细胞培养物分成若干小份冻存，以备以后施用。

细胞冻存的方法是本领域普通技术人员所熟知的，包括例如在培养液中加入DMsO后冻存于-70℃冰箱或者液氮中。在一个实施方案中，将细胞重悬在含1.4mol/L DMSO的Hank′s液(pH7.2)中后分装在试管中并密封，温度为0℃-4℃，4℃静置30-40分钟，以6-8分钟的速度降温至0℃，再按0.4-0.6℃/min速度降温至-80℃后，再放入-196℃氮液中。如此保存的细胞可完好地保藏一至数年。

使用时，复苏适当量的细胞，直接或经培养后用于受试者。复苏细胞时，可以用37-40℃温水快速搅动复温，然后按照上文所述进行培养，例如在CO₂培养箱内37℃恒温培养48-72小时。检查细胞复活良好，确定无污染的存在，才可使用。优选地，用含有AB血清的DMEM培养液培养细胞，细胞的初始接种密度为每毫升含细胞个数10²-10⁶个，优选10³-10⁵个。培养时间依具体情况而定，通常2-14天，优选地3-10天，更优选5-8天，尤其优选6-7天。在培养过程中，也可以对细胞进行传代培养一次或多次，例如1-5次，优选1-3次。

在将细胞移植到受试者之前或者冻存之前，也可对细胞进行其它操作，包括例如重组导入外源核酸。所述核酸可以编码各种具有有益效果的蛋白质，例如治疗活性化合物，活性因子，或者有助于改善机体一般健康状况的多肽等等。将核酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域普通技术人员所熟知的，包括例如转染、电穿孔、脂转染法等。核酸的导入可以在扩增细胞之前或之后进行。

在将细胞移植到受试者之前，还可以可选地采用包裹技术对所述细胞进行包裹。有关包裹细胞疗法的技术可参见例如国际专利申请公开WO2004058305。不局限于具体的理论，推测包裹技术中采用的膜能保护被包裹细胞免于宿主免疫系统的影响，同时又足够通透，可允许细胞存活所需的分子流入，以及机体所需的生物活性化合物和废产物的分泌。有多种材料可用于细胞包裹，其中最常用的是多糖，例如海藻酸。在本发明中，可以采用本领域中已知的任何合适的膜包裹材料。

在本发明中，可以将来源于一种胚胎器官组织的细胞给予受试者。或者，也可以将来源于几种不同器官组织的动物胚胎细胞混合给予受试者。另外，本发明的动物胚胎细胞也可以与其它物质、例如细胞因子、治疗剂等结合使用。在这方面，已知对人体有益的各种细胞因子、治疗剂等都适用于本发明中。

本发明的细胞可以通过多种已知方法施用给受试者。例如，可以使用针或其它投递装置将细胞通过肌肉内或静脉内等途径施用到期望的位点。或者，可以通过导管来投递细胞。也可通过外科手术方式、或者在合适的情况下在外科手术期间投递细胞。如果可能的话，优选非外科手术方法。细胞可以经一种方式施用，或者可结合几种方式施用。

可以在细胞注射之前浓缩细胞，例如通过缓冲液洗涤和离心等方法。适用的洗涤缓冲液可以是例如Hank′s液、PBS缓冲液、生理盐水等。细胞的投递量可以广泛变化，并以多种因素而定，包括例如细胞类型、导入位点、导入途径、受试者的年龄、体重、激素水平、一般健康状况等，这可由医务工作者容易地加以确定。一般以10²-10⁹，优选10⁴-10⁸，更优选10⁵-5×10⁷的量投递细胞。细胞投递的体积也可以广泛变化，通常可以是1-10ml，优选1-8ml，更优选4-8ml。可以通过胃肠外的方式将这些细胞施用给受试者，包括例如静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内等途径，并可通过注射或输注方式进行异位注射、优选原位注射。对受试者的接受位点并没有特别的限制，通常可以在手臂、大腿和臀部等。优选地，可以将细胞植入在大腿内侧肌肉中。

因此，本发明在另一方面涉及通过前述方法获得的非人哺乳动物胚胎细胞，所述的细胞适于移植到哺乳动物内。在一个实施方案中，所述细胞来源于非人哺乳动物胎儿的睾丸。在另一个实施方案中，所述细胞来源于非人哺乳动物胎儿的卵巢。在又一个实施方案中，所述细胞来源于非人哺乳动物胎儿的肝脏。在进一步的实施方案中，所述细胞来源于非人哺乳动物胎儿的肾脏。在更进一步的实施方案中，所述细胞来源于非人哺乳动物胎儿的胰腺。当然，本发明并不局限于来源于上述器官组织类型的细胞，任何合适的器官组织来源均可适用。这些细胞可以单一来源的形式施用，或者可以将多来源的本发明细胞联合施用。

本发明的细胞内含有活性因子，并且在组织培养时也能够向培养基中分泌活性因子。这样的活性因子在机体的美容抗衰老、健康状况改善或疾病治疗中同样是有用的。因此，本发明还涉及由上述非人哺乳动物胚胎细胞获得的提取物。

本发明还涉及一种改善受试者的健康状况的方法，包括有此需要的个体施用有效量的本发明细胞和/或其提取物。如上文所述，普通技术人员可以很容易地依据多种因素确定本发明细胞和/或其提取物用于改善受试者健康状况的有效量。可以通过途径将本发明的细胞和/或其提取物施用给受试者，包括例如静脉内、肌内注射或输注等，优选通过静脉内注射的方式将所述细胞施用于受试者。在一个实施方案中，对受试者单独施用所述细胞或细胞提取物。在又一个实施方案中，对受试者联合施用所述细胞和细胞提取物。或者，可以将本发明的细胞和/或细胞提取物与其它活性因子、美容组合物和/或药物联合施用。适用的活性因子、美容组合物或药物包括例如细胞因子、干扰素、表皮生长因子、绵羊胎盘活性因子、雌性激素、雄性激素、胶原蛋白质、牛胚胎激活素、鲨鱼胚胎激活素、羊胚胎激活素、荷尔蒙补充液、羊胎盘素，其具体用量可由本领域普通技术人员容易地确定。

在本发明中，可以将细胞和/或其提取物配制在适于投递到受试者血流或直接投递到合适的组织器官内的剂型之中。合适的配方可由医务工作者根据每个受试者、投递位点等因素确定。现有技术中熟知药学上可接受的载体及其配方，具体可参阅Remingt0n’sPharmaceutical Science，第16版，A.Osol编，1980。本发明的细胞优选配制在pH值为约6.5-8.5的溶液中。也可加入能够将溶液调节至等渗的载体，例如4.5％甘露糖醇或者0.9％氯化钠溶液，其pH以被本领域众所周知的缓冲溶液如磷酸钠所缓冲。在所述溶液中，还可加入其它药学上可接受的药剂，包括例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(如甘露糖醇，山梨醇等)或者其它无机或有机溶质。也可在溶液中添加可以提高细胞活力和存活的因子。

本发明还涉及所述的非人哺乳动物胚胎细胞和/或其提取物在制备可用于对哺乳动物进行抗衰老或疾病治疗或者健康状况改善的药物中的用途。待治疗的疾病状况可包括例如性功能障碍、慢性皮肤病如湿疹、过敏、牛皮癣等，关节炎，动脉硬化，肌肉萎缩，狼疮，癌症，心血管和神经性障碍，各种先天性缺陷，思维和行动障碍，免疫系统疾病，帕金森病，以及现有技术中已知采用细胞疗法可实现治疗或者缓解效果的任何其它疾病。

应当理解，若在本发明中联合使用一种或多种本发明的细胞和/或其提取物和/或一种或多种药物、因子、组合物时，它们中的任何两种或多种或全部成分可以同时给予受试者(分开地或者在一种组合物中)，或者可以顺序给予。其具体的给予顺序可依具体情况而定，在本发明中一般对此没有特别的限制。

在本发明中，“受试者”是指待接受细胞移植的哺乳动物个体，优选灵长类，更优选人类。用于预处理供体动物(即怀孕哺乳动物)的组织细胞来源于与该受试者属相同物种的哺乳动物个体，最优选来自该受试者自身。

下面通过实施例对本发明作进一步描述。应当理解，这些实施例只是举例，它们不以任何方式限定本发明的范围。

实施例

实施例1绵羊胚胎睾丸生殖间质细胞的制备

1.获得绵羊胎儿组织

取已怀孕4-8周、经B超检查胎儿为雄性的母绵羊，将从准备接受胚胎细胞激活治疗的男性受试者的血液10ml～15ml～20ml(根据接受治疗的人的年龄来最后确定，来自40岁～50岁男性的血液注射10ml，来自50岁～60岁男性的血液注射15ml，来自60岁～70岁男性的血液注射20ml)，静脉内注射到该绵羊体内。维持刺激2-6周后，麻醉母绵羊，通过解剖取出绵羊胎儿。

通过局部常规消毒小切口，将双侧睾丸取出，用生理盐水冲洗，然后放入装有70％酒精消毒大口瓶内，并将标本瓶放入冰壳内，冰壳内温度为0℃-4℃，在冷缺血2小时内送往实验室。

2.生殖间质细胞培养

标本送达实验室后，立即从瓶内取出标本，用生理盐水冲掉睾丸鞘膜外残留酒精，然后剪开并去掉鞘膜，并将睾丸内组织剪成小块，去掉结缔组织，加入适量的胶原消化酶进一步消化。沉降去除大的组织块后，取含单细胞或小细胞块的上层悬液离心，向细胞沉淀中加入含有AB血清的DMEM培养液，每个培养瓶中加5-10ml的培养液，每毫升含细胞个数为10³-10⁵个，将培养瓶放入5％CO₂培养箱中进行培养，温度为37℃恒温。培养6-7天后，对细胞进行镜检，确定细胞生长良好，无细菌生长。然后收集细胞，用Hank′s液冲洗，离心后将细胞沉淀重悬在PBS缓冲液中备用。

3.确认生殖间质细胞的状态

通过镜检确定细胞复活良好，无细菌生长，选择备用。

4.对人受试者的施用

收集睾丸细胞，经细胞计数确认其数量达到2×10⁶～2×10⁷～2×10⁸。在5ml体积内将其注射在受试者的肌肉内，完成男性睾丸活细胞的移植。这些志愿者均有处在亚健康状态、疲劳综合症、性功能减退、心慌气短、神经衰弱等症状。

其中：40岁～50岁(注射细胞2×10⁶)  28例  占28％

50岁～60岁(注射细胞2×10⁷)        40例  占40％

60岁～70岁(注射细胞2×10⁸)        32例  占32％

在移植后48小时～240小时开始，这些志愿者的症状开始缓解。其中80％有明显效果，疲劳综合症明显改善，性功能明显提高，总有效率85％，无变化15％。这些志愿者移植后观察均在一年以上，效果持续明显，未发现副反应。

另外，采用放射免疫测定法对注射了本发明的绵羊胚胎睾丸间质细胞的受试者检测血清睾丸素水平，并以注射了从未经人组织细胞预处理的怀孕母羊的胎儿来源的睾丸间质细胞的人受试者作为对照进行比较，结果见下表中(平均值是以加权平均法计算的)：

	对照	本发明
			血清中睾丸素	移植前平均663ng/dl	移植前平均663ng/dl
移植后平均767ng/dl	移植后平均826ng/dl
		提高15.6％		提高24.6％
延续周期	半年左右				一年以上

上述结果显示，本发明的绵羊胎儿睾丸间质细胞在注射到人体后，可以更高的水平、更长的周期表达活性因子，从而更好地改善受试者的状况。

实施例2绵羊胚胎卵巢生殖间质细胞的制备

1、获得绵羊胚胎的组织。以类似于实施例1的方式进行，但是采用来自女性受试者的血液注射胎儿为雌性的怀孕母绵羊(根据接受治疗的人的年龄来最后确定，来自30岁～40岁女性的血液注射10ml，来自40岁～50岁女性的血液注射15ml，来自50岁～60岁女性的血液注射20ml)，并取胎儿卵巢制备胚胎细胞。

2、生殖间质细胞培养(同实施例1)

3、确认生殖间质细胞的状态(同实施例1)

4、对人体受试者的试用(同实施例1)

收集卵巢细胞，经细胞计数确认其数量达到2×10⁶～2×10⁷～2×10⁸。在5ml-10ml体积内将其注射在受试者的肌肉内，完成女性卵巢活细胞的移植。这些志愿者均有面色无华、腰酸腿软、神疲乏力、心悸胸闷、骨质疏松、性冷淡、肥胖症等症状。

其中：30岁～40岁(注射细胞2×10⁶)    25例    占28％

40岁～50岁(注射细胞2×10⁷)          34例    占38％

50岁～60岁(注射细胞2×10⁸)          30例    占34％

在移植后5-10天开始，这些志愿者的症状开始缓解。其中83％有明显效果，女性荷尔蒙水平增高，新陈代谢加快，皮肤光滑细腻，富有弹性、性欲明显提高，并有明显的减肥效果。总有效率88％，无变化12％。这些志愿者移植后观察半年以上，均持续有效，并且未发现副反应。

尽管为了说明的目的而在本文中描述了本发明的一些具体实施方案，但从上文可知，还可对本发明进行各种修饰和改变而仍不偏离本发明的精神和范围。这样的修饰和改变均在本发明的保护范围之内。在整篇公开书中，引用了多种发表物、专利、和已发表专利说明书作为参考。将这些发表物、专利、和已发表专利的公开书完整收入本公开书作为参考。

Claims (13)

1.一种制备非人哺乳动物胚胎细胞的方法，其中包括以下步骤：

(1)将来自哺乳动物个体的预处理组织细胞注射到怀孕的非人哺乳动物体内；

(2)在进一步喂养该怀孕动物后从中取出胚胎；和

(3)分离胚胎组织器官，获得非人动物胚胎组织细胞；

条件是该预处理组织细胞的来源动物不同于所述怀孕哺乳动物，优选属不同物种。

2.权利要求1的方法，其中还包括对步骤(3)中获得的胚胎组织细胞进行增殖的步骤。

3.权利要求1的方法，其中在步骤(1)中使用的预处理组织细胞是血液，优选是全血或者血浆。

4.权利要求1的方法，其中所述胚胎细胞来自胚胎肝脏、胰腺、肾、睾丸或卵巢。

5.权利要求1的方法，其中所述怀孕的非人哺乳动物是猪、绵羊、山羊、兔、豚鼠、牛、马、狗或猫等哺乳动物，优选绵羊。

6.权利要求1的方法，其中在所述怀孕哺乳动物怀孕4-8周后对其注射于处理组织细胞，并在其继续怀孕一周至达到生产前时从中获得胚胎组织器官。

7.权利要求1的方法，其中所述预处理组织细胞来源于人，优选男性或女性。

8.权利要求1的方法，其中步骤(1)中的预处理组织细胞来源于待植入该非人哺乳动物胚胎细胞的受试者，优选人受试者。

9.按照权利要求1-8中任一项的方法制备的非人哺乳动物胚胎组织细胞、由此衍生的组织细胞以及由所述组织细胞得到的提取物。

10.权利要求9的组织细胞或提取物在制备可用于细胞移植的产品中的用途。

11.一种改善受试者的健康状况或者美容的方法，包括对该受试者施用有效量的权利要求9所述组织细胞或提取物，优选通过肌肉内或静脉内注射的方式进行施用。

12.权利要求11的方法，其中将所述组织细胞或细胞提取物与其它保健、美容组合物和/或药物联合施用。

13.权利要求11的方法，其中所述受试者是人，优选男性或女性个体。