CN1753997A

CN1753997A - 葡萄糖脱氢酶的制造方法

Info

Publication number: CN1753997A
Application number: CN03824735.6A
Authority: CN
Inventors: 早出广司; 山冈秀亮; 星岛光博; 黑坂啓介; 川瀬至道
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2006-03-29
Anticipated expiration: 2023-08-20
Also published as: JP2004089052A; CN100540669C; EP1536014B1; WO2004020638A1; AU2003262259A8; EP1536014A4; EP1536014A1; US7713718B1; DE60332845D1; ATE469965T1; JP4102138B2; AU2003262259A1

Abstract

本发明涉及葡萄糖脱氢酶的制造方法。该制造方法是，将含有编码在序列号1记载的具有葡萄糖脱氢活性的α亚单位及作为电子传递蛋白质的β亚单位的序列的DNA导入属于假单胞菌属的微生物中，形成转化体，培养该转化体，产生含有上述β亚单位的第1葡萄糖脱氢酶和不含上述β亚单位的第2葡萄糖脱氢酶。所述α亚单位在例如还原条件下的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为60kDa，所述β亚单位在例如还原条件下的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为43kDa。

Description

葡萄糖脱氢酶的制造方法

技术领域

本发明涉及葡萄糖脱氢酶的制造方法。由该方法得到的葡萄糖脱氢酶，可以用于葡萄糖传感器中。

背景技术

使用对于特定底物有特异反应的酶的生物传感器的开发，不分产业领域地正在盛行起来。作为生物传感器的代表，可以举出主要在医疗领域使用的葡萄糖传感器。

葡萄糖传感器是用于构筑含有酶和电子传递物质的反应体系的器件，在利用该葡萄糖传感器的情况下，例如采用电流分析的方法对葡萄糖进行定量测定。作为酶来说，使用葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)(日本国特开2002-65778号公报)。

GOD，因为针对葡萄糖的底物特异性高、热稳定性优异、能够实现酶的批量化生产，所以，与其它酶相比，有生产成本低的优点。其反面，使用GOD的体系，因为容易受到测定样品中的溶解氧的影响，所以有溶解氧对测定结果产生影响的问题。

另一方面，使用GDH的体系不易受到测定样品中的溶解氧的影响。因此，使用GDH的体系，即使在氧分压低的环境下进行测定、对要求氧量多的高浓度样品进行测定时，也可以精度高地测定葡萄糖浓度。其反面是GDH有热稳定性差、底物特异性比GOD差的问题。

从这样的情况出发，摸索着弥补GOD和GDH双方的缺点。如国际公开WO02/36779号公报所公开的那样，作为本发明人之一的早出从温泉附近的土壤中分离出新型菌株(Burkhorderia cepacia KS1株)，由该菌株取得了新的GDH。该GDH是由α、β、γ亚单位构成的(以下称“CyGDH”)，与电子传递物质的反应速度高，在耐热性方面也没有问题，作为葡萄糖传感器用的酶是合适的。

但是，在KS1菌株中，因为CyGDH的生产性差，所以在考虑到工业化应用时，由KS1菌株批量化生产CyGDH是困难的。因此，本发明人等人，将编码α、β、γ亚单位的DNA导入大肠菌中进行表达，高效率地产生GDH。但是，该GDH是由α、γ亚单位构成的，欠缺β亚单位(以下称“αGDH”)。这样，在转化大肠菌的方法中，不能使α、β、γ亚单位全部表达。

本发明人等人，再对αGDH的特性进行了调查，结果是，虽然与CyGDH相比，αGDH与电子传递物质的反应速度小，但是比CyGDH耐热性高，相对于葡萄糖的Km小。即，与CyGDH同样，αGDH是作为葡萄糖传感器用的酶是有用的，这已确认。

目前，在制造这样有用的2种酶时，需要分别进行表达菌株的取得、培养及精制，在制造成本、效率方面是不利的。

发明内容

本发明的目的在于高效率地制造例如在葡萄糖传感器等中能够应用的2种GDH。

本发明的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，将含有编码在序列号1记载的具有葡萄糖脱氢活性的α亚单位和作为电子传递蛋白质的β亚单位的序列的DNA导入属于假单胞菌属的微生物中，形成转化体，培养该转化体，产生含有上述β亚单位的第1葡萄糖脱氢酶和不含上述β亚单位的第2葡萄糖脱氢酶。

上述α亚单位在例如还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约60kDa。另一方面，上述β亚单位，在例如还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约43kDa。

上述DNA也可以含有将在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约14kDa的γ亚单位编码的碱基序列。此时，产生上述第1及第2葡萄糖脱氢酶作为含有上述γ亚单位的产物。

作为属于上述假单胞菌属的微生物来说，可以列举恶臭假单胞菌、萤光假单胞菌、铜绿假单胞菌等，但从重组体的安全性方面考虑，优选使用恶臭假单胞菌。

上述DNA例如是属于Burkhorderia属的微生物，可以从具有产生带有葡萄糖脱氢活性的酶的能力的微生物取得。在本发明中采用的属于Burkhorderia属的微生物，如果是属于具有产生该酶能力的Burkhorderia属的微生物，就没有特别的限制，但优选Burkhorderiacepacia，特别优选Burkhorderia cepacia KS1株(以下简称为“KS1株”)。

该KS1株是早出等人从温泉附近的土壤中分离的新型菌株，从其菌学性质鉴定为Burkhorderia cepacia，被命名为KS1株。该KS1株在平成12年9月25日(2000年9月25日)在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(

305-8566日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6)以微生物保藏号第FERM BP-7306号保藏。

另外，对于KS1株以外的株，本发明人等人索取了寄存在财团法人发酵研究所(Institute for Fermentation Osaka，IFO)或理化学研究所微生物系统保存设施(Japan Collection of Microorganisms，JCM)的该Burkhorderia cepacia的几个菌株，测定了葡萄糖脱氢活性，结果确认所有的菌株都有活性。因此，作为用于取得本发明中所使用的DNA的微生物来说，可以采用KS1株以外的Burkhorderia cepacia、例如JCM5506、JCM5507、JCM2800、JCM2801、IFO15124、IFO14595。

上述DNA从Burkhorderia cepacia染色体的DNA分离，但其碱基序列及由该碱基序列编码的氨基酸序列很清楚，所以，基于这些序列，也可以通过化学合成取得。

作为上述α亚单位来说，例如可以采用具有序列号3的氨基酸序列、或在序列号3的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一个或多个的氨基酸残基的氨基酸序列的α亚单位。该α亚单位由例如序列号1的碱基序列之中由碱基序号764～2380组成的碱基序列来编码。因此，作为本发明中所使用的DNA来说，优选使用具有上述碱基序列的DNA。

作为上述β亚单位来说，例如可以采用具有序列号5的氨基酸序列、或在序列号5的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一个或多个的氨基酸残基的氨基酸序列的β亚单位。该β亚单位由例如序列号1的碱基序列之中由碱性序号2386～3660组成的碱基序列来编码。因此，作为本发明中所使用的DNA来说，优选使用具有上述碱基序列的DNA。

早出等人确认，与只表达α亚单位的情况相比，若使上述γ亚单位与α亚单位一起表达，则可以得到高的酶活性。因此，从酶活性的观点出发，优选表达γ亚单位，在上述DNA中，编码γ亚单位的碱基序列，优选在编码α亚单位的碱基序列的上游区域含有。如果那样，可以认为，在产生α亚单位时，首先表达γ亚单位，作为蛋白质而存在，由此可以在微生物体内高效率地产生α亚单位。

作为上述γ亚单位来说，例如可以采用具有序列号2的氨基酸序列、或在序列号2的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成了一个或多个的氨基酸残基的氨基酸序列的γ亚单位。该γ亚单位由例如序列号1的碱序列之中由碱基序号258～761组成的碱基序列来编码。因此，作为本发明中所使用的DNA来说，优选使用具有上述碱基序列的DNA。

序列号1的碱基序列之中，碱基序号2386以后的碱基序列，推定为编码β亚单位，但碱基序号2386～2451的碱基序列，推定为编码β亚单位的信号肽。推定该信号肽的氨基酸序列是序列号4的氨基酸序号1～22的氨基酸序列。

由于信号肽是用核糖体合成的蛋白质通过内膜而在胞质空间分泌时是必要的肽，所以，如果信号肽存在，则在菌体胞质或培养上清液中含有的蛋白质量就增加。因此，作为上述DNA来说，优选使用含有编码上述β亚单位的信号肽的表达的碱基序列的DNA。

附图说明

图1表示从转化体取得的可溶化部分的Q-Sepharose FF层析法的结果。

图2表示SDS-PAGE的结果。

具体实施方式

以下，具体地说明本发明的葡萄糖脱氢酶的制造方法。

在本制造方法中，包括：取得编码例如α亚单位及β亚单位的表达的DNA的第1工序；将含有该DNA的重组媒介物导入属于假单胞菌属的微生物中形成转化体的第2工序；在培养基上培养该转化体、产生含有β亚单位的葡萄糖脱氢酶(例如CyGDH)和不含β亚单位的葡萄糖脱氢酶(例如αGDH)的第3工序；和，从培养基或微生物中采取葡萄糖脱氢酶的第4工序。

<第1工序(DNA的取得)>

在取得DNA时，首先构筑重组媒介物。重组媒介物通过如下这样来构筑，即，从属于Burkhorderia属的微生物(例如Burkhorderia cepaciaKS1株)分离并精制染色体DNA后、切断该染色体DNA的染色体DNA断片或由PCR等放大的DNA断片与直链的表达媒介物进行结合闭链。

染色体DNA的分离和精制，基于将微生物溶菌而得到的溶菌物来进行。作为溶菌的方法来说，可以列举由例如溶菌酶(lysozyme)等溶菌酶来处理，除了该处理之外，还可以根据需要现时使用蛋白水解酶、其它的酶和十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂。而且，还可以组合冻结熔解或法式细胞破碎仪(French press)处理等的物理破碎方法。另一方面，DNA从溶菌物中的分离和精制，可以通过适当组合例如苯酚处理或蛋白水解酶处理的除蛋白处理、核糖核酸酶处理、醇沉淀处理等的方法来进行。

染色体DNA的切断，按照通常方法、例如可以使用超声波处理或限制酶处理来进行。作为限制酶来说，可以使用例如在特定核苷酸序列作用的II型限制酶。

染色体DNA断片和表达媒介物的结合，使用例如DNA连接酶来进行。

作为表达媒介物来说，适合在宿主微生物内从能自律地增殖的噬菌体或质粒作为基因重组用而被构筑。作为噬菌体来说，例如在将后述的大肠杆菌作为宿主微生物时，例示Lambda gt10、Lambda gt11等。另一方面，作为质粒来说，例如在将大肠杆菌作为宿主微生物时，例不pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pTrc99A、pBluescript或作为粘粒的SuperCosI等。另外，使用假单胞菌时，例示革兰氏阴性菌用广宿主域媒介物的RSF1010、pBBR122、pCN51等。

接着，在重组媒介物上实施标记，将该重组媒介物移入宿主微生物中，形成转化体。从该转化体，以媒介物的标记和酶活性的表达为指标进行筛选，得到保持含有将GDH编码的基因的重组媒介物的基因给予微生物。

作为宿主微生物来说，只要重组媒介物是稳定的、且能自律地增殖、可以表达外来性基因，就没有特别的限制。一般地，可以使用大肠杆菌DH5α、XL-1Blue MR等。作为在宿主微生物中移入重组媒介物的方法，例如在宿主微生物是大肠杆菌时，可以使用由钙处理的感受态细胞法和电蚀孔法等。

培养基因给予微生物，再从该微生物分离和精制重组媒介物后，从重组媒介物中采集将GDH编码的基因(克隆化断片)。该克隆化断片的采集可以用与采集染色体DNA同样的方法进行。

该克隆化断片，具有编码含葡萄糖脱氢活性的α亚单位和作为电子传递蛋白质的β亚单位的碱基序列。在从Burkhorderia cepacia KS1株得到目标DNA时，克隆化断片，除了编码α亚单位和β亚单位(包括β亚单位的信号肽)的碱基序列以外，还得到作为含有编码γ亚单位的碱基序列的克隆化断片。另外，可以通过如下这样确认，克隆化断片编码α亚单位和β亚单位或者编码γ亚单位，可以用通常的方法解读该克隆化断片的碱基序列。

<第2工序(转化体的形成)>

含有作为目标的DNA的转化体，将在第1工序得到的克隆化断片组入媒介物中后，通过导入属于假单胞菌属的微生物就可以形成。作为属于假单胞菌属的微生物来说，优选使用例如恶臭假单胞菌。向宿主微生物中导入重组媒介物的导入方法，可以用与第1工序中筛选时形成转化体同样的方法进行。

<第3工序(转化体的培养和GDH的产生)>

在第2工序中得到的转化体，为了产生GDH而进行培养。从该转化体同时产生含有β亚单位的GDH和不含β亚单位的GDH。例如，从Burkhorderia cepacia KS1株得到作为目标的DNA时，同时产生具有α、β、γ亚单位的CyGDH和具有α、γ亚单位的αGDH。

转化体的培养形态，考虑宿主的营养生理性质、选择培养条件就可以，多数情况下进行液体培养。工业上进行通气搅拌培养是有利的。

作为培养基的营养源来说，在微生物培养中通常所使用的就可以广泛使用。作为碳源来说，如果是可供应的碳化合物就可以，例如使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。作为氮源来说，可供应的氮化合物就可以，例如使用胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆粕提取物等。其它，根据需要可使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。

培养温度，可以在转化体生长发育、转化体产生GDH的范围内适当变化，但优选是20～42℃左右。预计GDH达到最高产量时、在适当时间结束培养就可以，通常培养时间设为12～72小时。培养基的pH，可以在转化体生长发育、转化体产生GDH的范围内适当变化，但优选是pH为5.0～9.0左右的范围。

<第4工序(GDH的采集)>

GDH的采集，一般按照通常方法，从培养液或转化体中分离含有GDH的溶液后，精制该含有GDH的溶液。

含有GDH的溶液，在GDH存在于菌体内时，通过过滤或离心分离等手段从培养液中采集菌体之后，以机械方法或溶菌酶等酶方法破坏该菌体，根据需要添加EDTA等螯合剂和表面活性剂，使GDH成为可溶化，从而可以得到。另一方面，GDH存在于菌体外(培养液中)时，可以由过滤或离心分离等手段分离培养液和菌体而得到。

含有GDH的溶液的精制，可以从该溶液直接进行，但也可以浓缩该溶液中的GDH之后进行。就浓缩来说，可以由例如减压浓缩、膜浓缩、盐析处理或由亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙酮)进行分别沉淀来进行。在GDH的浓缩中，加热处理或等电点处理也是有效的精制手段。浓缩液的精制，可以通过适当组合例如过滤、吸附层析法、离子交换层析法、亲和层析法来进行。由此，可以分别地得到含有β亚单位的GDH和不含β亚单位的GDH。

这样得到的精制酶，可以由例如冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥而粉末化，在市场上流通。

实施例

以下，对上述制造方法的具体例子进行说明，同时，由该例实际证明可以得到2种GDH。

<源自Burkhorderia cepacia KS1株的染色体DNA的调制>

源自Burkhorderia cepacia KS1株的染色体DNA，根据通常的方法来调制。即，首先，使用TL液体培养液(聚蛋白胨＝10g、酵母提取液＝1g、NaCl＝5g、KH₂PO₄＝2g、葡萄糖＝5g、总量为1L、pH7.2)，在34℃温度下，振荡KS1株一个晚上。用离心分离机回收增殖的菌体。在含有10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5％SDS、100μg/mL的蛋白酶K的溶液中悬浊该菌体，在50℃处理6小时。在该悬浊液中加入等量的苯酚-氯仿，在室温下搅拌10分钟后，用离心分离机回收上清液。在其中加入醋酸钠，使最终浓度为0.3M，将2倍量的乙醇成为双层，使染色体DNA在中间层析出。用玻璃棒捞出析出物，用70％乙醇洗净后，使之溶解在适当量的TE缓冲液中，成为染色体DNA溶液。

<转化体的形成>

以先前得到的染色体DNA为模型，用PCR法放大编码GDH的基因全长。就引物来说，使用了GDH的γ亚单位的N末端部分的序列和GDH的β亚单位的C末端部分的序列。调整在位于各引物的端部的限制酶识别部位切断该DNA断片而得到的断片以及含有trc启动子的DNA断片，与广宿主域媒介物RSF1010结合后，导入大肠杆菌JM109中，用含有50μg/ml链霉素的LB琼脂培养基形成菌落。由所产生的菌落调整质粒，以此为模型，通过使用上述PCR引物的PCR，选择约3.4kb的断片被放大的克隆，通过将其导入恶臭假单胞菌ATCC47054株中，得到作为目标的转化体(GDH表达菌株)。

<转化体的培养和GDH的产生>

转化体的培养，在有氧的培养条件下进行。更具体地说，转化体的培养，使用每1升培养液的组成如表1所示那样调整的7L培养基、在34℃下进行8小时。以9000×g(4℃、10分钟)离心分离该培养液7L而得到了菌体。

表1：培养基组成

聚蛋白胨	10g
聚蛋白胨	10g	酵母提取液	1g
NaCl	5g	酵母提取液	1g
NaCl	5g	KH₂PO₄	2g
葡萄糖	5g	KH₂PO₄	2g
葡萄糖	5g	Einol(ABLE Co.，东京日本)	0.14g
Total、蒸馏水	1L	Einol(ABLE Co.，东京日本)	0.14g
Total、蒸馏水	1L	pH调制	7.2

<GDH的精制>

在10mM的磷酸钾缓冲液(pH6.0)使所得到的菌体分散的状态下，用法式细胞破碎仪(大竹制作所东京日本)施加1,500Kg/cm²的压力差进行破坏。以8000×g、10分钟离心分离此时所得到的细胞提取液，除去细胞固形物，得到了粗酶溶液。

粗酶溶液，添加Triton-X100，使最终浓度成为1％。然后，在4℃下缓慢搅拌一个晚上。接着，在超离心(4℃、69800×g、90分钟)后，再离心(4℃、15000×g、15分钟)，作为上清液，得到了可溶化部分。

用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)透析该可溶化部分后，将此溶液供给至用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)等量化过的Q-Sepharose FF柱(22mmID×20cmAmershambiosciences)。使蛋白质以直线性梯度来洗脱，使得10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的NaCl的浓度成为0～500mM。其流速为5mL/min。

对于洗脱液，测定每部分GDH活性。图1示意性地表示了该结果。如图1所示的那样，在梯度范围内确认了2个大峰。

GDH的活性测定，基于葡萄糖的脱氢化，通过追踪电子接收体的还原反应来进行。作为电子接收体，使用了2，6-二氯靛酚(DCIP)和菲双甲氧硫酸盐(PMS)。反应在聚乙烯管内以规定的温度来实施。

首先，在20μL的含有0.75mM PMS和0.75mM DCIP的25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.0)中添加5μL酶溶液，准备混合液。该混合液在事前定温放置1分钟。在混合液中加入1μL的2M葡萄糖(最终浓度：77mM)，使反应开始，定温放置2分钟。接着，加入100μL的冰冷蒸馏水或120μL的7.5M尿素，将试样冷却。对于该试样，使用超微量测量用比色皿(100μL)和可以用其测量的分光光度计(UV160岛津制作所京都日本)，随着时间推移地测量基于DCIP还原的退色。测定波长设定为DCIP吸收波长600nm。DCIP的摩尔吸收系数为22.23mM×cm^-1。1单位酶(U)定义为，在标准检测条件下，每1分钟氧化1μM葡萄糖的量。蛋白浓度以半限注法测定。

其次，对于2个GDH活性的峰，分别收集部分(fraction)，用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0、4℃)透析一夜，调整了2种GDH溶液。

对于各自的GDH调整溶液，使用DEAE-5PW柱(8.0mmID×7.5cm东ソ一、东京)，进行个别的精制。柱预先用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)平衡化。蛋白质用直线性梯度、流速为1mL/min来洗脱，使得10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的NaCl浓度为0-400mM。收集各个层析法中的GDH活性最高的部分，用含有0.2％Triton-X100的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)脱盐一夜，得到了2种精制酶(以下，为了方便，称为“第1精制酶”和“第2精制酶”)。

<精制酶的亚单位的特定>

用SDS-PAGE对各精制酶液进行电泳，特定亚单位的分子量。就SDS-PAGE来说，使用Tris-Tricline缓冲液，在8～25％聚丙烯酰胺的梯度凝胶中实施。该凝胶的蛋白质进行科麦西染料染色。通过PhastSystem(Pharmacia)，自动地进行分离和展开。由标准蛋白的相对移动度测定了分子质量。

图2表示SDS-PAGE电泳的结果。在图2中，路线1表示分子量标准标记蛋白质的科麦西染料染色，路线2表示第1精制酶的科麦西染料染色，路线3表示第2精制酶的科麦西染料染色。由该图中可以看出，第1精制酶分离为分子量约60kDa、约43kDa和约14kDa的蛋白质。因此，显示出第1精制酶是分子量约60kDa的α亚单位、分子量约43kDa的β亚单位和分子量约14kDa的γ亚单位结合在一起。第2精制酶分离为分子量约60kDa和约14kDa的蛋白质。因此，显示出第2精制酶是分子量约60kDa的α亚单位和分子量约14kDa的γ亚单位结合在一起。SDS-PAGE电泳的结果显示出，第1精制酶和第2精制酶是不同的GDH，同时生成2种GDH。

分别切取由电泳得到的含有α亚单位、β亚单位的带，复制到聚偏氟乙烯膜之后，由氨基酸定序器(岛津制作所、PPSQ-10)解读氨基酸序列。

对于α亚单位来说，确认了在序列号3的氨基酸序列中含有由氨基酸序号2～12组成的11残基构成的肽序列。另一方面，对于β亚单位来说，可以确认序列号5所示的N末端的16残基的氨基酸序列。

<重组媒介物的分析>

从具有GDH活性的恶臭假单胞菌的转化体中提取目标重组媒介物。对于该重组媒介物的插入DNA断片，由通常方法决定碱基序列。其结果是，含有序列号258～3660的碱基序列。

如国际公开WO02/36779号公报等公开的那样，编码α亚单位的碱基序列是序列号1的碱基序列中的碱基序号764～2380的碱基序列，编码β亚单位的碱基序列是序列号1的碱基序列中的碱基序号2386～3660的碱基序列，编码γ亚单位的碱基序列是序列号1的碱基序列中的碱基序号258～761的碱基序列，编码β亚单位的信号肽的碱基序列是序列号1的碱基序列中的碱基序号2386～2451的碱基序列。

因此，确认了目标重组媒介物含有编码α亚单位、β亚单位(包含β亚单位的信号肽)、γ亚单位的碱基序列。另外，对应于各碱基序列的氨基酸序列，对于α亚单位来说，示于序列号3，对于β亚单位来说，示于序列号5，对于γ亚单位来说，示于序列号2，对于β亚单位的信号肽来说，示于序列号4的氨基酸序列中的氨基酸序号1～22。

由以上可以清楚，在本发明中，例如αGDH和CyGDH那样，可以同时而且高效率地制造2种GDH。

序列表

<110>早出广司；爱科来株式会社

<120>葡萄糖脱氢酶的制造方法

<130>WO-AR2003-7

<150>JP 2002/253752

<151>2002-8-30

<160>5

<210>1

<211>3706

<212>DNA

<213>Burkhorderia cepacia

<220>

<221>CDS

<222>(258)..(761)

<220>

<221>CDS

<222>(764)..(2380)

<220>

<221>CDS

<222>(2386)..(3660)

<400>1

aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60

gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120

tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180

tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240

gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc 290

Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg

1 5 10

cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338

His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln

15 20 25

ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386

Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu

30 35 40

cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg 434

Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met

45 50 55

acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc 482

Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile

60 65 70 75

ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc 530

Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala

80 85 90

gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg 578

Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr

95 100 105

cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc 626

Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu

110 115 120

ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc 674

Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe

125 130 135

ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa 722

Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys

140 145 150 155

ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc 769

Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala Met Ala

160 165 170

gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc 817

Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val

175 180 185

gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg 865

Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val

190 195 200

atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag 913

Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu

205 210 215

cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg 96l

Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro

220 225 230

tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac 1009

Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr

235 240 245 250

ctg atc ctg aag ggc gag cac aag ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg 1057

Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala

255 260 265

gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att 1105

Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile

270 275 280

ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg 1153

Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp

285 290 295

ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa 1201

Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu

300 305 310

gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg 1249

Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro

315 320 325 330

cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag 1297

Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu

335 340 345

cag ace atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc 1345

Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val

350 355 360

gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg 1393

Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro

365 370 375

act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg 1441

Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala

380 385 390

atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg 1489

Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala

395 400 405 410

aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac 1537

Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp

415 420 425

aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat 1585

Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His

430 435 440

cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg 1633

Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr

445 450 455

ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc 1681

Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val

460 465 470

gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc 1729

Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly

475 480 485 490

acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc 1777

Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly

495 500 505

ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc 1825

Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg

510 515 520

gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc 1873

Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile

525 530 535

gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc 1921

Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro

540 545 550

gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag 1969

Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Gln

555 560 565 570

ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg 2017

Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val

575 580 585

ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc 2065

Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile

590 595 600

acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc 2113

Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg

605 610 615

gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg 2161

Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val

620 625 630

ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc 2209

Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile

635 640 645 650

atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg 2257

Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr

655 660 665

ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc 2305

Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr

670 675 680

gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg 2353

Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg

685 690 695

atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403

Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val Val Arg Lys Ser Thr Leu

700 705 710

act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg 2451

Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala

715 720 725

gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag cgc ggc gaa tac ctc gcg 2499

Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala

730 735 740 745

acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag atc tac acg agc aac atc 2547

Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys Ile Tyr Thr Ser Asn Ile

750 755 760

acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg gcc tgc cac acc gtg aag 2595

Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met Ala Cys His Thr Val Lys

765 770 775

ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc ggc atc ggc aaa tgg acg 2643

Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly Gly Ile Gly Lys Trp Thr

780 785 790

ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac ggc gtg tcg aag aac ggc 2691

Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His Gly Val Ser Lys Asn Gly

795 800 805

gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg tcg tac gcg aag atc aag 2739

Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val Ser Tyr Ala Lys Ile Lys

810 815 820 825

gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac ttc atg cac ggc gtc gag 2787

Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr Phe Met His Gly Val Glu

830 835 840

ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag atc cca gcg ctg cta agc 2835

Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu Ser

845 850 855

atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg ctg ttc ctg aag gac ggc 2883

Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp Leu Phe Leu Lys Asp Gly

860 865 870

ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc gaa tgg aat cgc ggc gcg 2931

Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala Glu Trp Asn Arg Gly Ala

875 880 885

tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc acg tgc cac acg ccg cgc 2979

Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser Thr Cys His Thr Pro Arg

890 895 900 905

ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac gaa acc ggc ggc agc ttc 3027

Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp Glu Thr Gly Gly Ser Phe

910 915 920

ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac ggc tac aac atc acg tcg 3075

Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp Gly Tyr Asn Ile Thr Ser

925 930 935

gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg cag cag cag ctc gtg cag 3123

Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr Gln Gln Gln Leu Val Gln

940 945 950

tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc gcg cag gcg gcc ggg ccg 3171

Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val Ala Gln Ala Ala Gly Pro

955 960 965

atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg aag atg acc gaa gcg gac 3219

Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp

970 975 980 985

atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg gtg ccg gcc gtt gcc gac 3267

Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr Val Pro Ala yal Ala Asp

990 995 1000

agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg ggc aag ccg gcc gag gac 3315

Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp Gly Lys Pro Ala Glu Asp

1005 1010 1015

ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg tcg tcg ggc atc gat ccg 3363

Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala Ser Ser Gly Ile Asp Pro

1020 1025 1030

gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg tgc cac cag atg cag ggc 3411

Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr Cys His Gln Met Gln Gly

1035 1040 1045

aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg ctg ttc cac aac tcc acc 3459

Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser Leu Phe His Asn Ser Thr

1050 1055 1060 1065

gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac crc gtg cag gtg arc ctg aac ggc 3507

Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val Gin Val Ile Leu Asn Gly

1070 1075 1080

gtg cag cgc aag arc ggc agc gag gat atc ggg atg ccc gct ttc cgc 3555

Val Gln Arg Lys Ile Gly Set Glu Asp Ile Gly Met Pro Ala Phe Arg

1085 1090 1095

tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg ctg acg aac tac gtg acc 3603

Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln lle Ala Ala Leu Thr Asn Tyr Val Thr

1100 1105 1110

gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg acg gag cag gac gtc gcg 3651

Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val Thr Glu Gln Asp Val Ala

1115 1120 1125

aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca cggcgcaacc gataggacag gag 3706

Lys Leu Arg

1130

<210>2

<211>168

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌

<400>2

Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu

20 25 30

Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp

35 40 45

Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser

50 55 60

Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu

65 70 75 80

Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gln

85 90 95

Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser

100 105 110

Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn

115 120 125

Val Val lle Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp

130 135 140

Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala

145 150 155 160

Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala

165

<210>3

<211>539

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌

<400>3

Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys

20 25 30

Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile

35 40 45

Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro

50 55 60

Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn

65 70 75 80

Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile

85 90 95

Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg

100 105 110

Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg

115 120 125

Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala

130 135 140

Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr

145 150 155 160

Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe

165 170 175

Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly

195 200 205

Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile

210 215 220

Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala

225 230 235 240

Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly

245 250 255

Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala

260 265 270

Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile

275 280 285

Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn

290 295 300

Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His

305 310 315 320

Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly

325 330 335

Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro

340 345 350

Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser

355 360 365

Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met

370 375 380

Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr

385 390 395 400

Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg

405 410 415

Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro

420 425 430

Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His

435 440 445

Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp

450 455 460

Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser

465 470 475 480

Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys

485 490 495

Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met

500 505 510

Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala

515 520 525

Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val

530 535

<210>4

<211>27

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌

<400>4

Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu

1 5 10 15

Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp

20 25

<210>5

<211>425

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌

<400>5

Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe

1 5 10 15

Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala

20 25 30 35

Thr A1a Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys 11e Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp

40 45 50 55

Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met Ala Cys His Thr Val Lys G1y Gly Lys Pro Tyr Ala

60 65 70 75Gly

G1y Leu Gly Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg A1a Val Arg

80 85 90

95

His Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro A1a Met Pro Tyr Val Ser Tyr

100 105 110

A1a Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr Phe Met His Gly Val

115 120 125 130

Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg

135 140 145 150

Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys

155 160 165 170Pro

Ser Gln Ser Ala Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His

175 180 185 190

Cys Ser Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp Glu

195 200 205

Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp Gly Tyr Asn Ile

210 215 220 225

Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr Gln Gln Gln Leu Val Gln

230 235 240 245

Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu

250 255 260 265

Ala Val Glu His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr

270 275 280

Tyr Val Arg Thr Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser

285 290 295 300

Trp Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala Ser Ser

305 310 315 320

Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr Cys His Gln Met Gln

325 330 335 340Gly

Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly

345 350 355 360

Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile

365 370 375

Gly Ser Glu Asp Ile Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile

380 385 390 395

Ala Ala Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val Thr

400 405 410 415

Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg

420 425

Claims

1.一种葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

将含有编码在序列号1记载的具有葡萄糖脱氢活性的α亚单位及作为电子传递蛋白质的β亚单位的序列的DNA导入属于假单胞菌属的微生物中，形成转化体，培养该转化体，产生含有所述β亚单位的第1葡萄糖脱氢酶和不含所述β亚单位的第2葡萄糖脱氢酶。

2.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述α亚单位在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为60kDa，

所述β亚单位在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为43kDa。

3.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述DNA含有编码在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为14kDa的γ亚单位的碱基序列，

所述第1及第2葡萄糖脱氢酶，作为含有所述γ亚单位的酶来产生。

4.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：所述属于假单胞菌属的微生物是恶臭假单胞菌。

5.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述DNA是属于Burkhorderia属的微生物，从具有产生葡萄糖脱氢酶能力的微生物取得。

6.如权利要求5所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：属于所述Burkhorderia属的微生物是Burkhorderia cepacia KS1株(FERMBP-7306)。

7.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述α亚单位具有序列号3的氨基酸序列或在序列号3的氨基酸序列中取代、空缺、插入或加成一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

8.如权利要求7所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述DNA含有在序列号1的碱基序列之中、编码由碱基序号764～2380组成的α亚单位的碱基序列。

9.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述β亚单位具有序列号5的氨基酸序列或在序列号5的氨基酸序列之中取代、空缺、插入或加成一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

10.如权利要求9所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述DNA含有在序列号1的碱基序列之中、编码由碱基序号2386～3660组成的β亚单位的碱基序列。

11.如权利要求3所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述γ亚单位具有序列号2的氨基酸序列或在序列号2的氨基酸序列之中取代、空缺、插入或加成一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

12.如权利要求11所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述DNA含有在序列号1的碱基序列之中、编码由碱基序号258～761组成的γ亚单位的碱基序列。

13.如权利要求12所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述DNA，在编码α亚单位的碱基序列的上游区域含有编码γ亚单位的碱基序列。

14.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：所述DNA含有编码所述β亚单位的信号肽的碱基序列。

15.如权利要求15所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述信号肽具有序列号4的氨基酸序列之中的氨基酸序号1～22的氨基酸序列。

16.如权利要求15所述的葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于：

所述信号肽由序列号1的碱基序列之中的碱基序号2386～2451的碱基序列来编码。