CN1772000A

CN1772000A - 用嗜酸乳杆菌制备能预防和治疗慢性胃病的保健品或药物

Info

Publication number: CN1772000A
Application number: CNA2005100172206A
Authority: CN
Inventors: 王江滨; 焦健; 李岩; 张学英
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2006-05-17

Abstract

本发明涉及嗜酸乳杆菌在功能食品和制药上的新用途，即用嗜酸乳杆菌制备能预防和治疗慢性胃病的保健品或药物。是将从人胃肠道排泄物中培养分离筛选出的对幽门螺杆菌生长具有特异拮抗作用的嗜酸乳杆菌接种于食品可接受的载体中或药物可接受的载体中，该嗜酸乳杆菌同时满足以下抗幽门螺杆菌特性：a、琼脂打孔法检测，其抑菌环直径大于2厘米；b、尿素酶活性定量法检测，在2小时内抑制幽门螺杆菌尿素酶活性大于50％；c、菌落计数法检测，在4小时内抑制幽门螺杆菌生长大于1LgCFU/ml。服用本发明保健品或药品可有效预防和治疗因幽门螺杆菌感染而导致的慢性胃病。

Description

用嗜酸乳杆菌制备能预防和治疗慢性胃病的保健品或药物

技术领域

本发明涉及嗜酸乳杆菌在功能食品和制药上的新用途，即用嗜酸乳杆菌制备能预防和治疗慢性胃病的保健品或药物。

背景技术

慢性胃炎、消化性溃疡是全球性的多发病，但在不同国家、不同地区的患病率存在差异，普遍认为发展中国家的患病率明显高于发达国家。新近欧洲的调查表明人群中幽门螺杆菌(H.pylori)感染率为40％-70％。H.pylori感染后机体一般难以自行将其清除，故感染后无例外地会引发胃粘膜炎症，因此人群中慢性胃炎的患病率大致等于H.pylori的感染率。我国尚缺少慢性胃炎的大样本流行病学调查，但抽样调查结果表明我国人群H.pylori感染率更高，且感染者的平均年龄较轻。

由于H.pylori感染而引发慢性胃炎的发病率高，因此探讨根除H.pylori感染而达到预防和治疗慢性胃炎的方法已成为国际范围内本领域的热点问题。目前普遍采用包括两种抗生素在内与铋剂或质子泵抑制剂联合应用的三联或四联疗法，但由于H.pylori即使被根除后也会再感染，因此人们早就认识到应用抗生素治疗绝非最佳治疗方案，况且长期应用抗生素可破坏人体微生态平衡引发其他相关性疾病，并且也可引起人群耐药性的广泛增加。

鉴于上述诸多问题的存在，近年来研究者们开始致力于寻找根除H.pylori感染的新的治疗方案，英国、智利的研究者相继发现某些嗜酸乳杆菌可在体外抑制H.pylori的生长，并表明嗜酸乳杆菌并非单纯通过乳酸成分抑制H.pylori生长，因为对H.pylori有最大抑制效应的嗜酸乳杆菌所产生的乳酸水平并不高，故认为嗜酸乳杆菌可能是通过分泌某些抑菌成分而抑制幽门螺杆菌的生长。日本Y Qiba研究组给予先饲喂嗜酸乳杆菌的小鼠灌注H.pylori，结果表明被灌注的H.pylori不能在胃内粘附定值，也未造成局部病理损伤。

国内广州第一军医大学及上海医科大学微生物教研室也都从多株嗜酸乳杆菌中筛选到具有抑制H.pylori作用的菌株，并已通过动物实验证实长期服用多菌株发酵液无毒副作用。研究结果提示人们应注重将对H.pylori有抑制作用的嗜酸乳杆菌发展成为可抑制H.pylori生长，有利于慢性胃炎、消化性溃疡、甚至胃癌防治的有效微生态治疗方法。

但是应该强调到目前为止上述工作还仅停留于实验室的研究，还未有人将其开发为可用于临床根除H.pylori的益生菌制剂，而且更未有针对H.pylori反复感染特点开发防治H.pylori感染的功能性食品。

发明内容：

本发明的目的在于提供嗜酸乳杆菌在功能食品和制药上的新用途，即用嗜酸乳杆菌制备能预防和治疗慢性胃病的保健品或药物。

本发明人通过厌氧培养技术从健康人粪便中分离培养出16株嗜酸乳杆菌，并分别采用琼脂平板打孔法、体外尿素酶活性定量检测法、菌落计数法筛选出2株对幽门螺杆菌具有确切抑制作用的嗜酸乳杆菌，并在C57/BL6小鼠体内证实：上述2株嗜酸乳杆菌及其上清液可以预防或减轻幽门螺杆菌(以下简称HP)感染所致的胃窦部黏膜慢性炎症。具体实验如下：

一、嗜酸乳杆菌的分离鉴定结果

从30名健康学生粪便中共分离出16株嗜酸乳杆菌菌落。分离菌株在LBs培养基上为乳白色菌落，表面光滑湿润，边缘整齐，直径为0.5-2mm。细菌经Gram染色后，光镜下可见Gram染色阳性的长杆菌，两端钝圆，单个、成双或短链状，无动力。其生物学及生化特性详见表1。结果显示分离株的形态生化特性与嗜酸乳杆菌高度一致，可判定为嗜酸乳杆菌，分别命名为L1～L16。

表1分离菌株的生物学及生化特性

特性	分离株	嗜酸乳杆菌
特性	分离株	嗜酸乳杆菌	形状动力Gram’s染色葡萄糖乳糖麦芽糖半乳糖甘露糖蔗糖阿拉伯糖木糖鼠李糖甘露醇七叶苷硝酸盐还原触酶试验明胶液化胆汁耐受阳性吲哚产生阴性	长杆状-+++++++--------+-	长杆状-++++++++-------+-

二、打孔法检测16株嗜酸乳杆菌上清液对Hp(标准株和临床分离株)生长的抑制作用详见表2。结果显示，16株嗜乳酸杆菌均对Hp标准株和临床分离株具有强弱不同的抑制作用，其中L4和L6的抑菌环直径最大。嗜乳酸杆菌上清液的pH值均大于乳酸(10g/L)的pH值，且抑菌环直径与嗜酸乳杆菌上清液pH值无相关性，提示嗜酸乳杆菌对Hp的抑制作用并非单纯依赖于其产生的乳酸。

表2 16株嗜酸乳杆菌上清液抑菌环直径及pH值的比较

pH	抑菌环直径
	抑菌环直径		Hp CagA+临床分离株	Hp标准株NCTC11637
	嗜酸乳杆菌L1L2L3L4L5L6L7L8L9L10L11L12L13L14L15L16布氏肉汤(含小牛血清)乳酸(10g/L)	3.573.693.803.643.903.673.843.673.853.213.913.543.523.613.513.707.013.00	Hp CagA+临床分离株	Hp标准株NCTC11637	2.12.01.72.42.12.41.91.81.81.81.81.52.12.01.91.801.3	1.92.01.92.32.02.52.02.01.92.12.01.72.02.12.01.901.4

三、嗜酸乳杆菌L4、L6上清液对Hp(标准株NCTC11637、CagA+临床分离株)尿素酶活性抑制作用的时间变化曲线详见图1、图2。结果显示，与Hp单独培养相比，加入嗜酸乳杆菌L4、L6上清液的Hp在培养1小时后尿素酶活性开始明显减低，4小时以后又逐渐升高，但升高幅度较Hp单独培养明显降低。

四、嗜酸乳杆菌L4、L6上清液对Hp(标准株NCTC11637、CagA+临床分离株)尿素酶活性抑制作用的浓度变化曲线详见图3-6。结果显示，随着嗜酸乳杆菌上清液的增多，其对Hp尿素酶活性的抑制作用逐渐增强，以250μl和500μl之间差距较大，500、750和1000μl嗜酸乳杆菌上清液对Hp尿素酶活性的抑制作用无明显差异。

五、嗜酸乳杆菌L4、L6上清液对Hp(标准株NCTC11637、CagA+临床分离株)菌落计数影响的时间变化曲线详见图7、图8，结果显示，随着培养时间的延长，Hp单独培养的菌落数不断增加，而加入嗜酸乳杆菌上清液的Hp菌落计数则逐渐减少，至4-6小时最低，之后也继续增加，但增加幅度明显低于Hp单独培养。

六、通过建立H.pylori感染动物模型，证实2株在体外对H.pylori表现有明显抑制效应的嗜酸乳杆菌在动物体内也可抑制H.pylori的黏附和定植于胃黏膜，并抑制其释放UreA/B、CagA、VacA等毒力因子，改善胃黏膜局部的病理损伤。

基于上述实验结果提出本发明，即用嗜酸乳杆菌制备能预防和治疗慢性胃病的保健品或药物，是将从人胃肠道排泄物中培养分离筛选出的对幽门螺杆菌生长具有特异拮抗作用的嗜酸乳杆菌接种于食品可接受的载体中或药物可接受的载体中，该嗜酸乳杆菌同时满足以下抗幽门螺杆菌特性：a.琼脂打孔法检测，其抑菌环直径大于2厘米；b.尿素酶活性定量法检测，在2小时内抑制幽门螺杆菌尿素酶活性大于50％；c.菌落计数法检测，在4小时内抑制幽门螺杆菌生长大于1LgCFU/ml。

上述所述的保健品可以是一种发酵乳及乳制品、酸豆奶或糖果。

上述所述的药品可以制成活菌胶囊、散剂或活菌制剂口服液。

本发明的显著技术进步在于，通过选取特定原宿主来源、培养分离具有抗幽门螺杆菌特异性生物学功能的嗜酸乳杆菌作为治病因子和能发挥其最大效应的适宜载体而制成的功能性食品或药品。可有效预防和治疗因幽门螺杆菌感染而导致的慢性胃病。

附图说明

图1是嗜酸乳杆菌L4、L6上清液(500μl)对Hp标准株NCTC11637尿素酶活性抑制作用的时间变化曲线；

图2是嗜酸乳杆菌L4、L6上清液(500μl)对Hp CagA+临床分离株尿素酶活性抑制作用的时间变化曲线；

图3是嗜酸乳杆菌L4上清液对Hp标准株NCTC11637尿素酶活性抑制作用的浓度变化曲线；

图4是嗜酸乳杆菌L4上清液对Hp临床分离株尿素酶活性抑制作用的浓度变化曲线；

图5是嗜酸乳杆菌L6上清液对Hp标准株NCTC11637尿素酶活性抑制作用的浓度变化曲线；

图6是嗜酸乳杆菌L6上清液对Hp临床分离株尿素酶活性抑制作用的浓度变化曲线；

图7是嗜酸乳杆菌L4、L6上清液对Hp标准株NCTC11637菌落计数影响的时间变化曲线；

图8是嗜酸乳杆菌L4、L6上清液对HpCagA+临床分离株菌落计数影响的时间变化曲线；

图9是未灌服发酵乳的Hp感染小鼠胃粘膜病理组织照片；

图10是灌服普通发酵乳的Hp感染小鼠胃粘膜病理组织照片；

图11是灌服本发明发酵乳产品的Hp感染小鼠胃粘膜病理组织照片。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步详细说明

实施例1

嗜酸乳杆菌菌种的制备

1)嗜酸乳杆菌的分离培养及确认鉴定

取健康青年人粪便标本按常规方法分离培养并确认获得各嗜酸乳杆菌菌株

2)具有抗幽门螺杆菌活性的嗜酸乳杆菌的筛选

从以上各嗜酸乳杆菌菌株中通过以下检测方法筛选出同时满足以下抗幽门螺杆菌特性的嗜酸乳杆菌菌株：

a.琼脂打孔法检测，其抑菌环直径大于2厘米；

b.幽门螺杆菌尿素酶活性定量法检测，2小时内抑制幽门螺杆菌尿素酶活性大于50％；

c.幽门螺杆菌菌落计数法检测，4小时内抑制幽门螺杆菌菌落生长大于1Lg(CFU/mL)；

3)嗜酸乳杆菌菌株的保存与复苏

将所筛选的嗜酸乳杆菌菌株置-70℃冻存，按常规细菌复苏方法复苏应用。

实施例2

能预防和治疗慢性胃病的发酵乳及乳制品的制备：

新鲜牛乳经加热杀菌(一般采用90℃30min)，在均质后，降低到适宜的温度(40～50℃)，添加糖和稳定剂搅拌均匀，接种经上述步骤筛选出的嗜酸乳杆菌10¹¹～10¹²CFU/ml，37℃发酵12～24小时，pH值达到3.5～5.5时置于4℃左右的冷库内冷却成熟，即得成品。

应用给小鼠(BALB/C鼠和C57/BL6鼠)灌服幽门螺杆菌菌液(标准株NCTC11637CagA+及CagA+临床分离株)的方法建立的Hp感染实验动物模型，进行采用本发明产品治疗的对比实验：

给感染幽门螺杆菌的小鼠灌服本发明能预防和治疗慢性胃病，每日一次，每次0.5毫升。同时以普通发酵乳及未灌服发酵乳作为对照。于6周后处死三组小鼠，取胃粘膜做病理切片，其病理改变状态参见图9-11。图9所示未灌服发酵乳的Hp感染小鼠胃粘膜炎症明显，大量中性粒细胞浸润；图10所示灌服普通发酵乳的Hp感染小鼠胃粘膜炎症无明显改善，大量中性粒细胞浸润；图11所示灌服本发明发酵乳产品的Hp感染小鼠胃粘膜病理改变明显改善，炎症明显减轻，有少量中性粒细胞浸润。

实施例3

能预防和治疗慢性胃病的酸豆奶的制备：

大豆经热烫、浸泡、磨浆等前处理，制得豆浆。豆浆中加入奶粉、蔗糖或乳糖等辅料，经均质、杀菌后，冷却到适宜温度(40～50℃)，接种经上述步骤筛选出的嗜酸乳杆菌10¹¹～10¹²CFU/ml进行发酵。发酵结束后放人4℃的冷库中冷却，并进行后发酵，即得成品。

实施例4

能预防和治疗慢性胃病的的糖果的制备：

牛乳高温消毒(10磅/英寸²，15分钟)，冷却后加入上述步骤筛选出的嗜酸乳杆菌，37℃发酵12小时；糖粉和糊精需经100℃2小时灭菌，待冷却到50℃以下时加入发酵乳；40～45℃条件下烘干，水分不超过1.5％；打片(压力控制在3～3.5公斤/厘米²)即得。

实施例5

能预防和治疗慢性胃病的活菌胶囊或散剂制备：

经上述步骤筛选出的嗜酸乳杆菌经培养、繁殖并采用冷冻干燥工艺后，按210mg(胶囊)含活菌数不低于1×10⁷CFU的比例，以淀粉为载体，按常规工艺与维生素、微量元素等对人体有益的成分配伍可制成胶囊制剂或散剂。注意服用时的水温一般不得超过40度。

实施例6

能预防和治疗慢性胃病的活菌制剂口服液的制备方法：

以大豆芽为原料，在牛肉汤，大豆芽浸液，酵母膏、蔗糖、葡萄糖、氯化钠等配合成的溶液中接种经上述步骤筛选出的嗜酸乳杆菌发酵生成种子液，取再次发酵的发酵液(活菌数不低于1×10⁷CFU/ml)直接装瓶即得活菌制剂口服液。

Claims

1.用嗜酸乳杆菌制备能预防和治疗慢性胃病的保健品或药物，是将从人胃肠道排泄物中培养分离筛选出的对幽门螺杆菌生长具有特异拮抗作用的嗜酸乳杆菌接种于食品可接受的载体中或药物可接受的载体中，该嗜酸乳杆菌同时满足以下抗幽门螺杆菌特性：a.琼脂打孔法检测，其抑菌环直径大于2厘米；b.尿素酶活性定量法检测，在2小时内抑制幽门螺杆菌尿素酶活性大于50％；c.菌落计数法检测，在4小时内抑制幽门螺杆菌生长大于1LgCFU/ml。

2.按权利要求1所述的能预防和治疗慢性胃病的保健品是一种发酵乳或乳制品。

3.按权利要求1所述的能预防和治疗慢性胃病的保健品是一种酸豆奶。

4.按权利要求1所述的能预防和治疗慢性胃病的保健品是一种糖果。

5.按权利要求1所述的能预防和治疗慢性胃病的药物是一种活菌胶囊或散剂。

6.按权利要求1所述的能预防和治疗慢性胃病的药物是一种活菌制剂口服液。