CN1955298A - 水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10的新用途。其目的是提供水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10在抑制基因沉默中的应用。具体来讲，应用水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10抑制植物中目的基因沉默的方法，是将编码水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10的基因S10导入植物组织或细胞，得到目的基因获得表达的植株。实验证明水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10均能够显著提高转基因植株中GUS基因的表达量和表达持续时间，与已鉴定的基因沉默抑制因子Cmv2b和Tav2b具有相同的提高基因瞬时、稳定表达量的功能，是一种新的基因沉默抑制因子，从而为利用植物材料快速、大量表达异源蛋白提供了有效的技术路线。本发明具有较高的实际应用价值。

Description

水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10的新用途

技术领域

本发明涉及蛋白的新用途，特别是涉及一个水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10在抑制基因沉默中的应用。

背景技术

基因沉默现象普遍存在于动、植物体中。现有的转录后基因沉默的模型中，沉默基因被降解的途径主要有PTGS、VIGS等。现有的PTGS模型认为系统沉默的产生是由于在引发基因沉默的区域产生系统基因沉默信号，该信号具有序列特异性，并且能够经植物的胞间连丝和微管系统传播到植株的各部分。现在还认为双链RNA的产生是引发PTGS的必要条件。并且认为系统基因沉默信号的产生位点在PTGS的起始阶段，即形成dsRNA之前(11.Hamilton，A.，Voinnet，O.，Chappell，L.，and D.C.Baulcombe.2002.Two classes of short interfering RNA in RNA silencing.EMBOJ.17：4671-4679；Mallory，A.C.，Mlotshwa，S.，Bowman，L.H.，Vance，V.B.2003.The capacity of transgenic tobacco to send a systemic RNA silencingsignal depends on the nature of the inducing transgene locus.Plant J.35，82-92；Susi，P.，M.Hohkuri，T.Wahlroos，and N.，J.，Kilby.2004.Characteristics of RNA silencing in plants：similarities and differencesacross kingdoms.Plant Mol.Bil.54：157-174；Voinnet，O.，Baulcombe，D.C.1997.Systemic signalling in gene silencing.Nature 389，553.Hamilton，A.，Voinnet，O.，Chappell，L.，Baulcombe，D.，2002.Two classes of shortinterfering RNA in RNA silencing.EMBO J.21，4671-4679；Voinnet，O.，Lederer，C.and Baulcombe，D.C.2000.A viral movement protein prevents spreadof the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.Cell 103：157-167.)。被沉默基因的mRNA通过PTGS途径被降解成21-25nt的siRNA。通过检测siRNA的存在可确定PTGS的产生，因而siRNA又被称为PTGS的特征分子(Bernstein，E.，A.A.Caudy，S.M.Hammond，and G.J.Hannon.2001b.Role for a bidentateribonuclease in the initiation step of RNA interference.Nature 409：363-366；Hammond，S.M.，E.Bernstein，D.Beach，and G.J.Hannon.2000.An RNA-directednuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.Nature 404：293-296；Tuschl，T.，P.D.Zamore，R.Lehmann，D.P.Bartel，and P.A.Sharp.1999.Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA invitro.Genes Dev.13：3191-3197；Zamore，P.D.，T.Tuschl，P.A.Sharp，and D.P.Bartel.2000.RNAi：double-stranded RNA directs the ATP-dependentcleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell 101：25-33.)。

用二种不同的病毒侵染植物常导致病毒症状的加重，这种现象称为病毒的协同效应(synergetic effect)(Pruss，G.，X.Ge，X.M.Shi，J.C.Carrington，and V.B.Vance.1997.Synergism：the potyviral genome encodes a broad-rangepathogenicity enhancer that transactivates replication of heterologousviruses.Plant Cell 9：859-868.；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signalin Nicotiana benthamiana.Cell 103：157-167.)。现已知产生这种现象的机制在于二种病毒中的基因沉默抑制因子功能的叠加或互补，导致对VIGS抑制作用的增强，从而使病毒的复制、侵染等活性得以增强(Ding，S.W.2000.RNA silencing.Curr.Opin.Biotechnol.11：152-156；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signalin Nicotiana benthamiana.Cell 103：157-167.Waterhouse，P.M.，and C.A.Helliwell.2003.Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing.Nature4：29-38.)。

番茄不孕病毒2b蛋白(Tomato aspermy virus，Tav2b)、黄瓜花叶病毒2b蛋白(Cucumber mosaic virus 2b，Cmv2b)为已经报道的基因沉默抑制因子，具有抑制系统基因沉默的功能(Brigneti，G.，O.Voinnet，W.X.Li，L.H.Ji，S.W.Ding，and D.C.Baulcombe.1998.Viral pathogenicity determinants aresuppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana.EMBO J.17：6739-6746；Voinnet，O.2005.Induction and suppression of RNAsilencing：insights from viral infections.Nature 6：206-220.)。

基因沉默抑制因子对可移动的系统基因沉默信号的作用主要分为二种：一种是使系统基因沉默的信号不能产生；另一类是阻断沉默信号的传播途径(Brigneti，G.，O.Voinnet，W.X.Li，L.H.Ji，S.W.Ding，and D.C.Baulcombe.1998.Viralpathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing inNicotiana benthamiana.EMBO.J.17：6739-6746；Guo，H.S.，and S.W.Ding.2002.A viral protein inhibits the long range signaling activity of the genesilencing signal.EMBO J.21：398-407；Voinnet，O.，C.Lederer，and D.C.Baulcombe.2000.A viral movement protein prevents spread of the gene silencingsignal in Nicotiana benthamiana.Cell 103：157-167.)。

水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus，RDV)的基因组由12条双链RNA组成，将此12个基因分别命名为S1-S10，编码12个非结构蛋白(Pns1-Pns10)(Xu，H.，Y.Li，Z.J.Mao，Z.Wu，L.Qu，C.An，.X.Ming，J.Schiemann，R.Casper，and Z.L.Chen.1998.Rice dwarf phytovirus segment sll encodes a nucleic acidbinding protein.Virology 240：267-272；Zhang，F.，Y.Li，Y.F.Liu，C.C.An，and Z.L.Chen.1997.Molecular cloning，sequencing，and functionalanalysis and expression in E.coli of major core protein gene(S3)of ricedwarf virus Chinese isolate.Acta Virol.141：161-168；Zheng，H.H.，L.Yu，C.H.Wei，D.W.Hu，Y.P.Shen，Z.L.Chen，and Y.Li.2000.Assemblyof double-shelled，virus-like particles in transgenic rice plants expressingtwo major structural proteins of Rice dwarf virus.J Virol.74：9808-9810；Nobuhiro Suzuki.1995.Molecular analysis of the rice dwarf virus genome.VIROLOGY，6：pp 89-95)。

发明内容

本发明发明人的研究证实，水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10可以抑制植物中基因沉默过程的产生。

具体来讲，应用水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10抑制植物中目的基因沉默的方法，是将编码水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10的基因S10导入植物组织或细胞，S10表达后，抑制基因沉默过程的产生，从而得到目的基因获得表达的植株。

所述水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S10可通过含有所述水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S10的植物表达载体导入植物组织或细胞；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体，如pE3、pWEIMING101(物理图谱见图16、图17)等。

使用水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S10构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S10的植物表达载体可通过使用渗透注射技术、农杆菌介导、Ti质粒、植物病毒载体等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主可包括双子叶和单子叶植物，如烟草、拟南芥或水稻等。

实验证明水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10均能够显著提高植株中瞬时GUS基因的表达量和表达持续时间，与已鉴定的基因沉默抑制因子Cmv2b和Tav2b具有相同的提高基因瞬时表达量的功能，同时Pns10能够提高转基因GFP的表达量，是一种新的基因沉默抑制因子，从而为利用植物材料快速、大量表达异源蛋白提供了有效的技术路线。本发明具有较高的实际应用价值。

附图说明

图1为渗透注射后6天转基因烟草叶片绿色荧光蛋白的观察结果

图2为Northern杂交检测渗透注射后6天转基因烟草叶片内GFP基因转录情况和由GFP基因的mRNA降解产生的siRNA的积累情况的结果

图3为Western Blott检测转基因烟草内S10蛋白表达情况的结果

图4为通过观察经渗透注射的转基因烟草系统叶GFP的荧光发光情况检测Pns10作为基因沉默抑制因子对系统基因沉默的抑制作用的结果

图5A为检测S10与GFP分离注射后对系统基因沉默的影响的实验结果

图5B为Northern杂交检测经渗透注射的转基因烟草系统叶GFP的转录情况检测Pns10作为基因沉默抑制因子对系统基因沉默的抑制作用的结果。

图6为GFP基因双链RNA与S10基因瞬时共表达检测Pns10作为基因沉默抑制因子对由双链RNA引起的局部和系统基因沉默的抑制作用的结果

图7为Northern杂交检测Pns10作为基因沉默抑制因子对由双链RNA引起的局部和系统基因沉默的抑制作用的结果

图8为(35S-ssGFP或35S-dsGFP)与RDV S10或Tav2b四种组合空间分离渗透注射方式的示意图

图9为GUS组织化学染色观察经渗透注射农杆菌组合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的转基因烟草叶片中GUS基因表达情况的结果

图10为经渗透注射农杆菌组合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的转基因烟草叶片中GUS活性的荧光检测结果

图11为经渗透注射农杆菌35S-S10、35S-Tav2b的转基因烟草叶片中GFP活性的绿色荧光的观察结果

图12为经渗透注射农杆菌35S-S10、35S-Tav2b的转基因烟草叶片中GFP活性的Northern杂交检测结果

图13为分别含S10及其突变体基因的PVX病毒载体pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染烟草第9和第20天后注射叶片的染病情况

图14为分别含S10及其突变体基因的PVX病毒载体pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染烟草第20天后系统叶片的染病情况

图15为分别含S10及其突变体基因的PVX病毒载体pGR107-S10和pGR107-ΔS10侵染烟草第9、20天后叶片中PVX基因组的mRNA稳定态累积量的Northern杂交检测结果

图16为质粒pE3的物理图谱

图17为质粒pWEIMING101的物理图谱

图18为载体p35S-ssGFP的构建流程图

图19为pCAMBIA1300的物理图谱

图20为pGR107病毒载体的部分物理图谱

图21为质粒Jawohl8 RNAi的物理图谱

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生工合成。

渗透注射菌悬液的制备：用渗透注射缓冲液重悬菌体至浓度为OD₆₀₀＝1。室温下放置3小时以上。如为混合注射，则各菌按相等浓度、等量混合。

渗透注射缓冲液的组成为：高压灭菌蒸馏中含：MES 10mM，乙酰丁香酮(AS)150μM，MgCl₂ 10mM。

渗透注射方法：在植株叶片上用一次性注射器针头打一小孔。吸有农杆菌的注射器去针头，并对准、抵住叶片小孔处，另一只手的食指在叶片另一面抵住小孔，轻推注射器使液体缓慢注射入叶片内。

实施例1、编码水稻矮缩病毒非结构蛋白中具有抑制基因沉默作用蛋白的基因S10的筛选及检测

一、从水稻矮缩病毒(RDV)的基因组中筛选编码具有抑制基因沉默作用蛋白的基因

1、水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S1-S12的克隆

根据水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S1-S12的序列(GenBank登录号分别为：NC_003773、AY847464、NC_003772、NC_003761、NC_003762、NC_003763、AY305383、D00536、NC_003765、D10221、NC_003767、NC_003768)设计引物进行PCR扩增，引物序列如下：

扩增S1的引物：

Ps1F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGGATCTTGCGAGGTCGGA-3’

Ps1R(反向引物)：5’-GCGAATTCTCACATTTGCTCGTCGCTCT-3’；

扩增S2的引物：

Ps2F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGGCTTATCCTAATGACGT-3’

Ps2R(反向引物)：5’-GCGAATTCTCACAATGCATCATAGATAG-3’；

扩增S3的引物：

Ps3F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGGACAGTACCGGCCGAGC-3’

Ps3R(反向引物)：5’-GCGAATTCTCACAGAGGCGGCTGATCTC-3’；

扩增S4的引物：

Ps4F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGAACCAATCTCGAAGCTT-3’

Ps4R(反向引物)：5’-GCGAATTCTTACTTTGACAGCTTAGAAG-3’；

扩增S5的引物：

Ps5F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGTCGAACCCGGACTATTG-3’

Ps5R(反向引物)：5’-GCGAATTCTCAGATTTTGAATACCAAAT-3’；

扩增S6的引物：

Ps6F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGGACACAGAAACTCTTTG-3’

Ps6R(反向引物)：5’-GCGAATTCTTATTTGTACACGGTAATAG-3’；

扩增S7的引物：

Ps7F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGTCTGCGATTGTAGGCCT-3’

Ps7R(反向引物)：5’-GCGAATTCTCATAAAGTTGACAACTTTT-3’；

扩增S8的引物：

Ps8F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGTCACGCCAGATGTGGTT-3’

Ps8R(反向引物)：5’-GCGAATTCGTATGCGCACCAGCAGATTC-3’；

扩增S9的引物：

Ps9F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGGGTAAGCTCCAAGATGG-3’

Ps9R(反向引物)：5’-GCGAATTCTCAAACTGAGGGTGCGAGTC-3’；

扩增S10的引物：

Ps10F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGGAAGTAGACACTGCTA-3’

Ps10R(反向引物)：5’-TTAGGAACCGCCGCCTTTAAGAGCA-3’；

扩增S11的引物：

Ps11F(正向引物)：5’-AGAGATCTGCGAATTCATGAGTGGAACA-3’

Ps11R(反向引物)：5’-TTAGGAACTTAGGAACTTACTTACGCTT-3’；

扩增S12的引物：

Ps12F(正向引物)：5’-AGAGATCTATGTTCAAGAGTGGGTCCGG-3’

Ps12R(反向引物)：5’-TTAGGAACTCACCGTTCAAGAGAAAAGG-3’

以水稻矮缩病毒的基因组RNA为模板，分别在上述12对引物的引导下进行RT-PCR扩增，50ul PCR反应体系为：dNTP(2.5mM)2.5ul，10×PCR缓冲液5ul，模板1ul，Taq酶+pfu酶(3U/ul)：2ul+0.5ul，H₂O 39ul。PCR反应条件为：94℃ 5min，50-55℃ 45sec，72℃1-3min，72℃10min(反应条件依各被扩增基因的长度和各自引物碱基组成的不同而不同)。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增得到了大小分别为4422bp、3511bp、3195bp、2218bp、2449bp、1579bp、1559bp、1424bp、1224bp、1321bp、1036bp和1066bp的片段，将上述扩增片段回收并经纯化后分别转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，进行测序，测序结果表明获得了序列正确的水稻矮缩病毒12个非结构蛋白基因S1-S12。

2、载体构建

1)构建含有花椰菜花叶病毒的35S启动子和水稻矮缩病毒非结构蛋白基因的载体

将步骤1克隆的12个水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S1-S12用限制性内切酶BglII和EcoRI酶切后，分别与经相同酶双酶切的载体pE3连接，得到含有花椰菜花叶病毒的35S启动子和水稻矮缩病毒非结构蛋白基因的重组载体，分别命名为p35S-S1-p35S-S12。

2)构建含有花椰菜花叶病毒的35S启动子和S10提前终止突变体基因的载体

S10翻译提前终止突变体片断是将其读码框的第二位的谷氨酸(GAA)替换成终止密码TAA。该突变位点是通过设计5’端引物而引入的。方法是：在引物5’-GGGGTACCCCAACATGTAAGTAGACACTGC-3’(黑斜体碱基为终止密码)和5’-GCTCTAGAGCTTAAGAACTGCCGCCTTTGA-3’的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃5分钟，55℃40秒，72℃1分钟30秒，共30个循环，最后72℃10分钟。将PCR产物和植物表达载体pWEIMING101经Kpn I和Xba I酶切后，连接、重组得到S10提前终止突变克隆载体，命名为p35S-S10stop。

3)构建含有花椰菜花叶病毒的35S启动子和单链绿色荧光蛋白(GFP)基因的载体。

将包含GFP基因的克隆载体pRTL2-GFP(物理图谱见图18)经Hind III酶切后得到GFP基因片断，然后将GFP基因片断克隆到经同样酶酶切的载体pWEIMING101中，得到包含GFP基因的植物表达载体，命名为p35S-ssGFP，构建流程见图18。

4)构建含有花椰菜花叶病毒的35S启动子和番茄不孕病毒(Tomato aspermycucumovirus，Tav)编码的基因沉默抑制因子Tav2b基因的载体

将番茄不孕病毒(Tomato aspermy cucumovirus，Tav)编码的基因沉默抑制因子Tav2b基因克隆入载体pCAMBIA1300(物理图谱见图19)中，得到的Tav2b基因的植物表达载体，命名为pCAMBIA1300-T2b。

5)构建分别含有S10、S10缺失和移码突变基因和S10 25K缺失突变基因的PVX载体

以水稻矮缩病毒的基因组RNA为模板，在引物Ps10F(引物序列为5’-AGATCGATATGGAAGTAGACACTGCTA-3’)和Ps10R(引物序列为5’-AGGTCGACTTAGGAACCGCCGCCTTTAA-3’)的引导下进行PCR扩增，得到含Cla I和Sal I识别位点的S10基因。PCR反应条件为：先94℃，5分钟；55℃，40秒；72℃，1分钟30秒，共30个循环，然后72℃ 10分钟。将PCR产物和pGR107(部分物理图谱见图20，其中LB、RB分别表示整合到植物基因组中的左、右边界，RdRP代表病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶，25K、12K、8K和CP分别代表病毒编码的25K、12K、8K和外壳蛋白，MCS代表多克隆位点，下方箭头所示gRNA、sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3分别代表病毒转录产物：基因组、亚基因组1、亚基因组2和亚基因组3)经Cla I和Sal I酶切后，经过连接、转化和在含50ug/mL卡那霉素的LB抗性培养基上筛选阳性克隆，提质粒，将质粒载体命名为pGR107-S10。含有S10缺失和移码突变的克隆载体pGR107-ΔS10的构建方法为：将pGR107-S10载体用Csp45 I酶切，用T4 DNApolymerase补平，再经连接得到。含有PVX p25缺失突变克隆pGR107-Δ25K-S10是用pGR107-S10经Bsu36I酶切，DNA聚合酶补平并连接后得到，该25K缺失突变基因保留3’端的75个核苷酸，将该质粒命名为PVXΔ25K-S10。

3、转化农杆菌

将步骤2构建的载体p35S-S1-p35S-S12、p35S-S10stop、p35S-ssGFP、pCAMBIA1300-T2b和PVXΔ25K-S10分别转化农杆菌EHA105，筛选转化子，将转化有上述载体的阳性克隆分别命名为35S-S1-35S-S12、35S-S10stop、35S-ssGFP、35S-Tav2b和PVX-S10。

4、利用GFP的瞬时表达结果从水稻矮缩病毒的基因组中筛选具有抑制基因沉默作用的基因

采用渗透注射技术，将水稻矮缩病毒12个非结构蛋白基因的转化农杆菌35S-S1至35S-S12与单链GFP基因的转化菌35S-ssGFP等浓度(OD₆₀₀＝1)、等体积混合，共注射转有GFP基因的烟草(Nicotiana benthamiana)16c株系，同时以35S-Tav2b和35S-ssGFP共注射植株作为正对照，以35S-S10stop和35S-ssGFP共注射植株作为负对照，以35S-ssGFP单独注射植株为参照。注射后2-3天，在长波长的紫外灯下观察上述转基因植株内GFP基因的瞬时表达情况。正常情况下，GFP应呈现较亮的绿色荧光，而野生型的烟草在紫外灯下呈红色(由于叶绿素在紫外灯下呈红色的缘故)，且转有GFP基因的烟草(Nicotiana benthamiana)16c在GFP基因沉默的情况下也呈红色。结果35S-ssGFP单独注射和与上述其它转化菌同时注射的叶片，由于外源和内源GFP基因同时表达的缘故，注射区域在紫外灯下呈现亮的绿色荧光。在共注射组合35S-S10+35S-ssGFP、35S-Tav2b+35S-ssGFP中，注射区域的荧光可一直持续保持发光达7天以上，并且前一种组合(35S-S10+35S-ssGFP)注射区的荧光强度比后一种的(35S-Tav2b+35S-ssGFP)较弱。共注射PVXΔ25K-S10+35S-ssGFP的结果与上述相同。而35S-Tav2b+35S-ssGFP共注射区的荧光可一直持续发光直到注射区的叶片组织死亡为止。35S-ssGFP单独或与除35S-S10以外的其它转化有花椰菜花叶病毒的35S启动子和水稻矮缩病毒非结构蛋白基因的农杆菌转化菌以及与35S-S10stop共注射的叶片区域从第3天开始，绿色荧光蛋白的荧光亮度逐渐减弱，至第6-7天则完全变红(如图1所示，1、2、3、4分别表示注射有下述组合的GFP转基因烟草叶片：35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+PVXΔ25K-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP+35S-S10stop；5表示经35S-ssGFP单独注射的叶片)。与经文献报道的结果相同，GFP绿色荧光的丢失表明GFP基因的表达被沉默(Anandalakshmi et al.，1998；Brignetiet al.，1998；Hamilton et al.2002；Voinnet et al.，1997)。GFP荧光的观察结果表明，S10的表达与番茄不孕病毒(Tomato aspermy cucumovirus，Tav)编码的基因沉默抑制因子Tav2b一样，具有抑制基因沉默(本实施例为GFP基因)的功能。而RDV的其它11个非结构蛋白基因表达后则没有此功能。

二、Northern杂交检测转基因烟草内GFP基因的表达水平

进一步用Northern杂交的方法鉴定水稻矮缩病毒12个非结构蛋白基因中负责编码基因沉默抑制因子的基因。对步骤一获得的各种注射渗透组合的叶片材料在第6天取样，剪下注射区域，提取RNA后进行Northern杂交验证，所用探针为地高辛标记的GFP基因，结果如图2所示(泳道1-5分别表示经35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP+PVXΔ25K-S10、35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-S10stop组合注射和经35S-ssGFP单独注射的叶片；图中底部rRNA为溴化乙锭染色的18S RNA，作为相等上样量的标示)，共注射35S-ssGFP+35S-S10和35S-ssGFP+35S-Tav2b的叶片的稳定态mRNA的表达水平在第6天仍有大量的积累，而单独注射35S-ssGFP或35S-GFP+35S-S10stop注射组合的转基因植株叶片组织中的mRNA则基本上检测不到，表明：1)外源引入的GFP基因的大量表达可引起内、外源GFP基因的沉默，即在第6天时35S-ssGFP单独注射或与35S-S10stop共注射导致GFP基因不表达，其mRNA被降解；2)与对照相比，35S-ssGFP+35S-S10共注射叶片GFP基因的mRNA仍有大量积累，与步骤一中GFP荧光仍然保持的观察结果一致，证明RDV S10与Tav2b一样，具有抑制由ssGFP引起的基因沉默的功能，进一步从分子水平上证明S10是RDV的基因沉默抑制因子。

三、Northern杂交检测转基因烟草内siRNA的积累情况

将步骤一获得的的各种注射渗透组合的叶片材料在第6天取样，剪下注射区域，提取小RNA样品，通过变性15％PAGE胶分离，以地高辛标记的GFP基因为探针进行Northern杂交，检测由GFP基因的mRNA降解产生的siRNA的积累情况，结果如图2所示，35S-ssGFP单独注射或与S10stop共注射的叶片内siRNA大量积累。与对照相比，共注射组合35S-ssGFP+S10和35S-ssGFP+TAV2b叶片中的siRNA的积累量则显著减少，表明负对照(35S-ssGFP单独注射或与S10stop共注射)组的植株在注射后第6天GFP基因的mRNA的消失的确是由于其被特异性地降解成siRNA，而共注射组合35S-ssGFP+S10、35S-ssGFP+Tav2b样品中GFP基因的mRNA大量累积，且siRNA相对少量累积，表明GFP基因的mRNA经PTGS机制的降解过程被大部分抑制，即RDV S10与Tav2b一样，具有抑制GFP基因转录后基因沉默的功能。此外，35S-S10和35S-TAV2b二种与35S-GFP共注射的样品中均有少量21nt、25nt的siRNA产生，说明RDV S10与Tav2b一样，均不能完全阻断或去除siRNA的产生(Guo，H.S.and Ding S.-W.2002.A viral protein inhibitsthe long range signaling activity of the gene silencing signal.EMBO J.21：398-407.；Li，H.W.，A.P.Lucy，H.S.Guo，W.X.Li，L.H.Ji，S.M.Wong，S.W.Ding.1999.Strong host resistance targeted against a viralsuppressor of the plant gene silencing defence mechanism.EMBO J18：2683-2691.)。

四、Western Blott检测转基因烟草内S10蛋白的表达情况

1、S10在农杆菌中的克隆

将实施例1获得的p35S-S10用Bgl II和EcoR I双酶切后，切胶回收S10，将其克隆到经同样酶双酶切的植物表达载体pE3中，经连接得到含有S10的重组载体，命名为pE3-S10。在含有50ug/mL的利福平和50ug/mL的壮观霉素的3-5mL LB液体培养基中接种农杆菌EHA105，在28℃、200rpm下振荡培养12-24小时至菌浓度OD₆₀₀＝1-2，再按1∶1000扩大培养至菌浓度OD₆₀₀＝1-2，扩大培养基组成：LB液体培养中含：MES 10mM，AS20μM，50ug/mL的利福平和50ug/ml的壮观霉素。培养结束后，2000g离心5分钟，去除上清。

2、S10在大烟草中的表达

将步骤一构建的含S10的重组载体pE3-S10转化农杆菌AGL-1，挑选阳性克隆，渗透注射入烟草叶片中(Nicotiana benthamiana)16c株系，使S10在烟草内瞬时表达。

3、Western Blott检测转基因烟草内Pns10的表达情况

用Western Blott法检测步骤一获得的35S-ssGFP+PVX-S10、35S-ssGFP+35S-S10stop共注射植株内S10编码蛋白Pns10的表达情况，以步骤1在大肠杆菌中表达的S10蛋白和步骤2转化有pE3-S10的植株内表达的Pns10为阳性对照，所用抗体为常规方法制备的Pns10抗体，结果如图3所示(泳道1-5分别表示：在大肠杆菌中表达的Pns10、瞬时表达pE3-S10的植株内的Pns10、35S-ssGFP+PVX-S10共注射植株内Pns10的表达情况、35S-ssGFP+S10stop共注射植株内Pns10的表达情况、空白对照)，表明S10的翻译提前终止突变体35S-S10stop没有抑制基因沉默的功能，该突变体不能翻译成完整的Pns10，与正常Pns10所具有的抑制基因沉默功能相比，RDV S10所具有的基因沉默抑制子的功能是其蛋白Pns10、而非其核酸的作用产生的。

实施例2、检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对系统基因沉默的抑制作用

一、通过观察GFP的荧光检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对系统基因沉默的抑制作用

以GFP基因为例检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对系统基因沉默的抑制作用。实施例1的试验结果表明Pns10具有抑制本叶(即叶片的渗透注射区)GFP基因沉默的功能。GFP转基因烟草Nicotiana benthamiana 16c株系经渗透注射35S-ssGFP、35S-ssGFP+35S-S10stop不但能诱导本叶的GFP基因沉默(图1中的4、5所示)，而且还能在2周以后引起上部系统叶以及最后全植株的GFP基因沉默(Voinnet，O.，and D.C.Baulcombe.1997.Systemic signalling in genesilencing.Nature 389：553.)。为了确定RDV Pns10作为基因沉默抑制因子是否对系统基因沉默具有抑制作用，观察经下述各种渗透注射组合的烟草植株GFP的表达情况，方法为在转GFP基因的烟草Nicotiana benthamiana 16c株系处于4叶期大小的时候，在植株的底部2片叶上分别注射各种农杆菌组合，6-7天后观察上部未注射叶片(称为系统叶)的GFP表达情况，结果如图4所示(1-3分别表示经35S-ssGFP单独注射、35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b)，负对照组中的35S-ssGFP单独注射组的植株最早从注射后第6天开始在最上部的系统叶上即开始出现GFP基因的沉默现象，表现为在紫外灯下，先在主叶脉和次级叶脉处出现红色，继而扩展到整个叶片(注射2周后)乃至整个植株(注射15天后的观察结果见图4中的第1图)，大部分的负对照均出现GFP的系统沉默现象。共注射35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b的大部分植株均未发现GFP系统沉默上传的现象(见图4中的第2、3图)。

二、Northern杂交检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对系统基因沉默的抑制作用

用与实施例1相同的方法，通过检测步骤一获得的转基因烟草内GFP基因的表达水平和由GFP基因的mRNA降解产生的siRNA的积累情况，检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对系统基因沉默的抑制作用，显微注射结果如图5A所示，Northern杂交检测结果如图5B所示(泳道1-5分别表示经35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b、35S-ssGFP(T)+35S-S10(B)、35S-ssGFP单独注射、35S-ssGFP(B)+35S-S10(T)渗透注射的叶片；B和T分别代表叶的基部(base)和顶部(tip)单独注射的叶片；图中底部rRNA为溴化乙锭染色的18S RNA，作为相等上样量的标示)，35S-ssGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-Tav2b和35S-ssGFP(T)+35S-S10(B)共注射植株的系统叶中GFP基因的mRNA含量丰富，由其降解的siRNA则检测不到(见泳道1-3)，负对照组(35S-ssGFP单独注射、35S-ssGFP(B)+35S-S10(T))的GFP基因的mRNA基本检测不到，而由其降解的siRNA则大量地累积(见泳道4-5))。与步骤一GFP绿色荧光观察结果相一致，进一步证明RDV S10对由ssGFP引起的系统沉默同样具有抑制作用。表明Pns10对GFP的系统基因沉默具有抑制作用，其作用机制可能阻断系统基因沉默信号的传播或使其失活。

实施例3、检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对由双链RNA引起的局部和系统基因沉默的抑制作用

实施例2的试验结果表明水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10对于由ssGFP引起的局部和系统的GFP基因沉默均有抑制作用。现有的PTGS模型认为系统沉默的产生是由于在引发基因沉默的区域产生系统基因沉默信号，该信号具有序列特异性，并且能够经植物的胞间连丝和微管系统传播到植株的各部分。现在还认为双链RNA的产生是引发PTGS的必要条件。并且认为系统基因沉默信号的产生位点在PTGS的起始阶段，即形成dsRNA之前。有鉴与此，用下述实验进一步分析RDV S10作用于PTGS途径中的具体步骤，从而更深入地阐明S10的作用机制。该实验所依据的原理是，在植物细胞中引入GFP基因的双链RNA(dsGFP)，按照PTGS作用模式，同样能够引发GFP的沉默，而且根据已有的报道，双链RNA比单链RNA是更强的引起基因沉默的诱导分子(Bernstein et al.，2001；Elbashir et al.，2001b；Fire et al.，1998；Tuschl et al.，1999；Voinnetet al.，1998；Winston et al.，2002)。ssRNA和dsRNA引起PTGS的区别在于：前者需要细胞的RdRP以合成双链，而后者不依赖于这一过程而直接形成dsRNA。如果S10与PTGS的作用位点在形成dsRNA的上游，则在S10与35S-dsRNA GFP共表达的情况下，推测S10不能够影响GFP的RNA沉默的产生。反之如果S10作用于形成dsRNA的下游，则无论由ssRNA还是dsRNA引起的GFP的RNA沉默均受到抑制。利用dsRNA与待鉴定的基因沉默抑制因子共表达，观察基因沉默是否受影响，可以确定该因子是作用于形成dsRNA的上游还是其下游，或是与dsRNA相结合。具体方法如下：

1、含有GFP基因反向重复序列的载体pJawohl8-GFP RNAi的构建及农杆菌转化子的获得

构建含反向重复序列GFP的植物表达载体pJawohl8-GFP RNAi的过程如下：GFP基因片断经PCR扩增获得，模板为克隆的GFP基因(GeneBank No.M62653)，引物序列为：5-CACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’和5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’。PCR反应条件为：94℃ 5分钟，52℃ 40秒，72℃ 1分钟15秒，共30个循环；然后72℃ 10分钟。用Invitrogen公司的“TOPO克隆技术”将PCR扩增的GFP基因先克隆到中间载体pTOPO中，反应条件为：PCR GFP片断(约100ng/μl)5.5μl，pENTR 2μl，Salt solution2.5μl，室温下放置1小时或适当延长反应时间，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上筛选阳性克隆，提质粒，命名为pENTR-GFP。然后将阳性克隆质粒再与载体pJawohl8 RNAi(物理图谱见图21及载体序列为GeneBankNo.AF408413)一起经LR重组反应，将二个GFP片断重组进载体pJawohl8 RNAi中，反应体系及反应条件为：5×LRreaction buffer 4μl，pENTR-GFP 10μl，pJawohl8 RNAi4μl，LR clonase Mix 2μl，室温下反应12-24小时，将产物转化大肠杆菌DH5α，将在含有50ug/mL氨卞青霉素的LB培养基上筛选阳性克隆，提质粒，得到含有GFP基因反向重复序列的质粒载体，命名为pJawohl8-GFP RNAi。该载体在转录后由于有同源配对序列将形成GFP基因的双链RNA，从而抑制GFP基因的表达。将pJawohl8-GFP RNAi电击转化农杆菌GV3101(其中包含质粒pMP90RK)，筛选阳性重组子，命名为35S-dsGFP。

2、GFP基因双链RNA与S10基因瞬时共表达检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对由双链RNA引起的局部和系统基因沉默的抑制作用

将35S-ssGFP、35S-dsGFP分别和35S-S10、35S-Tav2b混合后，分别渗透注射入GFP转基因烟草Nicotiana benthamiana 16c株系中，以35S-ssGFP+35S-dsGFP以及35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10stop混合菌注射植株作为负对照。其中各组合中加入单链、正义链GFP基因是为了便于观察GFP基因的表达及其沉默状况，因为35S-dsGFP不能表达GFP。在注射5天后在紫外灯下观察并拍照，结果如图6所示(1-4分别表示ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b注射组的叶片；5表示35S-S10+35S-dsGFP在植株底部叶片注射后15天系统叶片GFP沉默的情况)，混合注射ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10及35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop的叶片中GFP基因完全沉默。同时在注射后15天观察，系统叶也发生了GFP基因的沉默现象，表明S10对于由双链RNA引起的局部和系统基因沉默均没有抑制作用。而混合注射35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b的本叶在叶片注射区存活的情况下，GFP一直表达，表明Tav2b对于由双链引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用(图6中的第4图)。

3、Northern杂交检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对由双链RNA引起的局部和系统基因沉默的抑制作用

用与实施例1相同的方法，通过检测步骤2获得的转基因烟草内GFP基因的表达水平和由GFP基因的mRNA降解产生的siRNA的积累情况，检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对由双链RNA引起的局部和系统基因沉默的抑制作用，结果如图7所示(泳道1-4分别表示ssGFP+dsGFP、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-S10、35S-ssGFP+35S-dsGFP+S10stop、35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b注射组的叶片；泳道5表示35S-S10+35S-dsGFP在植株底部叶片注射后15天系统叶片GFP沉默的情况)，表明S10对于由双链RNA引起的局部和系统基因沉默均没有抑制作用(见泳道2)。但系统叶在注射35S-ssGFP+35S-dsGFP+35S-Tav2b 2周以后GFP沉默，表明Tav2b对于由双链RNA引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用(见泳道4)，而对系统沉默没有抑制作用(因与S10混合注射引起的结果相同，数据未显示)。Northern杂交检测结果与GFP荧光观察结果一致，进一步证明：1)RDV S10不能抑制由双链RNA产生的局部和系统GFP基因沉默。由此推测S10作用于PTGS途径中双链RNA产生的上游，即可能作用于细胞中的RdRP或其辅助因子。2)Tav2b对由双链引起的GFP局部基因沉默具有抑制作用，但对系统基因沉默则没有作用。暗示系统基因沉默信号的产生和传播路径可能具有以下二种性质：(1)系统基因沉默信号可能不止一种；(2)该信号的传播途径可能也不止一条。并且这种多信号组成或多信号传播途径依赖于引起基因沉默引发分子的不同(即单链或双链RNA)。这二种可能性或者同时存在，或者其中任何一种存在均导致所观察的结果。而Tav2b对不同形式的引发分子产生的不同结果则说明其可能只作用于其中的一种信号或阻断其中的一条传播途径。

实施例4、水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10在基因沉默信号传播途径中的表达对系统基因沉默影响的分析实验

上述实施例中的实验表明RDV S10具有抑制系统基因沉默信号产生的功能。已知基因沉默信号的传播过程实际上也是其不断扩增、放大的过程(Himber，C.，P.Dunoyer，G.Moissiard，C.Ritzenthaler，and O.Voinnet.2003.Transitivity-dependent and-independent cell-to-cell movement of RNAsilencing.The EMBO Journal 22：4523-4533.)，当RDV S10在基因沉默信号传播的途径中表达时，即在产生沉默信号的区域(称为信号的源，source)与接受信号区域之间表达，如果Pns10对基因沉默信号产生作用，则势必影响该信号的传播，并最终影响基因系统沉默的产生。参照Guo等描述的方法(Guo，H.S.and Ding S.-W.2002.A viral protein inhibits the long range signaling activity of the genesilencing signal.EMBO J.21：398-407.)中所进一步确定Pns10对系统基因沉默信号的作用方式，具体方法为将引起GFP沉默的引发分子(35S-ssGFP或35S-dsGFP)与RDV S10或Tav2b分别经渗透注射入同一叶片的不同部位(基部或顶部)或同一植株的的不同部位(上部叶片和下部叶片)，其空间分离渗透注射方式的示意图如图8所示(红色代表注射含基因沉默抑制因子的农杆菌区域，绿色代表注射含GFP基因的农杆菌区域)。含GFP基因沉默的引发分子(ssGFP或dsGFP)与基因沉默抑制因子(S10或Tav2b)的4种组合及其注射方式对GFP系统基因沉默影响的部分统计结果如表2所示。当S10或Tav2b在系统基因沉默信号传播的途径中表达时(即在叶基部或植株的第二片系统叶)，而系统沉默信号在叶顶部或第一片叶中由35S-ssGFP产生时，大部分植株中GFP基因的系统沉默不能产生(表2中的第8、12组合)。但在同样的注射方式下，当产生信号源为dsGFP时，几乎所有的植株均有系统基因沉默的产生(表2中的第10、14组合)。负对照中所有植株中的GFP基因也均产生系统基因沉默。用Tav2b所做的同样的实验所得结果与S10的实验结果一致(表2中未列出)。以上实验表明Pns10能够抑制由GFP单链、正义链引起的系统基因沉默信号的传播，从而使GFP系统基因沉默不能够建立。而对由GFP双链引起的系统基因沉默信号的传播和系统基因沉默的建立没有影响。

表2 各种组合农杆菌渗透注射引起的GFP系统基因沉默株数统计表

组号	农杆菌组合	注射株数	系统沉默株数	沉默百分比(沉默/未沉默)
					123456789101112131415	S10+ssGFPPVXΔ25K·S10+ssGFPTav2b+ssGFPS10stop+ssGFPssGFPS10+dsGFPdsGFPS10(B)+ssGFP(T)*S10(T)+ssGFP(B)S10(B)+dsGFP(T)S10(T)+dsGFP(B)S10(U)+ssGFP(L)**S10(L)+ssGFP(U)S10(U)+dsGFP(L)S10(L)+dsGFP(U)	402130364023211515108171398	2113338232111510811398	5％4.76％3.3％91.68％95％100％100％667％100％100％100％5.88％100％100％100％

*括号中的B和T分别指注射部位叶的基部(Base)和顶部(Tip)；**括号中的U和L分别指植株的上部叶(Upper)和下部叶(Lower)。

实施例5、水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10具有增强瞬时和永久基因表达的功能验证实验

一、检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10对瞬时表达GUS基因的影响

上述实施例中用渗透注射法在GFP转基因的烟草Nicotiana benthamiana 16c株系中进行的基因沉默抑制因子(S10、Tav2b)与GFP基因的瞬时表达实验结果表明Pns10抑制本叶GFP基因沉默的效率比Tav2b要弱，此结论是从注射叶片GFP绿色荧光的亮度和持续时间上得出的，即前者比后者的荧光亮度在注射后第6天要弱，并且持续的时间也比后者要短。用葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因作为诱导基因沉默的引发分子，观察瞬时表达GUS基因的条件下Pns10的作用情况，以进一步比较Pns10和Tav2b在抑制基因沉默效率上的差异，已知的基因沉默抑制因子Tav2b和Cmv2b分别被用作正对照，具体方法如下所示：

1、GUS组织化学染色观察经渗透注射农杆菌组合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的烟草叶片中GUS基因的表达情况

将农杆菌组合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b分别渗透注射GFP转基因的烟草Nicotiana benthamiana 16c株系中的烟草叶片，单独注射的35S-GUS作为负对照。渗透注射后5天的叶片取样，进行GUS组织化学染色，结果如图9所示(1-4分别表示35S-GUS单独注射组、35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Cmv2b、35S-GUS+35S-Tav2b混合注射组)，单独注射35S-GUS的叶片在注射后的第5天只有较少量的GUS活性可以检测到，表现为只能检测到痕量的蓝色反应底物。而在混合注射35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b和35S-GUS+35S-Cmv2b的叶片中，注射后5天的GUS活性仍然较强，表现为有大量的蓝色反应底物累积。表明S10与Tav2b和Cmv2b一样，在非转基因的、外源瞬时表达基因作为唯一的诱导PTGS引发分子的实验体系中同样具有抑制基因沉默的功能。

2、经渗透注射农杆菌组合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b、35S-GUS+35S-Cmv2b的烟草叶片中GUS活性的定量检测

用荧光分光光度法定量测定步骤1获得的3种基因沉默抑制因子与GUS基因共表达后第5天烟草叶片中GUS的相对活性，以进一步比较RDV Pns10、Tav2b和Cmv2b三者之间抑制GUS基因沉默效能方面的差异，35S-GUS单独注射叶片作为负对照。结果如图10所示，与负对照相比，Pns10、Cmv2b和Tav2b均能显著提高GUS的表达活性。但三者之间也存在差异，相对于负对照，三者与35S-GUS共注射叶片中的GUS相对活性分别约提高37.5倍、46倍和66.04倍，即Pns10使GUS相对活性提高的幅度最小，Cmv2b次之，Tav2b最强，与步骤1的GFP的绿色荧光观察结果基本一致。

二、检测水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10对瞬时表达GFP基因的影响

1、荧光观察经渗透注射农杆菌组合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b的烟草叶片中GFP基因的表达情况

上述实验结果均证明Pns10具有抑制基因沉默的功能，但这些实验均是以瞬时表达基因作为研究的对象。新近的研究表明除了已知的抗病毒等功能外，PTGS机制可能具有调节自然状态下基因的表达功能(Senda，M.，C.Masuta，S.Ohnishi，K.Goto，A.Kasai，T.Sano，Jin-Sung Hong，and S.MacFarlaned.2004.Patterning ofVirus-Infected Glycine max Seed Coat Is Associated with Suppression ofEndogenous Silencing of Chalcone Synthase Genes.The Plant Cell 16：807-818.；Tuteja，J.H.，S.J.Clough，W.C.Chan，and L.O.Vodkin.2004.Tissue-Specific Gene Silencing Mediated by a Naturally Occurring ChalconeSynthase Gene Cluster in Glycine max.The Plant Cell 16：819-835.)。受该研究及步骤一进行的Pns10对GUS基因瞬时表达调控的实验结果进行了以下实验，以检测Pns10是否对转基因的组成型表达的基因具有调控作用。具体方法为：将35S-S10和35S-Tav2b单独渗透注射入GFP转基因烟草N.benthamiana 16c的株系中。注射后3天观察转记忆植株叶片组织绿色荧光蛋白的荧光强度，以渗透注射空载体pE3和未转GFP基因的野生型烟草为对照，结果如图11所示(1-4分别表示为渗透注射空载体pE3、35S-Tav2b、35S-S10、未转GFP基因的野生型烟草)，与注射空载体的叶片相比，在35S-S10和35S-Tav2b的叶片注射区域GFP的绿色荧光明显增强。

2、Northern杂交检测经渗透注射农杆菌组合35S-GUS+35S-S10、35S-GUS+35S-Tav2b的烟草叶片中GFP基因的表达情况

用与实施例1相同的方法，检测步骤一获得的转基因烟草内GFP基因的表达水平的积累情况，水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns10作为基因沉默抑制因子对系统基因的沉默具有抑制作用，结果如图12所示(泳道1-4分别表示渗透注射空载体pE3、35S-Tav2b、未转GFP基因的野生型烟草渗透注射的叶片、35S-S10；图中底部rRNA为溴化乙锭染色的18S RNA，作为相等上样量的标示)，用GFP探针对以上叶片进行的Northern杂交实验结果表明瞬时表达S10和Tav2b组织中的GFP的mRNA累积量明显高于对照。这与GFP的绿色荧光观察结果相一致。但这些样品中的siRNA检测不到(结果未显示)。

上述实验实验结果表明：1)RDV Pns10在由瞬时表达基因(此处为GUS基因)作为单一诱导基因沉默的引发分子的条件下同样具有抑制基因沉默的功能，GUS基因的表达和抑制都是在没有内源基因存在的背景下产生。Pns10等抑制其沉默的功能也是在同一背景下产生。这与前述在转GFP烟草中所进行的实验是有差别的；2)三种用于检测的基因沉默抑制因子的作用效能存在差别，即Pns10的效能最小，Cmv2b次之，Tav2b最强；3)Pns10和Tav2b均能提高转基因植株的GFP(组成型表达)表达量。

实施例6、检测Pns10对病毒引起的基因沉默的抑制作用

一、含S10的病毒载体(PVX)侵染烟草及其病症观察

将实施例1构建的重组PVX载体pGR107-S10和pGR107-ΔS10转化含有质粒pJICSA_Rep的农杆菌GV3101中，挑选阳性克隆，将转化有pGR107-S10的重组子命名为35S-PVX-S10，将转化有pGR107-ΔS10的重组子命名为35S-PVX-ΔS10，将两者分别渗透注射于4-6叶期大的野生型烟草N.benthamiana最下部的二片叶，以转有PVX空载体pGR107的重组子为对照，观察植株的发病情况，第9和第20天的叶片观察结果如图13所示，三种注射叶片均未表现病毒病症，但三种注射植株的系统叶(即上部未注射的叶片)均表现不同程度的病毒症状。病症在最上部叶的出现最早可在注射后6天出现。渗透注射35S-PVX，35S-PVX-ΔS10植株系统叶上的病症较注射35S-PVX-S10上的要轻，前二者最开始感病叶片上的病症为：在主叶脉和次级叶脉上现出现褪绿病斑，继而扩展至全叶。但在注射2周后，随后新长出的大部分叶片的病症减轻或消失，即这些植株重又恢复健康状态。35S-PVX-S10感病植株的系统叶在2周以后观察病症较前二种的严重，表现为大部分系统叶没有出现恢复健康的现象，并且大部分系统叶片上均出现散在分布的坏死斑，注射后20天的系统叶如图14所示(1、健康的、未侵染病毒的叶片(对照)；2、PVX侵染的叶片；3、PVX-ΔS10侵染的叶片；4、PVX-S10侵染的叶片)。

二、侵染有重组PVX病毒载体pGR107-S10和pGR107-ΔS10的Northern杂交检测

为确定S10在异源病毒中的表达所引起的病症加重的机理，即验证是否与VIGS有关，现对步骤一的3种侵染植株的系统叶分别在注射后第9、20天剪下，提取RNA并分别以此为模板，用地高辛标记的PVX的CP(外壳蛋白)基因探针，以pGR107为模板经PCR扩增获得，引物序列为：正向引物：5’-ATGTCAGCACCAGCTAGCAC-3’；反向引物：5’-TTATGGTGGT GGTAGAGTGA-3’)，反应体系为：模板1μl，dNTP(其中A为地高辛标记)1μl，10×PCR缓冲液2μl，正、反向引物各1μl，Taq DNA聚合酶1μl，无菌水13μl。PCR反应条件与前述相同。PCR反应产物用蛋白酶K在56℃降解30分钟，再经酚、氯仿抽提后，溶于DEPC处理的水中。进行Northern杂交检测PVX基因组的mRNA稳定态的累积量，以健康的、未染病植株作为对照，结果如图15所示(gRNA、gRNA1-3分别指PVX转录的全长基因组、亚基因组1-3)，在注射后第9天的叶片中三种侵染植株叶片的PVX基因组mRNA均有大量累积，但在侵染后第20天，35S-PVX、35S-PVX-ΔS10侵染样品中的mRNA大部分被降解，而35S-PVX-S10的侵染样品中仍有大量mRNA累积。上述实验结果表明：1)在PVX载体上表达的S10对病毒在本叶的病症没有增强作用；2)Pns10对PVX系统侵染及其在系统叶上的病症具有增强作用，即与前述的Pns10主要抑制GFP系统基因沉默的作用相同，推断Pns10对VIGS的影响主要也是抑制VIGS的系统RNA沉默信号的产生。

                                序列表

<160>8

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

agagatctat ggatcttgcg aggtcgga                                             28

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gcgaattctc acatttgctc gtcgctct                                             28

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

agagatctat ggcttatcct aatgacgt                                             28

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gcgaattctc acaatgcatc atagatag                                             28

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

agagatctat ggacagtacc ggccgagc                                             28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gcgaattctc acagaggcgg ctgatctc                                              28

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

agagatctat gaaccaatct cgaagctt                                              28

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gcgaattctt actttgacag cttagaag                                              28

Claims (7)

1、水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10在抑制基因沉默中的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用是将编码水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10的基因S10导入植物组织或细胞，S10表达后，得到目的基因获得表达的植株。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S10通过含有所述水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S10的植物表达载体导入植物组织或细胞。

4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：用于构建所述植物表达载体的出发载体为pE3、pWEIMING101或pCAMBIA1300。

5、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述携带有水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S10的植物表达载体通过渗透注射技术、农杆菌介导、Ti质粒、Ri质粒或植物病毒载体转化植物细胞或组织。

6、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物宿主包括双子叶或单子叶植物。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物宿主为烟草、拟南芥或水稻。

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