New! View global litigation for patent families

CN1832956B - 编码IgE信号肽和/或IL-15的核酸序列与包含IgE信号肽和/或IL-15的组合物及其使用方法 - Google Patents

编码IgE信号肽和/或IL-15的核酸序列与包含IgE信号肽和/或IL-15的组合物及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1832956B
CN1832956B CN 200480022891 CN200480022891A CN1832956B CN 1832956 B CN1832956 B CN 1832956B CN 200480022891 CN200480022891 CN 200480022891 CN 200480022891 A CN200480022891 A CN 200480022891A CN 1832956 B CN1832956 B CN 1832956B
Authority
CN
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
signal
acid
methods
sequences
il
Prior art date
Application number
CN 200480022891
Other languages
English (en)
Other versions
CN1832956A (zh )
Inventor
D·B·维纳
M·库茨勒
A·K·楚
J·杨
J·D·博伊尔
Original Assignee
宾夕法尼亚州大学信托人
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54Interleukins [IL]
    • C07K14/5443IL-15
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53DNA (RNA) vaccination
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55522Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527Interleukins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/01Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Abstract

公开了融合蛋白和编码融合蛋白的核酸分子。公开了包含与IL-15蛋白序列连接的非IL-15信号肽的融合蛋白和包含与非IgE蛋白序列连接的IgE信号肽的融合蛋白。公开了包含所述核酸分子的载体以及包含所述载体的宿主细胞;还公开了编码融合蛋白的重组疫苗和减毒活病原体及其使用方法。公开了在给予IL-15和CD40L之后,在有或没有免疫原的情况下的免疫调节效应,也公开了用于传递所述蛋白的各种核酸分子及其组合物与所述组合物的使用方法。

Description

编码IgE信号肽和/或IL-15的核酸序列与包含IgE信号肽和/或IL-15的组合物及其使用方法

发明领域

[0001] 本发明涉及改良疫苗、用于针对免疫原的预防性和/或治疗性免疫个体的改进方法,并且涉及改进的免疫治疗组合物和改进的免疫治疗方法。

[0002] 发明背景

[0003] 免疫治疗涉及调节个体免疫应答,以达到所需的治疗效果。免疫治疗药涉及这样的组合物:当给予个体时,能调节个体的免疫系统,最终减少与不想要的免疫应答相关的症状,或者最终通过增加所需免疫应答而缓解症状。在某些情况下,免疫治疗是接种方案的组成部分,其中将疫苗给予个体,使个体暴露给免疫原,个体将产生抗该免疫原的免疫应答。在这样的情况下,免疫治疗药增加免疫应答和/或选择性加强免疫应答部分(例如细胞免疫或体液免疫),这是治疗或预防特定病症、感染或疾病所需要的。

[0004] 疫苗用于使个体产生抗靶抗原的免疫,所述靶抗原例如变应原、病原体抗原或涉及人类疾病的细胞相关抗原。涉及人类疾病的细胞相关抗原包括癌相关肿瘤抗原和涉及自身免疫性疾病的细胞相关抗原。

[0005] 在设计这样的疫苗中,已经认识到,在接种个体细胞中产生靶抗原的疫苗能有效诱导免疫系统的细胞免疫。具体地讲,减毒活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗各自在接种个体细胞中引起抗原的产生,结果诱导免疫系统的细胞免疫。另一方面,死疫苗即灭活疫苗以及仅包含蛋白的亚单位疫苗不能诱导良好的细胞免疫应答,尽管它们能诱导体液应答。

[0006]细胞免疫应答,对于提供抗病原体感染的保护性以及提供治疗病原体感染、癌症或自身免疫性疾病的有效的免疫介导疗法来说,通常是必需的。因此,在接种个体细胞中产生靶抗原的疫苗(例如减毒 活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗)通常是优选的。

[0007] 尽管这类疫苗通常能使个体有效产生针对病原体感染或人类疾病的预防性或治疗性免疫,但是需要改良疫苗。需要产生增强免疫应答的组合物和方法。

[0008] 同样,尽管某些免疫治疗药可用于调节患者的免疫应答,但是仍需要改进的免疫治疗组合物和方法。

[0009] 基因治疗涉及将基因传递给有需要的个体,或者能从所述基因编码的蛋白获益的个体。已经开发出各种策略,以传递蛋白,因为个体没有产生足够和/或完整功能蛋白的相应基因。因此,基因治疗能补偿所缺失的足够的完整功能性内源蛋白。在某些基因治疗策略中,使用设计用来产生治疗有效量蛋白的构建体,给患者提供治疗有效的蛋白。基因治疗提供一种用于传递蛋白治疗药的替代方法。仍需要改进的基因治疗组合物和方法。

[0010] 除了直接将核酸分子给予个体之外,经常还可给予蛋白。由重组方法产生的这类蛋白通常是制备它们的最有效方式。仍然需要改进的生产蛋白的组合物和方法。

[0011] 发明概述

[0012] 本发明涉及含核酸分子的重组疫苗和使个体产生抗免疫原免疫的方法,所述核酸分子包含编码免疫原的核酸序列和编码融合蛋白的核酸序列以及任选编码CD40L的核酸序列,所述融合蛋白包含与IL-15蛋白序列连接的非IL-15信号序列;所述方法包括给予个体所述重组疫苗。

[0013] 本发明涉及包含核酸分子的减毒活病原体和使个体产生抗病原体免疫的方法,所述核酸分子包含编码融合蛋白的核酸序列以及任选编码CD40L的核酸序列,所述融合蛋白包含与IL-15蛋白序列连接的非IL-15信号序列;所述方法包括给予个体所述减毒活病原体。

[0014] 本发明涉及分离的核酸分子,所述核酸分子包含编码IL-15蛋白的核酸序列和编码CD40L蛋白的核酸序列以及任选编码免疫原的核酸序列。

[0015] 本发明涉及包含这样的核酸分子的组合物:含有编码IL-15蛋白的核酸序列的核酸分子和含有编码CD40L蛋白的核酸序列的核酸分子,以及任选在以上一种或两种核酸分子上含有编码免疫原的核酸序列。

[0016] 本发明涉及调节个体免疫应答的方法,所述方法包括给予个体包含一种或多种核酸分子的组合物,其包含编码IL-15蛋白的核酸序列和编码⑶40L的核酸序列。编码各种不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子上,或者两者皆有。

[0017] 本发明涉及诱导个体产生抗免疫原的免疫应答的方法,所述方法包括给予个体包含一种或多种核酸分子的组合物,所述核酸分子包含编码IL-15蛋白的核酸序列、编码免疫原的核酸序列和编码CD40L的核酸序列。编码各种不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子或者其组合上。

[0018] 本发明涉及含核酸分子的重组疫苗和使个体产生抗免疫原免疫的方法,所述核酸分子包含编码免疫原的核酸序列、编码IL-15蛋白的核酸序列和编码CD40L的核酸序列;所述方法包括给予个体所述重组疫苗。

[0019] 本发明涉及包含核酸分·子的减毒活病原体和使个体产生抗病原体免疫的方法,所述核酸分子包含编码IL-15蛋白的核酸序列和编码CD40L的核酸序列;所述方法包括给予个体所述减毒活病原体。

[0020] 本发明涉及核酸分子,其包含编码融合蛋白的核酸序列,所述融合蛋白由与非IgE蛋白序列连接的IgE信号肽组成,其中所述IgE信号肽和所述非IgE蛋白序列来源于相同物种的动物。

[0021] 本发明涉及宿主细胞体外培养物,所述培养物包含在所述宿主细胞中可操作的表达载体,所述表达载体包含编码由与非IgE蛋白序列连接的IgE信号肽组成的融合蛋白的核酸序列;涉及所述核酸分子;和涉及包含所述载体的宿主细胞。

[0022] 本发明涉及核酸分子,所述核酸分子包含与表达所需调节元件操作性连接且编码融合蛋白的核酸序列,以及与表达所需调节元件操作性连接且编码免疫原的核酸序列;所述融合蛋白包含与非IgE蛋白序列连接的IgE信号肽。

[0023] 本发明涉及组合物,所述组合物包含这样的核酸分子:含有编码融合蛋白的核酸序列的核酸分子和含有编码免疫原的核酸序列的核酸分子,其中含有编码融合蛋白的核酸序列的核酸分子与含有编码免疫原的核酸序列的核酸分子完全不同,所述融合蛋白包含与非IgE蛋白序列连接的IgE信号肽。

[0024] 本发明涉及分离的融合蛋白,所述融合蛋白包含与非IgE蛋白序列连接的IgE信号肽。[0025] 本发明涉及调节个体免疫应答的方法,所述方法包括给予个体组合物,所述组合物包含这样的核酸分子:含有编码融合蛋白的核酸序列的核酸分子,所述融合蛋白包含与免疫调节蛋白连接的IgE信号肽。

[0026] 本发明涉及诱导个体产生抗免疫原的免疫应答的方法,所述方法包括给予个体核酸分子,所述核酸分子含有编码融合蛋白的核酸序列和含有编码免疫原的核酸序列;所述融合蛋白包含与免疫调节蛋白连接的IgE信号肽。编码不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子上。

[0027] 本发明涉及含核酸分子的重组疫苗和使个体产生抗免疫原免疫的方法,所述核酸分子包含编码免疫原的核酸序列和编码融合蛋白的核酸序列,所述融合蛋白包含与免疫调节蛋白连接的IgE信号序列;所述方法包括给予个体所述重组疫苗。

[0028] 本发明涉及包含核酸分子的减毒活病原体和使个体产生抗病原体免疫的方法,所述核酸分子包含编码融合蛋白的核酸序列,所述融合蛋白包含与免疫调节蛋白连接的IgE信号序列;所述方法包括给予个体所述减毒活病原体。

[0029] 本发明涉及核酸分子、载体和宿主细胞,所述核酸分子包含编码融合蛋白的核酸序列,所述融合蛋白包含与IL -15蛋白序列连接的IgE信号肽;所述载体包含所述核酸分子;所述宿主细胞包含所述载体。

[0030] 本发明涉及融合蛋白,所述融合蛋白包含与IL-15蛋白序列连接的IgE信号肽。

[0031] 本发明涉及组合物,所述组合物包含这样的核酸分子:含有编码融合蛋白的核酸序列的核酸分子和含有编码免疫原的核酸序列的核酸分子;所述融合蛋白包含与IL-15蛋白序列连接的IgE信号肽。任选编码CD40L的核酸序列可存在于包含编码融合蛋白和/或免疫原的核酸序列的核酸分子上或存在于各自的核酸分子上。

[0032] 本发明涉及调节个体免疫应答的方法,所述方法包括给予个体包含一种或多种核酸分子的组合物,其包含编码融合蛋白的核酸序列,并任选包含编码⑶40L的核酸序列,所述融合蛋白包含与IL-15蛋白连接的IgE信号肽。编码各种不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子上,或者两者皆有。

[0033] 本发明涉及诱导个体产生抗免疫原的免疫应答的方法,所述方法包括给予个体包含一种或多种核酸分子的组合物,所述核酸分子包含编码融合蛋白的核酸序列、编码免疫原的核酸序列和任选编码CD40L的核酸序列;所述融合蛋白包含与IL-15蛋白序列连接的IgE信号肽。编码各种不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子或者其组合上。

[0034] 附图简述

[0035] 图1描绘来自实施例1的数据,显示用IL-15和抗⑶3单克隆抗体刺激人PBMC后,产生IFN-Y。PBMC得自接受三联疗法(HAART)的HIV-1慢性感染者。所有供体的病毒量都低于500拷贝/ml,他们的⑶4计数高于500细胞/ml。为了确定IL-15增加IFN-Y产生是否可作为效应子功能的指标,将细胞用IL-15和抗CD3刺激,然后用标准酶联免疫斑点测定法(ELIspot assay)进行分析。

[0036] 图2描绘来自实施例1的数据,显示用IL-15和抗⑶3单克隆抗体刺激人PBMC后,IFN-Y的产生主要是由⑶8介导的。如图1所示,来自接受三联疗法(HAART)的HIV-1慢性感染者的PBMC已耗尽了⑶4或⑶8 T细胞,然后用IL-15和抗⑶3进行刺激,再用标准酶联免疫斑点测定法进行分析。

[0037] 图3A、3B、3C和3D描绘来自实施例1的数据,显示用HIV-1肽和IL-15刺激人PBMC后,产生抗原特异性IFN- Y。对来自接受三联疗法(HAART)的HIV-1慢性感染者的PBMC,在标准酶联免疫斑点测定法中分析其响应25ng/ml IL-15 (图3A和图3C)和响应HIV-1Gag肽与IL-15联用(图3B和图3C)而分泌IFN-Y的能力。⑶8已耗尽,用HIV-1肽和IL-5刺激后,评价IFN- Y的产生(图3D)。

[0038] 图4A、图4B和图4C描绘来自实施例1的数据,显示在用HIV-1DNA疫苗和IL-15免疫后,HIV-1抗原特异性细胞免疫应答。在第O周和第2周,给Balb/c小鼠共注射50 μ gpCenv或pCgag以及SOygpIL-M和IL-15表达质粒。最后免疫后2周,收获脾细胞。在图4A中,通标准铬释放测定法,测定脾细胞的抗HIV-1包膜和重组痘苗病毒感染的P815细胞的CTL活性。在图4B中,对HIV-1抗原特异性趋化因子的分泌水平进行分析。脾细胞用HIV-1 env重组痘苗病毒感染的P815细胞进行刺激。在第3天,收获上清液,测定MIP-1 β的分泌。在图4C中,对抗原特异性IFN-Y分泌水平进行评价。将脾细胞重悬浮,浓度为5X IO6细胞/ml。将100 μ I等分试样加入到96孔平底微量滴定板的各孔中。将重组ρ24蛋白加入到各孔中,一式三份,得到终浓度5 μ g/ml和I μ g/ml。将细胞于37°C /5% CO2孵育3天,收获上清液。用市售ELISA试剂盒,测定所分泌的细胞因子水平。

[0039] 图5A和图5B描绘来自实施例1的数据,显示Thl细胞因子的胞内染色。小鼠接受两次注射:单独的pCgag或者pCgag加上pIL-lOTNA质粒。一周后,收获脾细胞,在含有P55肽合并液(含127种15聚体,其跨越HIV-1 p55,具有11个氨基酸的重叠)和布雷菲德菌素A的培养基中体外培养5小时。刺激后,细胞用抗小鼠CD3抗体和抗小鼠CD8抗体进行胞外染色,然后用抗小鼠进行胞内染色。显示CD3+/CD8+淋巴细胞的应答。图5A显示IFN-Y的数据。图5B显示肿瘤坏死因子-α的数据。斑点印迹显示⑶3+/⑶8+淋巴细胞的应答。

[0040] 图6描绘来自实施例1鼠T辅助细胞增殖测定的数据。在第O周和第2周,给Balb/c小鼠共注射50 μ g pCgag或pCenv和50 μ g质粒,所述质粒表达IL-2R依赖性Thl细胞因子IL-2或IL-15的cDNA。将含5 X IO5细胞的100 μ I等分试样立即加入到96孔平底微量滴定板的各孔中。将重组Ρ24蛋白加入到各孔中,一式三份,得到终浓度5 μ g/ml和I μ g/ml0测定刺激指数。自发计数孔中包含10%胎牛血清,起到无关蛋白对照作用。同样,pCgag或对照通常针对无关gp 120蛋白来说,SI为I。为了确保细胞健康,采用PHA或Con A(Sigma)作为多克隆刺激物阳性对照。

[0041] 图7描绘来自实施例1的数据,即用DNA疫苗pCgag免疫Balb/c小鼠后,Gag的表位作图。在第O周和第2周,给Balb/c小鼠共注射50 μ g pCgag和50 μ g pIL_15质粒或表达基因IL-15的载体骨架或载体骨架。分离脾细胞,在标准酶联免疫斑点测定法中用一系列肽进行编排。肽混合·成一系列22种合并液的矩阵形式,测定其激活细胞产生IFN- Y的能力。

[0042] 图8A、图8B和图8C描绘来自实施例1的数据,显示在对来自⑶4敲除小鼠的脾细胞进行刺激后,产生IFN-Y。图8A,在第O周和第2周,给Balb/c小鼠共注射50 μ g pCgag和50 μ g pIL-15即IL-15表达质粒。在最后一次免疫后两周,收获脾细胞,采用酶联免疫斑点测定法,测定产生的HIV-1特异性IFN- Y。图8B,Cd4tmlKmv小鼠用pCgag、用和不用pIL_15进行免疫。图8C,Cd4tmlKmv小鼠用pCgag以及pIL-15、p⑶40L或这两者进行免疫。在最后一次免疫后两周,收获脾细胞,在用HIV-1 Gag肽进行体外刺激后,采用酶联免疫斑点测定法,测定产生的HIV-1 Gag特异性IFN- Y。

[0043] 图9描绘来自实施例2的数据,显示IL-15和⑶40L在疫苗部位的局部产生,可以取代对T细胞辅助的需要,供CD8效应T细胞扩增用。

[0044] 图10、图11、图12A-C、图13A-B、图14和图15涉及实施例3中记载的内容。

[0045] 图16涉及实施例4中记载的内容。

[0046] 优选实施方案的详述

[0047] 定义

[0048] 本文所用的术语“靶蛋白”是指本发明基因构建体所编码的肽和蛋白,其作为免疫应答的靶蛋白。术语“靶蛋白”和“免疫原”可互换使用,是指可诱导免疫应答的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白,其与病原体蛋白或不需要的细胞类型(例如癌细胞或涉及自身免疫性疾病的细胞)的蛋白共享至少一个表位,希望产生抗这些蛋白的免疫应答。针对靶蛋白的免疫应答将会保护个体,预防和/或治疗个体与所述靶蛋白相关的特异性感染或疾病。

[0049] 本文所用的术语“基因构建体”是指DNA或RNA分子,其包含编码靶蛋白或免疫调节蛋白的核苷酸序列。编码序列包括与调节元件操作性连接的起始信号和终止信号,所述调节元件包括在接受所述核酸分子的个体细胞中能指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。

[0050] 本文所用的术语“可表达形式”是指含有与编码靶蛋白或免疫调节蛋白的编码序列操作性连接的必要调节元件的基因构建体,使得当存在于个体细胞中时,可以表达编码序列。`

[0051] 本文所用的术语“共享表位”是指,蛋白包含至少一个与另一蛋白表位相同或基本类似的表位。

[0052] 本文所用的术语“基本类似的表位”是指具有与蛋白表位不同的结构、但仍能诱导细胞或体液免疫应答的表位,其与所述蛋白有交叉反应。

[0053] 本文所用的术语“胞内病原体”是指这样的病毒或病原生物:其复制或生命周期的至少一部分是在宿主细胞内进行、因而产生病原体蛋白或引起病原体蛋白的产生。

[0054] 本文所用的术语“过度增殖性疾病”是指特征为细胞过度增殖的疾病和障碍。

[0055] 本文所用的术语“过度增殖相关蛋白”是指与过度增殖性疾病相关的蛋白。

[0056] 本文所用的术语“免疫调节蛋白”是指调节个体免疫系统的蛋白,所述个体已接受免疫调节蛋白。免疫调节蛋白的实例包括:IL-15、CD40L、TRAIL ;TRAILrecDRC5、TRAIL_R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40 LIGAND、NKG2D、F461811 或MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、CD30、CD153(CD30L)、Fos、c_jun、Sp-1、Apl、Ap_2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、NIK、SAP K、SAPl、JNK2、JNK1B2、JNKlBl、JNK2B2、JNK2B1、JNK1A2、JNK2A1、JNK3A1、JNK3A2、NF-κ -B2、p49 剪接形式、NF-κ -B2、plOO 剪接形式、NF- κ -B2、pl05 剪接形式、NF- κ -B 50Κ 链前体、NF κ B ρ50、人 IL-1 α、人 IL-2、人 IL-4、鼠IL-4、人 IL-5、人 IL-10、人 IL-15、人 IL-18、人 TNF-α、人 TNE-β、人白介素 12,MadCAM-KNGF IL-7、VEGF、TNF-R、Fas、CD40L、IL-4, CSF、G-CSF, GM-CSF, M-CSF, LFA-3、I CAM-3,ICAM-2, ICAM-1、PECAM、P150.95、Mac_l、LFA-1、CD34、RANTES、IL-8、ΜΙΡ-la、E-selecton、CD2、MCP-1> L-selecton、P-selecton、FLT> Apo-1> Fas、TNFR-1> p55、WSL-1> DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4 (TRAIL)、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、ICE、VLA-1 和CD86 (B7.2)。

[0057] 概述

[0058] 本发明来自以下发现。I)当IL-15信号肽不存在时,IL-15蛋白表达水平更高,无论所表达的IL-15蛋白是“截短”的IL-15蛋白,还是含有与非IL-15信号肽(特别是IgE信号肽)连接的IL-15蛋白序列的融合蛋白。缺乏IL-15信号肽的IL-15蛋白,无论是“截短”的IL-15蛋白还是含有与非IL-15信号肽(特别是IgE信号肽)连接的IL-15蛋白序列的融合蛋白,在用于传递IL-15蛋白作为免疫调节蛋白的疫苗和构建体中,都特别有用。2)涉及IL-15和⑶40L传递的疫苗和免疫调节组合物特别有用。3)包含IgE信号肽的融合蛋白有助于增强表达,在蛋白的产生、疫苗和基因治疗药中是特别有用的,例如用于传递蛋白(例如免疫调节蛋白)。在一些优选的实施方案中,本发明提供载体、疫苗和免疫调节组合物和方法,其中包含核酸分子,所述核酸分子包含编码以下蛋白的核苷酸序列:包含缺乏IL-15信号肽(优选缺乏IL-15 Kozak区和非翻译区)的人IL-15编码序列的蛋白;或提供具有非IL-15信号肽(优选IgE信号序列)的人IL-15编码序列的融合蛋白。IL-15编码序列优选缺乏IL-15信号序列,及优选缺乏IL-15 Kozak区和非翻译区。在一些优选的实施方案中,本发明提供载体、疫苗和免疫调节组合物和方法,其中包含核酸分子,所述核酸分子包含编码以下蛋白的核苷酸序列:1)IL-15蛋白,例如缺乏IL-15信号肽的IL-15蛋白,或包含与非IL-15信号肽(例如IgE信号肽)连接的IL-15蛋白序列的融合蛋白;2)编码人⑶40L的核苷酸序列。IL-15编码序列优选缺乏IL-15信号序列,和优选缺乏IL-15Kozak区和非翻译区。在一些优选的实施方案中,本发明提供载体、疫苗和免疫调节组合物和方法,其中包含核酸分子,所述核酸分子包含编码IgE信号肽与非IgE蛋白序列(优选人IL-15蛋白序列)连接的融合蛋白的核苷酸序列。

[0059] 包含与非IgE蛋白连接的IgE信号序列的融合蛋白和编码与非IgE蛋白连接的IgE信号序列的基因构建体

[0060] 因此,本发明的 一个总的方面涉及包含与非IgE蛋白连接的IgE信号序列的融合蛋白和编码与非IgE蛋白连接的IgE信号序列的基因构建体,以及所述构建体在表达载体、疫苗和免疫调节组合物中的用途。关于这一方面,提供几个不同的实施方案和形式。

[0061] 根据一些实施方案,提供包含分离的核酸分子的组合物,所述分离的核酸分子包含编码与非IgE蛋白序列操作性连接的IgE信号序列的融合蛋白的核酸序列。

[0062] 非IgE蛋白的特性取决于构建体的预定用途。例如,对于基因治疗实施方案来说,蛋白序列将是这样的所需蛋白,例如患者所缺乏的足量功能性或完整功能性蛋白。这类所需蛋白的实例包括酶,例如DNA酶、生长因子(例如生长激素(人、牛、猪)、凝血因子、胰岛素、肌营养不良蛋白等。所需蛋白也可是这样的蛋白:当在患者体内表达时,能提供治疗性益处的蛋白,例如红细胞生成素、IL-2、GM-CSF、TPA等。在一些实施方案中,非IgE蛋白序列是免疫原。所述构建体可用于疫苗,其中可提供免疫原的表达,作为免疫应答的目标。在一些实施方案中,非IgE蛋白序列是免疫调节蛋白。所述构建体可用于疫苗以及免疫调节组合物,所述疫苗可提供免疫原的表达,作为免疫应答的目标,而所述免疫调节组合物所需的效果是按照所治疗患者的病症上调或下调患者的免疫系统或免疫系统的具体方面。上调免疫系统的免疫调节剂可用于治疗罹患例如免疫抑制或传染性疾病的患者,而下调免疫系统的免疫调节剂可用于治疗例如自身免疫性疾病、接受器官移植、组织移植的患者或接受细胞治疗的患者,对于他们来说,免疫抑制是必要的。在一些实施方案中,IgE信号序列与非IgE蛋白序列连接,用于在一个需要产生IgE蛋白的系统中使用。在优选的实施方案中,IgE信号肽与其上连接的蛋白序列是来源于相同物种的动物。在优选的方法中,接受所述构建体的动物与IgE信号肽和蛋白序列的来源动物是相同的物种。所述融合蛋白将被认为是非免疫原性的。

[0063] 在一些实施方案中,包含与作为免疫调节蛋白的非IgE蛋白序列连接的IgE信号的编码序列的构建体的组合物,也可包含在同一核酸分子上或不同核酸分子上,即编码免疫原的核酸序列上。通常,下述免疫原可以是任何免疫原性蛋白,包括变应原、病原体抗原、癌相关抗原或涉及自身免疫性疾病的细胞相关抗原。在优选的实施方案中,免疫原是病原体抗原,最优选的病原体选自HIV、HSV、HCV和WNV。

[0064] 如上所述,非IgE蛋白序列优选为IL-15蛋白,更优选为缺乏IL-15信号序列的IL-15蛋白,还更优选为缺乏IL-15信号序列、缺乏IL-15Kozak区和缺乏IL-15非翻译序列的IL-15蛋白。在一些优选的实施方案中,所述组合物还包括编码⑶40L的核苷酸序列。该核苷酸序列可包含在同一核酸分子上(作为融合蛋白)或不同的分子上。CD40L可包含在含免疫原编码序列的疫苗组合物中,得到改良疫苗。在其它实施方案中,CD40L可包含在不含免疫原编码序列的免疫调节组合物中,得到改良的免疫调节组合物。

[0065] 在一些优选的实施方案中,核酸构建体是质粒。在一些优选的实施方案中,核酸分子掺入到病毒载体中,所述病毒载体例如痘苗病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒,或其它任何可接受的病毒载体,用作疫苗或基因治疗载体。

[0066] 包含与作为免疫调节蛋白的非IgE蛋白序列连接的IgE信号序列的基因构建体可直接掺入到本发明某些方面的减毒活病原体中。下面列出这些用作疫苗的病原体的实例。在优选的实施方案中,免疫调节蛋白是IL-15,更优选缺乏IL-15信号序列的IL-15蛋白,还更优选缺乏IL-15信号序列、缺乏I L-15 Kozak区和缺乏IL-15非翻译序列的IL-15蛋白。在一些实施方案中,还提供携带编码CD40L的核苷酸序列的减毒病原体。

[0067] 包含与非IgE蛋白序列操作性连接的IgE信号序列的融合蛋白也是本发明的一个方面。在一些实施方案中,融合蛋白的非IgE蛋白序列部分是酶。在一些实施方案中,融合蛋白的非IgE蛋白序列部分是免疫原。在一些实施方案中,融合蛋白的非IgE蛋白序列部分是免疫调节蛋白。优选的非IgE蛋白序列是IL-15蛋白,最优选缺乏IL-15信号序列。

[0068] 包含与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列的融合蛋白和编码与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列的基因构建体

[0069] 本发明的另一个总的方面涉及包含与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列的融合蛋白和编码与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列的基因构建体,以及所述构建体在疫苗和免疫调节组合物中的用途。关于这一方面,提供几个不同的实施方案和形式。通常,IL-15是指人IL-15。然而,构建体也可指来自狗、猫、马、牛、猪或羊等其它物种的IL-15。

[0070] 本发明的该方面来自这样的观察结果:天然IL-15 mRNA所表达的蛋白序列中含有抑制表达的信号或元件。通过去除这些抑制元件,得到更好的表达。在优选的实施方案中,IL-15编码序列缺乏IL-15信号肽的编码序列,优选在其位置上提供另一种信号蛋白,例如IgE信号蛋白。此外,去除IL-15 Kozak区和非翻译区并去除抑制元件。构建体中优选包含的仅IL-15序列,是编码缺乏IL-15信号肽的成熟IL-15蛋白的氨基酸序列的IL-15序列。

[0071] 根据一些实施方案,提供包含分离的核酸分子的组合物,所述分离的核酸分子包含编码与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列的融合蛋白的核酸序列。在一些优选的实施方案中,融合蛋白由与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列组成。在一些优选的实施方案中,IL-15蛋白缺乏IL-15信号序列。在一些优选的实施方案中,融合蛋白对于IL-15序列所来源的物种来说是非免疫原性的。因此包含人IL-15的非免疫原性融合蛋白在人体内是非免疫原性的。

[0072] 根据一些实施方案,提供包含构建体的组合物,所述构建体包含与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列的融合蛋白编码序列,所述序列也可包括在同一核酸分子上或不同核酸分子上,即编码免疫原的核酸序列上。通常,下述免疫原可以是任何免疫原性蛋白,包括变应原、病原体抗原、癌相关抗原或涉及自身免疫性疾病的细胞相关抗原。在优选的实施方案中,免疫原是病原体抗原,最优选的病原体选自HIV、HSV、HCV和WNV。

[0073] 在优选的实施方案中,组合物还包含编码⑶40L的核苷酸序列。该核苷酸序列可包含在同一核酸分子上作为融合蛋白,或不同分子上。CD40L也包含在含免疫原编码序列的疫苗组合物中,得到改良疫苗。在其它实施方案中,CD40L可包含在不含免疫原编码序列的免疫调节组合物中,得到改良的免疫调节组合物。

[0074] 在一些优选的实施方案中,核酸构建体是质粒。在一些优选的实施方案中,核酸分子掺入到病毒载体中,所述病毒载体例如痘苗病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒,或其它任何可接受的病毒载体,用作疫苗或基因治疗载体。

[0075] 包含与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列的融合蛋白的核苷酸序列的基因构建体可直接掺入到本发明相同方面 的减毒活病原体中。下面列出这些用作疫苗的病原体的实例。在优选的实施方案中,人IL-15(优选缺乏IL-15信号序列)与人IgE信号序列连接。在一些实施方案中,还提供具有编码CD40L的核苷酸序列的减毒病原体。

[0076] 包含与IL-15蛋白序列连接的非IL-15信号序列的融合蛋白是本发明的一方面。在一些优选的实施方案中,融合蛋白由与IL-15蛋白连接的非IL-15信号序列组成。在一些优选的实施方案中,IL-15蛋白缺乏IL-15信号序列。在一些优选的实施方案中,信号序列是IgE信号序列。序列优选人序列。在一些优选的实施方案中,融合蛋白是非免疫原性的。非免疫原性是指这样的蛋白:对于IL-15序列所来源的物种来说,所述蛋白是非免疫原性的。

[0077] 包含编码IL-15和⑶40L的基因构建体的组合物及其使用方法

[0078] 本发明的另一个总的方面涉及包含编码IL-15和⑶40L的基因构建体的组合物以及所述构建体在疫苗和免疫调节组合物中的用途。关于这一方面,提供几个不同的实施方案和形式。通常,IL-15是指人IL-15。然而,构建体也可指来自狗、猫、马、牛、猪或羊等其它物种的IL-15。IL-15可以是天然形式,即带有IL-15信号序列。优选IL-15是融合蛋白的组成部分(所述融合蛋白包含非11-15信号序列),最优选还缺乏IL-15信号序列。在优选的实施方案中,IL-15与IgE信号序列连接。

[0079] 根据一些实施方案,提供包含一种分离的核酸分子的组合物或两个不同的分离的核酸分子的组合物,前者包含编码IL-15和⑶40L的核酸序列,后者包含编码IL-15的第一核酸序列及包含编码⑶40L的第二核酸序列。在一些优选的实施方案中,包含IL-15的蛋白对于IL-15序列所来源的物种来说是非免疫原性的。

[0080] 根据一些实施方案,提供包含构建体的组合物,所述构建体包含IL-15和⑶40L的编码序列,所述序列也可包括在同一核酸分子上或在不同核酸分子上,即编码免疫原的核酸分子上。通常,下述免疫原可以是任何免疫原性蛋白,包括变应原、病原体抗原、癌相关抗原或涉及自身免疫性疾病的细胞相关抗原。在优选的实施方案中,免疫原是病原体抗原,最优选的病原体选自HIV、HSV、HCV和WNV。

[0081] 包含免疫原编码序列的组合物可用作疫苗。不包含免疫原编码序列的组合物可用作免疫调节组合物。在一些实施方案中,也提供蛋白免疫原,作为IL-15和⑶40L联用而增强的免疫应答的目标。

[0082] 在一些优选的实施方案中,核酸构建体是质粒。在一些优选的实施方案中,核酸分子掺入到病毒载体中,例如痘苗病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒,或其它任何可接受的病毒载体,用作疫苗或基因治疗载体。

[0083] 包含编码IL-15和⑶40L的核苷酸序列的基因构建体可直接掺入到本发明相同方面的减毒活病原体中。下面列出这些用作疫苗的病原体的实例。在优选的实施方案中,人IL-15 (优选缺乏IL-15信号序列)与人IgE信号序列连接。

[0084] 疫苗和免疫调节组合物

[0085] 按照本发明的一些实施方案,本发明的组合物包含基因构建体,所述构建体包含免疫原和/或免疫原性蛋白编码序列。将所述组合物给予个体,以调节个体免疫系统的活性,因而增强抗所述免疫原的免疫应答。当编码免疫调节蛋白的核酸分子被个体细胞摄入时,编码免疫调节蛋白的核苷酸序列在细胞中表达,因此将蛋白提供给个体。本发明的其它方面提供给予组合物中位于单个核酸分子上的蛋白编码序列的方法,所述组合物包含编码一种或多种不同转录因子或·中间因子(intermediate factor)的不同核酸分子,作为重组疫苗的组成部分和作为减毒疫苗的组成部分。

[0086] 按照本发明的一些方面,提供针对病原体或异常的疾病相关细胞的预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。疫苗可以是任何类型的疫苗,例如减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸疫苗或DNA疫苗。

[0087] 本发明涉及用于传递免疫调节蛋白的组合物及其使用方法。

[0088] 可使用任何众所周知的技术,包括DNA注射(亦称DNA疫苗接种)、重组载体(例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组痘苗病毒),来传递核酸分子。

[0089] DNA 疫苗描述于美国专利第 5,593,972,5, 739,118,5, 817,637,5, 830,876、5,962,428,5, 981,505,5, 580,859,5, 703,055,5, 676,594 号及其中引用的优先权申请,所述的每篇专利文献都通过引用结合到本文中。除了这些申请中描述的传递方案以外,传递DNA的替代方法描述于美国专利第4,945,050和5,036,006号,这两篇文献都通过引用结合到本文中。

[0090] 给药途径包括但不限于肌内、鼻内(intransally)、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内(intraoccularly)和口服以及局部、经皮、吸入或栓剂或粘膜组织,例如通过阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织灌洗。优选的给药途径包括粘膜组织、肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建体可通过包括但不限于以下方式给予:传统的注射器、无针注射装置或“微弹轰击基因枪(microprojectilebombardment gene guns) ”。

[0091] 当被细胞摄取时,基因构建体可保留在细胞中,作为功能性染色体外分子和/或整合到细胞染色体DNA上。可以将DNA导入细胞中,在此它可作为分离的遗传物质,以质粒形式存在。或者,可以将能整合到染色体上的线状DNA导入细胞中。当DNA导入细胞时,可以添加促进DNA整合到染色体中的试剂。可用于促进整合的DNA序列也可包括在DNA分子中。或者,可将RNA给予细胞。也预期提供基因构建体,作为线状小染色体,包括着丝粒、端粒和复制起点。基因构建体可在生活在细胞内的减毒活微生物体或重组微生物载体中保留部分遗传物质。基因构建体可以是重组病毒疫苗基因组的组成部分,其中遗传物质或者整合在细胞染色体上或者仍存在于染色体外。基因构建体包括核酸分子基因表达所需的调节元件。这些元件包括:启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。另外,编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达常需要增强子。这些编码所需蛋白的序列和调节元件操作性连接的元件,在接受它们的个体中是可操作的,这是必要的。

[0092] 起始密码子和终止密码子通常被认为是编码所需蛋白的核苷酸序列的组成部分。然而,这些元件在接受所述基因构建体的个体中能发挥功能,这是必要的。起始密码子和终止密码子在编码序列内必须符合读框。

[0093] 所用的启动子和聚腺苷酸化信号在个体细胞中必须起作用。

[0094] 本发明实践、尤其是人用基因疫苗生产中所用的启动子的实例包括但不限于来自以下来源的启动子:猿猴病毒40 (SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(MV)例如BIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)例如CMV立即早期启动子、Epstein Barr病毒(EBV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)以及来自人基因的启动子,例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸(muscle creatine)和人金属硫蛋白(metalothionein)等人基因的启动子。

[0095] 本发明实践、尤其是人用基因疫苗生产中所用的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。具体地讲,使用pCEP4质粒(Invitrogen, San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸化信号,称为SV40聚腺苷酸化信号。

[0096] 除了 DNA表达所需的调节元件之外,DNA分子中也可包含其它元件。所述其它元件包括增强子。增强子可选自以下增强子,包括但不限于:人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸和病毒增强子,例如来自CMV、RSV和EBV的增强子。

[0097] 基因构建体可提供哺乳动物复制起点,以便在染色体外保留构建体并在细胞中产生多拷贝构建体。来自Invitrogen (San Diego,CA)的质粒pVAXl、pCEP4和pREP4含有Epstein Barr病毒复制起点和核心抗原EBNA-1编码区,其产生高拷贝的未整合的附加体的复制。

[0098] 在免疫应用相关的一些优选实施方案中,给予核酸分子,所述核酸分子包含编码靶蛋白、免疫调节蛋白以及还能进一步增强抗所述靶蛋白免疫应答的蛋白的基因的核苷酸序列。所述基因的实例是编码以下的其它细胞因子和淋巴因子的基因:例如α-干扰素、Y-干扰素、血小板衍生生长因子(I3DGF)、TNF、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-U IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15,其中IL-15包括缺失信号序列并任选包括来自IgE的信号序列的IL-15。

[0099] 可以添加额外元件,所述元件起到细胞破坏的靶标作用,如果因任何原因需要消除接受基因构建体的细胞的话。基因构建体中可包含呈可表达形式的疱疹胸苷激酶(tk)基因。可将药物更昔洛韦给予个体,该药物将会引起对产生tk的任何细胞的选择性杀伤,因此,提供选择性破坏具有所述基因构建体的细胞的方法。

[0100] 为了最大量地产生蛋白,可以选择适合于在接受构建体的细胞中进行基因表达的调节序列。此外,可以选择在细胞中最有效转录的密码子。本领域普通技术人员可制备在细胞中起作用的DNA构建体。

[0101] 本发明的一个方法包括按以下途径给予核酸分子的步骤:肌内、鼻内、腹膜内、皮下、皮内或局部,或者通过向粘膜组织灌洗,所述粘膜组织选自吸入、阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织。

[0102] 在一些实施方案中,将核酸分子与多核苷酸功能增强子或基因疫苗易化剂一起给予细胞。多核苷酸功能增强子描述于1994年I月26日申请的美国顺序号5,593,972、5,962,428和国际申请顺序号PCT/US94/00899,每件申请都通过引用结合到本文中。基因疫苗易化剂描述于1994年4月I日申请的美国顺序号021,579,所述文献通过引用结合到本文中。与核酸分子联合给予的活性助剂可以作为与核酸分子的混合物给予,或者在给予核酸分子同时、之前或之后单独给予。另外,可起到转染剂和/或复制剂和/或炎性试剂的作用并能与GVF联合给药的其它试剂包括生长因子、细胞因子和淋巴因子,例如α -干扰素、Y-干扰素、GM-CSF、血小板衍生生长因子(H)GF)、TNF、表皮生长因子(EGF)、ILA、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纤维细胞生长因子、表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷脂酰脂质A(WL)、胞壁酰肽)、苯醌类似物和囊泡例如角鲨烯和角鲨烯,透明质酸也可与基因构建体联合给予。在一些实施方案中,免疫调节蛋白可用作GVF。在一些实施方案中,核酸分子与PLG —起提供,以增强传递/摄取。

[0103] 本发明的药物组合物包含约I纳克至约2000微克DNA。在一些优选的实施方案中,本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克DNA。在一些优选的实施方案中,药物组合物含有约10纳克至约800·微克DNA。在一些优选的实施方案中,药物组合物含有约

0.1至约500微克DNA。在一些优选的实施方案中,药物组合物含有约I至约350微克DNA。在一些优选的实施方案中,药物组合物含有约25至约250微克DNA。在一些优选的实施方案中,药物组合物含有约10至约200微克DNA。

[0104] 本发明的药物组合物可按照所用的给药方式来配制。在药物组合物是注射用药物组合物的情况下,它们无菌、无热源和无颗粒。优选使用等渗制剂。通常,等渗性添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在某些情况下,优选等渗溶液例如磷酸缓冲盐溶液。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中,向制剂中添加血管收缩药。

[0105] 根据本发明的一些实施方案,提供诱导抗免疫原免疫应答的方法,即通过将本发明的组合物给予个体。疫苗可以是减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸疫苗或DNA疫苗。

[0106] 除了使用免疫调节蛋白编码序列的可表达形式来改进基因疫苗之外,本发明还涉及改良的减毒活疫苗和改良疫苗,其使用重组载体来传递编码抗原的外源基因。减毒活疫苗和使用重组载体来传递外源抗原的疫苗的实例描述于美国专利第4,722,848、5,017,487,5, 077,044,5, 110,587,5, 112,749,5, 174,993,5, 223,424,10 5,225,336、5,240,703,5, 242,829,5, 294,441,5, 294,548,5, 310,668,5, 387,744,5, 389,368、5,424,065,5, 451,499,5, 453,364,5, 462,734,5, 470,734 和 5,482,713,以上每篇文献都

通过引用结合到本文中。提供基因构建体,其包含与调节序列操作性连接且编码免疫调节蛋白的核苷酸序列,所述调节序列可在疫苗中起到影响表达的作用。将基因构建体掺入到减毒活疫苗和重组疫苗中,以产生本发明的改良疫苗。

[0107] 本发明提供免疫个体的改进方法,其包括以下步骤:将基因构建体给予个体细胞,作为疫苗组合物的组成部分,所述疫苗组合物包括DNA疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗。基因构建体包含与调节序列操作性连接且编码免疫调节蛋白的核苷酸序列,所述调节序列可在疫苗中起到影响表达的作用。改良疫苗导致增强的细胞免疫应答。免疫原

[0108] 本发明用于诱发增强的抗靶蛋白的免疫应答,所述靶蛋白即与病原体、变应原或个体自身“异常”细胞特异性相关的蛋白。本发明可用于使个体产生抗病原因子和病原生物的免疫,使得抗病原体蛋白的免疫应答提供抗病原体的保护性免疫。本发明可用于控制过度增殖性疾病和障碍(例如癌症),即通过诱发抗靶蛋白的免疫应答,所述靶蛋白是与过度增殖细胞特异性相关的蛋白。本发明可用于控制自身免疫性疾病和障碍,即通过诱发抗靶蛋白的免疫应答,所述靶蛋白是与涉及自身免疫性疾病的细胞特异性相关的蛋白。

[0109] 根据本发明的一些方面,将编码靶蛋白和免疫调节蛋白的DNA或RNA导入个体组织细胞中,在此进行表达,因而产生所编码的蛋白。在个体细胞中,编码靶蛋白和一种或两种免疫调节蛋白的DNA或RNA序列与表达所需的调节元件连接。DNA表达的调节元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。另外,其它元件,例如Kozak区,也可以包含在基因构建体中。

[0110] 在一些实施方案中,发现编码靶蛋白序列的可表达形式以及编码两种免疫调节蛋白序列的可表达形式都在给予个体的同一核酸分子上。

[0111] 在一些实施方案中,编码靶蛋白序列的可表达形式存在于各自的核酸分子上,而不在含有编码一种或多种免疫调节蛋白的序列可表达形式的核酸分子上。在一些实施方案中,编码靶蛋白序列的可表达形式与编码一种或多种免疫调节蛋白的序列的可表达形式存在于一个核酸分子上,而不在含有编码一种或多种免疫调节蛋白的序列可表达形式的核酸分子上。可以按照本发明,产生并传递多种不同核酸分子,并且传递给个体。例如,在一些实施方案中,编码靶蛋白序列的可表达形式存在于各自的核酸分子上,而不在含有编码这两种免疫调节蛋白中的一种或多种的序列可表达形式的核酸分子上,而所述两种免疫调节蛋白存在于各自的核酸分子上,而不在含有编码一种或多种免疫调节蛋白的序列的可表达形式的核酸分子上。在这些情况下,将所有三种分子都传递给个体。

[0112] 可提供核酸分子,作为质粒DNA、重组载体的核酸分子或作为减毒疫苗或细胞疫苗所提供的遗传物质的组成部分。或者,在一些实施方案中,除了传递编码靶蛋白和/或一种或两种免疫调节蛋白的核酸分子以外,还可以将靶蛋白和/或一种或两种免疫调节蛋白作为蛋白来传递,或者是用·于替代编码它们的核酸分子。

[0113] 基因构建体可包括与基因表达所需调节元件操作性连接且编码靶蛋白或免疫调节蛋白的核苷酸序列。根据本发明,提供以下基因构建体的组合:一个基因构建体包含编码靶蛋白的核苷酸序列的可表达形式,而另一个基因构建体包含编码免疫调节蛋白的核苷酸序列的可表达形式。将包含基因构建体组合的DNA或RNA分子掺入到活细胞中,导致DNA或RNA的表达并产生靶蛋白和一种或多种免疫调节蛋白。导致增强的抗靶蛋白的免疫应答。[0114] 本发明可用于使个体产生抗所有病原体的免疫,所述病原体例如病毒、原核生物和病原性真核生物,例如单细胞病原生物和多细胞寄生虫。本发明特别用于使个体产生抗以下病原体的免疫,所述病原体感染细胞并且没有包囊膜(encapsulated),例如病毒和淋病(gonorrhea)、李斯特氏菌(listeria)和志贺氏菌(shigella)等原核生物。另外,本发明也可用于使个体产生抗原生动物病原体的免疫,所述病原体包括处于胞内病原体的生命周期某一阶段的病原体。表I列举了可用于制备本发明疫苗的一些病毒科属。包含编码肽的DNA序列的DNA构建体可用于疫苗,所述肽至少包含这样的表位:与该表所列举的抗原等病原体抗原上展示的表位相同或基本类似的表位。此外,本发明也可用于使个体产生抗其它病原体的免疫,所述病原体包括原核病原体和真核原生动物病原体,以及多细胞寄生虫,例如表2所列举的那些。

[0115]为了生产基因疫苗以保护机体免遭病原体感染,基因构建体中必须包含编码免疫原性蛋白的遗传物质,作为靶的编码序列,使得可以建立针对所述免疫原性蛋白的保护性免疫应答。对于病原体是在胞内感染(本发明对胞内感染特别有用)还是胞外感染来说,所有病原体抗原都诱导保护性反应,是不太可能的。因为DNA和RNA比较小,可以相对容易地生产,所以本发明提供采用多种病原体抗原接种的额外优点。基因疫苗中所用的基因构建体可包括编码许多病原体抗原的遗传物质,例如,一个构建体中可包含若干病毒基因,由此提供多种靶标。

[0116] 表I和表2列举了用于制备基因疫苗的一些病原因子和病原生物,以保护个体免遭其感染。在一些优选的实施方案中,使个体产生抗病原体免疫的方法针对HIV、HSV、HCV、WNV 或 HBV。

[0117] 本发明的另一方面提供赋予抗过度增殖细胞(其是过度增殖性疾病的特征)的保护性免疫应答的方法,并提供治疗罹患过度增殖性疾病的个体的方法。过度增殖性疾病的实例包括癌症和银屑病的所有形式。

[0118] 已经发现,将包含编码免疫原性“过度增殖细胞”相关蛋白的核苷酸序列的基因构建体导入个体细胞,导致在接种的个体细胞中产生这些蛋白。为了产生抗过度增殖性疾病的免疫,将包含编码过度增 殖性疾病相关蛋白的核苷酸序列的基因构建体给予个体。

[0119] 为了让过度增殖相关蛋白成为有效的免疫原性靶标,与正常细胞相比,过度增殖细胞中必须专一性或以更高水平产生蛋白。靶抗原包括所述蛋白、其片段和肽;其包括存在于所述蛋白上的至少一个表位。在一些实例中,过度增殖相关蛋白是蛋白编码基因的突变产物。与正常蛋白相比,突变基因编码除了具有稍微不同的氨基酸序列外几乎相同的蛋白,这产生正常蛋白上不存在的不同表位。所述靶蛋白包括例如以下癌基因所编码的蛋白:myb、myc、fyn 和易位基因 bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk 和 EGRF。除了癌基因产物作为靶抗原之外,抗癌治疗用靶蛋白和保护性方案还包括B细胞淋巴瘤产生的抗原的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区,在一些实施方案中也可用自身免疫性疾病的靶抗原。其它肿瘤相关蛋白也可用作靶蛋白,例如在肿瘤细胞中发现呈更高水平的蛋白,包括单克隆抗体17-1A所识别的蛋白和叶酸结合蛋白或PSA。

[0120] 尽管本发明可用于使个体产生抗几种类型癌症中的一种或多种的免疫,但是本发明特别可用于预防性免疫个体,所述个体易于发展特定癌症,或者所述个体已经罹患癌症并易于复发。遗传学和技术以及流行病学的发展,使人们能够对个体产生癌症的概率和风险进行测算和评价。采用遗传筛选和/或家族健康史,可以预测特定个体发生几种类型癌症中任何一种的概率。

[0121] 同样,那些已经罹患癌症的个体和那些经治疗消除癌症或得到缓解的个体,也特别易于复发。作为治疗方案的一部分,可对经诊断确认患有癌症的个体进行抗癌免疫,以便控制癌症复发。因此,一旦得知个体患有某类癌症并具有复发危险时,可以对他们进行免疫,使其免疫系统做好准备,以应付未来出现的任何癌症。

[0122] 本发明提供治疗罹患过度增殖性疾病的个体的方法。在该方法种,引入基因构建体,作为免疫治疗药,指导和启动个体免疫系统,以对付产生靶蛋白的过度增殖细胞。

[0123] 本发明提供治疗罹患自身免疫性疾病和障碍的个体的方法,即通过给予广谱保护性免疫应答,所述免疫应答是针对包括细胞受体和产生“自身”定向抗体的细胞在内的自身免疫相关靶标的。

[0124] T细胞介导的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、结节病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、关节强硬性脊椎炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、节段性回肠炎(Crohn’s disease)和溃瘍性结肠炎。这些疾病的特征都是结合内源性抗原并引起自身免疫性疾病相关的炎性级联的T细胞受体。抗T细胞可变区的接种,将会诱导包括CTL在内的免疫应答,以消除这些T细胞。

[0125] 在RA中,涉及该病的T细胞受体(TCR)的若干特异性可变区已经表征。这些TCR包括¥@-3、¥@-14、20 νβ-17和Va-17。因此,用编码至少一种所述蛋白的DNA构建体进行接种,将会诱导靶向涉及RA的T细胞的免疫应答。参见Howell,M.D.等,1991 Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 88:10921-10925 ;Piliard, X.等,1991 Science 253:325-329 ;ffilliams,W.V.等,1992 J Clin.1nvest.90:326-333 ;以上每篇文献都通过引用结合到本文中。在MS中,涉及该病的TCR的若干特异性可变区已经表征。这些TCR包括VfP和Va-1O。因此,用编码至少一种所述蛋白的DNA构建`体进行接种,将会诱导靶向涉及MS的T细胞的免疫应答。参见 Wucherpfennig, K.W.等,1990 Science 248:1016-1019 ;0ksenberg, J.R.等,1990 Nature 345:344-346 ;以上每篇文献都通过引用结合到本文中。

[0126] 在硬皮病中,涉及该病的TCR的若干特异性可变区已经表征。这些TCR包括V β _6、Vβ _8、Vβ —14 和 Va —16、Va _3C、Va _7、Va —14、Va —15、Va —16、Va —28 和 Va -12。因此,用编码至少一种所述蛋白的DNA构建体进行接种,将会诱导靶向涉及硬皮病的T细胞的免疫应答。

[0127] 为了治疗罹患T细胞介导的自身免疫性疾病(特别是TCR可变区已经表征的)的患者,可以进行滑膜活检。可以取出所存在的T细胞样品,用标准技术鉴定TCR可变区。用这些信息,可以制备基因疫苗。

[0128] B细胞介导的自身免疫性疾病包括狼疮(SLE)、格雷夫斯病(Grave’ s disease),重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆硬化和恶性贫血。这些疾病的特征都是结合内源性抗原并引起自身免疫性疾病相关的炎性级联的抗体。抗抗体可变区的接种,将会诱导包括CTL在内的免疫应答,以消除这些产生抗体的B细胞。

[0129] 为了治疗罹患B细胞介导的自身免疫性疾病的患者,必须对涉及自身免疫活性的抗体可变区进行鉴定。可以进行活检,可以取出炎症部位所存在的抗体样品。可以使用标准技术,对这些抗体的可变区进行鉴定。用这些信息,可以制备基因疫苗。

[0130] 在SLE的情况下,认为一种抗原是DNA。因此,在有待进行抗SLE免疫的患者中,可以对他们的血清筛选抗DNA抗体,可以制备包含DNA构建体的疫苗,所述DNA构建体编码血清中存在的抗DNA抗体可变区。

[0131] TCR可变区和抗体可变区的共同结构特征是众所周知的。通常可按照以下众所周知的方法,找到编码特定TCR或抗体的DNA序列,所述方法例如描述于以下文献的方法:Kabat 等,1987 Sequence ofProteins of Immunological Interest U.S.Department ofHealth and HumanServices,Bethesda MD,所述文献通过引用结合到本文中。另外,从抗体克隆功能性可变区的通用方法可参见Chaudhary, V.K.等,1990Proc.Natl.Acad Sc1.USA87:1066,所述文献通过引用结合到本文中。

[0132] 重组蛋白的制备

[0133] 本发明涉及体外宿主细胞培养物,所述宿主细胞包含在所述宿主细胞中可操作的表达载体,所述表达载体包含编码由与非IgE蛋白序列连接的IgE信号肽组成的融合蛋白的核酸序列;涉及所述核酸分子;和涉及包含所述载体的宿主细胞。本发明也涉及产生融合蛋白的方法,所述方法包括培养宿主细胞的步骤。本发明涉及分离的融合蛋白,其包含与非IgE蛋白序列连接的IgE信号肽。

[0134] 可以通过常规方法,使用易得的原料,如上所述地制备融合蛋白。制备编码所需蛋白的合适DNA序列,就可以使用本领域已知的重组技术来制备蛋白。

[0135] 本领域普通技术人员可以使用众所周知的技术,将编码融合蛋白的DNA插入到市售表达载体中,用于众所周知的表达系统中。市售质粒pYES2 (Invitrogen, San Diego,Calif.)可用于在酿酒酵母(S.c erevisiae)中进行制备。市售MaxBac™(Invitrogen, SanDiego, Calif.)完整杆状病毒表达载体可用于在昆虫细胞中进行制备。市售质粒pcDNAI (Invitrogen, San Diego, Calif.)可用于在中国仓鼠卵巢细胞等哺乳动物细胞中进行制备。本领域普通技术人员可使用这些市售表达载体系统或其它系统,用常规技术和易得原料来制备融合蛋白。

[0136] 本领域普通技术人员可使用其它市售表达载体和系统,使用众所周知的方法和易得原料,来制备载体。含有所需控制序列(例如启动子和聚腺苷酸化信号,优选增强子)的表达系统是易得的,并且本领域已知可用于各种宿主。参见例如Sambrook等,MolecularCloning aLaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press (1989)。因此,所需蛋白既可在原核系统中也可在真核系统中制备,得到一系列加工形式的蛋白。

[0137]目前,各种各样的真核宿主也可用于制备重组外源蛋白。可以用产生所需蛋白(直接使用IgE信号肽)的表达载体转化真核宿主。

[0138] 常用的真核系统包括但不限于酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞和高等植物细胞。可以使用合适的启动子以及末端序列和增强子,其用于这些宿主类型时是相容的和可操作的,例如杆状病毒多角体启动子。如上所述,启动子可以是组成型或诱导型的。例如,在哺乳动物系统中,小鼠金属硫蛋白启动子可以因添加重金属离子而被诱导。

[0139] 适于所需宿主的表达系统的构建细节是本领域已知的。对于蛋白的重组制备来说,编码它的DNA适宜连接所选的表达载体并用于转化相容性宿主,然后在以下条件下培养和维持它们:其中发生外源基因的表达。从培养物中(或者可以通过裂解细胞或者优选从培养基中)回收由此产生的本发明蛋白。

[0140] 本领域普通技术人员可以使用众所周知的技术,使用所述表达系统,分离所产生的融合受体蛋白或其片段。

[0141] 实施例

[0142] 实施例1

[0143] 引言

[0144] 对许多HIV-1阳性个体来说,抗逆转录病毒的联合疗法在感染者中成功地降低了病毒量,导致良好的预后。然而,一些实验室已经报道,联合用药方案很少影响已建立的病毒储存库(以下参考文献1-3)。迄今为止,联合疗法尚未导致病毒的清除,而且目前的治疗方案具有相当大的副作用,最终会影响患者的依从性并影响病程。因此,非常需要开发替代疗法,包括用于HIV-1的潜在的免疫疗法。据信,⑶8+T细胞应答对于控制HIV-1感染和缓解病程来说,是重要的。尽管HIV-1特异性CD8+T细胞应答在控制病毒复制中的确切功能尚未完全阐明,但是,已经确定,HIV-1血清阳性个体中长期不发展与特异性CD8+T细胞介导的细胞应答之间的相关性(以下参考文献4-7)。另外,在网比亚,一组高暴露、但HIV阴性的个体缺乏抗体应答,但却显示出抗HIV-1的CD8+T细胞免疫应答(以下参考文献8和9)。的确,HIV-1感染后,增强的细胞免疫应答被诱导,同时伴随病毒量的下降。然而,尽管存在高水平的HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),但HIV-1感染仍然没有清除。高CD8介导的应答与持续的病程之间的矛盾值得深思。CTL不能清除病毒,可能部分因为CTL逃逸突变体(以下参考文献10-14),这是病毒可能的免疫致病机制,例如Nef相关性I类MHC的下调或Vpr或Env对宿主免疫力的影响(以下参考文献15-18)。另一个问题是CD8+T淋巴细胞缺乏有效的CD4+T·细胞辅助(以下参考文献19和20)。据观察,循环CD8+细胞可具有受损的功能(以下参考文献21)。如果HIV-1免疫发病机理限制产生有效的CD8应答的话,在抗逆转录病毒疗法中提供HIV-1抗原,则能以有限的方式强化CD8记忆细胞和效应细胞。这些事件能对克服疾病提供潜在影响。然而,为CD8+T细胞扩增提供帮助是重要的。鉴于此,人们发现,CD8+记忆T细胞的存活,对持续的抗原呈递来说,并非偶然,(以下参考文献22),但是可能依赖于周围环境中特异性细胞因子的产生。

[0145] 显著影响⑶8+T细胞的一个所述细胞因子是白介素-15(IL_15)。Waldmann及其同事首次报道,IL-15是一种15 kDa蛋白,使用IL-2受体复合物的Y链和β链,所述复合物是IL-2受体与信号T细胞的复合物,其具有独特α链(以下参考文献23)。IL-15表现出抗凋亡活性,看来在刺激记忆CD8+T细胞表型中起到作用。许多研究小组正在对IL-15在HIV-1感染中的作用进行研究。已经证明,IL-15减少从HIV-1感染者分离的淋巴细胞的细胞凋亡(以下参考文献24)并增加天然杀伤细胞的活性和增殖(以下参考文献25-27)。也认为,IL-15与HIV-1感染者的B细胞增殖(以下参考文献28和29)和巨噬细胞活化(以下参考文献30)有关。重要的是,IL-15看来也对HIV-1效应T细胞的增殖和干扰素-Y (IFN-Y)的产生具有直接作用(以下参考文献31和32)。然而,IL-15在许多检验为HIV-1血清阳性的患者中却不能刺激IFN-Y。因此,研究了 IL-15对抗原特异性⑶8+Τ细胞免疫应答的作用。[0146] 对IL-15对从慢性感染的HIV-1血清阳性患者分离的T细胞的作用进行了研究。发现,rhIL-15增强了⑶8 T细胞的增殖,而且重要的是,IL-15在所有患者中都增加了的效应抗原特异性⑶8+IFN-Y的产生。在免疫模型中,IL-15增强了⑶8+效应细胞的功能,这是在免疫模型系统中进行的研究。来自小鼠的CD8+淋巴细胞能够以更高水平裂解表达HIV-1抗原的靶标,当提供IL-15时。这一作用发生在⑶4+T细胞剧烈增殖不存在的情况下。然而,在⑶4敲除(KO)小鼠中,在产生⑶8效应细胞应答时,IL-15不能完全忽略⑶4辅助的需要。这些结果表明,IL-15在⑶8记忆细胞的增殖中是高度有效的,但是单独的IL-15对其开始产生并不足够。

[0147] 材料与方法

[0148] 人PBMC的酶联免疫斑点测定

[0149] 通过标准酶联免疫斑点测定,对于通过基本ficoll-hypaque技术从HIV-1阳性志愿者分离的PBMC,评价效应子功能。将PBMC重悬于含10% FCS(RlO)的RPMI中,浓度为IXlO6 细胞/ml。将抗体 1-DIK (Mabtech, Mariemont OH ;Nacka, SE)在 0.1M 碳酸盐-碳酸氢盐溶液(pH 9.6)中稀释至15 μ g/ml,用于包被96孔硝酸纤维素膜板(Millipore,Bedford,MA)。膜板在4°C孵育过夜。用200 μ I PBS洗涤膜板6次。将122种无菌肽的混合物(mixture)配制成混合物(cocktail),浓度(对于每种肽)为50 μ g/ μ I的DMS0。所述肽是一系列重叠肽,长度为15个氨基酸,包括所有HIV-1 Gag (AIDS Reagent和ReferenceRepository, ARRR)。将100,000个PBMC加入到硝酸纤维素抗体包被板的每孔中(100 μ 101.0 X IO6细胞/ml),再加入100 μ I肽混合物(稀释I: 200 (溶于R10),有或没有50ng/ml IL-15,终浓度25ng/ml)。每个样品按一式三份进行测定。用5μ g/ml PHA作为阳性对照。将各板在37°C孵育约24小时。然后用200 μ I PBS洗涤各板6次。将100 μ I抗体7-Β6-1-生物素(Mabtech)加入到每孔中,浓度为I μ g/ml的PBS。各板在室温下孵育2-4小时。然后用200 μ IPBS洗涤各板6次。将100 μ I链霉抗生物素-ALP (Mabtech)加入到每孔中,浓度为I μ g/ml的PBS。各板在室温下孵育1-2小时。用200 μ I PBS洗涤各板6次。将100μ I底物溶液(BCI·P/NBT,Sigma)加入到每孔中。用自来水除去显影液。使用或者与CD8特异性单克隆抗体偶联或者与CD4特异性单克隆抗体偶联的Dynabeads (DynalBiotech, Lake success, NY ;0slo, NO)来耗尽 CD8 和 CD4 群体。

[0150] 用抗⑶3单克隆抗体对PBMC的共刺激

[0151]在有或没有 IL-15 (50ng/ml)的情况下,用结合 Dynabeads (DynalBiotech)的对⑶3具有特异性的单克隆抗体,刺激从HIV-1血清阳性患者分离的PBMC,然后通过如上所述的酶联免疫斑点测定法,分析产生的IFN- Y。使用或者与CD8特异性单克隆抗体偶联或者与0)4特异性单克隆抗体偶联的Dynabeads (Dynal Biotech)来耗尽0)8和0)4群体。

[0152] 用CD40L对PBMC的共刺激

[0153] 测定⑶40L蛋白与IL-15和肽混合物的联用,其浓度为250 μ g/ml,然后通过如上所述的酶联免疫斑点测定法,分析产生的IFN-Y。

[0154] 在小鼠中进行质粒免疫

[0155] 在第O周和第2周,雌性Balb/c小鼠用50 μ g pCgag或pCenv和50 μ g质粒一起进行接种,所述质粒如前所述表达IL-2R依赖性Thl细胞因子IL-15的基因(以下参考文献33)。也采用Cd4tmlKmv定向突变的纯合型小鼠。这些小鼠因⑶4基因突变而在⑶4+T细胞发育中被完全阻断;其90%的循环T-细胞是CD8+。纯合突变型小鼠在辅助T细胞活性和其它T细胞应答上也显示出II类限制性缺陷。在第O周和第2周,B6.129S6-Cd4tmlKmv用50 μ g pCgag和50 μ g质粒一起进行接种,所述质粒表达⑶40L、IL-15或两者的组合。用Qiagen柱制备所有DNA,最终的制剂是0.25%布比卡因的等渗柠檬酸缓冲液。第二次注射后一周,切取脾脏。

[0156] 鼠细胞毒性T淋巴细胞测定

[0157] 在5小时51Cr释放CTL测定中,使用重组痘苗病毒感染的细胞作为靶标,评价CTL应答。在接种和体外刺激后一周,分离脾细胞。用相关痘苗病毒感染的细胞刺激效应子。P815 用 vDKl (gag/pol) (ARRR)或 vMN462 (ARRR) (env)感染。如前所述,刺激物用 0.1%戊二醛固定,然后与脾细胞一起(比例为1: 20)在CTL培养基中孵育4-5天。CTL培养基由 1:1 的 Iscove 改良 Dulbecco Media(Gibc-BRL,Grand Island,NY)和 Hanks 平衡盐溶液(Gibco-BRL)组成,后者含有 10% 胎牛血清 1640 (Gibco-BRL)和 10% RAT-T-SHM,不含Con A (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)。通过在 37°C感染 3 X 106P815 细胞(感染复数MOI为10)达12小时,制备痘苗病毒感染的靶标。进行标准铬释放测定,其中靶细胞用20 μ Ci/ml Na251CrO4标记120分钟,然后与受刺激的效应脾细胞一起在37°C孵育6小时。在效应子:靶标(E: T)比例为50: I至12.5: I的范围内,测定CTL裂解。收获上清液,在LKB CliniGamma Y-计数器上计数。按照下式求出特异性裂解的百分数:

[0158]

Figure CN1832956BD00201

[0159] 通过使靶细胞在含1% Triton X-100培养基中裂解,求出最大释放。如果“自发释放”计数值超过“最大释放”的20%的话,认为测定无效。

[0160] ⑶8+T细胞的完全裂解

[0161] 通过用抗⑶8单克隆抗体(Pharmingen, San Diego, CA)进行处理,然后通过在37°C与兔补体(Sigma) —起保温45分钟,从脾细胞中去除⑶8+T细胞(以下参考文献33)。

[0162] 鼠T辅助细胞增殖测定

[0163] 采用淋巴细胞增殖测定,评价淋巴细胞的总免疫活性并检测对分裂细胞具有特异性的抗原。按照以下参考文献34所述,从脾脏收获淋巴细胞,去除红细胞,然后用新鲜培养基洗涤几次,以制备淋巴细胞。分离的细胞以5X IO6细胞/ml的浓度重悬浮。将含5X IO5细胞的100 μ I等分试样立即加入到96孔平底微量滴定板的每孔中。将重组ρ24蛋白加入到各孔中,一式三份,得到终浓度5 μ g/ml和I μ g/ml。将细胞于37°C /5% CO2孵育3天。将I μ Ci的氚化胸苷加入到各孔中,然后将细胞在37°C孵育12-18小时。收获各板中的细胞,在Beta读板仪(Wallac, Turku, Finland)上测定所掺入的氣化胸苷的数量。按下式求出刺激指数:

[0164] 刺激指数(SI)=(实验计数/自发计数)

[0165]自发计数孔中包含10%胎牛血清,起到无关蛋白对照作用。同样,来自pCgag或对照免疫小鼠的脾细胞通常针对其无关蛋白靶标来说SI为I。为了确保细胞健康,采用PHA或Con A(Sigma)作为多克隆刺激物阳性对照。

[0166] 受刺激鼠细胞的细胞因子和趋化因子分析[0167] 从脾脏收获淋巴细胞,将分离的细胞重悬浮,浓度为5X IO6细胞/ml。将含5X IO5细胞的100 μ I等分试样加入到96孔平底微量滴定板的各孔中。将重组Ρ24蛋白或包膜蛋白加入到各孔中,一式三份,得到终浓度5 μ g/ml和I μ g/ml。将细胞于37°C /5% CO2孵育3天,收获上清液。用市售ELISA试剂盒测定细胞因子和趋化因子。

[0168] 受刺激鼠细胞的干扰素-Y的胞内染色

[0169] 小鼠接受两次注射:pCgag DNA或者pCgag DNA质粒加上pIL-15。一周后,收获脾细胞,在含有P55肽合并液(含122种15聚体,其跨越HIV-1 p55,具有11个氨基酸的重叠)和布雷菲德菌素A的培养基中体外培养5小时。刺激后,细胞用抗小鼠CD3抗体和抗小鼠CD8抗体进行胞外染色,然后用抗小鼠IFN-Y进行胞内染色。描点曲线显示CD3+/⑶8+淋巴细胞的应答。

[0170] 表位作图

[0171] 将脾细胞重悬于含10% FCS(RlO)的RPMI中,浓度为IX IO6细胞/ml。将得自AIDS Reference和Reagent Repository的系列122种妝,混合成为每种合并液中含10种肽的混合物,终浓度为20 μ g/ml/肽。每种肽都包含在两个不同的合并液中,总共有22种肽合并液。以矩阵形式排列各合并液,用于脾细胞刺激。IFN-Y的产生通过酶联免疫斑点测定法(R和D系统)评价。将各板于37°C孵育约24小时。每个样品按一式三份进行测定。

[0172] 结果

[0173] 用⑶3和IL-15对淋巴细胞进行刺激

[0174] 评价IL-15以协同方式,与T细胞受体刺激一起,增强T细胞效应子活化的能力。PBMC是从HIV-1感染者中分离的。PBMC用抗CD3表面结合抗体进行刺激,然后与IL-15 —起孵育过夜。不出所料,⑶3 单独刺激PBMC,能诱导IFN- Y的产生,而单独补充IL-15却只能诱导低应答至无应答。然而,当淋巴细胞用⑶3和IL-15 —起刺激时,观察到细胞分泌IFN- Y的数量增加好几倍(图1)。受刺激群体耗尽⑶4+或⑶8+T细胞,然后补充IL-15,再次检测活性。CD8细胞的损失再次耗尽活化信号。数据表明,来自HIV-1慢性感染者的⑶8+效应T细胞,可以因IL-15/⑶3刺激而扩增(图2)。

[0175] HIV-1阳性样品经IL-15刺激后产生抗原特异性IFN- Y

[0176] 对IL-15增强HIV-1抗原特异性⑶8+应答的能力,进行体外评价。从接受抗逆转录病毒联合治疗(HAART)的HIV-1慢性感染者中,采集样品。在用HIV-1特异性肽刺激后,在IL-15存在或不存在的情况下,评价PBMC分泌IFN- Y的能力。PBMC用包含HIV-1 gag蛋白完整可读框的重叠HIV-1 15个氨基酸肽进行刺激。来自接受肽刺激的患者的PBMC,当用IL-15处理后,表现出IFN-Y产生增加(图3A和图3B),IFN-y产生在有无IL-15的情况下具有显著性差异(P =.009),(图3C)。一些患者单用IL-15刺激,就会高水平分泌INF-γ (图3A),表明它们具有部分T细胞活化,所述活化被阻断并需要补充细胞因子才有效。这一活性清楚表明,当CD8细胞群体被耗尽时,CD8在介导IFN-γ的产生中的活性已经丧失(图3D)。

[0177] IL-15在小鼠体内增加CD8+CTL应答

[0178] 以上对HIV-1应答和IL-15的研究,确定IL-15在初次刺激的T细胞群体中能增加IFN-Y的产生。然而,尚不清楚,IL-15对⑶8+T细胞的体内功能诱导具有什么样的效应。为了解决该问题,使用小鼠模型系统。给小鼠接种HIV-1质粒,作为传递HIV-1抗原并研究CD8免疫在体内诱导的措施。HIV-1表达质粒是与或者表达IL-15的质粒、或者对照质粒一起注射的,然后比较所得免疫应答。在大量CTL测定中,与表达HIV-1包膜和IL-15的质粒一起注射,导致约40%表达HIV-1包膜的靶标裂解,其比例为50: I效应子:靶标,相比之下,用包膜质粒和对照载体则观察到11%裂解(图4A)。这些结果是⑶8 T细胞依赖性的,表明IL-15对效应T细胞应答的显著影响。

[0179] 小鼠在抗原刺激后IL-15诱导MIP-1 β和IFN_g的分泌

[0180] 疫苗诱导的细胞免疫应答可进一步扩增,即通过检查β -趋化因子MIP-1 β作为免疫活化标记的表达分布型。趋化因子是免疫和炎症反应的重要调节剂。它们在白细胞从血管进入宿主防御的外围部位的分子调控中尤为重要。此外,先前已经报道过,T细胞产生的趋化因子包括MIP-1 β,在细胞免疫增殖中起到关键作用(以下参考文献24)。因此,受刺激T细胞所产生的趋化因子的水平,可提供抗原特异性细胞免疫应答的量和质方面的补充知识。对受刺激T细胞的上清液(如材料与方法小节所述)的MIP-1 β释放进行分析和检测。用IL-15共同免疫,结果导致高水平分泌MIP-1 β (图4Β)。

[0181] 也对上清液中产生的Thl细胞因子IFN-Y进行评价。在细胞用于CTL测定之前,在用表达HIV-1包膜的重组痘苗病毒所感染的效应细胞进行为期3天的淋巴细胞刺激之后,得到样品。图4C表明,与单独注射质粒疫苗或对照的小鼠相比,共注射IL-15的小鼠的脾细胞诱导产生更高水平的IFN-Y (120pg/ml)。相比之下,在这些研究中没有观察到任何培养物明显产生的IL-4(数据未显示)。

[0182] IFN- Y和TNF- α的胞内染色

[0183] 为了定量研究对HIV-1疫苗的T细胞应答,进行胞内细胞因子染色测定。处死免疫动物,收获脾细胞,在含Ρ55混合物和布雷菲德菌素A的培养基中体外培养5小时。通过流式细胞术,测定⑶8+⑶3+Τ细胞`的IFN-Y或TNF-α的产生(图5A和图5B)。共同接种IL-15的动物表现出高⑶8效应T细胞应答,2.6%的⑶8+T细胞产生IFN- Y,3.7%的产生TNF- α。这些数据表明,IL-15对功能性⑶8+T细胞应答显示出巨大影响。

[0184] 用IL-15和HIV-1疫苗共同免疫的鼠脾细胞中淋巴细胞增殖

[0185] T辅助淋巴细胞的活化和增殖对体液免疫和细胞免疫扩增来说,是至关重要的。在基础淋巴细胞增殖测定中,评价了来自免疫小鼠的脾细胞在响应重组HIV-1抗原刺激时的增殖能力。看来IL-15对增殖应答没有重大影响(图6)。然而,IL-2用作对照,清楚地看至Li,在共注射IL-2质粒的小鼠中,对于gpl20 env蛋白的脾细胞增殖显著增加。比起用对照、pCgag单用或pCEnv+IL-15联用免疫的小鼠来说,共注射IL-2的小鼠脾细胞,导致刺激指数至少高出3倍(图6)。该数据进一步证明,在没有T细胞辅助剧烈扩增时,IL-15看来也能增加⑶8 T细胞功能。这也证明,IL-15所引起的扩增并不依赖于IL-2。这表明,在这种情况下,⑶4及⑶8效应子功能的扩大。

[0186] 表位作图

[0187] IL-15处理对CD8+T细胞应答的增强作用,是否是因为所响应的表位数量的增加(即:表位延伸),还是因为对同一表位具有特异性的CD8+T细胞数量的总体增加?为了解决这些问题,使用酶联免疫斑点测定和一系列得自AIDS Reference和Reagent Repository的肽(按矩阵形式混合成合并液),鉴定出两个表位。将优势表位作图到Gag氨基酸197-211 (AMQMLKETMEEAAE-SEQ ID NO:1)(图 7)。Paterson 等人先前在用重组单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)HIV-1疫苗进行免疫后,已经确定AMQMLKET1-SEQIDN0:2(以下参考文献35)为优势CD8表位。进而确定了亚优势表位即Gag氨基酸293-307 (FRDVDRFYKTRAE-SEQ ID NO:3)(图7)。在仅用Gag免疫的小组中,观察到所响应表位的数量没有增加。然而,IL-15极大地增加了对这些表位应答的数量级。仅在用IL-15共同免疫的动物中是亚优势表位的清楚证据。IL-15影响CD8效应细胞的扩增。

[0188] ⑶4敲除小鼠

[0189] 我们观察到,在来自HIV-1感染者的PBMC中,IL-15使抗原特异性⑶8 T细胞扩增。我们也观察到,在我们的疫苗模型中,显著的CD8效应细胞诱导不依赖于CD4扩增。因此,⑶4辅助T细胞对IL-15免疫扩增的贡献引起疑问。为了解决这一问题,对IL-15在完全没有CD4细胞的情况下诱导CD8效应群体的能力,进行了调查。对Cd4tmlKmv定向突变的纯合型小鼠(以下参考文献36)进行免疫。这些小鼠在CD4+T细胞发育中被阻断,因此大多数循环淋巴细胞是CD8细胞。利用质粒共同免疫模型(其中在正常小鼠中每一百万个脾细胞中平均约有200个IFN- Y产生细胞被诱导),在绝对没有CD4细胞的情况下,IL-15不能拯救诱导的CD8效应子功能(图8B)。因为看来IL-15的作用不涉及CD4扩增(图6),所以该缺陷理所当然是因为缺乏T辅助细胞所提供的另一功能,CD4 T辅助细胞也提供对CD8扩增的帮助,即通过抗原呈递细胞(APC)的活化。在这一 APC活化模型中,APC上的⑶40与T细胞⑶40配体的连接,上调B7的表达,使T细胞活化。在I类MHC肽呈递的情况下,B7分子对⑶8 T细胞扩增提供共刺激。而且,Bourgeois等(以下参考文献37)证明,⑶40L能直接影响CD8记忆细胞的发育。

[0190] 在⑶4辅助方面的缺陷表现为缺乏共刺激水平,这一点是下一项要考虑和研究的。为了检验该假说,小鼠用含有IL-15和CD40L以及pCgag的质粒进行共免疫。使用锚定的⑶40L分子。锚定的⑶40L是局部表达的并在转运的免疫细胞,但是不能分泌,这使实验变得更复杂(以下参考文献38 )。这样的接种可在质粒模型中提供共刺激(以下参考文献38)。的确,当研究pCgag与P⑶40L联合使用时,在⑶40 KO小鼠中,诱导Gag特异性⑶8免疫应答(图8)。该数据进一步表明,IL-15直接影响记忆⑶8淋巴细胞。当⑶4细胞不存在时,IL-15从稚细胞不能诱导抗原特异性CD8细胞应答。

[0191] 讨论

[0192] HIV-1特异性⑶8免疫应答的维持和增强一直是许多研究的来源。近期研究已经报道,IL-15在支持记忆细胞存活中起到重要作用。观察到在小鼠模型中,IL-15的存在,可导致记忆细胞分裂(以下参考文献39)。离体功能分析以及用遗传上缺乏IL12、IL-15或其特异性受体的转基因小鼠进行的研究,在表征IL-15所起的作用中是重要的。的确,Zhang及其合作者(以下参考文献39)证明,在体内小鼠模型中,IL-15对记忆表型、⑶44hi⑶8+T细胞提供有效而有区别的刺激。另外,Ku等(以下参考文献40)报道,记忆CD8+T细胞的分裂是由IL-15刺激的,但是被IL-2抑制。也发现,IL-2抑制⑶8+记忆T细胞的增殖。

[0193] 本文所公开的研究工作证明,IL-15对体外和体内诱导⑶8+效应T细胞也特别有效。当与肽和IL-15 —起孵育时,从HIV-1感染者分离的⑶8+T细胞能以抗原特异性方式分泌IFN-Y。IL-15与TCR协同作用,刺激淋巴细胞产生IFN-Y并确保效应子表型。在某些患者中,在抗原不存在的情况下,IL-15导致IFN-γ的产生。这表明,在HIV感染中,某些细胞被部分激活,而这类部分激活状态可被IL-15拯救。然而,重要的是,在所有患者中,当用IL-15和HIV-1抗原共同刺激PBMC时,效应子功能显著增加。

[0194] 目前,von Adrian及其同事(以下参考文献41)提出,对淋巴细胞的IL-15刺激能导致CD8+T细胞直接从稚细胞加工成记忆细胞表型。然而,本文的数据表明,TCR的结合可导致CD8+T淋巴细胞更完全活化,表明IL-15单用对稚细胞的作用是最小的。另外,也表明,IL-15导致非功能性记忆细胞(以下参考文献41)。该数据证明,在人以及小鼠研究中,IL-15扩增都能导致完全功能性⑶8+T细胞。在小鼠中,IL-15显著增加⑶8+T细胞应答以及增加趋化因子和IFN-Y应答,这清楚表明抗原特异性扩增并建立在先前的工作上(以下参考文献33和42)。在CD4+T细胞扩增不存在的情况下,观察到CD8+T细胞功能的扩增。然而,对于CD4 T细胞在发生CD8应答方面具有重要作用。在CD4敲除小鼠的研究中,通过使用⑶40L,可以遏止对⑶4 T细胞的需要。这一发现对病毒感染的免疫治疗极其重要。

[0195] 许多免疫治疗策略都集中于扩增⑶8+Τ细胞应答。HIV-1感染通过病毒诱导的免疫抑制,使免疫治疗变得更为复杂,所述免疫抑制能导致缺乏有效的CD4+T细胞辅助。反过来说,认为缺乏这样的辅助,造成无效CD8+T细胞应答。在通常的慢性感染中需要CD4+的辅助,以维持对病毒复制的控制,这可能是HIV-1感染的实例。Serbina等(以下参考文献43)证明,⑶8+细胞毒性T细胞的发展依赖于⑶4+Τ细胞。他们还观察到,在⑶4 T细胞敲除小鼠中具有降低的IL-15产生。然而,IL-15并不由⑶4+Τ细胞产生。它主要由基质细胞、单核细胞和巨噬细胞产生。可能有⑶4+Τ细胞增加IL-15产生的某些反馈机制,而在降低⑶4辅助的情况下,最终CD8+T细胞功能也下降。该反馈机制可解释,为什么6个患者中有3个IFN-Y产生是在单独添加IL-15之后。因此,在⑶4不存在且IL-15处于较低水平的情况下,在HIV-1血清阳性患者中,残留病毒仅可部分激活⑶8+Τ淋巴细胞。重要的是,由此看来,可以添加IL-15,以更改由病毒免疫抑制所引起的缺陷。应该在免疫治疗HIV-1的领域中,考虑该·假说的意义。

[0196] 总的来说,IL-15在小鼠中增强⑶8+Τ细胞效应子功能并增强从HIV-1感染阳性患者分离的CD8+T细胞的功能。应该考虑,将IL-15作为主动免疫疗法的补充,用作HAART的辅助治疗。

[0197] 参考文献(其各自通过引用结合到本文中)

[0198] 1.Ho, D.,1996, Therapy of HIV infections:problems and prospects(HIV 感染:问题和展望).Bull.New York Acad.Med.73, 37-45.[0199] 2.Finzi, D., Hermankova, M., Pierson, T., Carruth, LM., Buck C., 1997,Identification of a Reservoir for HIV-1 Patients on Highly ActiveAntiviralTherapy (用高度活性抗病毒治疗的HIV患者储库的鉴定),Science,278:1295-1300.[0200] 3.Wong, J., Hezareh, Μ., Gunthard, Η., Havlir, DV., 1997, Recovery ofReplication-Competent HIV Despite Prolonged Suppressionof Plasma Viremia(尽管延长对病毒血症的抑制,但有复制能力的HIV仍能恢复),Science,278:1291-1294.[0201] 4.Rosenberg, ES., Altfeld, Μ., Poon, SH., Phillips,MN., Wilkes, BM., Eldridge,RL., Robbins, GK., D Aquilia R, Τ.Goulder, PJR, Walker, BD, 2000, Immune control ofHIV-1 after early treatment of acuteinfection (急性感染早期治疗后,对HIV-1 的免疫控制),Nature,407:523.[0202] 5.Koup R,Safrit J,Cao Y,1994,Temporal association of cellularimmuneresponses with the initial control of viremia in primary Humanimmunodeficiencyvirus type I syndrome (在原发性人免疫缺陷病毒I型综合征中,细胞免疫应答与开始控制病毒血症之间的时序关系).J ofVirol,68:4650-4655.[0203] 6.Rinaldo C,Huang X , Fan Z,1995,High Levels ofAnt1-HumanImmunodeficiency Virus Type I (HIV-1)Memory Cytotoxic T-LymphocyteActivity and Low Viral Load Are Associated with Lack ofDisease in HIV-1InfectedLong-Term Nonprogressors (高抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)记忆细胞毒性T-淋巴细胞活性水平和低病毒量,与HIV-1感染长期带毒者中疾病的缺乏有关),J Virol.,69:5838-5842.[0204] 7.Cao, H.,Kanki,P.,Sankale,J., 1 9 9 7, Cytotoxic TLymphocyteCross-Reactivity among Different HIV-1 Type I Clades:ImplicationforVaccine Development (细胞毒性T淋巴细胞与不同HIV-1的I型分化群的交叉活性:对疫苗开发的意义),J Virol ;71:86158623.[0205] 8.Rowland-Jones SiNixon DiAldhous M.,1993,HlV-specificcytotoxic T-cellactivity in an HIV-exposed but uninfected infant (在 HIV 暴露但未感染婴儿中,HIV特异性细胞毒性T细胞活性).Lancet,341:860-86.[0206] 9.Rowland-Jones S,Sutton J, Ariyoshi K, 1995.HIV-specific T-cells inHIV-exposed but uninfected Gambian women (在HIV暴露但未感染的网比亚妇女中的HIV特异性 T 细胞).Nature Medicine,1:59-64

[0207] 10.Borrow, P,Lewicki, H,Wei, S,1997,Antiviral pressure exertedby HIV-1specific cytotoxic T lymphocytes during primary infectiondemonstrated by rapidselection of CTL escape virus (在原发性感染中,CTL逃逸病毒的快速选择证明了 HIV-1特异性细胞毒性T淋巴细胞所施加的抗病毒压力).Nature Medicine, 3:205-211.[0208] 11.Borrow, R.Shaw GM,1998,Cytotoxic lymphocyte escape viralvariant howimportant are they in viral evasions of immune clearance invivo (细胞毒性淋巴细胞逃逸病毒变株,它们在体内免疫清除病毒入侵中的重要性),Immunology Rev,164:37-51.[0209] 12.Goulder PJ, Phi I lips RE,Colbert RA 1997,Late escape fromanimmunodominant cytotox·ic T lymphocyte response associated withprogression toAIDS(从与AIDS发展有关的免疫优势细胞毒性T淋巴细胞应答中的晚期逃逸),NatureMedicine,3 ;212_217.[0210] 13.Goulder PJ, Sewell AK, Lalloo DG,1997, Pattern ofimmunodominance inHIV-1 specific cytotoxic T lymphocyte response intwo human histocompatibilityleukocyte antigens HLA identical siblingswith HLA A0201 are influence byepitope mutations (在具有HLA A0201的两个人类组织相容性白细胞抗原HLA相同的同胞兄弟姐妹中,HIV-1特异性细胞毒性T淋巴细胞应答的免疫优势模式,受表位突变的影响).J Exp Med,185:1423-1433.[0211] 14.Phillips RE,Rowland-Jones, S Nixon, DF,1991, Humanimmunodeficiencyvirus genetic Variation' that can escape cytotoxic T cellrecognition(可以逃逸细胞毒性T细胞识别的人免疫缺陷病毒遗传变异).Nature,354 ;453_459.[0212] 15.Koup,RA,1994,Virus Escape from CTL recognition (病毒逃逸 CTL 识别),J Exp Med,180 ;779_782.[0213] 16.Ayyavoo, V.,Mahboubi, A.,Mahal ingam, S.,Ramalingam R.,Kudchodkar, S.,Williams, WV.,Green,DR.,Weiner, DB,1997,HIV-1vpr suppresses immune activationand apoptosis through regulation ofnuclear factor KB (HIV-1 vpr 通过调节核因子KB,抑制免疫活化和细胞凋亡),Nature Medicine,3:1117-1122.[0214] 17.Kerkau, Τ.,Bacik 1.,Bennink,JR.,Yewdell,JW.,Huning,T.,Schimpll,A.,Schubert,U,1997,The human immunodeficiency virus typel (HIV-1)vpu proteininterferes with an early step in the biosynthesis ofmajor histocompatibilitycomplex (MHC) class I molecules (人免疫缺陷病毒I型(HIV-1) vpu蛋白干扰主要组织相容性复合体(MHC) I类分子生物合成的早期步骤),J Exp Med, 185:1295-1305.[0215] 18.Lenburg, Μ.E.和 Landau N.R.,1993,VPU induced degradationof CD4:Requirement for specific amino acid residues in the cyotplasmicdomain of⑶4(VPU诱导⑶4降解:对⑶4胞质结构域特异性氨基酸残基的要求),J Virol,67:6542-6550.[0216] 19.Anderson, S.,Shugar, D.C.,SwanstrOM, R.,Garcia, J.V., 1993, Nef fromprimary isolates of human immunodeficiency virus type Isuppressed surface CD4expression in human and mouse T cells (人免疫缺陷病毒I型原代分离株的Nef,在人和小鼠T细胞中抑制表面CD4表达)J Virol 67:4923-4931.[0217] 20.Rosenberg,ES,Billings,JM,Caliendo,AM 等,Vigorous HIV-1Specific CD4T cell Responses Associated with Control of Viremia (强有力的 HIV-1 特异性 CD4 T细胞应答与病毒血症的控制有关),Science,278:1447-1450, (1997).[0218] 21.Kalam, SA, Walker BD., 2000, The critical need for CD4 helpinmaintaining effective cytotoxic T(在维持有效细胞毒性T中,对Q)4辅助的丨临界需求)Shankar P.Russo M.Harnisch B.Patterson M.SkolnikP.LiebermanJ.1mpaired function of circulating HIV-specific CD8(+)Tcells in chronic humanimmunodeficiency virus infection (慢性人免疫缺陷病毒感染中,循环HIV特异性CD8 (+) T 细胞的功能被削弱).Blood.96 (9):3094-101

[0219] 22.Mural1-Krishna, K.,Lau.,LL,Sambliara, S.,Lemonnier, F.,Altman,J.,Ahmed,R.,1999,Persistence of Memory CD8 T Cells inMHC Class 1-Deficient Mice(在MHC I类缺陷型小鼠中,记忆CD8 T细胞的持久性),Science,286:1377-1383.[0220] 23.Tagaya, Y.,Bamford, RN.,Defilippis, AP, Waldmann, TA.,1996,IL-15:APlenotropic Cytokine with Diverse Receptor/SignalingPathways Whose Expressionis Controlled at Multiple Pathways (具有不同受体 / 信号传导途径的 Plenotropic 细胞因子,其表达在多途径受到控制).1mmunity 4:329-336.[0221] 24.Chang, KH,Kim, JM,Kim HY,Sorig,YG,Choi, YH,Park, YS,Cho, JH·,Hong, SK.,2000, Spontaneous Programmed Cell Death ofPeripheral Blood Mononuclear Cellsfrom HIV-1nfected Persons isDecreased with IL-15 (HIV感染者的外周血单核细胞自发程序性细胞死亡,随 IL-15 而降低).Yonsei Medical Journal, 41:112-118.[0222] 25.Naora H.,Gougeon,ML,1999,Enhanced Survival and PotentExpansion ofthe Natural Killer Population of HIV Infected Individuals byExogenous IL_15(夕卜源IL-15使HIV感染者存活率提高并有效扩增自然杀伤群体).1mmunology Letters,68:359-367.[0223] 26.Lin,SJ,Roberts,RL,Ark,BJ,Nguyen,OH,Thomas,EH,Stichn,ER.,1997,HumanImmunodeficiency Virus(HIV)Type-1 GP120_Specific Cell Mediated CytotoxicityInterleukin-2 (IL-2),IL-12, and IL-15 (人免疫缺陷病毒(HIV) I 型 GP120 特异性细胞介导的细胞毒性白介素-2(IL-2)、IL-12 和 IL-15).Clin.1mm.1mmpath,82:163-173.[0224] 27.Loubeau, Μ.,Ahmad A.,Toma E.,Menezes,J.,1997,J0.Enhancement ofNatural Killer and Antibody Dependent CytotoxicActivities of the PeripheralMononuclear Cells of HIV-1nfected Patientsby Recombinant IL-15 (重组 IL-15 导致HIV感染者的外周单核细胞自然杀伤细胞和抗体依赖性细胞毒活性的增加).AIDS 16:137-145.[0225] 28.Kacani, L.,Sprizl GM.,Erdei, A.,Dierich, MP, 1999, Interleukin-15Enhances HIV-1 Driven Polyclonal B-Cell Response inVitro (白介素-15 在体外增强HIV-1 驱动的多克隆 B 细胞应答).Expand Clin Immun, 16:167-179.[0226] 29.Kacani, L., Stoiber H.,Dierich,MP,1997,Role of IL-15 in HIV-1Associated Hypergammaglobulinanemia (IL-15 在 HIV-1 相关高丙球蛋白血症中的作用).Clin Exp Imm 108:14-18.[0227] 30.Agostini, C.,Zambello, R.,Perrin A.,Piazzo, F.,Siviero, M.,Basso,U.,Borfolin,M.,Trentin L.,Semenatao,G.,1999,CD8 T-CellInfiltration inExtravascular Tissues of Patients with HumanImunodeeiciency Virus Infection.1nterleukin 15 Upmodulates Co-Stimulatory Pathways Involved in the AntigenPresenting Cells of T-celllnteraction(人免疫缺陷病毒感染者血管外组织中的CD8 T细胞浸润。白介素15上调涉及T细胞相互作用抗原呈递细胞的共同剌激途径).Blood,93:1277-1286.[0228] 31.Patki,AH.,Quinone S.,Mateo, ME.,Dorazio, D.,Yen-Lieberman Β.,BoomWH, Thomas, EK., Lederm`ann MM,1996, Activation of antigen Inducaed LymphocuteProliferation by Interleukin-15 Without the Mitogenic Effect og Interleukin-2That May InduceHuman Immunodefeciency Virus-1 Expression (由白介素-15 激活抗原诱导的淋巴细胞增殖,没有对可诱导人免疫缺陷病毒-1表达的白介素_2的促有丝分裂原效应).JCI,98:616-621.[0229] 32.Lucey DR.,Pinto LA,Bethke,FR.,Rusnak J.,Mekher GP, Hashemi,FN,Landay, AL,Kessler,HA, f Paxton, RJ.,Grabstein,K.,Shearer GM.,In VitroImmunologic and Virologic Effects of Interleukin-15 on Peripheral BloodMononuclear Cells from Normal Donors andHuman Immunodeficiency Virus Type-1Infected Patients (白介素-15对来自正常供体和人免疫缺陷病毒I型感染者的外周血单核细胞的体外免疫学和病毒学效应).Clin Diagn Lab Imm,4:43-48.[0230] 33.Kim, JJ.Trivedi, NN.,Nottingham,LK.,Morrison, L,Tsai, A.,Hu, Y.,Mahalingarn, S.,Dang, K.,Aim,L,Doyle, NK.,Wilson, D.,Chattergoon,MA.,Chalian,AA.,Boyer, JD.,Agadjanyan, M.,Weiner, DB.,1998, Modulation of amplitutude anddirection of in vivo immuneresponses by co-administration of cassettes withDNA immunogens (共同给予DNA免疫原盒,对体内免疫应答的幅度和方向的调节),Eur.JImmunol.28:1089-1103.[0231] 34.Kim JJ.Tsai A.Nottingham LK.Morrison L.Cunning DM.0h J.Lee DJ.DangK.Dentchev T.Chalian AA.Agadjanyan MG.Weiner DB,1999,Intracellular adhesionmolecule-1 modulates beta—chemokines anddirectly costimulates T cells invivo (胞内粘附分子-1在体内调节β -趋化因子并直接共同刺激T细胞),Journal ofClinical Investigation.103:869-77.[0232] 35.Mata, M.,Travers, PJ.Liu, Q.,Frankel,FR.,Paterson, Y.,1998,The MHCClass I Restricted Immune Response to HIV-1 gag in Balb/cMice Selects a SingleEpitope That Does not Have a Predictable MHCBinding-Motif and Binds to KdThrough Interactions Between aGlutamine at PS and Pocket D (在 Balb/c 小鼠中,针对HIV-1 gag的MHCI类限制性免疫应答选择单个表位,所述表位没有可预测的MHC结合基序,并通过在PS的谷氨酰胺与口袋之间的相互作用而结合Kd),Jo of Immun., 161:2985-2993.[0233] 36.McCarrick III JW, Parties JR, Seong RH,Solter D,Knowles BB.1993.Positive-negative selection gene targeting with the diphtheria toxinA-chaingene in mouse embryonic stem cells (在小鼠胚胎干细胞中,用白喉毒素A链基因进行正-负选择基因打革E ).Transgenic Res 2:183-190.[0234] 37.Bourgeois,C.,Rocha,B.,Tanchot,C.,A Role for CD40Expression on CD8+TCells in the Generation of CD8+T Cell Memory (在 CD8+T 细胞记忆产生过程中,CD40表达对 CD8+T 细胞的作用),2002,Science 297:2060-2063.[0235] 38.Sin J1.Kim JJ.Zhang D.Weiner DB.Modulation of cellularresponses byplasmid CD40L:CD40L plas mid vectors enhance antigen-specific helper T cell typeI CD4+T cell-mediated protective immunityagainst herpes simplex virus type 2in vivo (质粒CD40L对细胞应答的调节:CD40L质粒载体在体内增强抗原特异性辅助T细胞I型⑶4+T细胞介导的针对单纯疱疹病毒2型的保护性免疫).Human GeneTherapy.12:1091-102,2001.[0236] 39.Zhang, X.,Sun,S.,Hwang, 1.,Tough,DF.Sprent, 1998,J.,Immunity,8:591-599.[0237] 40.Ku,CC.,Murakami, M.,Sakamoto,A.,KappIer,J.,Marrack.P.,2000,Controlof Homerostasis of CD8 Memory T Cells by OpposingCytokines (相反细胞因子对 CD8记忆T细胞稳态的控制),Science,288:675-678.[0238] 41.Manjunath, N.,Shankar, P.,Wan, J.,Weninger, W.,Crowley, MA.Hieshmina,K., Springer, TA., Fan, X., Shen, H., Lieberman, J., vonAndrian, UH.,2001, Effectordifferentiation is not prerequisite forgeneration of memory cytotoxic Tlymphocytes (效应细胞分化对于记忆细胞毒性T淋巴细胞的产生来说并非必要),Journalof Clinicallnvestigation, 108:871-878.[0239] 42.Moore AC.Kong WP.Chakrabarti BK.Nabel GJ.Effects ofantigen andgenetic adjuvants on immune responses to humanimmunodeficiency virus DNAvaccines in mice (在小鼠中,抗原和遗传佐剂对针对人免疫缺陷病毒DNA疫苗的免疫应答的作用).Journal ofVirology.76(1):243-50,2002 年 I 月.[0240] 43.Serbina NV.Lazarevic V.Flynn JL 2001,CD4(+)T cells arerequired forthe development of cytotoxic CD8 (+)T cells duringMycobacterium tuberculosisinfection (在结核分枝杆菌感染中,CD4 (+) T细胞对细胞毒CD8 (+) T细胞发育来说是必需的).Journal ofImmunology.167:6991-7000.[0241] 实施例2

[0242] 需要⑶4(+) Th细胞并产生IFN-Y,以在免疫抑制个体体内以及抗肿瘤免疫中控制病毒复制。来自实验的数据证明,对于T细胞辅助以扩增CD8效应T细胞的需要,可以被疫苗部位局部产生IL-15和⑶40L来替代。用通过基因敲除II类MHC的β -链(MHC IIΚ0)而消除⑶4 (+) T细胞的小鼠进行实验,揭示出用抗原gag+IL-15+⑶40L初次免疫所述动物,导致CD8 T细胞的活化。用IFN-Y的产生(以斑点表示)测定活化。在该测定中多于50点的为阳性。这些数据见图9,说明了用于测定不依赖⑶4(+)T细胞辅助的效应⑶8T细胞的活化的简单方法。这些研究对于无免疫应答个体的治疗来说,具有重要意义。

[0243] 实施例3

[0244] 人、小鼠和猿猴IL-15 cDNA均编码162个氨基酸(aa)残基的前体蛋白,含有48个aa残基的前导序列,将其切除后,得到114个aa残基的成熟IL-15。人IL-15与猿猴和小鼠IL-15分别共享约97%和73%的序列同一性。人IL-15和猿猴IL-15对小鼠细胞都有活性。尽管IL-15的结构尚 未确定,但是预测其类似于IL-2和四螺旋束细胞因子家族的其它成员。(Grabstein, K.等(1994) Science 264:965, Anderson, D.Μ.等(1995) Genomics25:701 ;和 Bamford, R.N.等(1995) Cytokine 7:595, Brandhuber, B.J.等(1987) Science238:1707,所述文献都通过引用结合到本文中。)

[0245] IL-15 mRNA在心脏、肺、肝脏、胎盘、骨骼肌、粘附外周血单核细胞、APC(树突细胞)和上皮细胞系以及成纤维细胞系中都可检出。然而,IL-15 mRNA在含有高水平IL-2mRNA的活化外周血T细胞中没能检出。IL-15已经显示出刺激天然杀伤细胞、活化外周血T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和B细胞的生长。另外,IL-15也已经显示出是人血T淋巴细胞的趋化因子,在NK细胞中能诱导淋巴因子活化杀伤(LAK)活性,并能诱导溶细胞性效应细胞的产生。(Armitage, R.J.等(1995) J.1mmunol.154:483 ;P.Wilkinson

F.Liew (1995) J.Exp.Med.181: 1255 ;Grabstein, K.等(1994) Science 264:965 ;Giri,J.G.等(1994) EMBO J.13:2822 #PGiri,J.G.等(1995) EMBO J.15:3654,每篇文献都通过引用结合到本文中)。

[0246] 因为IL-15是原型Thl细胞因子,而且由于其作为T细胞、NK细胞、LAK细胞和TIL刺激物的活性,IL-15是一种令人兴奋的候选物,作为分子佐剂可与DNA疫苗(例如HIV疫苗)联用,以增强细胞免疫应答。IL-15增加HIV特异性CTL,而IL-15的过量产生与节段性回肠炎等炎性疾病有关。

[0247] RNA印迹分析表明IL-15的广泛组成型表达。表达的控制发生在转录后的翻译和转运(胞内运输)水平。IL-15 mRNA中包含许多妨碍其翻译成蛋白的元件,包括1)5' AUG带有上游AUG,其干扰有效的IL-15翻译(小鼠有5个,人有12个);2) IL-15编码序列的起始密码子具有弱KOZAK区(GTAATGA) ;3) IL-15成熟蛋白编码序列的C-端存在负元件。(Grabstein 等(1994)Science 264:965-968,Bamford 等(1996)PNAS 93:2897-2902 ;Bamford 等(1998)J.1mmunol 160:4418-4426 ;和 Kozak 等(1991)J.Cell Biol.115:887-903,所述文献各自通过引用结合到本文中。这三个控制元件各自可被消除,以改进表达。

[0248] 天然IL-15同种型含有两个前导肽:21个氨基酸的信号肽(SSP)或48个氨基酸的信号肽(LSP) (Waldmann 等,Ann.Rev > Immunol.(1999) 17:19-49,其通过引用结合到本文中。

[0249] 进行下述策略:通过优化用于免疫的IL-15 DNA构建体,来增加IL-15的表达。引物设计成从信号肽开始扩增IL-15,因此上游抑制性AUG在最终IL-15信使中不存在。引物设计成包括强KOZAK区(GCCGCCACC)。C-端负调节元件用PCR反义引物设计来除去。所述引物见图10。

[0250] 进行下述策略:通过用IgE前导序列取代48个氨基酸的IL-15信号肽(LSP),来增加IL-15的表达。有义引物设计成从48个氨基酸的LSP后开始,而反义引物从终止位点扩增。引物设计成包括强KOZAK区(GCCGCCACC-SEQ ID NO:4)。有义引物设计成含有IgEill导序列加上ATG起始位点的序列。所述引物见图11。

[0251] 制备不同的构建体,用于转染RD细胞。测定不同构建体的IL-15蛋白的产生。数据见图12A-C。图13A显示,包·含与IL-15连接的21个氨基酸信号肽(IL-15 SSP-左)的编码序列和人48个氨基酸信号肽(IL-15 LSP-右)的编码序列的人构建体的表达比较。图12B显示,包含48个氨基酸信号肽(人IL-15 LSP-左)的编码序列和IgE信号肽(人IL-15-1gE-右)的编码序列的人构建体的表达比较。图12C显示,包含48个氨基酸信号肽(恒河猴IL-15 LSP-左)的编码序列和IgE信号肽(恒河猴IL-15-1gE-右)的编码序列的恒河猴构建体的表达比较。

[0252] 对不同构建体所产生的IL-15蛋白,测定IL-15的生物活性。数据见图13A和图13B。图13A显示,在包含48个氨基酸信号肽(人IL-15LSP-左)和IgE信号肽(人IL-15-1gE-右)的编码序列的人构建体之间的IL-15生物活性比较。图13B显示,包含48个氨基酸信号肽(恒河猴IL-15 LSP-左)的编码序列和IgE信号肽(恒河猴IL-15-1gE-右)的编码序列的恒河猴构建体之间的IL-15生物活性比较。

[0253] 用具有与IgE信号肽编码序列连接的IL-15编码序列的插入序列的表达载体pVAX,制备构建体。也得到编码HIV-1 Gag的构建体。进行免疫学实验,用IL-15工程质粒以及HIV-1 Gag,比较对免疫应答的效应。按照图14的免疫方案,对Balb/c小鼠进行接种。

[0254] 在第三次免疫后5周,通过比较对抗原特异性IFN- Y产生的再次刺激,研究免疫应答。数据见图15。疫苗组包括首次用于实验的小鼠,接种载体PCDN3的小鼠,接种编码HIV-1 Gag的构建体的小鼠,接种编码HIV-1 Gag和IL-15 (连接48个氨基酸信号肽)的构建体的小鼠,接种编码HIV-1 Gag以及IgE信号肽的构建体的小鼠。

[0255] 实施例4

[0256] 构建工程化IL-15质粒疫苗,即通过除去天然IL-15 Kozak区、AUG和UTR。提供具有IgE信号肽编码序列的工程化IL-15质粒。工程化IL-15的表达水平比相关野生型质粒高30-50倍。在用工程化IgE信号-1L-15和HIV-1 gag构建体共同免疫的小鼠中,所观察到的免疫应答明显比单用HIV-1 gag构建体免疫的小鼠高几倍。数据见图16。

[0257] 实施例5

[0258] 编码免疫调节蛋白的分离的cDNA可用作构建可产生免疫调节蛋白的构建体的原料。在一些实施方案中,提供这样的构建体:其中一个以下免疫调节蛋白的编码序列与IgE信号肽连接。在一些实施方案中,提供所述构建体作为疫苗和免疫调节组合物的组成部分,例如如上所述的构建体。

[0259] 用标准技术和易得原料,可以制备编码免疫调节蛋白的核酸分子,并掺入到如上所述的构建体、载体、疫苗等中。

[0260] Genbank检索号AF031167是指人IL-15 mRNA的完整编码序列。Genbank检索号Y09908、X91233、X94223和Χ94222也是指人IL-15序列。它们都通过引用结合到本文中。

[0261] Genbank检索号L07414是指人⑶40-配体mRNA的完整编码序列。其通过引用结合到本文中。

[0262] Bax的核苷酸序列和氨基 酸序列的GENBANK检索号为L22473,其通过引用结合到本文中。

[0263] TRAIL的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为U37518或AF023849,其通过引用结合到本文中。

[0264] TRAILrecDRC5的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为U90875或AF016266,其通过引用结合到本文中。通过引用结合到本文中的还有TRAIL-R2 AFO16849 ;TRAIL-R3 AF014794;和 TRAIL-R4 AF021232。

[0265] RANK的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为AF018253,其通过引用结合到本文中。

[0266] RANK配体的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为AFO19047或AF333234,其通过引用结合到本文中。

[0267] 0x40的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为X75962,其通过引用结合到本文中。

[0268] 0x40配体的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为X79929或AB007839,其通过引用结合到本文中。

[0269] NKG2D的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为AF461811或X54870,其通过引用结合到本文中。

[0270] MICA的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为X92841,其通过弓丨用结合到本文中。

[0271] MICB的核苷酸序列和氨基酸序列的、GENBANK检索号为U65416,其通过引用结合到本文中。

[0272] NKG2A的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为X54867,其通过引用结合到本文中。

[0273] NKG2B的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为X54868,其通过引用结合到本文中。

[0274] NKG2C的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为X54869或Aj0016984,其通过引用结合到本文中。

[0275] NKG2E的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为L14542,其通过引用结合到本文中。

[0276] NKG2F的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为AH006173、U96845或U96846,其通过引用结合到本文中。

[0277] CD30的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为M83554,(Durkop,H等,Cell68 (3),421-427 (1992)),其通过引用结合到本文中。

[0278] ⑶153 (⑶30L)的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK检索号为L09753,(Smith,C.A.等,Cell 73(7) ,1349-1360(1993)),其通过引用结合到本文中。

[0279] Fos的核苷酸序列的GENBANK检索号为K00650或V01512,其通过引用结合到本文中。

[0280] c-jun的核苷酸序列的GENBANK检索号为J04111或M29039,其通过引用结合到本文中。

·[0281] Sp-1 的核苷酸序列的 GENBANK 检索号为 BC021101、BC005250、BC002878、M31126、J02893或X15102,其通过引用结合到本文中。

[0282] Apl的核苷酸序列可在以下文献中找到:Lee等,1987 Cell 49:741-752,Rauscher 等,1988 Science 240:1010-1016,和 Chiu 等,1988Cell 54:541_552,其通过引

用结合到本文中。

[0283] Ap-2的核苷酸序列的GENBANK检索号为M36711,其通过引用结合到本文中。

[0284] p38的核苷酸序列的GENBANK检索号为U66243,其通过引用结合到本文中。

[0285] p65Rel的核苷酸序列的GENBANK检索号为L19067,其通过引用结合到本文中。

[0286] MyD88的核苷酸序列的GENBANK检索号为U70451,其通过引用结合到本文中。

[0287] IRAK的核苷酸序列的GENBANK检索号为NM001569,其通过引用结合到本文中。

[0288] TRAF6的核苷酸序列的GENBANK检索号为U78798,其通过引用结合到本文中。

[0289] IkB的核苷酸序列可在以下文献中找到:Gilmore等,Trends Genetl993年12月;9(12):427-33,其通过引用结合到本文中。

[0290] NIK的核苷酸序列的GENBANK检索号为Y10256,其通过引用结合到本文中。

[0291] SAP K的核苷酸序列可在以下文献中找到:Franklin等,Oncogene.1995年12月7日;11(11):2365-74,其通过引用结合到本文中。

[0292] SAPl的核苷酸序列的GENBANK检索号为M85164或M85165,其通过引用结合到本文中。

[0293] JNK2的核苷酸序列的GENBANK检索号为L31951,其通过引用结合到本文中。

[0294] JNK1B2的核苷酸序列的GENBANK检索号为U35005 ;其通过引用结合到本文中。

[0295] JNKlBl的核苷酸序列的GENBANK检索号为U35004 ;其通过引用结合到本文中。

[0296] JNK2B2的核苷酸序列的GENBANK检索号为U35003 ;其通过引用结合到本文中。[0297] JNK2B1的核苷酸序列的GENBANK检索号为U35002 ;其通过引用结合到本文中。

[0298] JNKIA2的核苷酸序列的GENBANK检索号为U34822 ;其通过引用结合到本文中。

[0299] JNK2A1的核苷酸序列的GENBANK检索号为U34821 ;其通过引用结合到本文中。

[0300] JNK3A1的核苷酸序列的GENBANK检索号为U34820 ;其通过引用结合到本文中。

[0301] JNK3A2的核苷酸序列的GENBANK检索号为U34819,其通过引用结合到本文中。

[0302] NF- κ -B2即p49剪接形式的核苷酸序列的GENBANK检索号为A57034,其通过引用结合到本文中。

[0303] NF- κ -B2即plOO剪接形式的核苷酸序列的GENBANK检索号为A42024,其通过引用结合到本文中。

[0304] NF- κ -B2即pl05剪接形式的核苷酸序列的GENBANK检索号为S17233,其通过引用结合到本文中。

[0305] NF- κ -B 50K链前体的核苷酸序列的GENBANK检索号为A37867,其通过引用结合到本文中。

[0306] NF κ B p50 的核苷酸序列描述于:Meyer R.等(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88(3),966 970,其通过引用结合到本文中。

[0307] 人IL-1的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献:Telford等(1986)Nucl.Acids Res.14:9955-9963, Furutani 等(1985)Nucl.Acids Res.14:3167-3179,March ^ (1985)Nature 315:641-647和检索号 Swissprot P01583,其各自通过引用结合到本文中。

``[0308] 人IL-2的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献=HolbiOok等(1984) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:1634-1638, Fujita 等(1983) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 80:7437-7441, Fuse 等(1984)Nucl.Acids Res.12:9323-9331, Taniguchi 等(1983)nature 302:305-310,Meada 等(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.115:1040-1047,Devos等(1983)Nucl.Acids Res.11:4307_4323,检索号为 Swissprot P01585,其各自通过引用结合到本文中。

[0309] 人IL-4的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献:Arai等(1989)J.1mmunol.142:274-282 Otsuka 等(1987)Nucl.AcidsRes.15:333_344,Yokota 等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci USA 83:5894_5898,Noma 等(I 984)Nature 319:640_646,Lee 等

(1986) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 83:2061_2063,和检索号 Swissprot 05112 (鼠 IL-4 的检索号为Swissprot 07750),其各自通过引用结合到本文中。

[0310] 人IL-5的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献:Campbell等

(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 84:6629-6633, Tanabe 等(1987) J.Biol.Chem.262:16580-16584,Campbell 等(1988)Eur.J.Biochem.174:345_352,Azuma 等(1986)Nucl.Acids Res.14:9149-9158, Yokota 等(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 84:7388_7392,和检索号Swissprot P05113,其各自通过引用结合到本文中。

[0311] 人IL-1O的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献:Viera等(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:1172_1176,和检索号 Swissprot P22301。

[0312] 人IL-15的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献=Grabstein等(1994) Science 264:965_968,和检索号SwissprotU03099,其各自通过引用结合到本文中。

[0313] 人IL-18的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献=Ushio等(1996) J.1mmunol.156:4274_4279,检索号为D49950,其各自通过引用结合到本文中。

[0314] 人TNF-α的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献:Pennica,(1984)Nature 312:724_729,检索号为SwissprotP01375,其各自通过引用结合到本文中。

[0315] 人TNF-β的核苷酸序列和氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献:Gray,(1984)Nature 312:721_724,和检索号Swessprot P01374,其各自通过引用结合到本文中。人IL-1O氨基酸序列是众所周知的,示于以下文献:Viera等(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:1172-1176,和检索号Swissprot P22301,其各自通过引用结合到本文中。

[0316] 人白介素12 mRNA的完整编码序列示于Genbank检索号AF180563(P40 mRNA)和AF180562(P35 mRNA)和美国专利第5,840,530号,其各自通过引用结合到本文中。

[0317] MadCAM-1 的序列信息参见 Genbank 检索号 U80016 (Leung, E.等,Immunogenetics46(2),111-119(1997)),其各自通过引用结合到本文中。

[0318] MadCAM-1 的序列信息参见 Genbank 检索号 U43628 (Shyjan, A.Μ.等,J.1mmunol.156 (8),2851-2857 (1996)),其各自通过引用结合到本文中。

[0319] NGF 的序列信息参见 Genbank 检索号 M57399 (Kretschmer, P.J.等,GrowthFactors 5,99-114 (1991)),其各自通过引用结合到本文中。

[0320] IL-7 的序列信息参见 Genbank检索号 J04156 (Goodwin, R.G.等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.86(1), 302-306 (1989)),其各自通过弓I用结合到本文中。

[0321] VEGF 的序列信息参·见 Genbank 检索号 M32977 (Leung, D.W.等,Science 246,1306-1309 (1989)),其各自通过引用结合到本文中。

[0322] TNF-R 的序列信息参见 Genbank 检索号 M60275 (Gray, P.W.等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.87,7380-7384 (1990)),其各自通过弓I用结合到本文中。

[0323] TNF-R的序列信息参见Genbank检索号M63121 (Himmler,A.等,DNA Cell Biol.9,705-715 (1990)),其各自通过弓I用结合到本文中。

[0324] Fas 的序列信息参见 Genbank 检索号 M67454(Itoh, N.等,Cell 66(2),233-243 (1991)),其各自通过引用结合到本文中。

[0325] CD40L 的序列信息参见 Genbank 检索号 L07414 (Gauchat, J.F.M.等,FEBS Lett,315,259-266 (1992),其各自通过引用结合到本文中。

[0326] IL-4 的序列信息参见 Genbank 检索号 M23442 (Arai, N.等,J.1mmunol.142(1),274-282 (1989)),其各自通过弓I用结合到本文中。

[0327] IL-4 的序列信息参见 Genbank 检索号 M13982 (Yokota, T.等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.83 (16),5894-5898 (1986)),其各自通过弓I用结合到本文中。

[0328] CSF 的序列信息参见 Genbank 检索号 M37435 (Wong, G.G.等,Science 235 (4795),1504-1508 (1987)),其各自通过引用结合到本文中。

[0329] G-CSF 的序列信息参见 Genbank 检索号 X03656 (Nagata, S.等,EMBO J.5 (3),575-581 (1986)),其各自通过弓I用结合到本文中。

[0330] G-CSF 的序列信息参见 Genbank 检索号 X03655 (Nagata, S.等,EMBO J.5 (3),575-581 (1986)),其通过引用结合到本文中。[0331] GM-CSF 的序列信息参见 Genbank检索号 Ml 1220 (Lee, F.等,Proc.Ntl.Acad.Sc1.U.S.A.(13) ,4360-4364(1985)),其通过引用结合到本文中。

[0332] GM-CSF 的序列信息参见 Genbank 检索号 M10663(ffong, G.G.等,Science228 (4701),810-815 (1985)),其通过引用结合到本文中。

[0333] M-CSF 的序列信息参见 Genbank 检索号 M27087 (Takahashi, M.等,Biochem.Biophys.Res.Commun.161 (2),892-901 (1989)),其通过引用结合到本文中。

[0334] M-CSF 的序列信息参见 Genbank 检索号 M37435(Wong G.G.等,Science235(4795),1504-1508 (1987)),其通过引用结合到本文中。

[0335] LFA-3 的序列信息参见 Genbank 检索号 Y00636 (Wallner, B.P.等,J.Exp.Med.166 (4),923-932 (1987)),其通过引用结合到本文中。

[0336] ICAM-3的序列信息参见Genbank检索号X69819,其通过引用结合到本文中。

[0337] ICAM-2 的序列信息参见 Genbank 检索号 X15606 (Staunton, D.E.等,Nature339 (6219),61-64 (1989)),其通过引用结合到本文中。

[0338] ICAM-1 的序列信息参见 Genbank 检索号 J03132 (Staunton,D.E.等,Cell 52(6),925-933 (1988)),其通过引用结合到本文中。

[0339] PECAM 的序列信息参见 Genbank 检索号 M28526 (Newman, P.J.等,Science 247,1219-1222 (1990),其通过引用结合到本文中。

[0340] P150.95 的序列信息参见 Genbank 检索号 Y00093 (Corbi,A.L.等,EMBO J.6(13),4023-4028 (1987)),·其通过引用结合到本文中。

[0341] Mac-1 的序列信息参见 Genbank 检索号 J03925 (Corbi, A.L.等,J.Biol.Chem.263(25),12403-12411 (1988)),其通过引用结合到本文中。

[0342] LFA-1 的序列信息参见 Genbank 检索号 Y00796 (Larson.R.等,J.CellBiol.108 (2),703-712 (1989)),其通过引用结合到本文中。

[0343] CD34 的序列信息参见 Genbank 检索号 M81104 (Simmons, D.L.等,J.1mmunol.148,267-271 (1992)),其通过引用结合到本文中。

[0344] RANTES 的序列信息参见 Genbank 检索号 M21121 (Schall,T.J.等,J.1mmunol.141,1018-1025 (1988)),其通过引用结合到本文中。

[0345] IL-8 的序列信息参见 Genbank 检索号 M28130 (Mukaida, N.等,J.1mmunol.143(4),1366-1371 (1989)),其通过引用结合到本文中。

[0346] MIP-1 α 的序列信息参见 Genbank 检索号 U72395 (Fridell,R.Α.等,J.Cell.ScillO(ptll),1325-1331 (1997)),其通过引用结合到本文中。

[0347] E-selecton 的序列信息参见 Genbank 检索号 M24736 (Bevilacqua, M.P.等,Science 243(4895),1160-1165 (1989)),其通过引用结合到本文中。

[0348] CD2 的序列信息参见 Genbank 检索号 M14362 (Sewell, ff.A.等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.SA83,8718-8722 (1986) ;Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.84,7256-7256 (1987)),其通过引用结合到本文中。

[0349] MCP-1 的序列信息参见 Genbank 检索号 S69738(Li,Y.S.等,Mol.Cell.Biochem.126 (I),61-68 (1993)),其通过引用结合到本文中。

[0350] L-selection 的序列信息参见 Genbank 检索号 X16150 (Tedder, T.F.等,J.Exp.Med.170(1),123-133(1989)),其通过引用结合到本文中。

[0351] P-selection 的序列信息参见 Genbank 检索号 M25322 (Johnston, G.1.等,Cell56,1033-1044(1989),其通过引用结合到本文中。

[0352] FLT 的序列信息参见 Genbank 检索号 X94263 (Mandriota, S.J.等,J.Biol.Chem.271 (19),11500-11505 (1996)),其通过引用结合到本文中。

[0353] FLT 的序列信息参见 Genbank 检索号 X51602 (Shibuya, M.等,Oncogene 5(4),519-524 (1990) Hah, H.J.等 Hum.Mol.Genet.2 (12),2204 (1993)),其通过引用结合到本文中。

[0354] Apo-1 的序列信息参见 Genbank 检索号 X63717 (Oehm 等,J.Biol.Chem., (1992),267(15),10709-15),其通过引用结合到本文中。

[0355] Fas 的序列信息参见 Genbank 检索号 M67454 (Itoh 等,Cell, (1991),66 (2),233-43),其通过引用结合到本文中。

[0356] TNFR-1 的序列信息参见Genbank检索号M67454(Nophar等,EMBO J.,1990,9(10),3269-78),其通过弓I用结合到本文中。

[0357] p55 的序列信息参见 Genbank 检索号 M58286 (Loetscher 等,Cell, 1990,61,351-359),其通过引用结合到本文中。

[0358] WSL-1 的序列信息参见 Genbank 检索号 Y09392 (Kitson 等,Nature, 1996,384 (6607),372-5),其通过弓I用结合到本文中。

[0359] DR3 的序列信息参 见 Genbank 检索号 U72763 (Chinnaiyan 等,Science, 1996,274 (5829),990-2),其通过弓I用结合到本文中。

[0360] TRAMP 的序列信息参见 Genbank 检索号 U75381 (Bodmer 等,Immunity, 1997,6 (I),79-88),其通过引用结合到本文中。

[0361] Apo-3 的序列信息参见 Genbank 检索号 U74611 (Marsters 等,Curr.Biol., 1996,6(12),1669-76),其通过引用结合到本文中。

[0362] AIR的序列信息参见Genbank检索号U78029,其通过引用结合到本文中。

[0363] LARD 的序列信息参见 Genbank检索号 U94512 (Screaton 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1997,94(9),4615-19),其通过引用结合到本文中。

[0364] NGRF 的序列信息参见 Genbank 检索号 M14764 (Johnson 等,Cell, 1986,47 (4),545-554),其通过弓I用结合到本文中。

[0365] DR4 (TRAIL)的序列信息参见 Genbank 检索号 U90875 (Pan 等,Science, 1997,276(5309),111-113),其通过引用结合到本文中。

[0366] DR5 的序列信息参见 Genbank 检索号 AF012535 (Sheridan 等,Science, 1997,1227 (5327),818-821),其通过引用结合到本文中。

[0367] KILLER 的序列信息参见 Genbank 检索号 AF022386 (Wu 等,Nat.Genet.17 (2),141-143 (1997)),其通过引用结合到本文中。

[0368] TRA1L-R2的序列信息参见Genbank检索号AF020501,其通过引用结合到本文中。

[0369] TRICK2的序列信息参见Genbank检索号AF018657。

[0370] DR6的序列信息参见Genbank检索号AF068868,其通过引用结合到本文中。

[0371] ICE 的序列信息参见 Genbank 检索号 U13697、U13698 和 U13699 (Alnemri,E.S.等,J.Biol.Chem.270 (9),4312-4317 (1995)),其通过引用结合到本文中。

[0372] VLA-1 的序列信息参见Genbank检索号 X17033(Takada.等,J.Biol.Chem.109(1),397-407 (1989)),其通过引用结合到本文中。

[0373] CD86(B7.2)的序列信息参见 Genbank 检索号 U04343 (Azuma 等,Nature.366 (6450),76 (1993)),其通过引用结合到本文中。

[0374]表 I

[0375]小 RNA 病毒科(Picornavirus Family)

[0376] 属:鼻病毒属(Rhinovirus):(医学)是约50%感冒的病因

[0377] 肠道病毒属(Etherovirus):(医学)包括脊髓灰质炎

[0378] 病毒(poliovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、埃

[0379] 可病毒(echovirus)和人肠道病毒(human enterovirus)

[0380] 例如甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)

[0381] 口疮病毒属(Apthoviruse):(兽医)是口蹄疫病毒

[0382] 靶抗原:VP1、VP2、VP3、VP4、VPG

[0383]杯状病毒科(Calcivirus Family)

[0384] 属:诺沃克病毒组 (Norwalk group of Virus):(医学)这

[0385] 些病毒是流行性胃肠炎的重要致病因子

[0386]披膜病毒科(Togavirus Family)

[0387] 属:甲病毒属(Alphavirus):(医学和兽医)实例包括

[0388] Senilis virus、罗斯河病毒(Ross River virus)、东方

[0389] 马脑炎病毒和西方马脑炎病毒(Eastern & Western

[0390] Equine encephalitis virus)

[0391] 呼肠孤病毒属(Reovirus):(医学)风疫病毒(Rubella

[0392] virus)

[0393]黄病毒科(Flariviridue Family)

[0394] 实例包括:(医学)登革病毒(dengue virus)、黄热病

[0395] 毒(yellow fever virus)、日本脑炎病毒(Japanese

[0396] encephalitis virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis

[0397] encephalitis virus)和蝶传脑炎病毒(tick borne

[0398] encephalitis virus)。西尼罗病毒(West Nile virus)

[0399] (Genbank NC001563, AF533540, AF404757,

[0400] AF404756, AF404755, AF404754, AF404753,

[0401] AF481864, M12294, AF317203, AF196835,

[0402] AF260969, AF260968, AF260967, AF206518 和

[0403] AF202541)

[0404] 代表性靶抗原:

[0405] E

[0406] NS5

[0407] C[0408] 丙型肝炎病毒:(医学)这类病毒不在一个科内,但是据信仍是披膜

[0409] 病毒(togavirus)或黄病毒(fIavivirus)。与披膜病毒科最相似。

[0410] 冠状病毒科(Coronavirus Family):(医学和兽医)

[0411] 传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus)(家

[0412] 禽)

[0413] 猪传染性胃肠病毒(Porcine transmissible

[0414] gastroenteric virus)(猪)

[0415] 猪血凝脑脊髓炎病毒(Porcine hemaglutinating

[0416] encephalomyelitis virus)(猪)

[0417] 猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis

[0418] virus)(猫)

[0419] 猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus)(猫)

[0420] 犬冠状病毒(Canine coronavirus)(狗) [0421] SARS 相关性冠状病毒(SARS associated

[0422] coronavirus)

[0423] 人呼吸道冠状病毒(Human respiratory coronavirus)

[0424] 引起约40种感冒

[0425] EX.224E,0C43

[0426] 注释-冠状病毒可引起非甲、非乙或非丙型肝炎

[0427] 靶抗原:

[0428] El-也称为M或基质蛋白

[0429] E2-也称为S或剌突(Spike)蛋白

[0430] E3-也称为 BE 或 hemagglutin-elterose 糖蛋白(不

[0431] 存在于所有冠状病毒中)

[0432] N-核壳

[0433]弹状病毒科(Rhabdovirus Family)

[0434] 属:水疱病毒属(Vesiliovirus)

[0435] 狂犬病毒属(Lyssavirus):(医学和兽医)狂犬病

[0436] 靶抗原:G蛋白

[0437] N 蛋白

[0438]丝状病毒科(Filoviridue Family):(医学)

[0439] 出血热病毒(Hemorrhagic fever virus),例如马尔堡

[0440] 病毒(Marburg virus)和埃博拉病毒(Ebola virus)

[0441]副粘病毒科(Paramyxovirus Family):

[0442] 属:副粘病毒属(Paramyxovirus):(医学和兽医)

[0443] 目思腺炎病毒(Mumps virus)、新城疫病毒(New Castle

[0444] disease virus)(鸡的重要病原体)

[0445] 麻疹病毒属(Mortilliviiais):(医学和兽医)麻疹、犬

[0446] 瘟热[0447] 肺病毒属(Pneuminvirus):(医学和兽医)

[0448] 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)

[0449]正粘病毒科(Orthomyxovirus Family)(医学)

[0450] 流感病毒(Influenza virus)

[0451]布尼亚病毒科(Bungavirus Family)

[0452] 属:布尼亚病毒属(Bungavirus):(医学)加州脑炎病毒

[0453] (California encephalitis virus LA Crosse)

[0454] 白蛉热病毒属(Phlebovirus):(医学)立夫特山谷热

[0455] 病毒(Rift Valley Fever virus)

[0456] 汉坦病毒属(Hantavirus):Puremala是一种出血热

[0457] 病毒

[0458] 纳伊罗病毒(Nairvirus)(兽医)内罗毕绵羊病

[0459] 还有许多未命名的布尼亚病毒

[0460]沙粒病毒科(Arenavirus Family)(医学) [0461] LCM,拉沙热病毒(Lassi fever virus)

[0462]呼肠孤病毒科(Reovirus Family)

[0463] 属:呼肠孤病毒属(Reovirus):可能的人病原体

[0464] 轮状病毒属(Rotavirus):小儿急性胃肠炎

[0465] 环状病毒属(Orbivirus):(医学和兽医)

[0466] 科罗拉多蜱热、Lebombo (人)马器质性脑病、蓝舌

[0467]逆转病毒科(Retrovirus Family)

[0468] 亚科:

[0469] 致癌RNA病毒亚科(Oncorivirinal):(兽医)(医学)

[0470] 猫白血病病毒(feline leukemia virus)、HTLVI 和

[0471] HTLVII

[0472] 慢病毒亚科(Lentivirinal):(医学和兽医)HIVjg

[0473] 免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus)、马

[0474] 传染性贫血病毒(equine infections, anemia virus)

[0475] 泡沫病毒亚科(Spumavirinal)

[0476]乳多空病毒科(Papovavirus Family)

[0477] 亚科:

[0478] 多瘤病毒属(Polyomavirus):(医学)BKU 和 JQJ

[0479] 病毒

[0480] 亚科:

[0481] 乳头瘤病毒属(Papillomavirus):(医学)癌症或恶

[0482] 性乳头瘤相关的许多病毒类型

[0483]腺病毒(Adenovirus)(医学)

[0484] EX AD7,ARD.,0.B.-引起呼吸道疾病_某些腺

[0485] 病毒例如275引起肠炎[0486]细小 DNA 病毒科(Parvovirus Family)(兽医)

[0487] 猫细小DNA病毒(Feline parvovirus):引起猫肠炎

[0488] 猫肠炎病毒(Feline panleucopeniavirus)

[0489] 犬细小 DNA 病毒(Canine parvovirus)

[0490] 猪细小 DNA 病毒(Porcine parvovirus)

[0491]痕疫病毒科(Herpesvirus Family)

[0492] 亚科:甲型痕疫病毒亚科(Alphaherpesviridue)

[0493] 属:单纯疱疫病毒属(Simplexvirus)(医学)

[0494] HSVI (Genbank X14112,NC001806),HSVII

[0495] (NC001798)

[0496] 水痘病毒属(Varicellovirus):(医学兽医)伪狂犬病-

[0497] 水痘-带状疱疹

[0498] 亚科:乙型痕疫病毒亚科(Betaherpesviridue) [0499] 属:巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)(医学)

[0500] HCMV

[0501 ] 鼠巨细胞病毒属(Muromegalovirus)

[0502] 亚科:丙型痕疫病毒亚科(Gammaherpesviridue)

[0503] 属:淋巴隐伏病毒属(Lymphocryptovirus)(医学)

[0504] EBV_(伯基特淋巴瘤(Burkitts Iympho))

[0505] 蛛猴疱疫病毒属(Rhadinovirus)

[0506]痕病毒科(Poxvirus Family)

[0507] 亚科:脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxviridue)(医学-兽

[0508] 医)

[0509] 属:天花病毒属(Variola)(天花)

[0510] 痘苗病毒属(Vaccinia)(牛痘)

[0511] 副痘病毒属(Parapoxivirus)-兽医

[0512] 禽痘病毒属(Auipoxvirus)-兽医

[0513] 山羊痘病毒属(Capripoxvirus)

[0514] 野兔痘病毒属(Leporipoxvirus)

[0515] 猪痘病毒属(Suipoxvirus)

[0516] 亚科:昆虫痘病毒亚科(Entemopoxviridue)

[0517]嗜肝 DNA 病毒科(Hepadnavirus Family)

[0518] 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)

[0519]未分类 丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus)

[0520]表 2

[0521] 细菌病原体

[0522] 致病性革兰氏阳性球菌包括:肺炎球菌(pneumococcal);葡

[0523] 萄球菌(staphylococcal);和链球菌(streptococcal)。致病性革

[0524] 兰氏阴性球菌包括:脑膜炎球菌(menignococcal);和淋病球[0525] 菌(gonococcal)。

[0526] 致病性革兰氏阴性肠杆菌包括:肠杆菌科

[0527] (enterobacteriaceae);假单胞菌属(pseudomonas)、不动杆菌

[0528] 属(acinetobacteria)和艾肯氏菌属(eikenella)、melioidosis ;沙

[0529] 门氏菌属(sahnonella);志贺氏菌属(shigellosis);嗜血杆菌

[0530] 属(hemophilus);软下推菌属(chancroid);布鲁氏菌属

[0531] (brucellosis) ;土拉热菌属(tularemia);耶尔森氏菌属(yersinia

[0532] (巴斯德氏菌属(pasteurella));念球状链杆菌(streptobacillus

[0533] mortiliformis)和螺菌属(spirillum);单核细胞增生李斯特氏

[0534] 菌(listeria monocytogenes);猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrix

[0535] rhusiopathiae);白喉(diphtheria)、霍乱(cholera)、炭疽

[0536] (anthrax);性病肉芽肿(donovanosis (腹股沟肉芽肿(granuloma

[0537] inguinale));和巴尔通体病(bartonellosis)。

[0538] 致病性厌氧菌包括:破伤风(tetanus));肉毒中毒(botulism);

[0539] 其它梭状芽孢杆菌;·结核(tuberculosis);麻风(leprosy);和

[0540] 其它分枝杆菌。致病性螺旋体病包括:梅毒(syphilis);-密

[0541] 螺旋体病(treponematoses):雅司病(yaws)、品他病(pinta)和

[0542] 地方性梅毒;和钩端螺旋体病(leptospirosis)。

[0543] 由高等病原菌和致病性真菌引起的其它感染包括:放线菌

[0544] 病(actinomycosis);诺卡氏菌病(nocardiosis);隐球菌病

[0545] (cryptococcosis)、芽生菌病(blastomycosis)、组织胞衆菌病

[0546] (histoplasmosis)和球抱子菌病(coccidioidomycosis);念珠菌

[0547] 病(candidiasis)、曲霉病(aspergillosis)和毛霉病

[0548] (mucormycosis);抱子丝菌病(sporotrichosis);类球抱子菌病

[0549] (paracoccidiodomycosis)、petriellidiosis、球拟酵母菌病

[0550] (torulopsosis)、足分支菌病(mycetoma)和着色真菌病

[0551] (chromomycosis);和皮肤真菌病(dermatophytosis) ◦

[0552] 立克次氏体感染包括立克次氏体病(rickettsial和

[0553] rickettsioses)。

[0554] 支原体(mycoplasma)和衣原体(chlamydial)感染包括:

[0555] 肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae);性病性淋巴肉

[0556] 芽肿瘤(lymphogranuloma venereum);婴鸟鶴热

[0557] (psittacosis);和围产期衣原体感染。

[0558] 致病性真核生物

[0559] 致病性原生动物和寄生虫及其感染包括:阿米巴病

[0560] (amebiasis);症疾(malaria);利什曼病(leishmaniasis);维虫

[0561] 病(trypanosomiasis);弓形体病(toxoplasmosis);卡氏肺囊虫

[0562] (pneurnocystis carinii);巴贝虫病(babesiosis);贾第鞭毛虫

[0563] 病(giardiasis);旋毛虫病(trichinosis);丝虫病(filariasis);血[0564] 吸虫病(schistosomiasis));线虫(nematode);吸虫(trematode

[0565] 或 fluke);和绦虫(cestode (tapeworm))感染。

Claims (9)

1.一种编码融合蛋白的分离的核酸分子,所述融合蛋白由IgE信号肽与非IgE蛋白序列连接组成,其中所述IgE信号肽和所述非IgE蛋白序列来源于相同物种的动物,而且其中所述非IgE蛋白为IL-15。
2.权利要求1的分离的核酸分子,其中所述分离的核酸分子是质粒。
3.权利要求1或2的核酸分子,所述核酸分子掺入到病毒载体中。
4.一种注射用药物组合物,所述组合物包含权利要求1-3任一项的核酸分子。
5.一种重组疫苗,所述疫苗包含权利要求1-3任一项的核酸分子。
6.—种减毒活病原体,其中包含权利要求1-3任一项的核酸分子。
7.—种由IgE信号肽与非IgE蛋白连接组成的融合蛋白,其中所述IgE信号肽和所述非IgE蛋白来源于相同物种的动物,而且其中所述非IgE蛋白为IL-15。
8.—种体外细胞培养物,所述细胞培养物包括含权利要求1-3任一项的核酸分子的细胞,其中所述核酸序列与在所述细胞中表达所需的调节元件操作性连接。
9.一种制备融合蛋白的方法,所述方法包括将细胞在融合蛋白表达所需的条件下培养足够时间,所述细胞包括含编码所述融合蛋白的核酸分子的细胞,其中所述核酸分子包含在所述细胞中表达所述融 合蛋白所需的调节元件,所述培养时间足以让所述细胞表达所述融合蛋白;并且所述融合蛋白是权利要求7的融合蛋白。
CN 200480022891 2003-06-13 2004-06-14 编码IgE信号肽和/或IL-15的核酸序列与包含IgE信号肽和/或IL-15的组合物及其使用方法 CN1832956B (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47820503 true 2003-06-13 2003-06-13
US47821003 true 2003-06-13 2003-06-13
US60/478,210 2003-06-13
US60/478,205 2003-06-13
PCT/US2004/018962 WO2005000235A3 (en) 2003-06-13 2004-06-14 NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING AND COMPOSITIONS COMPRISING IgE SIGNAL PEPTIDE AND/OR IL-15 AND METHODS FOR USING THE SAME

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1832956A true CN1832956A (zh) 2006-09-13
CN1832956B true CN1832956B (zh) 2013-11-20

Family

ID=33555491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200480022891 CN1832956B (zh) 2003-06-13 2004-06-14 编码IgE信号肽和/或IL-15的核酸序列与包含IgE信号肽和/或IL-15的组合物及其使用方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US8173786B2 (zh)
EP (2) EP2292634A3 (zh)
JP (2) JP2007516696A (zh)
KR (2) KR101225473B1 (zh)
CN (1) CN1832956B (zh)
CA (1) CA2529145C (zh)
WO (1) WO2005000235A3 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8173786B2 (en) * 2003-06-13 2012-05-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
KR101421745B1 (ko) * 2006-01-13 2014-07-22 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 코돈 최적화된 il―15를 사용하는 백신 및 면역치료제, 및 그의 사용 방법
KR20170024131A (ko) * 2006-07-28 2017-03-06 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 개선된 백신 및 이의 사용 방법
JP5788676B2 (ja) * 2008-01-11 2015-10-07 イノビオ ファーマシューティカルズ,インコーポレイティド デングウイルスの複数のサブタイプに対する新規ワクチン
CA2720168A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 David B. Weiner Vaccines and immunotherapeutics using il-28 and compositions and methods of using the same
JP5744719B2 (ja) * 2008-04-04 2015-07-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア チクングニヤウィルスタンパク質の共通配列、これをコードする核酸分子、並びにこれを使用する組成物および方法
CA2771334A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines and immunotherapeutics comprising il-15 receptor alpha and/or nucleic acid molecules encoding the same, and methods for using the same
CN102781952B (zh) * 2010-02-08 2015-09-02 宾夕法尼亚大学托管会 编码rantes的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法
US9238679B2 (en) 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
KR20140048853A (ko) 2011-02-11 2014-04-24 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 B형 간염 바이러스 코어 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및 이를 포함하는 백신
KR20140116095A (ko) 2011-12-12 2014-10-01 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Mrsa pbp2a 및 이의 단편들을 포함하는 단백질, 이를 인코딩한 핵산, 및 mrsa 감염을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도
CN104619719A (zh) * 2012-04-10 2015-05-13 宾夕法尼亚大学理事会 人呼吸道合胞病毒共有抗原、由其制备的核酸构建体和疫苗及其使用方法
EP2836230A4 (en) * 2012-04-12 2016-03-02 Univ Pennsylvania Filovirus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2157994A (en) 1937-11-08 1939-05-09 Kelsey Hayes Wheel Co Brake mechanism
US5077044A (en) 1980-05-19 1991-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting shigella live vaccines
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US5223424A (en) 1985-09-06 1993-06-29 Prutech Research And Development Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence
US5310668A (en) 1986-06-20 1994-05-10 Merck & Co., Inc. Varicella-zoster virus as a live recombinant vaccine
US5242829A (en) 1986-09-23 1993-09-07 Therion Biologics Corporation Recombinant pseudorabies virus
US5387744A (en) 1987-06-04 1995-02-07 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi
KR0139950B1 (ko) 1987-06-04 1998-06-01 에드워드 알. 픽켄셔 무병원성 미생물 및 이의 용도
US5294441A (en) 1987-06-04 1994-03-15 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi
US5112749A (en) 1987-10-02 1992-05-12 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for the malaria circumsporozoite protein
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
NL9020389A (nl) 1989-03-08 1991-12-02 Health Research Inc Systeem voor het in de gastheer selecteren van recombinant-pokkenvirussen.
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP0465560B1 (en) 1989-03-31 1996-06-05 Washington University VACCINES CONTAINING AVIRULENT phoP-TYPE MICROORGANISMS
EP0431668B1 (en) 1989-12-04 1995-02-15 Akzo Nobel N.V. Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
US5294548A (en) 1990-04-02 1994-03-15 American Biogenetic Sciences, Inc Recombianant Hepatitis a virus
US5462734A (en) 1990-11-02 1995-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Bovine herpesvirus vaccine and method of using same
US5240703A (en) 1991-03-01 1993-08-31 Syntro Corporation Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof
US5981505A (en) 1993-01-26 1999-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for delivery of genetic material
CA2153593C (en) 1993-01-26 2010-04-13 David B. Weiner Compositions and methods for delivery of genetic material
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5962428A (en) 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
NL9401820A (nl) 1994-11-02 1996-06-03 Meyn Maschf Inrichting voor het bewerken van aan zijn poten opgehangen gevogelte.
DE69635639D1 (de) 1995-08-01 2006-02-02 Hoffmann La Roche Interleukin-12-beta-Rezeptoren mit niedriger Bindungsaffinität
JP2001507216A (ja) * 1996-10-23 2001-06-05 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 免疫療法および改良ワクチン
WO1999016466A3 (en) * 1997-09-29 1999-06-03 Dan H Barouch Vaccine compositions and methods of enhancing vaccine efficacy
CA2313805A1 (en) * 1997-12-19 1999-07-01 Immunex Corporation Method for reducing susceptibility to hiv infection
CA2320626A1 (en) * 1998-02-11 1999-08-19 Maxygen, Inc. Genetic vaccine vector engineering
US7560105B1 (en) * 1999-10-04 2009-07-14 Leids Universitair Medisch Centrum Dendritic cells activated in the presence of glucocorticoid hormones are capable of suppressing antigen-specific T cell responses
EP2269629A3 (en) 2000-05-11 2013-09-11 Baylor Research Institute Compositions and methods for producing antigen-presenting cells
JP4472250B2 (ja) * 2000-10-04 2010-06-02 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 高発現可能遺伝子
KR100911951B1 (ko) 2001-08-23 2009-08-13 젠맵 에이/에스 인터루킨 15 (il-15)에 대하여 특이적인 인간 항체
WO2004000217A3 (en) * 2002-06-20 2005-05-06 Univ Pennsylvania Vaccines for suppressing ige-mediated allergic disease and methods for using the same
US8173786B2 (en) * 2003-06-13 2012-05-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
KR20140137679A (ko) 2013-05-23 2014-12-03 삼성전자주식회사 카드 소켓 장치

Also Published As

Publication number Publication date Type
US8173786B2 (en) 2012-05-08 grant
JP2012110345A (ja) 2012-06-14 application
WO2005000235A3 (en) 2005-06-16 application
EP1638987A2 (en) 2006-03-29 application
EP1638987B1 (en) 2014-11-19 grant
WO2005000235A2 (en) 2005-01-06 application
KR101269548B1 (ko) 2013-06-21 grant
US20120276142A1 (en) 2012-11-01 application
EP2292634A2 (en) 2011-03-09 application
KR101225473B1 (ko) 2013-01-24 grant
EP1638987A4 (en) 2007-12-26 application
US20070041941A1 (en) 2007-02-22 application
CN1832956A (zh) 2006-09-13 application
KR20060030041A (ko) 2006-04-07 application
JP2007516696A (ja) 2007-06-28 application
JP5623444B2 (ja) 2014-11-12 grant
EP2292634A3 (en) 2012-08-08 application
KR20110129945A (ko) 2011-12-02 application
CA2529145C (en) 2017-07-11 grant
CA2529145A1 (en) 2005-01-06 application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Malek The biology of interleukin-2
Smith Lowest dose interleukin-2 immunotherapy
Cohen et al. Modulating the immune response to genetic immunization
Chomarat et al. Interleukin-4 and lnterleukin-13: Their similarities and discrepancies
Stonier et al. Trans-presentation: a novel mechanism regulating IL-15 delivery and responses
Handman Leishmaniasis: current status of vaccine development
Waldmann The multi-subunit interleukin-2 receptor
Kim et al. Modulation of amplitude and direction of in vivo immune responses by co‐administration of cytokine gene expression cassettes with DNA immunogens
Sacks et al. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice
Yasutomi et al. Immunization with recombinant BCG-SIV elicits SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in rhesus monkeys.
Gaffen Biology of recently discovered cytokines: interleukin-17–a unique inflammatory cytokine with roles in bone biology and arthritis
Solbach et al. The host response to Leishmania infection
US20020123099A1 (en) Highly expressible genes
Wojno et al. New directions in the basic and translational biology of interleukin-27
Nelms et al. The IL-4 receptor: signaling mechanisms and biologic functions
Williams et al. Identification of a population of CD4+ CTL that utilizes a perforin-rather than a Fas ligand-dependent cytotoxic mechanism.
US20070160578A1 (en) Expansion of natural killer and CD8 T-cells with IL-15R/ligand activator complexes
Leonard, MD The molecular basis of X-linked severe combined immunodeficiency: defective cytokine receptor signaling
US20030186875A1 (en) Uses of mammalian cytokine; related reagents
Gurunathan et al. CD40 ligand/trimer DNA enhances both humoral and cellular immune responses and induces protective immunity to infectious and tumor challenge
Fehniger et al. Interleukin 15: biology and relevance to human disease
Waldmann et al. The multifaceted regulation of interleukin-15 expression and the role of this cytokine in NK cell differentiation and host response to intracellular pathogens
Lodolce et al. Regulation of lymphoid homeostasis by interleukin-15
US20090238791A1 (en) Il-15ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of il-15 action through il-15beta/gamma, and hyperagonist (il-15ralpha sushi - il-15) fusion proteins
WO1994004680A1 (en) Human interleukin-13

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
C10 Entry into substantive examination
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: PRIORITY; FROM: MISSING THE SECOND ARTICLE OF PRIORITY TO: 2003.6.13 US 60/478,210

C14 Grant of patent or utility model