CN1792347A - 大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法 - Google Patents

大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法 Download PDF

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Abstract

大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，涉及一种雌核发育方法，尤其是涉及一种大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法。提供一种大黄鱼雌核发育二倍体的诱导方法。取大黄鱼精液经稀释液稀释后用紫外线照射，使精子的遗传失活。在海水中混合大黄鱼成熟卵子及经紫外线照射的大黄鱼精子，启动卵子雌核发育；卵子授精后转移到海水中冷休克或静水压处理，使染色体组加倍，产生雌核发育二倍体；将大黄鱼雌核发育卵转入海水中，按普通大黄鱼苗管理，即得黄鱼雌核发育二倍体鱼苗。所诱导产生的后代只含有雌性亲本的基因，可加速优良基因纯合化、使优良的遗传性状得以迅速固定，可应用于大黄鱼快速育种，是大黄鱼遗传分析与性别控制的辅助手段。

Description

大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法
技术领域
本发明涉及一种雌核发育方法，尤其是涉及一种大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法。
背景技术
利用细胞工程技术为水产养殖业培育优良品种具有深远的理论意义和广阔的应用前景。雌核发育是一种细胞工程技术，指卵子只依靠本身的遗传物质发育成为个体的现象，它需要同种或异种精子进入卵内，但这些精子只起激动作用，而并不参与发育，胚胎发育完全是在雌核的控制之下进行的，因此得到的后裔全部是母性性状，基因型与母本相同或略有差异。人工诱导雌核发育是加速鱼类优良基因纯合化，使优良的遗传性状得以迅速固定，从而实现快速育种的最有效方法之一，同时也是进行鱼类遗传分析与性别控制的有效辅助手段，已经被广泛应用于国内外许多种鱼类遗传育种的研究与实践。例如，日本已经对几乎所有该国开展养殖的海、淡水鱼类都进行人工雌核发育研究，借助该项技术进行鱼类快速育种、性别控制以及各种遗传性状包括DNA标记的遗传分析，培育出全雌虹鳟与牙鲆鱼苗供养殖利用，培育了各种养殖对象的雌核发育纯合g隆鱼供遗传学研究；美国在20世纪80年代就借助人工雌核发育技术进行草鱼的性别控制；国内也已经对多种淡水鱼类开展人工雌核发育研究，利用该项细胞工程(染色体组操作)技术培育出了异育银鲫，在较短的时间内使建鲤与高寒鲤的优良性状得到固定，促进了良种的快速育成。
大黄鱼是目前福建省海水养殖鱼类中的最重要种类，其养殖规模、产量、从业人员数量等都居于海水养殖鱼类之首。然而，大黄鱼养殖业的持续发展，面临着种质退化等问题迫切需要研究解决。排除与减少群体中存在的不良及有害基因，增加优良基因与基因型的频率，消除或减少不良基因的影响，是解决大黄鱼种质退化问题的最根本办法。然而传统的育种方式(定向选择+近交)基因纯合速度慢，育种周期长，不符合当前大黄鱼养殖业发展的迫切需要，因此有必要开展可加速育种进程的人工雌核发育技术研究。另一方面，大黄鱼不论是野生或是在人工养殖中，雌雄两性个体的生长都存在着显著的差异，雌鱼的生长速度明显快于雄鱼。目前，大黄鱼的雌核发育研究尚属空白。
发明内容
本发明的目的在于针对已有的大黄鱼育种技术中存在的问题，提供一种大黄鱼雌核发育二倍体的诱导方法。
本发明所说的大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法其步骤为：
1)、精子的遗传失活：取大黄鱼精液经稀释液稀释10～50倍后用紫外线照射，紫外线照射剂量为50000-100000μW/cm2
2)、卵子雌核发育的启动：在海水中混合大黄鱼成熟卵子及经过紫外线照射的大黄鱼精子，精子最终浓度至少为105个/ml；
3)、雌核发育单倍体染色体组加倍：卵子授精后3～5min，转移到0～3C的海水中冷休克或转移到水压机中静水压处理，使染色体组加倍，产生雌核发育二倍体；
4)、将大黄鱼雌核发育卵转入海水中，按普通大黄鱼苗生产方法管理，生产出大黄鱼雌核发育二倍体鱼苗。
在步骤1)中，取大黄鱼精液经稀释液稀释30倍后用紫外线照射，精液的厚度最好为0.5～1.0mm；稀释液的配制为：称取NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl2 0.2g、NaHCO3 0.2g，加蒸馏水逐项溶解后调至1L。
在步骤2)中，海水水温最好为20～25℃。
在步骤3)中，在海水中冷休克的时间为5～15min，最好为10min；转移到水压机中静水压处理的压力为45MPa/cm2，水压机中静水压处理的时间为2～3min。
本发明利用失活大黄鱼精子的遗传物质、启动卵子雌核发育以及染色体组加倍的措施，所诱导产生的后代只含有雌性亲本的基因，可加速优良基因纯合化、使优良的遗传性状得以迅速固定，因此本发明可应用于大黄鱼快速育种，同时也是进行大黄鱼遗传分析与性别控制的有效辅助手段。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
实施例1
取大黄鱼精液经稀释液稀释30倍后放置于直径为6～15cm的培养皿内，用紫外线照射，紫外线照射剂量为50000-100000μW/cm2，精液厚度0.5mm。稀释液的配制为：每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl2 0.2g、NaHCO3 0.2g，使精子的遗传失活。将海水水温调整到22～23℃，在此海水中混合大黄鱼成熟卵子及经过紫外线照射的大黄鱼精子，精子最终浓度至少为105个/ml，启动大黄鱼卵子的雌核发育。卵子授精后3～4min，转移到0～1℃的海水中冷休克10min，使大黄鱼雌核发育单倍体染色体组加倍成为雌核发育二倍体。经上述处理后的大黄鱼雌核发育卵转入正常水温海水中，按普通大黄鱼种苗生产方法管理，生产出大黄鱼雌核发育二倍体苗种。
所说的普通大黄鱼鱼苗生产方法管理是指：采用静水孵化法，受精卵在水中的密度为3×104粒/m3～1×104粒/m3。放养密度为仔鱼期2.4×104尾/m3～0.8×104尾/m3，稚鱼期0.6×104尾/m3～0.3×104尾/m3，幼鱼期0.2×104尾/m3～0.1×104尾/m3。可采用以下饵料系列：
1)褶皱臂尾轮虫
投喂前经6h以上20×106个/mL小球藻液强化培养，投喂量见表1。
表1褶皱臂尾轮虫投喂方法
  鱼苗日龄d   水中轮虫密度个/mL
  3～5   3～5
  5～12   10～15
  12～20   15～10
2)卤虫无节幼体
投喂时间为12日龄～16日龄，水中密度为0.5个/mL～1个/mL。
3)桡足类及其无节幼体
应从无污染、无病原体的水域中采捕。从12日龄开始投喂，水体中保持密度在0.2个/mL～0.5个/mL。
4)鱼、虾、贝肉糜及配合饲料
肉糜日投喂量：20日龄～30日龄，50g/万尾～80g/万尾；30日龄～45日龄100g/万尾～120g/万尾。35日龄以上可在肉糜中拌入适量粉状配合饲料。
在日常管理中，应连续充气，使水中溶解氧保持在5mg/L以上。每天换水1次～2次，日换水量20％～120％，并在换水前用虹吸管吸去池底的残饵、死苗、粪渣及其他杂物。经常进行仔稚鱼摄食情况的观察，监测理化因子变化情况，发现问题及时处理。中间培育时，鱼苗在室内水泥池中培育至全长20mm以上时，可移到海区网箱中继续进行培育，直至全长30mm为止。
实施例2
与实施例1类似，其区别在于取大黄鱼精液经稀释液稀释10倍后用紫外线照射，紫外线照射剂量为50000-100000μW/cm2，精液厚度0.8mm。稀释液的配制为：每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl2 0.2g、NaHCO3 0.2g，使精子的遗传失活。将海水水温调整到20～22℃，在此海水中混合大黄鱼成熟卵子及经过紫外线照射的大黄鱼精子，精子最终浓度至少为105个/ml，启动大黄鱼卵子的雌核发育。卵子授精后4～5min，转移到水压机中静水压处理，压力为45MPa/cm2，水压机中静水压处理的时间为2～3min。使大黄鱼雌核发育单倍体染色体组加倍成为雌核发育二倍体。经上述处理后的大黄鱼雌核发育卵转入正常水温海水中，按普通大黄鱼种苗生产方法管理，生产出大黄鱼雌核发育二倍体苗种。
实施例3
与实施例1类似，其区别在于取大黄鱼精液经稀释液稀释50倍后用紫外线照射，紫外线照射剂量为50000-100000μW/cm2，精液厚度1.0mm。稀释液的配制为：每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl2 0.2g、NaHCO3 0.2g，使精子的遗传失活。将海水水温调整到23～25℃，在此海水中混合大黄鱼成熟卵子及经过紫外线照射的大黄鱼精子，精子最终浓度至少为105个/ml，启动大黄鱼卵子的雌核发育。卵子授精后4min，转移到水压机中静水压处理，压力为45MPa/cm2，水压机中静水压处理的时间为3min。使大黄鱼雌核发育单倍体染色体组加倍成为雌核发育二倍体。经上述处理后的大黄鱼雌核发育卵转入正常水温海水中，按普通大黄鱼种苗生产方法管理，生产出大黄鱼雌核发育二倍体苗种。
实施例4
取大黄鱼精液经稀释液稀释25倍后用紫外线照射，紫外线照射剂量为50000-100000μW/cm2，精液厚度0.6mm。稀释液的配制为：每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO3 0.2g，使精子的遗传失活。将海水水温调整到23～24℃，在此海水中混合大黄鱼成熟卵子及经过紫外线照射的大黄鱼精子，精子最终浓度至少为105个/ml，启动大黄鱼卵子的雌核发育。卵子授精后3min，转移到2～3℃的海水中冷休克5min，使大黄鱼雌核发育单倍体染色体组加倍成为雌核发育二倍体。经上述处理后的大黄鱼雌核发育卵转入正常水温海水中，按普通大黄鱼种苗生产方法管理，生产出大黄鱼雌核发育二倍体苗种。
实施例5
取大黄鱼精液经稀释液稀释35倍后用紫外线照射，紫外线照射剂量为50000-100000μW/cm2，精液厚度0.7mm。稀释液的配制为：每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO3 0.2g，使精子的遗传失活。将海水水温调整到23～24℃，在此海水中混合大黄鱼成熟卵子及经过紫外线照射的大黄鱼精子，精子最终浓度至少为105个/ml，启动大黄鱼卵子的雌核发育。卵子授精后4min，转移到1～2℃的海水中冷休克15min，使大黄鱼雌核发育单倍体染色体组加倍成为雌核发育二倍体。经上述处理后的大黄鱼雌核发育卵转入正常水温海水中，按普通大黄鱼种苗生产方法管理，生产出大黄鱼雌核发育二倍体苗种。

Claims (8)

1、大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，其特征在于其步骤为：
1)、精子的遗传失活：取大黄鱼精液经稀释液稀释10～50倍后用紫外线照射，紫外线照射剂量为50000-100000μW/cm2；
2)、卵子雌核发育的启动：在海水中混合大黄鱼成熟卵子及经过紫外线照射的大黄鱼精子，精子最终浓度至少为105个/ml；
3)、雌核发育单倍体染色体组加倍：卵子授精后3～5min，转移到0～3℃的海水中冷休克或转移到水压机中静水压处理，使染色体组加倍，产生雌核发育二倍体；
4)、将大黄鱼雌核发育卵转入海水中，按普通大黄鱼苗生产方法管理，生产出大黄鱼雌核发育二倍体鱼苗。
2、如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，其特征在于在步骤1)中，取大黄鱼精液经稀释液稀释30倍后用紫外线照射。
3、如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，其特征在于在步骤1)中，精液的厚度为0.5～1.0mm。
4、如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，其特征在于在步骤2)中，海水水温为20～25℃。
5、如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，其特征在于在步骤3)中，在海水中冷休克的时间为5～15min。
6、如权利要求5所述的大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，其特征在于在步骤3)中，在海水中冷体克的时间为10min。
7、如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，其特征在于在步骤3)中，转移到水压机中静水压处理的压力为45MPa/cm2。
8、如权利要求1或7所述的大黄鱼雌核发育二倍体诱导方法，其特征在于在步骤3)中，水压机中静水压处理的时间为2～3min。
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Granted publication date: 20090826

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