CN1675246A - 用于诊断糖尿病性视网膜病的蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于诊断糖尿病性视网膜病的材料。更具体的说，本发明涉及用于诊断糖尿病性视网膜病的免疫球蛋白A蛋白、包含针对该蛋白质的抗体的用于诊断糖尿病性视网膜病的试剂盒、以及用于诊断糖尿病性视网膜病的方法。本发明可用于诊断糖尿病性视网膜病。

Description

用于诊断糖尿病性视网膜病的蛋白质

                     技术领域

一般而言，本发明涉及用于糖尿病性视网膜病的诊断物质，更具体的说，涉及包含免疫球蛋白A蛋白及其抗体的诊断试剂盒和使用这种试剂盒的诊断方法。

                     发明背景

一般而言，作为复杂的代谢紊乱引起微血管病的糖尿病是一种系统性疾病，广泛损害全身组织。糖尿病可能影响视觉，而且最重要的是，损害眼睛中的血管(LEE Tae-hee、CHOI Young-gil，《DiabeticVascular Complications》即糖尿病性血管并发症，汉城，KoryoMedicine)。随着糖尿病患者的寿命和发病时程因生活水平的改进和治疗的发展而延长，糖尿病性视网膜病，最严重的并发症之一，成为最重要的问题(Klein R.等人，Arch Ophthalmol.，102：520-532，1984)。糖尿病性视网膜病分为两个阶段，非增生阶段和增生阶段。非增生阶段的特征是由血管紊乱导致的视网膜损伤局限于视网膜。增生阶段的特征是来自视网膜的新血管组织突入玻璃体腔(Green，《Ophtalmic Pathology：an atlas and textbook》即眼科病理学：图集和课本，第4版，Spencer WH编，费城，WB Saunder，1124-1129，1996)。糖尿病性视网膜病是通过观察眼底结构中的特征性变化来诊断的。由于糖尿病性视网膜病的视力受损源自增生阶段中伴随着黄斑牵引性视网膜脱落的出血性corporis vitrei和黄斑病。众所周知手术治疗的激光处理对视力受损的效力(《Diabetic Retinopathy StudyReport》即糖尿病性视网膜病研究报告，第14期；Int OphthalmolClin.，27：239-253，1987)。遵循正确步骤的这种治疗能够预防视力受损，将副作用降至最小。应当经常检查和诊断糖尿病性视网膜病以确定是否对糖尿病性视网膜病进行手术。然而，由于目前只能通过眼底镜检查来诊断糖尿病性视网膜病，因此难以在其早期阶段检测糖尿病性视网膜病。结果是，患者非常普遍的丧失了预防糖尿病性视网膜病和对其进行手术的机会。因此，本发明公开了用于早期在血液中诊断糖尿病性视网膜病的方法。尚无使用血液诊断糖尿病性视网膜病的方法。本发明人通过蛋白质组学(proteomics)发现了在血液中发生变化的一种蛋白质，并将这种蛋白质应用于诊断学。由于这种蛋白质在没有糖尿病性视网膜病并发症的糖尿病患者与具有并发症的糖尿病患者之间显示显著的数量变化，通过免疫学方法使用精确定量而完成了包含这种蛋白质的本发明。

                     发明详述

为了克服上述问题，本发明的一个目标是为糖尿病性视网膜病提供有用的诊断剂。

本发明的另一个目标是提供用于诊断糖尿病性视网膜病的试剂盒，包括诊断剂。

本发明的还有一个目标是提供用于诊断糖尿病性视网膜病的方法。

为了实现上述目标，提供了有效诊断糖尿病性视网膜病的免疫球蛋白A蛋白及其蛋白质片段。

通过蛋白质分析得到的序列符合免疫球蛋白A重链的一个恒定位点。免疫球蛋白A蛋白以重链和轻链型存在。由于每条链都具有一个可变区，因此蛋白质包含具有许多不同序列的位点。结果是，能够获得经测定是免疫球蛋白A蛋白的具有某种序列的蛋白质。

公开的免疫球蛋白A蛋白可以具有多种氨基酸序列，像重链的SEQID NO：1。

IgA H链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述。

公开的免疫球蛋白A蛋白质片段可以具有多种类型的片段，包括SEQ ID NO：2的肽。

提供了特异结合蛋白质的抗体。抗体可以是多克隆的和单克隆的，但是更优选单克隆的。

还提供了包含抗体且用于诊断糖尿病性视网膜病的试剂盒。

公开的试剂盒还包含通过缀合酶过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素得到的抗体蛋白。

公开的诊断试剂盒中所使用的其余试剂可以容易的由一般诊断试剂盒中所使用的成分获得。

还提供了用于诊断糖尿病性视网膜病的方法，包括：a)用血样和缀合了过氧化物酶、碱性磷酸酶、或生物素的抗免疫球蛋白A蛋白处理抗体；并b)测量化合物的光密度，其中当测量结果表示低于400mg/dL免疫球蛋白A时诊断是糖尿病性视网膜病。

提供了用于编码免疫球蛋白A蛋白的SEQ ID NO：3免疫球蛋白A基因和用于编码SEQ ID NO：2肽的SEQ ID NO：4核苷酸。

下面将详细描述本发明。

在本发明中，糖尿病性视网膜病患者眼球玻璃体的免疫球蛋白A蛋白显示相对于健康玻璃体而言增加。本发明人在这里发现血液中的蛋白质发生了变化，即糖尿病性视网膜病患者血液中的免疫球蛋白A蛋白相对于糖尿病患者而言减少了。因此，公开了使用免疫学方法的糖尿病性视网膜病诊断。

为了实现上述目标，使用蛋白质组学方法分析了在糖尿病性视网膜病中显示特异变化的蛋白质群。通过分析糖尿病性视网膜病患者玻璃体与正常玻璃体中的蛋白质数量变化和蛋白质类型发现了下列结果。在检查了血液中的靶蛋白变化之后，使用适当的免疫学方法制备了用于诊断糖尿病性视网膜病的试剂盒。第一，选择正常玻璃体作为对照组。通过二维凝胶分离和图像分析，在由糖尿病患者和糖尿病性视网膜病患者获得的玻璃体中分离显示性质和数量差异的蛋白质群。使用MS和Q-TOF分析仪鉴定蛋白质群。证明了其中观察并鉴定变化的蛋白质是免疫球蛋白A。观察到在正常玻璃体中几乎观察不到的免疫球蛋白A在糖尿病性视网膜病患者的玻璃体中增加。然而，尚无关于免疫球蛋白A在糖尿病性视网膜病患者的玻璃体中增加的报告。第二，这种蛋白质在血液中显示数量变化。在以糖尿病患者的血液作为对照组时，糖尿病性视网膜病患者血液中的免疫球蛋白A减少。然而，这一结果也尚无报道。第三，通过制备经由免疫学方法的试剂盒，选择了用于测量蛋白质存在值的简单、灵敏、且精确的方法。

下面将依照优选实施方案详细描述本发明。

                    附图简述

图1的示意图例示了将要应用于蛋白质组学分析的眼球玻璃体的预处理过程。

图2显示的凝胶照片例示了眼底玻璃体蛋白质在二维电泳后的CBB染色。正常眼球玻璃体的标记区域中未显示蛋白质，而糖尿病性视网膜病眼球玻璃体的标记区域中显示蛋白质。

图3显示的CBB染色凝胶照片例示了糖尿病性视网膜病患者和只是糖尿病患者的血清蛋白质，蛋白质在二维电泳后CBB染色。只是糖尿病患者的标记区域中存在过量的蛋白质，而糖尿病性视网膜病患者的标记区域中显示蛋白质的数量减少。

图4显示的曲线图例示了使用MALDI-TOF和Q-TOF分析仪得到的图2标记区域中蛋白质的经胰蛋白酶处理的肽的质谱(A)，以及肽片段中肽的氨基酸序列(B)。

图5显示的标准滴定曲线图例示了0、15.6、31.25、62.5、125、250、500ng/ml免疫球蛋白A标准溶液和ELISA反应后的光密度测量值。

                优选实施方案

实施例1：用于分析蛋白质组学的玻璃体的样品制备

糖尿病性视网膜病是由长期糖尿病引起的并发症之一。糖尿病性视网膜病的特征是生成许多异常新血管系统，它们具有不完整的血管结构，在眼球的玻璃体中引起出血。出血在视网膜中导致异常，进而视力削弱和丧失。在本发明中，使用蛋白质组学方法通过分析正常对照组与糖尿病性视网膜病患者玻璃体中的蛋白质来搜索疾病指征，并且获得了表现疾病状态的蛋白质信息。首先，为了将蛋白质组学方法应用于蛋白质，处理玻璃体以便于分析。玻璃体含有大量的高分子量粘多糖、透明质酸。然而，已证实这种多糖妨碍蛋白质分离。因此，设计一种方法来有效清除这种多糖(见图1)。首先，用16ml蒸馏水稀释4ml玻璃体，将稀释液置于具有1,000,000截留膜的管中并于4℃以8,000rpm离心2小时。将这一程序重复三次，通过分子量差异过滤超过1,000,000的高分子量多糖。将未过滤的蛋白质置于具有10,000截留膜的管中，并于4℃以4,000rpm离心，然后浓缩用于分析。用于在本发明中清除高分子量多糖的方法通过解决在低pH不易分离的问题而使之能够有效分析。

实施例2：在由正常人与糖尿病性视网膜病患者获得的眼球玻璃体中发生变化的蛋白质群的研究

由每个玻璃体分离蛋白质，并浓缩至1mg/ml用于分析。首先，通过逐步法使用蛋白质的两个不同特征将蛋白质在二维上分开。在第一步中，通过对蛋白质施加电刺激使蛋白质根据蛋白质的净电荷移动(IEF，pH 3-10)。在第二步中，蛋白质在丙烯酰胺凝胶(8-18％)上根据每种蛋白质的分子量移动。对蛋白质进行一维电泳(根据pH的蛋白质移动)，每块凝胶50mA 12小时。然后，在聚丙烯酰胺上对蛋白质进行二维电泳(根据分子量的蛋白质移动)，每块凝胶50mA 6小时。用考马斯亮蓝G250染料和银染法将这些移动蛋白质染色用于显影。在电脑中使用图象分析软件Phoretix(Nonlinear dynamics，英国)分析正常玻璃体与糖尿病性视网膜病患者玻璃体之间的蛋白质差异。通过分析两组的蛋白质，本发明人确认了存在显示差异的蛋白质群(见图2和3)。

实施例3：在糖尿病患者与糖尿病性视网膜病患者之间显示差异的血清蛋白质的鉴定

通过MALDI-TOF和Q-TOF分析仪搜索并鉴定具有数量和性质差异的蛋白质以获知蛋白质的种类(见图4)。显示糖尿病性视网膜病患者血液中的免疫球蛋白A数量低于糖尿病患者的血液。

实施例4：通过酶联免疫吸收测定法(ELISA)诊断糖尿病性视网膜病

进行本研究是为了查明能否通过三明治酶联免疫吸收测定法(ELISA)使用抗免疫球蛋白A抗体在糖尿病患者中鉴别糖尿病性视网膜病的血清。在医院中，由10名正常健康人、45名没有糖尿病性视网膜病的糖尿病患者和86名糖尿病性视网膜病患者获得血清。首先，向EIA 96孔板的每个孔中加入100ul溶于包被缓冲液(50mM NaHCO₃，pH 9.0)的抗免疫球蛋白A(Koma，韩国)(1ug抗体蛋白/孔；终浓度10ug/ml)，并于室温反应并包被1小时。将每个孔用400ul PBST清洗两次10分钟，然后用含1％BSA的PBS封闭(post-coated)。向每个孔中加入100ul用PBST缓冲液稀释的患者血清，反应1小时，然后用PBS清洗五次。向每个孔中加入100ul稀释的缀合了过氧化物酶的抗免疫球蛋白A抗体(KOMA生物技术公司，韩国)，然后反应1小时。反应后，将每个孔用PBS清洗三次。然后，向其中加入100ul含1mg/ml OPD(邻苯二胺二氢氯化物)和0.03％H₂O₂的0.1M柠檬酸盐-磷酸盐(pH 4.9)，并于室温反应20-30分钟。加入100ul 3M硫酸终止反应，并使用ELISA读数仪测量450nm光密度。通过将标准滴定曲线和稀释度转换成光密度来确定每个单位体积(ml)血液中的免疫球蛋白A数量(见图5)。ELISA测量的结果是，免疫球蛋白A的数量在正常人血清中的范围是131.2-298.7mg/dL，糖尿病患者血清中的范围是226.5-771.9mg/dL，而糖尿病性视网膜病患者血清中的范围是105.3-557.2mg/dL。这些结果在表1中以平均值显示。作为免疫球蛋白A的测量平均值，正常人是217.6±82.1mg/dL，糖尿病患者是457.6±151.6mg/dL，非增生性糖尿病性视网膜病患者是244.4±117.1mg/dL，而增生性糖尿病性视网膜病患者是278.6±123.6mg/dL。在这里显著显示了糖尿病患者群的血清中存在大量的免疫球蛋白A。然而，显示了非增生性与增生性糖尿病性视网膜病患者血清中的免疫球蛋白A数量存在略微差异。若当免疫球蛋白A数量低于ELISA值的400mg/dL时判定糖尿病性视网膜病是阳性的，则86人中有72人证明是患者。在这里显示了83.7％的诊断灵敏性。在无视网膜病的糖尿病患者的情况中，45人中有22人证明是患者。在这里显示了48.9％的诊断特异性(见表2)。

表1：通过ELISA测量健康人和患者血清中免疫球蛋白A的平均值

		平均IgA浓度(mg/dL)
			健康人		217.6±82.1
DM		457.5±151.6
			DMR	NPDR(非增生性)	244.4±117.1
PDR(增生性)	278.6±123.6

表2：根据ELISA标准400mg/dL(取舍点)判断糖尿病性视网膜病患者

	健康人	无视网膜病的DM	有视网膜病的DM
				高于400mg/dl	0	22	14
低于400mg/dl	10	23	72
				合计	10	45	86

                      工业应用

本发明涉及用于容易诊断糖尿病性视网膜病的技术，那是糖尿病的一种并发症。尚无用于糖尿病性视网膜病的有效商品化诊断方法。糖尿病性视网膜病完全依靠医院的眼科医生来诊断。对于糖尿病患者而言，不可能在不进行定期眼科检查且没有视力缺陷的主观症状的情况下在其早期诊断糖尿病性视网膜病。本发明诊断方法的特征是简单的血液测试，而且能够非常有效的在眼科检查之前鉴定并发症的发展。具体而言，本发明的优势是花费低廉且处理简单，尤其是对于接受医学测试或咨询医生的一群糖尿病患者而言，只需调整使用96孔板的ELISA法就能够大量测试。同样，通过使用免疫化学方法，本发明的准确性和精确性也是卓越的。总之，本发明有效的在其早期诊断和筛选中诊断糖尿病性视网膜病，而且有助于潜伏和早期糖尿病性视网膜病患者确定药物治疗时间，从而延缓疾病发展成严重的糖尿病性视网膜病。

序列表

<110>EYEGENE INC.

<120>用于诊断糖尿病性视网膜病的蛋白质

<150>KR102002041771

<151>2002-07-16

<160>4

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>353

<212>PRT

<213>人类

<400>1

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr

  1               5                  10                  15

Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

             20                  25                  30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val

         35                  40                  45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

     50                  55                  60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly

 65                  70                  75                  80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

                 85                  90                  95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro

            100                 105                 110

Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser

        115                 120                 125

Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn

    130                 135                 140

Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe

145                 150                 155                 160

Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu

                165                 170                 175

Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys

            180                 185                 190

Ala Glu Pro Trp Ash His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr

        195                 200                 205

Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn

    210                 215                 220

Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu

225                 230                 235                 240

Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser

                245                 250                 255

Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro

            260                 265                 270

Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly

        275                 280                 285

Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp

    290                 295                 300

Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu

305                 310                 315                 320

Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro

                325                 330                 335

Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys

            340                 345                 350

Tyr

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg

  1               5                  10

<210>3

<211>1059

<212>DNA

<213>人类

<400>3

gcaagcttga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct gcagcaccca gccagatggg        60

aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc        120

tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc cacccagcca ggatgcctcc        180

ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cctagccggc       240

aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc       300

tgcccagttc cctcaactcc acctacccca tctccctcaa ctccacctac cccatctccc       360

tcatgctgcc acccccgact gtcactgcac cgaccggccc tcgaggacct gctcttaggt       420

tcagaagcga acctcacgtg cacactgacc ggcctgagag atgcctcagg tgtcaccttc       480

acctggacgc cctcaagtgg gaagagcgct gttcaaggac cacctgaccg tgacctctgt       540

ggctgctaca gcgtgtccag tgtcctgtcg ggctgtgccg agccatggaa ccatgggaag       600

accttcactt gcactgctgc ctaccccgag tccaagaccc cgctaaccgc caccctctca       660

aaatccggaa acacattccg gcccgaggtc cacctgctgc cgccgccgtc ggaggagctg       720

gccctgaacg agctggtgac gctgacgtgc ctggcacgtg gcttcagccc caaggatgtg       780

ctggttcgct ggctgcaggg gtcacaggag ctgccccgcg agaagtacct gacttgggca       840

tcccggcagg agcccagcca gggcaccacc accttcgctg tgaccagcat actgcgcgtg       900

gcagccgagg actggaagaa gggggacacc ttctcctgca tggtgggcca cgaggccctg       960

ccgctggcct tcacacagaa gaccatcgac cgcttggcgg gtaaacccac ccatgtcaat       1020

gtgtctgttg tcatggcgga ggtggacggc acctgctac                              1059

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人类

<400>4

tggctgcagg ggtcacagga gctgccccgc                                      30

Claims (7)

1.SEQ ID NO：1中描述的免疫球蛋白A蛋白及其类似蛋白质或蛋白质片段，其中蛋白质有效诊断糖尿病性视网膜病。

2.依照权利要求1的蛋白质片段，其中蛋白质片段包含SEQ IDNO：2中描述的肽序列。

3.特异结合权利要求1或2的蛋白质的抗体。

4.包含权利要求3的抗体的用于诊断糖尿病性视网膜病的试剂盒。

5.依照权利要求4的试剂盒，还包含缀合了酶过氧化物酶、碱性磷酸酶、或生物素的抗免疫球蛋白A抗体。

6.用于诊断糖尿病性视网膜病的方法，包括：

a)血样和缀合了过氧化物酶、碱性磷酸酶、或生物素的抗免疫球蛋白A蛋白处理权利要求2的抗体；并

b)测量化合物的光密度，

其中当光密度的测量值(ELISA值)低于正常值时诊断是糖尿病性视网膜病。

7.编码权利要求1或2的蛋白质的SEQ ID NO：3的蛋白质免疫球蛋白A基因和类似基因。

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