CN1960733B - 包含src激酶抑制剂azd0530和抗雌激素或egfr-tk抑制剂的组合产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530的用于协同治疗乳腺癌的组合，包含EGFR TKI和Src激酶抑制剂AZD0530的用于协同治疗癌症的组合，以及包含抗雌激素、EGFR TKI和Src激酶抑制剂AZD0530的用于协同治疗乳腺癌的三部分组合。

Description

包含SRC激酶抑制剂AZD0530和抗雌激素或EGFR-TK抑制剂的组合产品
在第一方面，本发明涉及包含抗雌激素和非受体酪氨酸激酶的Src家族的特定抑制剂的组合。本发明的组合在治疗癌症，尤其是乳腺癌的方法中或在延缓该癌症发展的方法中是有用的。本发明还涉及包含该组合的药物组合物及其在制备用于治疗癌症的药物或制备用于延缓癌症发展的药物中的应用。
在另一方面，本发明涉及包含表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶(TK)抑制剂和非受体酪氨酸激酶的Src家族的特定抑制剂的组合。本发明的该组合在治疗癌症，尤其是乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和头颈部癌的方法中或在延缓这些癌症发展的方法中是有用的。本发明的该方面还涉及包含该组合的药物组合物及其在制备用于治疗癌症，尤其是肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和头颈部癌的药物或制备用于延缓这些癌症发展的药物中的应用。
在另一方面，本发明涉及包含抗雌激素、EGFR TK抑制剂和非受体酪氨酸激酶的Src家族的特定抑制剂的组合。本发明的该组合在治疗癌症，尤其是乳腺癌的方法中或在延缓该癌症发展的方法中是有用的。本发明的该方面还涉及包含该组合的药物组合物及其在制备用于治疗癌症的药物或制备用于延缓癌症发展的药物中的应用。
现在治疗癌症的选择包括外科切除、外粒子束放射治疗和/或全身化疗。这些在癌症的一些形式中获得了某种程度的成功，但是在其他的形式中则很少成功。明显需要治疗癌症的新的疗法。
目前许多用于细胞增殖疾病，如癌症的治疗方法都使用抑制DNA合成的化合物。这些化合物通常具有细胞毒性，但是它们对于快速分裂的细胞，如肿瘤细胞的毒性作用可能是有益的。其它不通过抑制DNA合成机理而发挥作用的抗肿瘤剂方法具有增强的作用选择性。
近年来发现，通过将其DNA的一部分转化为致癌基因，即在激活时导致恶性肿瘤细胞形成的基因可以导致细胞癌化(Bradshaw，Mutagenesis，1986，1，91)。几种这样的致癌基因会引起作为生长因子受体的肽的产生。生长因子受体复合物的激活随后导致细胞增殖增加。已知几种致癌基因编码酪氨酸激酶，某些生长因子受体也是酪氨酸激酶(Yarden等人，Ann.Rev.Biochem.，1988，57，443；Larsen等人，Ann.Reports in Med.Chem.，1989，Chpt.13)。首批被识别的酪氨酸激酶来自这些病毒性致癌基因，例如pp60v-Src酪氨酸激酶(又被称为v-Src)和在正常细胞中的相应酪氨酸激酶，例如pp60c-Src酪氨酸激酶(又被称为c-Src)。
受体酪氨酸激酶在引发细胞复制的生化信号传递中是重要的。它们是跨越细胞膜的较大的酶并且具有用于与生长因子如表皮生长因子(EGF)结合的细胞外结合区和作为激酶磷酸化蛋白质中的酪氨酸并因此影响细胞增殖的细胞内部分。根据与不同受体酪氨酸激酶结合的生长因子家族，已知多种类型的受体酪氨酸激酶(Wilks，Advances inCancer Research，1993，60，43-73)。该分类包括I类受体酪氨酸激酶，其包括受体酪氨酸激酶的EGF家族，如EGF，TGFα，Neu和erbB受体，II类受体酪氨酸激酶，其包括受体酪氨酸激酶的胰岛素家族，如胰岛素和IGF1受体以及胰岛素相关受体(IRR)，和III类受体酪氨酸激酶，其包含受体酪氨酸激酶的血小板衍生生长因子(PDGF)家族，如PDGFα、PDGFβ和集落刺激因子1(CSF1)受体。
还已知某些酪氨酸激酶属于非受体酪氨酸激酶类，其位于细胞内并且涉及生化信号的传递，例如影响肿瘤细胞运动、传播和扩散以及随后转移性肿瘤生长的那些(Ullrich等人，Cell，1990，61，203-212，Bolen等人，FASEB J.，1992，6，3403-3409，Brickell等人，CriticalReviews in Oncogenesis，1992，3，401-406，Bohlen等人，Oncogene，1993，8，2025-2031，Courtneidge等人，Semin.Cancer Biol.，1994，5，239-246，Lauffenburger等人，Cell，1996，84，359-369，Hanks等人，BioEssays，1996，19，137-145，Parsons等人，Current Opinionin Cell Biology，1997，9，187-192，Brown等人，Biochimica et BiophysicaActa，1996，1287，121-149和Schlaepfer等人，Progress in Biophysicsand Molecular Biology，1999，71，435-478)。已知多种类型的非受体酪氨酸，其包括Src家族，如Src、Lyn、Fyn和Yes酪氨酸激酶，Abl家族，如Abl和Arg，以及Jak家族，如Jak1和Tyk2。
已知非受体酪氨酸激酶的Src家族在正常细胞中是高度调节的，并且在缺乏细胞外刺激时保持无活性形态。然而，在常见的癌症，如胃肠癌症，例如结肠、直肠和胃癌(Cartwright等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，558-562和Mao等人，Oncogene，1997，15，3083-3090)和乳腺癌(Muthuswamy等人，Oncogene，1995，11，1801-1810)中，一些Src家族成员，例如c-Src酪氨酸激酶经常被显著激活(当与正常细胞水平相比时)。还可以在其它常见的人类癌症，如非小细胞肺癌(NSCLCs)中发现非受体酪氨酸激酶的Src家族，其中包括包括肺的腺癌和扁平细胞癌(Mazurenko等人，EuropeanJournal of Cancer，1992，28，372-7)、膀胱癌(Fanning等人，CancerResearch，1992，52，1457-62)、食管癌(Jankowski等人，Gut，1992，33，1033-8)、前列腺癌、卵巢癌(Wiener等人，Clin.Cancer Research，1999，5，2164-70)和胰腺癌(Lutz等人，Biochem.and Biophys.Res.Comm.，1998，243，503-8)。随着在更多人类肿瘤组织中对非受体酪氨酸激酶的Src家族的检测，人们期望能够证实其广泛的普遍性。
进一步已知，c-Src非受体酪氨酸激酶的主要作用是通过与大量胞质蛋白质包括例如粘着斑激酶和桩蛋白相互作用来调控粘着斑复合物的集结。另外c-Src与限制促进细胞运动性的肌动蛋白细胞骨架的信号路径相结合。同样，c-Src、c-Yes和c-Fyn非受体酪氨酸激酶在整联蛋白介导的信号中和在分裂钙粘着蛋白依赖性细胞-细胞连接中起重要的作用(Owens等人，Molecular Biology of the Cell，2000，11，51-64和Klinghoffer等人，EMBO Journal，1999，18，2459-2471)。对于局部肿瘤发展到分散至血流中、侵入其他组织和开始转移性肿瘤生长的阶段，必然需要细胞的运动性。例如，已经证实结肠肿瘤由局部性发展到散布性的侵入转移性疾病与c-Src非受体酪氨酸激酶活性有关(Brunton等人，Oncogene，1997，14，283-293，Fincham等人，EMBOJ，1998，17，81-92and Verbeek等人，Exp.Cell Research，1999，248，531-537)。
相应的，人们已经认识到这种非受体酪氨酸激酶抑制剂作为肿瘤细胞运动性的选择性抑制剂和作为导致转移性肿瘤生长抑制作用的哺乳动物癌细胞的扩散和侵入的选择性抑制剂应该是很有价值的。特别是这种非受体酪氨酸激酶抑制剂作为用于抑制和/或治疗实体肿瘤疾病的抗侵入活性剂应该是有价值的。
如在国际专利申请WO01/94341和WO02/16352中所述，其中所公开的Src激酶抑制剂可以以单独治疗的方式给药，或可以包括除该发明的喹唑啉衍生物之外的常规手术或放射疗法或化学疗法。所述的这样的化学疗法包括一种或多种下列种类的抗肿瘤活性剂：-
(i)其它抗侵入活性剂(例如金属蛋白酶抑制剂，例如马立马司他和尿激酶纤溶酶原激活物受体功能的抑制剂)；
(ii)抗增殖/抗肿瘤药与其组合，在医学肿瘤学中使用，例如烷化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、马利兰和亚硝基脲)；代谢拮抗剂(例如抗叶酸物例如氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、氨甲喋呤、阿糖胞苷和羟基脲，或例如一种在专利申请No.562734中公开的优选的抗代谢拮抗剂，例如(2S)-2-{邻-氟-对-[N-{2，7-二甲基-4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-6-基甲基}-N-(丙-2-炔基)氨基]苯甲酰氨基}-4-(四唑-5-基)丁酸)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环雷抗生素，例如阿霉素、争光霉素、亚德利霉素、柔毛霉素、表柔霉素、表柔比星、去甲氧柔红霉素、丝裂霉素-C、放线菌素和光神霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱例如长春新碱、长春碱、去乙酰长春酰胺和长春瑞宾和紫杉烷类例如紫杉酚和泰索帝)；和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼脂素，例如鬼臼亚乙苷和表鬼臼毒噻吩糖苷、安吖啶、拓扑替康和喜树碱)；
(iii)细胞生长抑制剂例如抗雌激素(例如三苯氧胺，枸橼酸托瑞米芬、雷诺昔酚、屈落昔芬和iodoxyfene)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和乙酸塞普龙)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素雷(例如甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、vorazole和依西美坦)和5α-还原酶德抑制剂例如非那雄胺；
(iv)生长因子功能抑制剂，例如此类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR酪氨酸激酶抑制剂N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(ZD1839)，N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(CP358774)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI1033))，例如血小板衍生生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；和
(v)抗血管生成素剂，例如抑制血管内皮细胞生长因子的活性剂例如在国际专利申请WO97/22596、WO97/30035、WO97/32856和WO98/13354中公开的化合物以及通过其它机理起作用的活性剂(例如利诺胺，整联蛋白αvβ3功能抑制剂和血管他丁)。
抗雌激素和Src抑制剂AZD0530的组合
乳房的早期和晚期癌瘤通常是激素依赖性的，并且因此对经由雌激素受体的雌激素驱动的生长信号敏感。通过手术去势可以实现去除雌激素。优选的，雌激素的影响也可以通过使用抗雌激素治疗进行抑制，例如使用非甾类抗雌激素如三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、雷诺昔酚、屈落昔芬和iodoxyfene，特别是使用三苯氧胺。雌激素的影响可以使用其它抗雌激素治疗来抑制，例如使用甾类雌激素受体下调因子如氟维司群。
还发现某些其它癌症如肺癌的生长可以是激素依赖性的。例如，在肺肿瘤组织中发现了雌激素受体。这些癌症因而可以是对经由雌激素受体的由雌激素驱动的生长信号敏感。
然而，对激素治疗的抗性是乳腺癌治疗中的主要障碍。最初对抗激素治疗应答的肿瘤随后在肿瘤的发展中产生抗性。近年来，正在开展用以更多了解在乳腺和前列腺癌中对激素治疗和疾病发展产生抗性的机理的研究。已经建立了用于反映乳腺癌中对抗激素活性剂的抗性，特别是三苯氧胺抗性的体外模型。其显示在MCF7人类乳腺癌细胞中对抗雌激素三苯氧胺的抗性部分是由EGFR信号途径的组分的表达提高和活化所介导的(Knowlden等人，Endocrinology，2003，144，1032-1044)。还显示生长因子受体如EGFR通过据信涉及分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号途径的诱导的机理刺激细胞迁移(Price等人，Cell.Commun.Adhesion，2002，9，87-102)。影响癌症患者死亡率的最重要的因子是在他们肿瘤中具有侵入表型的癌细胞的发展。这些细胞显示增强的细胞可动性和侵入性，是体内疾病发展的反映。
由国际专利申请WO01/94341可知，某些5位取代的喹唑啉衍生物具有Src激酶抑制活性，并且是在治疗包括乳腺癌在内的各种癌症中有用的抗侵入活性剂。在其实施例14中以化合物No.73公开了化合物4-(6-氯-2，3-亚甲二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基氧基喹唑啉。该化合物是有效的Src激酶抑制剂，并且被表示为编号AZD0530。
在本发明中，Src激酶的活性被增加，并且其是控制抗激素抗性细胞增强的侵入能力的主要途径。Src激酶的抑制导致细胞侵入减少，其进一步表明在该抗性细胞中Src激酶信号的重要作用。意想不到的是，发现从国际专利申请WO01/94341和WO02/16352中提到的联合治疗的一般公开内容中的一种具体选择是非常有效的。特别是抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530，或其药学可接受的盐的组合产生惊人的有效结果。更具体的说，抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530的组合产生比由抗雌激素或Src激酶抑制剂AZD0530单独给药所达到的效果更好。
虽然在国际专利申请WO01/94341和WO02/16352中表示其所记载的Src激酶抑制剂可以与抗雌激素(例如三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、雷诺昔酚、屈落昔芬(屈洛昔芬和iodoxyfene)联合使用，但其中并没有具体记载抗雌激素与Src激酶抑制剂AZD0530的联合使用，或任何该组合产品的令人惊讶的有效结果。
按照本发明，提供了适合用于乳腺癌的协同治疗的组合，其包括抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530，或其药学可接受的盐。
应了解术语“组合”是指，组合中的组分是同时、顺序或分开给药的。在本发明的一方面，“组合”是指抗雌激素和Src抑制剂的同时给药。在本发明的另一方面，“组合”是指这些活性剂的顺序给药。在本发明的另一方面，“组合”是指这些活性剂的分开给药。在这些活性剂的给药是顺序或分开时，第二种组分延迟给药将不会使联合治疗的协同作用丧失。因此，为了避免疑惑，本发明提供包含抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD5030或其药学可接受的盐，在乳腺癌的协同治疗中同时、顺序或分开使用，或在乳腺癌发展的协同延缓中同时、顺序或分开使用的组合。
抗雌激素是例如非甾类抗雌激素，如三苯氧胺、枸橼酸托瑞米芬、雷诺昔酚、屈落昔芬和iodoxyfene，特别是三苯氧胺，或甾类雌激素受体下调因子，如氟维司群。优选的抗雌激素是三苯氧胺或氟维司群。更优选的抗雌激素是三苯氧胺。抗雌激素三苯氧胺(AstraZeneca的商品名为“Nolvadex”)是1-(p-2-二甲基氨基乙氧苯基)-1，2-二苯基丁-1-烯的反式异构体，其公开于美国专利4,536,516中。三苯氧胺的另一个名字是(Z)-2-[对-(1，2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]乙基二甲胺。
甾类抗雌激素氟维司群(AstraZeneca的商品名为“Faslodex”，编号ICI182，780)是有效的纯抗雌激素的新类中的第一个，其完全没有与传统抗雌激素如三苯氧胺有关的部分拮抗、类雌激素活性。该化合物为雌激素受体下调因子。氟维司群已经在对经三苯氧胺治疗后乳腺癌已发展的妇女的临床试验中显示出了效果。氟维司群的化学名称为7-α-[9-(4，4，5，5，5-五氟戊基亚磺酰基)壬基]雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇，欧洲专利申请0138504的实施例35和权利要求4中记载了该化合物。
此外，合适的抗雌激素包括，例如非甾类芳香酶抑制剂如阿那曲唑、来曲唑、法倔唑、vorazole和氨基苯乙哌啶酮或甾类芳香酶抑制剂如依西美坦和1-甲基-1，4-雄三烯-3，17-二酮。优选的抗雌激素芳香酶抑制剂是阿那曲唑、来曲唑或依西美坦。更优选的抗雌激素芳香酶抑制剂是阿那曲唑或来曲唑。例如，阿那曲唑(商品名为“Arimidex”)具有作为活性成分的化合物2，2’-[5-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-1，3-亚苯基]二(2-甲基-丙腈)，其公开于美国重新发行的专利36,617中。阿那曲唑的另一个名字是2，2’-二甲基-2，2’-[5-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-1，3-亚苯基]二(丙腈)。
AZD0530的合适的药学可接受的盐是，例如药学可接受的酸加成盐，例如与无机或有机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸或富马酸，如单-或双-富马酸的酸加成盐。
如上文所述，本发明的包含抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530的组合在肺癌的协同治疗中也是有用的，因为在肺肿瘤组织中发现的雌激素受体。
本发明的癌症治疗包括抗肿瘤效果，其可以通过常规方法例如应答率、疾病发展时间和/或存活率来评定。本发明的抗肿瘤效果包括但不陷于：抑制肿瘤生长、延缓肿瘤生长、肿瘤的消落、肿瘤的缩小、增加停止治疗后肿瘤的再生时间和延缓疾病的发展。例如，可以预期当给需要对涉及实体瘤的癌症进行治疗的温血动物例如人类给药本发明的组合时，这种治疗效果会产生可通过例如一种或多种以下参数来测定的效果：抗肿瘤的程度、应答率、疾病发展的时间和存活率。
如上文所述，本发明的组合在乳腺癌的协同治疗和预防中特别有用。按照本发明，如果在常规剂量下通过例如应答程度、应答率、疾病发展时间或生存时间测量的效果在治疗学上优于给药联合治疗的一种或其它组分可以获得的效果，则联合治疗被定义为产生了协同效果。例如，如果效果在治疗学上优于单独使用抗雌激素或Src激酶抑制剂AZD0530所能获得的效果，则联合治疗的效果是协同的。另外，如果在对单独的抗雌激素或Src激酶抑制剂AZD0530不应答(或很少应答)的一组患者中获得有益效果，则联合治疗的效果是协同的。另外，如果一种组分以常规剂量给药且另外的组分以减少的剂量给药，而通过例如应答程度、应答率、疾病发展时间或生存时间测量的效果等同于或好于以常规剂量给药联合治疗的任何一种组分所可以获得的效果，则联合治疗的效果被定义为产生了协同效果。特别的，如果可以减少抗雌激素或Src激酶抑制剂AZD0530的常规剂量而不损害应答程度、应答率、疾病发展时间或生存数据的一种或多种，特别是没有损害应答的时间，但是却具有比使用每个组分的常规剂量时所出现的更少和/或更小的讨厌的副作用，则认为存在协同作用。
本发明的治疗性组合可以以合适的药物组合物的形式给药。按照本发明的这方面，提供了适合用于治疗或预防乳腺癌的药物组合物，其包括如在上文中所定义的、与药学可接受的赋形剂或载体联合的组合。
本文中描述的组合物可以是适合于口服给药的形式，例如片剂或胶囊，适合于肠胃外注射(包括静脉、皮下、肌肉、血管或输液)的形式，例如无菌溶液、悬浮液或乳液，适合于局部给药的形式，例如油膏或乳膏剂，适合于直肠给药的形式，例如栓剂，或者给药途径可以是通过直接注射到肿瘤，或通过区域递送或局部递送。在本发明的其他实施方案中，联合治疗的Src激酶抑制剂可以经皮肤、静脉内或皮下，或通过内诊镜或向气管、损伤、腹膜或肿瘤内递送。通常本文中所描述的组合物可以使用本领域熟知的赋形剂或载体，以常规的方式来制备。
用于片剂制剂的合适的药学可接受的赋形剂或载体包括，例如惰性的赋形剂如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙，造粒和崩解剂如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂如凝胶或淀粉；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉；防腐剂如乙基或丙基40羟基苯甲酸酯，和抗氧化剂如抗坏血酸，片剂制剂可以是无包衣的或包衣的，以或者改善他们的分解和随后在胃肠道中活性组分的吸收，或者改善它们的稳定性和/或外观，两种情况都使用常规的包被剂和本领域公知的方法。
用于口服的组合物可以为硬胶囊的形式，其中活性组分与惰性固体赋形剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者为软胶囊的形式，其中活性组分与水或油例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
本发明的组合物可以方便的以单位剂量的形式表示。
抗雌激素组分可以按照已知的临床实践给药。例如在晚期乳腺癌的治疗中，可以使用0.5和100mg之间的三苯氧胺的每日口服剂量，适宜使用5和30mg之间的每日剂量。如果使用抗雌激素的芳香酶，其可以按照已经的临床实践给药。例如可以使用0.005和25mg之间的阿那曲唑的每日口服剂量，适宜使用0.5和5mg之间的剂量。例如可以使用5和200mg之间的依西美坦的每日口服剂量，适宜使用10和40mg之间的剂量。
如果使用氟维司群，其通常以给予有效、无毒的剂量给药。剂量的大小根据给药患者的途径而自然不同。通常使用氟维司群的常规剂量。更具体的，每日给药的剂量在例如从约10mg到5g，优选从约10mg到1g，更优选从约10mg到300mg化合物(即约0.2mg/kg到100mg/kg体重，优选从约0.2mg/kg到20mg/kg体重，更优选从约0.2mg/kg到6mg/kg体重)的范围内，如果需要的话以分开的剂量给予。方便的，氟维司群的给药剂量足以在病患中获得疾病应答，使用的氟维司群的剂量包括可以以短期作用制剂给药1到15mg每日，根据给药的形式而定，或以长期作用制剂相当于每月200到300mg化合物。优选的给药途径是通过肌肉注射。给药的剂量使得产生5到20ng/ml的氟维司群的血清水平。优选的制剂是将适剂量例如250mg的氟维司群溶解在5ml包含10％w/v乙醇、10％w/v苯甲醇和15％w/v苯甲酸苄酯的蓖麻油样品中。该制剂将被肌肉注射，并将提供大约28天的治疗水平的氟维司群。
通常给药Src激酶抑制剂AZD0530以获得在例如0.1mg/kg到75mg/kg体重范围内的每日剂量，如果需要的话以分开的剂量给予。通常当利用肠胃外途径给药时将给药较低的剂量。因此，例如，对于静脉给药，通常使用例如0.1mg/kg到30mg/kg体重范围内的剂量。类似的，对于吸入给药，可使用例如0.05mg/kg到25mg/kg体重范围内的剂量。然而优选口服给药，特别时片剂形式。通常对于口服给药，使用例如0.1mg/kg到20mg/kg体重范围内的剂量。特别的，使用0.2mg/kg到10mg/kg体重范围的口服剂量；更特别的，使用0.5mg/kg到5mg/kg体重的口服剂量。典型的，单位剂量形式将包含约0.5mg到0.5g的Src激酶抑制剂；更特别的，单位剂量形式将包含约25mg到250mg的Src激酶抑制剂。
在上文所述的剂量和时间表可以根据患者的具体疾病状况和总体条件进行改变。例如，为减少毒性，减少上述联合治疗组分的剂量可能是必要或希望的。时间表可以由治疗任一具体病患的医生使用其专业技术和知识来确定。
应理解按照本发明的药物组合物包括包含抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530的组合以及药学可接受的赋形剂或载体。该组合物方便的提供了用于在乳腺癌的协同治疗中同时给药的本发明的治疗性组合产品。
按照本发明的该方面，提供了适合在乳腺癌的协同治疗中使用的药物组合物，其包含抗雌激素、Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐，以及药学可接受的赋形剂或载体。
本发明的药物组合物还包括分开的组合物，其包括，包含抗雌激素和药学可接受的赋形剂或载体的第一组合物，以及包含Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋形剂或载体的第二组合物。该组合物方便的提供了用于在乳腺癌的协同治疗中顺序或分开给药的本发明的治疗性组合物，但是该分开的组合物也可以同时给药。
方便的，本发明的该药物组合物包含药盒，其中包括具有包含抗雌激素的合适组合物的第一容器，和具有包含Src激酶抑制剂AZD0530的合适组合物的第二容器。按照本发明的这个方面，提供了在乳腺癌的协同治疗中使用的药盒，其包括：-
a)抗雌激素与药学可接受的赋形剂或载体，以第一单位剂量形式(如片剂或胶囊)；
b)Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐，与药学可接受的赋形剂或载体，以第二单位剂量形式；和
c)用于包含所述第一和第二单位剂量形式的容器。
按照本发明的另一方面，提供了如前文所定义的用于乳腺癌协同治疗的组合。
按照本发明的该方面，还提供了用于乳腺癌的协同治疗的药物组合物，其包含如前文所定义的、与药学可接受的赋形剂或载体联合的组合。
本发明的特别令人惊讶的益处在于能够用本发明的组合治疗的乳腺癌不仅可以是还没有用抗雌激素治疗的患者的乳腺癌，还可以是已经用抗雌激素治疗过但对这种疗法没有应答或是在最初能用该疗法治疗后已经产生抗性的乳腺癌。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的组合在制备用于给药温血动物以协同治疗乳腺癌的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的组合在制备用于给药温血动物以协同治疗抗雌激素抗性乳腺癌的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供协同治疗乳腺癌的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的组合的组分。
按照本发明的另一方面，提供协同治疗抗雌激素抗性乳腺癌的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的组合的组分。
按照本发明的该方面，还提供协同治疗乳腺癌的方法，其包括在给药有效量的Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐之前、同时或之后给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的抗雌激素。
按照本发明的这个方面，还提供协同治疗乳腺癌的方法，其包括同时、顺序或分开给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的组合的组分。
按照本发明的这个方面，还提供协同治疗乳腺癌的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的雌激素，并同时、顺序或分开给药有效量的Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐。
本发明还涉及用于延缓乳腺癌从激素应答到激素无应答状态的发展，即抑制乳腺癌细胞从激素依赖、非侵入的状态到激素非依赖、更加侵入的状态的转化的包含抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合物。因此，该组合对疾病发展的时间和存活率有有益的效果。
按照本发明的这个方面，还提供用于延缓乳腺癌从激素应答到激素无应答状态的发展的包含抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
在另一方面，本发明涉及该组合在抑制乳腺细胞转化为癌细胞中的应用，即化合物的组合提供乳腺癌化学预防效果。
在停经前妇女的正常人乳腺上皮细胞中，细胞具有标准大小和标准染色质水平的核。已知当癌变发展时正常乳腺上皮细胞的外观出现一系列的变化。在正常的上皮组织中，雌激素刺激正常生长并诱导孕酮受体的表达，其使得孕酮介导乳腺上皮细胞生长。因此该上皮细胞的生长包括细胞的非雌激素依赖性基线转换。在停经前妇女中，通常当核的大小开始变大并且染色质水平开始增加时，乳腺上皮组织疾病的病症开始显现。这些是癌变前的改变，在这个阶段该状况被(似非而可能是的)称为原位管癌(DCIS)。随着疾病发展和DCIS细胞被转变为恶性细胞，细胞明显具有增大的细胞核或核仁以及明显增加的染色质水平。
我们已经发现，本发明的组合意想不到的不仅对已转变的乳腺癌细胞的生长，而且对乳腺中的正常细胞和非恶性、异常细胞的基本生长都具有效果。本发明的组合因此被用于减少、优选抑制乳腺细胞向恶性状态的转变。本发明的抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530的组合能够抑制正常细胞向DCIS状态的转变。所述组合物也能够抑制DCIS细胞向恶性细胞的转变。
进一步期望该组合在防止遗传上倾向患有该疾病的妇女中乳腺癌的发作中具有有益效果。
按照本发明的这个方面，提供用于减少，优选抑制正常乳腺细胞向DCIS状态转变的包含抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
依照本发明的这个方面，还提供用于减少，优选抑制正常乳腺细胞或DCIS细胞向恶性状态转变的包含抗雌激素和Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
上文所定义的本发明的联合治疗可以作为单独治疗施行，或者可以附加包括手术或放射性治疗或给药化疗剂。
手术可以包括部分或完全切除肿瘤的步骤，在施行本发明的联合治疗之前、期间或之后进行。
可选与本发明的联合治疗一起使用的化疗剂可以包括，例如下列治疗剂种类：
(i)在医药肿瘤血中使用的抗增值/抗肿瘤药和其组合(例如卡铂和顺铂)；
(ii)细胞抑制剂，例如生长因子功能的抑制剂如生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗erbB2抗体曲妥单抗和B1抗体西妥昔单抗)、酪氨激酶抑制剂(例如表皮生长因子家族的抑制剂)、II类受体酪氨酸激酶抑制剂(例如胰岛素生长因子家族的抑制剂如IGF1受体抑制剂，其如例如Chakravarti等人，Cancer Research，2002，62，200-207所记载)、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂和血小板衍生的生长因子抑制剂；
(iii)抗血管生成素剂，例如抑制血管内皮生长因子效果的那些(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO01/32651中实施例2)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO00/47212中)，vatalanib(PTK787；WO98/35985)和SU11248(WO01/60814))；
(iv)血管损伤剂如国际专利申请WO99/02166，WO00/40529，WO00/41669，WO01/92224，WO02/04434和WO02/08213中公开的化合物；
(v)生物学反应调节因子(例如干扰素)；和
(vi)二膦酸盐如替鲁膦酸、英卡膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、氯膦酸、奈立膦酸、帕米膦酸和阿仑膦酸。
例如，施用所定义的抗雌激素、Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐以及电离辐射可以产生抗癌效果，如抗肿瘤效果，其优于行电离辐射所获得的效果。
根据本发明的这个方面，还提供了协同治疗乳腺癌的方法，其包括在治疗有效量的Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐之前、同时或之后和在有效量电离辐射之前、同时或之后给药需要这种治疗的温血动物如人类有效量的抗雌激素。
可以在给药如上文所定义的本发明的组合一周之前至一周之后的时间内对所述温血动物如人类实施电离辐射。
放射疗法可以按照已知的临床放射疗法中的实践来实施。电离辐射的剂量是在临床放射疗法中已知的。所使用的放射治疗包括例如使用γ-射线、X-射线和/或来自放射性同位素的辐射的直接递送。其他形式的DNA损伤因子也包括在本发明中，例如微波和紫外线照射。例如X-射线可以以1.8-2.0Gy的日剂量给予，一周5天，保持5-6周。通常分次剂量的总和在45-60Gy范围内。单一较大的剂量，例如5-10Gy可以以放射疗法的一个历程的一部分来给予。可以在手术中给予单一剂量。可以使用超分割放射疗法，由此小剂量的X-射线可以在一段时期内有规则地给予，例如在若干天内酶小时给予0.1Gy。放射性同位素的剂量范围可在很大程度上改变，取决于同位素的半衰期、强度和发出辐射的类型，并取决于细胞的吸收量。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的组合在制备用于给药正在进行电离辐射治疗的温血动物如人类以提供乳腺癌的协同治疗的药物中的应用。
EGFR TKI和Src抑制剂AZD0530的组合
本发明还涉及包含表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(下述“EGFR TKI”)和Src家族非受体酪氨酸激酶的特定抑制剂的组合。本发明的该组合在治疗癌症的方法中是有用的。
在大量人类肿瘤中广泛出现EGFR的高表达水平，该增加的表达可能与患者的疾病发展和不良预后有关(Nicholson等人，Breast CancerResearch Treatment，1994，29，117-125和European Journal of Cancer，2001，37，Supplement 4，S9-15)。例如已显示在MCF7人类乳腺癌细胞中对抗雌激素三苯氧胺的抗性部分是由EGFR信号途径的组分的表达提高和活化所介导的(Knowlden等人，Endocrinology，2003，144，1032-1044)。其还显示基本的和TGFα刺激的三苯氧胺抗性MCF7乳腺癌细胞的生长都可以被EGFR TKI ZD1839抑制。
可用本发明该方面的组合治疗的癌症包括食管癌、骨髓癌、肝癌、胰腺癌和宫颈癌、Ewings肿瘤、成神经细胞瘤、卡波西肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、黑素瘤、肺癌[包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)]、胃癌、头颈部癌、脑癌、肾癌、淋巴瘤和白血病。更具体的，本发明的该组合在乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、NSCLC和头颈部癌的治疗中或在延缓这些癌症发展的方法中是有用的。
依照本发明的这个方面，提供适合用于癌症(特别是乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和头颈部癌)的协同治疗的组合，其包括EGFR TKI或其药学可接受的盐，以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐。
应当理解术语“组合”表明同时、顺序或分开给药如上文所述的组合的组分。
已知I类激酶如受体酪氨酸激酶的EGF家族经常在一般的人类上皮癌如前列腺癌中出现(Visakorpi等人，Histochem.J.，1992，24，481)。因此认为受体酪氨酸激酶的抑制剂具有作为前列腺癌生长的选择性抑制剂的价值。
由欧洲专利申请No.0566226和国际专利申请WO96/33980和WO97/30034可知某些在4-位具有苯胺替代的喹唑啉衍生物具有EGFR酪氨酸激酶抑制剂活性，并且是包括前列腺癌在内的癌组织增殖的抑制剂。J R Woodburn等人in Proc.Amer.Assoc.Cancer Research，1997，38，633和Pharmacol.Ther.，1999，82，241-250公开了化合物N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(又称为gefitinib和AstraZeneca的商品名“Iressa”)。该化合物是有效的EGFRTKI，在下文中用编号ZD1839表示。
由国际专利申请WO96/30347可进一步得知某些在4-位具有苯胺替代的结构相关的喹唑啉衍生物也具有EGFR酪氨酸激酶抑制剂活性。在WO99/55683中还公开了化合物N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺或其药学可接受的盐(链接到编号CP358774和OSI-774)是EGFR TKI。该化合物还被称为erlotinib，并在下文中用编号OSI-774表示。
由国际专利申请WO97/38983可进一步得知某些在4-位具有苯胺替代的其它结构相关的喹唑啉衍生物也具有EGFR酪氨酸激酶抑制剂活性。在J.Med.Chem.，1999，42，1803-1815和WO00/31048中已经公开了化合物6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(链接到编号PD183805和CI1033)是EGFR TKI。该化合物在下文中用编号CI1033表示)。
由国际专利申请WO97/02266可进一步得知某些其它结构相关的杂环衍生物也具有EGFR酪氨酸激酶抑制剂活性。例如化合物4-[(1R)-1-苯基乙基氨基]-6-(4-羟基苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(链接到编号PKI-166、CGP 75166和CGP 59326)是EGFR TKI。该化合物在下文中用编号PKI-166表示。
由欧洲专利申请No.0787722和国际专利申请WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037可进一步得知某些在4-位具有苯胺替代的其它结构相关的喹唑啉衍生物也具有EGFR酪氨酸激酶抑制剂活性。例如，化合物N-[4-(3-溴苯胺基)喹唑啉-6-基]丁-2-炔酰胺(链接为编号CL-387785和EKB-785)是EGFR TKI。该化合物在下文中用编号CL-387785表示。
由Nature Medicine，2000，6，1024-1028和美国专利No.6,002,008可进一步得知某些在4-位具有苯胺替代的其它结构相关的喹唑啉衍生物也具有EGFR酪氨酸激酶抑制剂活性。例如，化合物4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-6-(4-二甲基氨基丁-2(E)-烯酰氨基)-7-乙氧基喹啉(下文中表示为编号EKB-569)是EGFR TKI。
在本发明的合适的组合中，EGFR TKI选自例如ZD1839、OSI-774、CI 1033、PKI-166、CL-387785和EKB-569。优选EGFR TKI组分是ZD1839或OSI-774。更优选EGFR TKI组分是ZD1839。
如上文所述，AZD0530的合适的药学可接受的盐是，例如药学可接受的酸加成盐，例如与无机或有机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸或富马酸的酸加成盐。类似的可以使用本发明这个方面的EGFR TKI组分的药学可接受的盐。
如上文所述，本发明包含EGFR TKI和Src激酶抑制剂AZD0530的组合在癌症的协同治疗中是有用的。本发明的癌症治疗包括抗肿瘤效果，其可以通过上文所述的常规方法进行评测。
如果使用类似的标准其效果在治疗学上优于上文所述的那些，则本发明的联合治疗被定义为产生了协同效果。
依照本发明的这个方面，优选的组合包含EGFR TKI ZD1839或其药学上可接受的盐，以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学上可接受的盐。
依照本发明的这个方面，进一步优选的组合包含EGFR TKI OSI-774或其药学可接受的盐，以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学上可接受的盐。
本发明这个方面的治疗性组合可以以合适的药物组合物的形式给药。按照本发明的这方面，提供了适合用于协同治疗癌症的药物组合物，其包含与药学可接受的赋形剂或载体联合的包含EGFR TKI或其药学可接受盐以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
本发明这个方面中所述的组合物可以为任何合适的形式，如上文所述的形式。
优选的适合用于癌症协同治疗的药物组合物包含与药学可接受的赋形剂或载体联合的包含EGFR TKI ZD1839或其药学可接受盐以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
进一步优选的适合用于癌症协同治疗的药物组合物包含与药学可接受的赋形剂或载体联合的包含EGFR TKI OSI-774或其药学可接受盐以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
对于EGFR TKI组分，用于口服给药的片剂或胶囊剂通常包含，例如从约20mg到1g的活性成分。当EGFR TKI是ZD1839，包含50mg、100mg、250mg或500mg活性成分的常规片剂可以被用于口服给药。方便的，ZD1839的每日口服剂量超过40mg，例如在50到750mg的范围内，优选在100到500mg的范围内，更优选在200到500mg的范围内。当EGFR TKI是OSI-774，包含25mg，100mg或150mg活性成分的常规片剂被用于口服给药。方便的，OSI-774的每日口服剂量在50到300mg的范围内，优选在50到200mg的范围内，更优选在100到150mg的范围内。
通常使用如上文所述类似的量和途径给药Src激酶抑制剂AZD0530。
上文所述的剂量和时间表可以根据患者的具体疾病状况和总体条件进行改变。例如，为减少毒性，减少上述联合治疗组分的剂量可能时必要或可希望的。服药时间安排可以由治疗任一具体病患的医生使用其专业技术和知识来确定。
应理解按照本发明的药物组合物包括包含EGFR TKI和Src激酶抑制剂AZD0530的组合物以及药学可接受的赋形剂或载体。该组合物方便的提供了用于在癌症协同治疗中同时给药的本发明的治疗性组合产品。
依照本发明的这个方面，提供适合用于癌症协同治疗的药物组合物，其包含EGFR TKI或其药学可接受的盐、Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋型剂或载体。
依照本发明的药物组合物也包括分开的组合物，其包括，包含EGFR TKI或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋形剂或载体的第一组合物，和包含Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋形剂或载体的第二组合物。该组合物方便的提供了用于在癌症的协同治疗中顺序或分开给药的本发明的治疗性组合物，但是该分开的组合物也可以同时给药。
方便的，本发明的该药物组合物包含药盒，其中包括具有包含EGFR TKI的合适组合物的第一容器，和具有包含Src激酶抑制剂AZD0530的合适组合物的第二容器。按照本发明的这个方面，提供了在癌症的协同治疗中使用的药盒，其包括：
a)EGFR TKI或其药学可接受的盐，与药学可接受的赋形剂或载体，在第一单位剂型中；
b)Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐，与药学可接受的赋形剂或载体，在第二单位剂型中；和
c)用于包含所述第一和第二单位剂型的容器。
按照本发明的另一方面，提供了如上文所定义的用于癌症协同治疗的组合。
按照本发明的该方面，还提供了用于癌症协同治疗的药物组合物，其包含如前文所定义的组合与药学可接受的赋形剂或载体。
本发明的特别令人惊讶的益处在于能够用本发明的组合治疗的癌症不仅可以是还没有用生长因子抑制剂治疗的患者的癌症，还可以是已经用生长因子抑制剂，例如用EGFR TKI治疗过但对这种疗法没有应答或是在最初能用该疗法治疗后已经产生抗性的癌症。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的组合在制备用于给药温血动物以协同治疗癌症的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的组合在制备用于给药温血动物以治疗EGFR TKI抗性癌症的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供协同治疗癌症的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的组合的组分。
按照本发明的另一方面，提供治疗EGFR TKI抗性癌症的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的组合的组分。
按照本发明的这个方面，还提供协同治疗癌症(包括EGFR TKI抗性癌症)的方法，其包括在给药有效量的Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐之前、同时或之后给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的EGFR TKI或其药学可接受的盐。
按照本发明的这个方面，还提供协同治疗癌症(包括EGFR TKI抗性癌症)的方法，其包括同时、顺序或分开给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的组合的组分。
按照本发明的这个方面，还提供协同治疗癌症(包括EGFR TKI抗性癌症)的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的EGFR TKI或其药学可接受的盐，并同时、顺序或分开给药有效量的Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐。
上文所定义的本发明的联合治疗可以作为单独治疗施行，或者可以附加包括手术或放射性治疗或给药如上文所述的化疗剂。
抗雌激素、EGFR TKI和Src抑制剂AZD0530的组合
本发明还涉及三部分组合，其包含抗雌激素、EGFR酪氨酸激酶抑制剂和Src家族非受体激酶的特定抑制剂。本发明的该组合在治疗癌症，尤其是乳腺癌的方法中是有用的。
如上文所述，在MCF7人类乳腺癌细胞中对抗雌激素三苯氧胺的抗性部分是由EGFR信号途径的组分的表达提高和活化所介导的。其还表明基本的和TGFα刺激的三苯氧胺抗性MCF7乳腺癌细胞的生长都可以被EGFR酪氨酸激酶抑制剂ZD1839抑制。
按照本发明的这个方面，提供了适合用于乳腺癌的协同治疗的三部分组合，其包含抗雌激素、EGFR TKI或其药学可接受的盐和Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐。
应当理解术语“组合”表明同时、顺序或分开给药如上文所述的组合的组分。
适当的抗雌激素具有所有上文所定义的含义。
适当的EGFR TKI具有所有上文所定义的含义。在本发明的适当的由三部分组合中，EGFR TKI选自，例如ZD1839、OSI-774、CI1033、PKI-166、CL-387785和EKB-569。优选本发明的三部分组合的EGFRTKI组分是ZD1839或OSI-774。更优选本发明的三部分组合的EGFRTKI组分是ZD1839。
如上文所述，EGFR TKI或AZD0530的药学可接受的盐是，例如药学可接受的酸加成盐，例如与无机或有机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸或富马酸的酸加成盐。
如上文所述，本发明的三部分组合在乳腺癌的协同治疗中是有用的。本发明的癌症治疗包括抗肿瘤效果，其可以通过上文所述的常规方法进行评测。
如果使用类似的标准其效果在治疗学上优于上文所述的那些，则本发明的三部分联合治疗被定义为产生了协同效果。
依照本发明的这个方面，优选的三部分组合包含抗雌激素、EGFRTKI ZD1839或其药学上可接受的盐，以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学上可接受的盐。
依照本发明的这个方面，进一步优选的三部分组合包含抗雌激素、EGFR TKI OSI-774或其药学可接受的盐，以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学上可接受的盐。
本发明的三部分组合在肺癌的协同治疗中也是有用的，因为在肺肿瘤组织中发现了雌激素受体。
本发明这个方面的三部分组合可以以合适的药物组合物的形式给药。按照本发明的这方面，提供了适合用于协同治疗乳腺癌的药物组合物，其包含与药学可接受的赋形剂或载体联合的，抗雌激素、EGFRTKI或其药学可接受盐以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
本发明的这个方面中所述的组合物可以为任何适当的形式，例如上文所述的形式。
优选的适合用于乳腺癌的协同治疗的药物组合物包括与药学可接受的赋形剂或载体联合的，抗雌激素、EGFR TKI ZD1839或其药学可接受盐以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
进一步优选的适合用于乳腺癌的协同治疗的药物组合物包括与药学可接受的赋形剂或载体联合的，抗雌激素、EGFR OSI-774或其药学可接受盐以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
抗雌激素组分、EGFR TKI组分和Src激酶抑制剂AZD0530中的每个通常都使用如上文所述的类似的量和途径给药。
上文所述的剂量和时间表可以根据患者的具体疾病状况和总体条件进行改变。例如，为减少毒性，减少上述联合治疗组分的剂量可能时必要或可希望的。服药时间安排可以由治疗任一具体病患的医生使用其专业技术和知识来确定。
应理解按照本发明的药物组合物包括包含抗雌激素、EGFR TKI和Src激酶抑制剂AZD0530的组合以及药学可接受的赋形剂或载体。该组合物方便的提供了用于在乳腺癌协同治疗中同时给药的本发明的治疗性组合产品。
依照本发明的这个方面，提供适合用于乳腺癌协同治疗的药物组合物，其包含抗雌激素、EGFR TKI或其药学可接受的盐、Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋型剂或载体。
依照本发明的药物组合物也包括分开的组合物，其包括，包含抗雌激素以及药学可接受的赋形剂或载体的第一组合物、包含EGFR TKI或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋形剂或载体的第二组合物、和包含Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋形剂或载体的第三组合物。该组合物方便的提供了用于在癌症的协同治疗中顺序或分开给药的本发明的治疗性组合物，但是该分开的组合物也可以同时给药。
方便的，本发明的该药物组合物包含药盒，其中包括、具有包含抗雌激素的适当组合物的第一容器、具有包含EGFR TKI的适当组合物的第二容器、和具有包含Src激酶抑制剂AZD0530的适当组合物的第三容器。按照本发明的这个方面，提供了在乳腺癌的协同治疗中使用的药盒，其包括：-
a)抗雌激素与药学可接受的赋形剂或载体，以第一单位剂量形式(如片剂或胶囊)；
b)EGFR TKI或其药学可接受的盐，与药学可接受的赋形剂或载体，以第二单位剂量形式；
c)Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐，与药学可接受的赋形剂或载体，以第三单位剂量形式；和
d)用于包含所述第一、第二和第三单位剂量形式的容器。
还需要理解，为了方便，三部分组合的任意两种组分可以共同以第一单位剂量形式而第三组分以第二单位剂量形式产生。
按照本发明的另一方面，提供了上文所定义的用于乳腺癌的协同治疗的三部分组合。
根据本发明的这个方面，还提供了用于乳腺癌的协同治疗的药物组合物，其包含与药学可接受的赋形剂或载体联合的上文所定义的三部分组合。
如上所述，对乳腺癌的激素治疗的抗性是主要问题。最初对抗激素治疗应答的肿瘤在肿瘤的发展中产生了抗性。类似的，也会产生对使用EGFR TKI的乳腺癌疗法的抗性。已经建立了反映乳腺癌细胞对抗激素治疗，如三苯氧胺的抗性，和对EGFR TKI治疗的抗性获得的体外细胞模型。现在已经显示在三苯氧胺抗性MCF7人类乳腺癌细胞中对EGFR TKI ZD1839的抗性部分是由Src激酶信号途径的组分的表达提高和活化所介导的，其导致具有侵入性表形的癌细胞的发展。这些细胞显示增强的细胞可动性和侵入性，其是体内疾病发展的反映。
本发明这个方面的特别令人惊讶的益处在于能够用本发明的三部分组合治疗的乳腺癌不仅可以是还没有进行抗雌激素治疗或EGFRTKI治疗的患者的乳腺癌，还可以是已经用抗雌激素和EGFR TKI之一或共同治疗过但对这种疗法没有应答或是在最初能用该疗法治疗后已经产生抗性的乳腺癌。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的三部分组合在制备用于给药温血动物以协同治疗乳腺癌的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的三部分组合在制备用于给药温血动物以治疗抗雌激素抗性乳腺癌的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的三部分组合在制备用于给药温血动物以治疗EGFR TKI抗性乳腺癌的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供如上文所定义的三部分组合在制备用于给药温血动物以治疗对抗雌激素和EGFR TKI都具有抗性的乳腺癌的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供协同治疗乳腺癌的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的三部分组合的组分。
按照本发明的另一方面，提供治疗抗雌激素抗性乳腺癌的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的三部分组合的组分。
按照本发明的另一方面，提供治疗EGFR TKI抗性乳腺癌的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的三部分组合的组分。
按照本发明的另一方面，提供治疗对抗雌激素和EGFR TKI治疗都具有抗性的乳腺癌的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的三部分组合的组分。
按照本发明的这个方面，还提供协同治疗乳腺癌的方法，其包括在给药有效量的如上文所定义的EGFR TKI或其药学可接受的盐之前、同时或之后，以及在给药有效量的Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐之前、同时或之后给药需要这种治疗的温血动物有效量的抗雌激素。
按照本发明的这个方面，还提供协同治疗乳腺癌的方法，其包括同时、顺序或分开给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的三部分组合的组分。
按照本发明的这个方面，还提供协同治疗乳腺癌的方法，其包括给药需要这种治疗的温血动物有效量的如上文所定义的雌激素，同时、顺序或分开给药有效量的如上文所定义的EGFR TKI或其药学可接受的盐，并同时、顺序或分开给药有效量的Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐。
本发明还涉及用于延缓乳腺癌从激素应答到激素无应答状态的发展，即抑制乳腺癌细胞从激素依赖、非侵入的状态到激素非依赖、更加侵入的状态的转化的三部分组合，其包含抗雌激素、EGFR TKI或其药学可接受的盐，以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐。因此，该三部分组合对疾病发展的时间和存活率有有益的效果。
按照本发明的这个方面，还提供用于延缓乳腺癌从激素应答到激素无应答状态的发展的三部分组合，其包含抗雌激素、EGFR或其药学可接受的盐，以及Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受的盐。
在另一方面，本发明涉及该三部分组合在抑制乳腺细胞转化为癌细胞中的应用，即化合物的组合提供乳腺癌化学预防效果。
我们已经发现，本发明的三部分组合意想不到的不仅对已转变的乳腺癌细胞的生长，而且对乳腺中的正常细胞和非恶性、异常细胞的基本生长都具有效果。本发明的三部分组合因此被用于减少、优选抑制乳腺细胞向恶性状态的转变。本发明的抗雌激素、EGFR TKI和Src激酶抑制剂AZD0530的三部分组合能够抑制正常细胞向DCIS状态的转变。所述三部分组合物也能够抑制DCIS细胞向恶性状态的转变。
进一步期望该三部分组合在防止遗传上倾向患有该疾病的妇女中乳腺癌的发作中具有有益效果。
按照本发明的这个方面，提供用于减少，优选抑制正常乳腺细胞向DCIS状态转变的包含抗雌激素、EGFR TKI或其药学可接受盐和Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的三部分组合。
按照本发明的这个方面，还提供用于减少，优选抑制正常乳腺细胞或DCIS细胞向恶性状态转变的包含抗雌激素、EGFR TKI或其药学可接受盐和Src激酶抑制剂AZD0530或其药学可接受盐的组合。
上文所定义的本发明的三部分联合治疗可以作为单独治疗施行，或者可以附加包括手术或放射性治疗或给药上文所定义的化疗剂。
生物学试验方法
下列试验方法可用于显示当与抗雌激素和/或EGFR TKI联合使用时Src激酶抑制剂AZD0530的活性。
(a)细胞生长研究
各种试验方法由Knowlden等人在Endocrinology，2003，144，1032-1044中作出描述，其包括一种或多种的：-
(i)三苯氧胺应答的“野生型”MCF7人类乳腺癌细胞；
(ii)该MCF7乳腺癌细胞的对激素不敏感的变体，其被表示为“Tam-R”(三苯氧胺抗性)；和
(iii)该“TAM-R”细胞的变体，其对用EGFR TKI ZD1839的治疗也不敏感，其被表示为“Tam/TKI-R”。
三苯氧胺应答的“野生型”MCF7乳腺细胞通常培养在补入5％胎牛血清加青霉素(10IU/ml)、链霉素(10μg/ml)和两性霉素B(2.5μg/ml)的无酚红RPMI培养基中。培养物于37℃保持在包含5％CO2的潮湿空气中。当在下述试验中用于试验分析时，细胞保持在补入5％活性炭吸附的、去类固醇胎牛血清、上述抗生素和谷酰胺(200mM)的无酚红RPMI培养基中。
“Tam-R”MCF7乳腺癌细胞保持在补入5％活性炭吸附的、去类固醇胎牛血清、上述抗生素、谷酰胺(200mM)和4-羟基三苯氧胺(乙醇中10-7M)的无酚红RPMI培养基中。
通过连续将“Tam-R”MCF7乳腺癌细胞暴露在ZD1839(10-6M)中12个月获得“Tam/TKI-R”MCF7乳腺癌细胞。
使用Nunc(Rosklide，Denmark)组织培养塑料器皿。
单细胞层于无血清生长因子DCCM培养基中在存在递增浓度的上述组合物的组分或组合物本身的情况下生长7天。通过单细胞层的胰蛋白酶消化法评估细胞群体生长，使用Beckman Coulter计数器(可从Beckman Coulter Limited，Luton，GB购得)测量细胞的数量。所有的细胞生长试验都一式三份。
(b)细胞运动性的时延分析
细胞培养于6孔组织培养皿中，使其达到对数生长阶段。平皿被转移到热的倒置显微镜的镜台上，细胞培养物用矿物油覆盖以在细胞运动性分析时最小化培养基中的pH改变。使用与时延录影系统连接的摄影机记录细胞运动性6个小时。为定量细胞运动性，在录像重放的过程中以10分钟为间隔获取图像，使用Optimas图像分析软件(MediaCybernetics UK，Finchampstead，Berkshire，GB)追踪至少10个细胞个体的移动。以细胞位置(x轴位置对y轴位置)或迁移的总距离(μm)作为时间函数绘制细胞的移动。为确定细胞运动性的定向持续，绘制细胞的轨迹使得所有的轨迹始于原点。
(c)损伤愈合试验
收集指数生长细胞，平皿培养于24孔培养皿上。产生单层培养物后，通过用吸液管尖端手动刮擦损伤细胞，并用磷酸盐缓冲血清(PBS)洗涤。加入包含适当生长因子、抑制剂化合物(或抑制剂化合物的组合)的新鲜培养基。36小时后，细胞用4％甲醛固定，用结晶紫(PBS中0.5％)染色，以20倍的放大比例对损伤拍照。一些孔在损伤后立即(t＝0小时时间点)被固定和染色以用于计算损伤愈合百分率。
(d)纤维粘连蛋白细胞移动试验
Transwell小室的聚碳酸酯滤膜(6.5mm直径，8.0μm孔大小，来自Costar Inc.，Cambridge，MA，USA)被铺在具有50μg/ml纤维粘连蛋白的膜下侧，无血清RPMI中37℃下2小时。用PBS漂洗聚碳酸酯膜。收集细胞，以无血清RPMI中每毫升5×105细胞的浓度悬浮。试样量的细胞(100μl；5×104细胞)被接种到加入有500μl试验培养基的每个孔中。在对照试验中，让细胞向膜下侧移动20小时。在测试试验中，加入适当浓度的抑制剂化合物(或抑制剂化合物的组合)，让细胞向膜下侧移动20小时。用棉签除去膜上侧的未移动细胞，附着在膜下侧的移动细胞用4％甲醛固定，在室温下用0.5％结晶紫染色10分钟。使用倒置显微镜以20倍的放大率计算移动细胞的数量。
(e)细胞侵入性试验
先前由Hiscox等人(Breast Cancer Research Treatment，2000，59，245-254)描述的改进的方法倍用于研究乳腺癌细胞的侵入本性。
将Transwell聚碳酸酯滤膜插入物(6.5mm直径，8μm孔大小，来自Costar Inc.)置于24孔组织培养平皿中，用Matrigel(0.4μg/ml)包被在室温下于无菌培养罩中过夜。37℃下用无血清RPMI再水合1小时后，以5×104细胞/孔将细胞接种到具有或不具有适当浓度的抑制剂化合物(或抑制剂化合物的组合)的膜插入物上，加入600μl培养基以浸入膜插入物。孔在37℃下培养72小时，之后用棉签从孔内部除去未侵入细胞和Matrigel。用4％甲醛固定已经侵入到膜下侧的细胞，使用解剖刀刀刃将多孔膜从侵入室移出，安放在包含核染色剂DAPI的显微镜承物玻璃片上(使用来自Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA的Vectashield)。用荧光显微镜通过以2倍的放大率观察每块膜上5个分开的区域并计算每个区域中的细胞数量来量度细胞侵入。根据每区域的平均细胞或相对于对照的侵入百分率标绘数据。
(f)细胞粘着试验
用基质胶(50μg/孔)包被96孔平皿的孔，在无菌组织培养罩中风干过夜。收集对数期生长的细胞，在包含适当浓度抑制剂化合物(或抑制剂化合物的组合)的培养基中调节浓度为每毫升2×105个细胞。试样量的细胞(2×104细胞)被接种到每个孔中，平皿在37℃下培养30分钟。在每孔加入150μ1的MTT溶液(无血清培养基中0.5mg/ml)前，用PBS洗孔两次以除去未结合的细胞。37℃下进一步培养平皿4个小时以使得四唑晶体在细胞中发展。从孔中除去MTT溶液，4℃下用10％TX-100溶液提取染料过夜。用装备有540nm滤光器的TiterteckMultiskan EL1SA平皿读数器(Flow Laboratories，UK)测量吸光率。响应治疗的细胞粘着被计算为在对照(未处理)孔中粘着的细胞的百分比。
(g)体外c-Src转染NIH 3T3(c-src 3T3)成纤维细胞增殖试验
该试验测定测试化合物(或测试化合物的组合)抑制用人c-Src的活化突变体(Y530F)稳定转染的美国全国卫生研究所(NIH)小鼠3T3成纤维细胞增殖的能力。
使用类似于Shalloway等人，Cell，1987，49，65-73所述的方法，用人c-Src的活化突变体(Y530F)转染NIH 3T3细胞。获得的c-Src3T3细胞一般以每孔1.5×104个接种到96孔组织培养物处理的清洁的试验平皿(Costar)中，其每个包含含有Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM；Sigma)加上0.9％氯化钠水溶液中0.5％胎牛血清(FCS)、2mM谷酰胺、100单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的试验培养基。平皿在潮湿(7.5％CO2∶95％空气)的培养器中37℃下培养过夜。
经测试化合物溶解到DMSO中以形成10mM贮存溶液。用上述DMEM培养基稀释试样量的贮存溶液并加入到适当的孔中。进行连续稀释以产生测试浓度的范围。每个平皿都包括没有加入测试化合物的对照孔。平皿在潮湿(7.5％CO2∶95％空气)的培养器中37℃下培养过夜。
在包含0.5％FCS的DMEM培养基中以1∶100的系数稀释BrdU标记试剂(Boehringer Mannheim Catalogue No.647229)，加入试样量(20μl)到每个孔中以产生10μM的终浓度)。平皿37℃下培养2小时。轻轻倒出培养基。加入变性溶液(FixDenat solution，BoehringerMannheim Catalogue No.647229；50μl)到每个孔中，平皿在室温下置于平皿摇晃器上45分钟。轻轻倒出上清液，用PBS洗孔(每孔200μl)。在包含1％BSA和0.025％干脱脂乳(Marvel(注册商标)，PremierBeverages，Stafford，GB)的PBS中以1∶100的系数稀释抗-BrdU-过氧化物酶溶液(Boehringer Mannheim Catalogue No.647229)，加入试样量(100μl)的获得的溶液到每个孔中。平皿在室温下置于平皿摇晃器上90分钟。用PBS(x5)洗孔以保证除去未结合的抗体共轭物。吸干平皿，向每孔中加入四甲基对二氨基联苯(Boehringer MannheimCatalogue No.647229；100μl)。平皿在平皿摇晃器上轻轻的摇动，在10到20分钟的时间中逐步显示出颜色。在690nm测量孔的吸光率。测定在每个测试化合物(或测试化合物的组合)在浓度范围中对细胞增殖的抑制程度，导出抗增殖的IC50值。
(h)体外微滴迁移试验
该试验测定测试化合物(或测试化合物的组合)抑制粘着的哺乳动物细胞系，如人肿瘤细胞系A549迁移的能力。
水浴加热包含10％FCS、1％L-谷酰胺和0.3％琼脂糖(DifcoCatalogue No.0142-01)的RPMI培养基(Sigma)到37℃。高压灭菌贮存的2％琼脂水溶液，42℃保存。即将使用前将试样量(1.5ml)琼脂溶液加入到RPMI培养基(10ml)中。以2×107细胞/ml的浓度将A549细胞(编号No.ATCC CCL185)悬浮于培养基中，保持在37℃的温度下。
用吸移管将小滴(2μl)细胞/琼脂糖混合物转移到许多96孔，平底的未用组织培养物处理的微量平皿(Bibby Sterilin Catalogue No.642000)的每个孔的中心。平皿暂时置于冰上以加速含琼脂糖小滴的凝胶化。冷至4℃的试样量(90μl)的培养基被转移到每个孔中，注意不要扰乱微滴。使用上述的RPMI培养基从DMSO中10mM贮存溶液稀释测试化合物。转移试样量(10μl)稀释的测试化合物到孔中，再次注意不要扰乱微滴。平皿在潮湿(7.5％CO2∶95％空气)的培养器中37℃下培养48小时。
直观评估迁移，测量回到琼脂小滴边缘的迁移距离。通过标绘与测试化合物浓度成对照的平均迁移测量值获得迁移抑制IC50。
(i)体内异种移植物生长试验
这个试验测定本发明的组合产品抑制生长为无胸腺裸鼠中肿瘤的人和/或小鼠肿瘤生长的能力。适合用于注射的癌细胞包括人MCF7乳腺癌细胞(可获自American Type Culture Collection，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209；Cat.No.HTB-22、c-Src转染小鼠3T3成纤维癌细胞(通过Shalloway等人，Cell，1987，49，65-73所述的类似的方法用人c-Src的活化突变体(Y530F)转染)、人LoVo结肠直肠癌细胞(可获自European Collection of Cell Cultures，ECACC，CAMR，Salisbury，Wiltshire，SP40JG，UK；Cat.No.CCL229)、人CaLu-6肺癌细胞(ATCC Cat.No.HTB-56)和人A549NSCLC癌症细胞(ATCC Cat.No.CCL185)。
在0.1ml的基质胶(Beckton Dickinson Catalogue No.40234)和Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM；Gibco Catalogue No21090-022)的1∶1混合物中的总共大约1×106个人类癌细胞被皮下注射到每个测试小鼠的侧腹，让所产生的肿瘤生长约10天。挑选动物以获得平均肿瘤体积大致同等的对照和治疗组。将每个组合产品制备为1％聚山梨醇酯中的球磨悬浮液-80载体(以适当的测试剂量每10g体重0.1ml)，每日口服一次从第10天开始进行约28天的时间。每周使用卡尺测量两次肿瘤大小，计算理论体积。评估对肿瘤生长的效果。
通常，在一个或多个上述试验中当单独使用时Src激酶抑制剂AZD0530所具有的活性可以在下列浓度或剂量显示：-
试验(a)：-在例如0.1-5μM范围中的IC50；
试验(b)：-在例如0.1-1μM范围中的IC50；
试验(d)：-对大约0.1μM的“Tam-R”细胞IC50；
试验(e)：-对大约0.1μM的“Tam-R”细胞IC50；
试验(f)：-在例如0.1-1μM范围中的IC50；
试验(g)：-在例如0.1-5μM范围中有活性；
试验(h)：-在例如0.1-5μM范围中有活性；
试验(i)：-activity in the range，for example，1-200mg/kg/day.
通常，当Src激酶抑制剂AZD0530在一个或多个上述试验中与抗雌激素和/或EGFR TKI联合使用时，可以显示超过单独AZD0530所示的增加的活性。可选的，在一个或多个上述试验中当与抗雌激素和/或EGFR TKI联合使用时Src激酶抑制剂AZD0530所具有的活性可以在更低的浓度或剂量显示。
例如，当AZD0530(0.1μM)和ZD1839(1μM)的组合被用于“Tam-R”细胞，可以显示下列活性：-
试验(d)：-大约IC70效果；
试验(e)：-大约IC70效果；
并且当AZD0530(1μM)和ZD1839(1μM)的组合被用于“Tam-R”细胞，可以显示下列活性：-
试验(d)：-大约IC85效果；
试验(e)：-大约IC70效果。

Claims (5)

1.适合用于协同治疗癌症的组合物，其包括EGFR TKI N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺或其药学可接受的盐，和Src激酶抑制剂4-(6-氯-2，3-亚甲二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基氧基喹唑啉或其药学可接受的盐。
2.适合用于协同治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1所述的组合物与药学可接受的赋形剂或载体。
3.权利要求2所述的药物组合物，其包括，包含EGFR TKI N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺或其药学可接受的盐和药学可接受的赋形剂或载体的第一组合物，以及包含Src激酶抑制剂4-(6-氯-2，3-亚甲二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基氧基喹唑啉或其药学可接受的盐和药学可接受的赋形剂或载体的第二组合物。
4.权利要求1所述组合物在制备用于给药温血动物以协同治疗癌症的药物中的应用。
5.权利要求1所述组合物在制备用于给药温血动物以治疗EGFRTKI抗性癌症的药物中的应用。
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