CN1555384B - 从乳制品获得具有低相互交叉污染的生长因子(TGF-β和IGF-1)、乳过氧化物酶和免疫球蛋白制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从乳中提取有益化合物,特别是生长因子,如TGF-β和IGF-1的方法。在该方法中包含疏水相互作用色谱步骤。将具有丁基或苯基作为配体的树脂用作疏水相互作用树脂。当配体是苯基时,可以用基本上不含醇的盐梯度洗脱该树脂,从而获得富含所需的生长因子的部分。可以通过羟基磷灰石柱进一步分离这些部分。
Description
技术领域
本发明涉及从乳制品(乳或乳清)获得含有有益化合物的部分的方法。具体而言,根据本发明,获得富含生长因子化合物,如转化生长因子β(TGF-β)或胰岛素样生长因子1(IGF-1)的部分。
背景技术
乳制品含有具有有益活性的生长因子已为人所知一段时间。这些生长因子在乳制品中以很低的浓度存在,这就是为何有时它们被称为微量营养物的原因。它们的特征可以在于它们的相对高于其它乳蛋白的等电点,以及它们的分子量。本发明特别关注生长因子TGF-β和IGF-1。
TGF-β是在所有哺乳动物组织中发现的多功能蛋白。现在已知五种TGF-β的形式,β1-β5。它与组织的发育、分化和生长,免疫系统功能的控制,以及致癌作用有关。TGF-β可以分离自天然来源(如血小板)、哺乳动物乳或初乳,或者可由重组细胞产生。
IGF-1,合成代谢的,即促进生长的生长因子,是一种小蛋白(分子量约为7800),它在骨代谢中起着重要作用。已证明它刺激培养物中的细胞生长。在垂体缺乏的正常和分解代谢状态下也刺激动物生长。肾功能也得到改善。其可以利用重组DNA技术、固相肽合成而生产,通过从血清或哺乳动物乳,如牛乳或人乳分离之而生产。
这种生长因子的提取在本领域中是已知的。因此,Eur.J.Biochem.197,353-358(1991)描述了可以从牛乳获得与TGF-β2相关的多肽。该描述的方法包括强阳离子交换色谱、低压疏水相互作用色谱、疏水相互作用高效液相色谱、反相高效液相色谱和最后的尺寸排阻高效液相色谱步骤的组合。该方法的缺点是多步方法,基于乳的收率低于1%TGF-β。根据该方法,仅一个部分从乳中得到分离。因此,需要一种简单的方法,其产生多于一种类型的诸如TGF-β和IGF-1的生长因子组分,但其还能够产生其它有益组分。
本申请人的WO 01/25276中对此给出了一种解决方法,在该申请中描述了如何经通过HydroxyAPatite(HAP)柱而从乳制品中提取含有生长因子TGF-β和IGF-1的部分。虽然可以获得生长因子的适当部分,但该方法具有一些缺点。这些缺点之一是HAP柱的寿命和每个循环的收率相对较低,这使该方法在经济上不太可行。另外,HAP柱结合乳过氧化物酶,使得该方法不太有效,因为该部分中的蛋白的主要部分由乳过氧化物酶组成。
因此,本发明的目的是提供从乳获得含有生长因子的部分的方法,特别是从乳制品以相对纯的部分分离TGF-β和IGF-1(即IGF-1的纯度高于150μg/g蛋白而基本上没有TGF-β,以及TGF-β的纯度高于400μg/g蛋白,优选至少为500μg/g蛋白而基本上没有IGF-1)的方法,从而通过经济上可行的方法提供高含量的生长因子。本发明的进一步的目的是提供适于口服给予的形式的这些生长因子。本发明的进一步的目的是以相对纯的部分从乳制品回收TGF-β和IGF-1,并同时回收大量天然乳过氧化物酶(LP)。
发明内容
根据本发明,已经发现了分离富含生长因子和其它有益化合物的部分,并同时产生高活性的乳过氧化物酶部分的方法。因此,本发明提供从乳制品提取含有生长因子组分的部分的方法,该方法包括以下步骤:
a)通过阳离子交换色谱回收乳制品的碱性部分;
b)使含有步骤a)中获得的部分的溶液与包含载体和连接于该载体的配体的疏水相互作用色谱树脂接触;其中该疏水相互作用色谱树脂的配体选自丁基和苯基;
c)用洗脱液洗脱该疏水相互作用色谱树脂,获得含有生长因子化合物的部分;并且
其中当将苯基用作步骤b)中的配体时,步骤c)的洗脱液基本上不含醇。
具体实施方式
本发明涉及从乳制品提取含有生长因子组分的部分的方法,该方法包括以下步骤:
a)通过阳离子交换色谱(CEC)回收乳制品的碱性部分;
b)使含有步骤a)中获得的部分的溶液与包含载体和连接于该载体的配体的疏水相互作用色谱(HIC)树脂接触;其中该疏水相互作用色谱树脂的配体选自丁基和苯基;
c)用洗脱液洗脱该疏水相互作用色谱树脂,获得含有生长因子化合物的部分;并且
其中当将苯基用作步骤b)中的配体时,步骤c)的洗脱液基本上不含醇。
用作本发明的原料的乳制品可以是任何哺乳动物乳或含有生长因子的乳衍生物,如酪乳清或酪蛋白乳清。优选使用牛乳或乳衍生物。将乳制品用作本发明的原料的优点是,除了所需的有益化合物,特别是生长因子以外,在洗脱的部分中还将存在其它化合物,这可贡献于所需的化合物的作用。
步骤a)-通过CEC的回收
用于步骤a)中的阳离子交换树脂可以是该领域中已知的任何合适的类型。优选使用平均粒径超过100μm或机械强度足以耐高压的阳离子交换树脂。这具有阳离子交换树脂耐高液体负载,而结合容量得以维持的优点。这使得在短时间内处理大量液体成为可能,而在短时间内处理大量液体是工业应用方法所要求的。适宜的阳离子交换树脂的实例是S-Ceramic Hyper D、SP-Toyopearl、SP-Sepharose FastFlow和SP-Sepharose Big Beads。
优选通过用pH值为5.5-7.5,优选为6.5的缓冲剂缓冲来平衡阳离子交换树脂。用于本文该方法中的适宜的缓冲剂是本领域技术人员已知的那些,并且通常选自醋酸铵、磷酸钠及其混合物,更优选为磷酸钠。然后例如通过抽吸而使该乳制品通过具有阳离子交换树脂的柱,从而从原料中吸附微量组分至该阳离子交换树脂上。为了阻止微生物生长,这些方法通常在4-7℃的温度下进行。然而,已发现在该温度下的粘度导致不能接受的压力升高。为了克服该问题,本申请人已发现,通过优选在15-30℃,更优选15-20℃的温度下进行吸附,降低了乳或乳衍生物的粘度,而仍保持了相对卫生的条件。
根据优选的实施方案,以高表面速度(大于500cm/小时),并以高液体负载(100-600柱床体积/小时)将原料抽吸至平均粒径为100-300μm的阳离子交换树脂上,如US 5,596,082中所描述的。根据该实施方案,实现了从经济角度而言极为有利,具有突出的工业实用性的方法。
在吸附步骤后,优选通过用缓冲为pH 5.5-7.5,优选6.5,盐浓度为0-0.20摩尔,优选为0.05-0.15摩尔,更优选为0.10摩尔的盐溶液洗涤而冲洗任何残余乳制品(原料)的阳离子交换树脂柱。
用于本文的适宜的盐是本领域技术人员一般已知的那些,它们通常选自氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钾、磷酸钠、醋酸铵,以及它们的混合物。
步骤a)的冲洗步骤的优选的盐为氯化钠。
在所需的组分吸附到离子交换树脂上之后,进行洗脱步骤,优选用多种洗脱液,优选至少两种洗脱液顺序洗脱,所述洗脱液的盐浓度或pH增加,从而获得具有LP和生长因子的部分,以及具有其它有益组分,如血管生成素和乳铁传递蛋白的另一部分。优选用缓冲为pH 5.5-7.5,更优选约6.5的盐溶液洗脱这些组分。本文可以使用上述任何的盐进行步骤a)的洗脱,然而优选的盐是氯化钠或氯化钾,更优选为氯化钠。步骤a)中的洗脱的盐浓度在0.15至小于1.5M的范围内。优选地,用0.15-0.5M,优选0.20-0.40M的盐溶液洗脱第一部分。这得到包含LP、IgG和血管生成素以及所需的生长因子TGF-β和IGF-1的部分。接着用浓度为0.50-1.5M,优选为0.9-1.1M的盐溶液洗脱第二部分。这得到包含乳铁传递蛋白和任选的血管生成素的部分。
步骤b)-使溶液和HIC树脂接触
根据本发明,在该方法的步骤b)中,使含有在阳离子交换色谱步骤a)中获得的部分的溶液,或者优选地,使含有在阳离子交换色谱步骤a)中获得的含生长因子的部分的溶液通过包含载体和连接于该载体的苯基或丁基配体的疏水相互作用色谱(HIC)树脂。
载体可以是本领域已知的任何载体。例如可以使用基于交联琼脂糖的载体,或基于甲基丙烯酸/丙烯酸或聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物的载体。适宜的树脂的实例为Tosoh的Toyopearl Phenyl 650M、PhenylSepharose Fast Flow(包括“high Sub”和“Low Sub”变体)、PhenylSepharose High Performance、Source Phenyl和正丁基Sepharose 4 FastFlow,所有均为Amersham Biosciences的,以及来自Biorad的Macro-Prep叔丁基HIC载体。和苯基配体组合使用的优选树脂是Phenyl Sepharose Fast Flow(包括“high Sub”和“Low Sub”变体)。
配体是苯基或丁基。用作本文的配体的适宜的丁基是叔丁基或正丁基。用于本文的优选配体是苯基或正丁基,更优选是苯基。最优选的配体是苯基。
得自离子交换步骤并负载到HIC树脂上的溶液含有在步骤a)中获得的部分,例如本文前述的,在盐的水溶液中的量为0.1-10%,并且pH为4-7。盐浓度为0.05-3M。当使用苯基或正丁基配体时,盐浓度优选为0.25-3M。当使用非正丁基的丁基配体时,盐浓度优选为0.05-1M,更优选为0.2-0.3M。用于本文的优选的盐是氯化钠。如前文所述,该溶液可进一步含有0.01-0.2M,优选0.01-0.1M,更优选0.01-0.03M的缓冲剂。用于该步骤的优选的缓冲剂是醋酸铵或磷酸钠。
将这样获得的溶液以约5-30柱床体积/小时,优选10-20柱床体积/小时的流速负载到树脂上,从而使所需的生长因子从溶液中吸附到HIC树脂上。
接着优选用适宜的洗涤液对HIC树脂进行洗涤步骤,该洗涤步骤包括将2-5柱床体积的负载缓冲液(即不含该部分的盐/缓冲液)抽吸到柱上。
步骤c)-HIC树脂内容物的洗脱
在吸附步骤b)后,在步骤c)中用适宜的洗脱液洗脱该HIC树脂。适宜的洗脱液是指含有0-50%(v/v)C1-C4醇的0.01-3.0M盐的水溶液。该溶液的pH为4.0-7.0,优选约为4.5-6.5,更优选为4.5-5.5。用于步骤c)中的盐通常为如前文所述用于步骤b)的盐,并且优选地包含缓冲盐如磷酸盐缓冲剂和洗脱盐如硫酸钠的混合物,并且更优选地选自醋酸铵、磷酸钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化钾,以及它们的混合物。
当使用苯基或正丁基配体时,优选将0.02-2.0M盐的水溶液用作洗脱液。那么最优选的盐是磷酸钠,或磷酸钠与硫酸铵、硫酸钠或氯化钠的混合物。有利地,现在本申请人已发现,当使用苯基或正丁基配体时,水溶液中不太需要,甚至不再需要醇的存在,而仍确保各部分的良好洗脱。因此,为了本发明的目的,当使用苯基或正丁基配体时,步骤c)的洗脱液优选基本上不含醇。“基本上不含醇”是指步骤c)的洗脱液含有少于15%(v/v)的醇,优选少于5%,更优选不含醇。该发现特别令人惊讶,特别是从现有技术的角度而言,在现有技术中一定量的醇总是用于洗脱HIC树脂,例如前文所述的Eur.J.Biochem.197,353-358(1991)。此外,已发现进行没有醇的洗脱方法在多个方面具有优势:与含有醇的洗脱液相比,已发现在所洗脱的部分的处理(work-up)和浓缩中所用的膜膨胀得不严重,这样在超滤期间导致更高的渗透物通量,更低的跨膜压力,并因此消耗更少的能量,膜老化速度更慢。实际上,对于后者而言,在醇的存在下,膜通常敏感并因此而恶化。本发明的方法通过提供简单而有效的方法解决了该问题。此外,由于醇的存在可以减少或者甚至不再需要,则考虑方法的安全性不需要大量投资,如防爆炸加工设备。
还是为了本发明的目的以及更好地分离各组分,当使用苯基或正丁基配体时,优选用浓度或pH值逐渐或线性降低的多种洗脱液,优选至少两种洗脱液顺序洗脱由前面的步骤获得的含有生长因子的部分,从而分别获得富含LP和IGF-1的部分,以及富含TGF-β和IGF-1的部分。在该例中,在步骤c)中所用的第一洗脱液的浓度优选为0.1-2.0M,而用于步骤c)中的接着的或第二洗脱液优选用磷酸盐缓冲剂的盐制备,更优选为0.01-1.0M盐的浓度,更优选为0.01-0.5M。
当使用非正丁基的丁基配体时,优选将0.01-1M盐,更优选0.08-0.2M盐的溶液用作洗脱液,其具有0-50%(v/v)的C1-C4醇,优选为0-40%的C1-C4醇。优选的醇为乙醇或2-丙醇,更优选为2-丙醇。更优选的盐是醋酸铵。为了本发明的目的和更好地分离各组分,当使用丁基配体时,优选使用醇浓度或pH逐步或线性增加的多种洗脱液,优选至少三种洗脱液顺序洗脱由前面步骤获得的含有生长因子的部分,从而分别获得含LP的部分,富含IGF-1的部分,和富含TGF-β和其它有益组分,如LP、IgG、乳叶酸结合蛋白、生乳素(lactogenin)、血管生成素(angiogenin)和核糖核酸酶的部分。特别地,0-50%的洗脱液梯度主要得到乳过氧化物酶,40-60%的洗脱液得到富含IGF-1的部分,50-100%的洗脱液得到富含TGF-β的部分。
洗脱液以5-30柱床体积/小时,优选10-20柱床体积/小时的流速通过树脂,从而所需的生长因子从HIC树脂上解吸到洗脱液中。
当将苯基或正丁基配体用于本发明的方法中时,洗脱HIC树脂后获得的未结合部分富含LP,而另一部分富含TGF-β和IGF-1。然后可以通过用申请WO 01/25276中描述的羟基磷灰石柱进一步分离该部分。然而,与经HAP获得的含有乳过氧化物酶(LP)的部分很少的WO 01/25276相反,在本发明中通过HIC获得的第一部分富含LP,即至少800mg/g蛋白,而接下来的部分富含生长因子和其它有益组分。因此,实现了比WO 01/25276好得多的HAP柱的使用和分离。
因此,使富含TGF-β和IGF-1的在步骤c)中获得的生长因子部分例如经抽吸通过羟基磷灰石柱,从而使所需的生长因子从原料吸附到羟基磷灰石上。吸附优选在5-7.5,更优选5.5-7.5的pH下,在盐,优选为磷酸钠,浓度为5-200mmol/L下进行。
吸附步骤后,用适宜的洗脱液体顺序洗脱该羟基磷灰石柱。可能的洗脱液为磷酸钠、氯化钠和氯化钾溶液。对于要获得的不同部分,这些洗脱液必须具有增加的盐浓度。也可能应用增加的pH梯度。其它可能的洗脱液对本领域技术人员而言是已知的。优选所用的盐溶液的总浓度范围在0.01-1.0M之间。
根据本发明,为了获得富含IGF-1的部分,通常用pH为5.5-7.5,磷酸盐浓度为0.05-0.2M,优选用pH为5.7-6.5,磷酸盐浓度为0.1-0.2M的磷酸盐缓冲液洗脱柱。为了获得富含TGF-β的部分,接着用pH为5.5-7.5,浓度至少为0.2M,优选用pH为5.7-6.5,浓度至少为0.25M的磷酸盐缓冲液洗脱柱。
当使用非正丁基配体的丁基配体时,获得的部分分别富含LP、TGF-β和IGF-1,因此不需要进一步的分离过程。
尽管如此,如果需要,根据本发明获得的部分可以通过已知方法进行进一步纯化分离成它们的单独组分。可以使用的分离方法的实例为阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱或羟基磷灰石色谱。
可以通过本领域已知的技术进一步处理终产品,以从其中除去盐和/或将它们浓缩。为了除去盐,例如可以使用超滤或凝胶过滤。为了浓缩,可以冷冻干燥或喷雾干燥那些部分。
预处理
在用于本发明的方法之前,可以对乳进行预处理,如温和的巴氏消毒,和/或用离心或微滤步骤脱脂。优选地,首先对原料进行最小的热处理。这是有利的,因为
1)在这样的热处理中,乳中自然存在的相当大部分的细菌被杀死,
2)乳过氧化物酶和其它乳浆蛋白的变性得到最小化。
最小的热处理理解为意指最高加热到80℃,优选在72-80℃的范围内,持续不超过几秒钟。
此外,在使原料经历吸附和洗脱步骤之前,去除其中的脂肪非常有利。已发现除去脂肪后,含有阳离子交换树脂的柱在吸附到阳离子交换树脂的步骤中几乎不沾油脂或阻塞。这防至了柱中的过度压力增加和不利的吸附周期缩短。
优选通过微滤除去脂肪,因为这同时实现原料微生物污染的减少。关于这一点,微滤被理解为意指用孔径为0.1-10μm的滤器过滤。
产品
本发明还涉及可由或由本发明的方法获得的不同生长因子部分。因此,本发明还包括还有富含TGF-β部分而基本上没有IGF-1的产品,以及含有富含IGF-1部分而基本上没有TGF-β的产品。
通常,含有富含TGF-β部分而基本上没有IGF-1的产品的TGF-β对IGF-1的重量比大于5,优选大于50。特别地,该产品含有超过400μg TGF-β/g蛋白,优选超过1500μg TGF-β/g蛋白,和少于8μgIGF-I/g蛋白,这通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测定。一般而言,这些部分将最多含有3000μg TGF-β/g蛋白。
优选地,本文还提供可由本发明的方法获得的产品,该产品含有至少1400μg TGF-β/g蛋白,优选超过2000μg TGF-β/g蛋白,更优选至少2500μg TGF-β/g蛋白,以及少于8μg IGF-I/g蛋白。
本发明进一步包括含有富含IGF-1部分而基本上没有TGF-β的产品,其中IGF-1对TGF-β的重量比大于10,优选大于100。特别地,该产品含有超过150μg IGF-1/g蛋白,以及少于30,优选少于10μgTGF-β/g蛋白。通常,这样的产品最多含有3500μg IGF-1/g蛋白。
因此,本文还提供可由本发明的方法获得的产品,该产品含有超过150μg IGF-1/个蛋白,优选至少160μg IGF-1/g蛋白,更优选至少180μg IGF-1/g蛋白,以及少于30,优选少于10μg TGF-β/g蛋白。
如上所述,在HIC柱的负载期间,未结合的部分含有大多数乳过氧化物酶,并给出含有乳过氧化物酶的产品,根据Shindler等(1976),European Journal of Biochemistry 65,325-331,用ABTS法测得的该乳过氧化物酶为1200单位/mg。含有由本发明的方法获得的乳过氧化物酶的产品将含有至少800mg乳过氧化物酶/g蛋白,优选至少850mg/g-900mg/g蛋白。
基于蛋白,IGF-和TGF-部分进一步含有约30-50%的免疫球蛋白。它们的主要功能是与有害的微生物如细菌相互作用。这防止微生物进入血液循环系统。该情形特别发生在患者的肠粘膜由于化疗而受损时。
免疫球蛋白可以分离自已针对某些病原体高度免疫的哺乳动物的乳,或者它们可以分离自常规牛乳或乳清。使用本发明的方法,用正常牛乳作为原料,获得富含包括IgG和IgA在内的免疫球蛋白的制剂。30-50%的蛋白部分由IgG和IgA型免疫球蛋白组成,即总计300mg/g蛋白至500mg/g蛋白。
根据本发明获得的TGF-β和IGF-1部分含有在酸化时释放的结合因子。因此,可以通过例如分别在酸处理存在或不存在下进行样品的生长因子特异性ELISA来测定两种生长因子的潜在和活性形式。结合因子在生长因子活性调节中实现作用,并且可以在穿过胃肠道期间保护生长因子。
根据本发明获得的IGF-和TGF-部分可以用于治疗和/或预防例如由于化疗或放疗引起的肠粘膜功能障碍或疾病。
本发明进一步由以下非限制性实施例阐明。在实施例中,用以下方法分析所获得的产品。
用定量夹心酶免疫测定技术(ELISA)测定TGF-β。已将对人TGF-β2特异性的单克隆抗体预先涂覆在微孔板(microplate)。人和牛TGF-β是一样的,这样抗体将检测牛形。将标准品和样品用吸量管加入孔中,任何存在的TGF-β均被固定的抗体结合。在该步骤之前,由于乳中的TGF-β以潜在的形式存在,它首先通过酸处理得到活化,以测定总TGF-β浓度。省略该活化步骤以测定游离(未结合)的TGF-β的量。
洗去任何未结合的物质后,向孔中加入对TGF-β2特异性的酶联多克隆抗体。接着洗涤除去任何未结合的抗体-酶试剂,向孔中加入底物溶液,与起始步骤中结合的TGF-β2的量成比例地显色。终止显色并测定颜色强度。
样品中的TGF-β以μg/g蛋白表示。
IGF-1:所用的试剂盒:来自Diagnostic Systems Laboratories,Inc.的IGF-1 ELISA DSL-10-2800。
IGF-1也通过类似于TGF-β的酶放大的“二步”夹心型免疫测定来测定。将样品、对照和预稀释的未知物在已涂覆有抗IGF-1抗体的微量滴定孔中温育。乳中的IGF-1可以结合到结合蛋白上,因此,当测定总IGF-1浓度时,使用类似于TGF-β使用的酸的活化步骤。当省略活化步骤时,测定游离IGF-1的量。
样品中的IGF-1以μg/g蛋白表示。
蛋白
通过Bradford方法,用乳铁传递蛋白绘制标准曲线而测定样品中的蛋白。或者,可以使用214-220nm波长处肽键的检测来测定蛋白。
通过SDS PAGE电泳(均质凝胶浓度20%;2%交联)测定样品中的乳过氧化物酶。
通过SDS电泳和蛋白质印迹(在硝化纤维膜上)来测定免疫球蛋白IgG和血管生成素。
通过SDS电泳,接着在用于蛋白测序的Sequi-blot PVDF膜(AltaBioscience,伯明翰大学,英国)上进行蛋白质印迹来测定乳叶酸结合蛋白、生乳素和核糖核酸酶。
以下是阐明本发明的非限制性实施例:
在将乳用作原料的实验中,IGF-1、TGF-β和乳过氧化物酶的浓度如下:IGF-1:0.045μg/g蛋白;TGF-β:0.9μg/g蛋白;乳过氧化物酶:1.5mg/g蛋白。
实施例1:从乳分离IGF-1、TGF-β和乳过氧化物酶(LP)(叔丁基)
用1L强阳离子交换剂(SP Sepharose Big Beads,Pharmacia)填充直径为10cm的离子交换色谱(IEC)柱。
用磷酸盐缓冲液(pH 6.5,0.025M磷酸盐)预处理柱。通过离心除去乳的脂肪部分,使360L所得的脱脂乳在室温下以100BVH(柱床体积/小时)的流速通过柱。用5L 0.10M NaCI,pH 6.5溶液洗涤柱。接着通过用:
a)5L 0.25M NaCl溶液,pH 6.5
b)5L 1.00M NaCl溶液,pH 6.5
洗脱柱来分离所吸附的蛋白。
部分a)主要含有乳过氧化物酶,并富含IGF-1和TGF-β。
部分b)富含血管生成素和乳铁传递蛋白。根据结果,部分a)含有800mg LP/g蛋白,30μg IGF-1/g蛋白和130μg TGF-β/g蛋白。接着将洗脱的部分a)调节至pH 5.0,并以15BVH负载到含有0.75LMacro-Prep叔丁基HIC载体(Biorad)的柱上。用含有0.025M磷酸盐和0.25M NaCl pH 5.0的缓冲液洗脱柱。接着通过用线性梯度和两步梯度洗脱柱来分离所吸附的蛋白:
c)线性梯度0.2M醋酸铵pH 5.0 0-20%异丙醇(v/v)
d)0.2M醋酸铵pH 5.0 20%异丙醇(v/v)
e)0.2M醋酸铵pH5.0 40%异丙醇(v/v)
未结合的部分,洗涤部分和部分c)主要含有LP(比活1200单位/mg)。部分d)含有500μg IGF-1/g蛋白与<5μg TGF-β/g蛋白。部分e)含有1500μg TGF-β/g蛋白,而IGF-1含量低(<1μg/g蛋白),并含有一定量的LP、IgG、乳叶酸结合蛋白、生乳素、血管生成素和核糖核酸酶。
通过SDS PAGE电泳(均质凝胶浓度20%;2%交联)测定LP;用本申请描述的试剂盒通过ELISA测定IGF-1和TGF-β;通过SDS电泳和蛋白质印迹(在硝化纤维膜上)鉴定IgG和血管生成素。通过SDS,接着通过在用于蛋白质测序的Sequi-blot PVDF膜(AltaBioscience,伯明翰大学,英国)上的蛋白质印迹鉴定乳叶酸结合蛋白、生乳素和核糖核酸酶。
实施例2:用不同HIC洗脱条件从乳分离IGF-1、TGF-β和LP(叔丁基)
也可以使用其它洗脱条件分离结合到叔丁基柱上的部分。
在与实施例1描述的相同条件下,将IEC洗出液[实施例1,部分a)]负载到叔丁基柱上,用含有0.25M NaCl/25mM磷酸盐,pH 5.0的缓冲液洗脱该叔丁基柱。接着用3.75L 0-40%乙醇的0.2M醋酸铵缓冲液pH 5.0的线性梯度洗脱该富含生长因子的部分。在该步骤中的生长因子收率稍低,但是富含IGF-1部分的比活远高于用如实施例1所描述的条件获得的部分,即1250μg/g蛋白。在该IGF部分中的TGF-β水平为9μg/g蛋白。
获得的富含TGF-β的部分具有与实施例1中相同数量级的比活。
实施例3:用不同HIC负载和洗脱条件从乳分离IGF-1、TGF-β和LP(叔丁基)
将通过实施例1中的IEC洗脱获得的部分a)分成两个部分:
将一部分调节到pH 4.0,将另一部分调节到pH 6.0。
pH 4.0:
将pH 4.0的部分以15BVH负载到含有0.75L Macro-Prep叔丁基的柱上。洗涤和洗脱缓冲液的pH也是4.0。用3L含有0.25M NaCl的0.025M醋酸盐pH 4.0以及3L 0.1M醋酸铵pH 4.0洗脱柱。接着通过用线性梯度的12L 0-40%异丙醇的0.1M醋酸铵缓冲液pH 4.0洗脱柱来分级分离所吸附的蛋白。乳过氧化物酶主要存在于未结合和洗涤部分中。在线性梯度期间,获得富含IGF-1和富含TGF-β的部分。获得的两部分的收率均良好,并且具有高比活,即IGF部分含有275μg IGF-1/g蛋白和<1μg TGF-β/g蛋白;TGF部分含有2600μgTGF-β/g蛋白和<2μg IGF-1/g蛋白。
PH 6.0:
将pH 6.0的部分负载到叔丁基柱上。洗涤和洗脱缓冲液的pH也是6.0。用3L含有0.25M NaCl的0.025M磷酸盐pH 6.0和3L 0.1M醋酸铵pH 6.0洗涤柱。接着通过用线性梯度的12L 0-40%异丙醇的0.1M醋酸铵缓冲液pH 6.0洗脱柱来分级分离所吸附的蛋白。乳过氧化物酶主要存在于无用(void)和洗涤部分中。在线性梯度期间,获得富含IGF-1的部分和富含TGF-β的部分。富含IGF-1的部分具有高比活,即3400μg IGF-1/g蛋白。富含TGF-β的部分具有1500μg TGF-β/g蛋白的比活。
实施例4:用Phenyl Sepharose Fast Flow low sub HIC树脂从乳分离IGF-1、TGF-β和LP
用1L强阳离子交换剂(SP Sepharose Big Beads,AmershamBiosciences)填充直径为10cm的离子交换色谱(IEC)柱。用磷酸盐缓冲液(pH 6.50.025M磷酸盐)预处理柱。通过离心除去乳的脂肪部分,使360L所得的脱脂乳在室温下以100BVH(柱床体积/小时)的流速通过柱。用5L 0.10M NaCl pH 6.5的溶液洗涤柱。接着通过用
a)5L 0.25M NaCl溶液,pH 6.5,
b)5L 1.00M NaCl溶液,pH 6.5
洗脱柱来分级分离所吸附的蛋白。
部分a)主要含有乳过氧化物酶,并富含IGF-1和TGF-β。部分b)富含血管生成素和乳铁传递蛋白。根据结果,部分a)含有780mgLP/g蛋白,25μg IGF-1/g蛋白和115μg TGF-β/g蛋白。向洗脱的部分a)中加入硫酸铵,直到溶液中硫酸铵的浓度为1M。将pH调节到5.0。接着将溶液负载到含有0.75L Phenyl Sepharose Fast Flow low sub(Amersham Biosciences)的柱上。用2L 0.025M磷酸盐和1.0M硫酸铵pH 5.0洗涤柱。接着通过用:
c)3L含有0.6M硫酸铵pH 5.0的0.025M磷酸盐,
d)3L pH 5.0的0.025M磷酸盐
洗脱来分级分离所吸附的蛋白。
未结合的蛋白部分和部分c)含有850mg LP/g蛋白(比活1200单位/mg)和10μg IGF-1/g蛋白。部分d)含有1000μg TGB-β/g蛋白与125μg IGF-1/g蛋白。
为了进一步的纯化步骤,将洗脱的部分d)负载到含有0.2L羟基磷灰石(BioRad ceramic HAP type I,40μm)的柱上,以从分离TGF-β和IGF-1。用含有60mM磷酸盐pH 6.0的缓冲液洗涤柱。
接着通过用:
e)1L 0.14M磷酸盐pH 6.0,
f)0.6L 0.5M磷酸盐pH 7.0
洗脱柱来分级分离所吸附的蛋白。
部分e)含有165μg IGF-1/g蛋白和<1μg TGF-β/g蛋白。该部分进一步含有30-50重量%的免疫球蛋白。鉴定的其它主要组分是核糖核酸酶。
部分f)含有2500μg TGF-β/g蛋白,而IGF-1含量低(<5μg IGF-1/g蛋白)。该部分进一步含有乳过氧化物酶和IgG。
实施例5:用Toyopearl苯基HIC树脂和不同的负载和洗脱条件从乳分离IGF-1、TGF-β和LP
向通过IEC洗脱获得的部分a)中加入NaCl,直到达到3M的盐浓度。将pH调节为5.0。用该溶液负载含有0.75L Toyopearl苯基650M(来自TosoHaas的HIC树脂)的柱。用2L 0.025M磷酸盐和3M NaClpH 5.0洗涤柱。接着通过用线性梯度的37.5L 3-0M NaCl,pH 5.0的0.025M磷酸盐缓冲液洗脱柱来分级分离所吸附的蛋白。未结合的部分、洗涤部分和盐梯度的第一部分主要含有乳过氧化物酶。生长因子IGF-1和TGF-β在很大梯度部分一起得到洗脱。该部分含有210μgIGF-1/g蛋白和875μg TGF-β/g蛋白。为了进一步分离IGF-1和TGF-β,使用如实施例4所描述的羟基磷灰石步骤(用BioRad ceramicHAP type I,40μm)。
实施例6:用Source Phenyl HIC树脂和不同的负载和洗脱条件从乳分离IGF-1、TGF-β和LP
向通过IEC洗脱获得的部分a)中加入NaCl,直到达到3M的盐浓度。将该溶液调节为pH 5.0。用该溶液负载含有0.75L Source Phenyl(HIC树脂,Amersham Biosciences)的柱。用2L 0.025M磷酸盐和3MNaCl pH 5.0的缓冲液洗涤柱。接着通过用:
g)5L含有1.5M NaCl pH 5.0的0.025M磷酸盐,
h)5L pH 5.0的0.025M磷酸盐
洗脱柱来分级分离所吸附的蛋白。
部分g)主要含有LP,而部分h)含有200μg IGF-1/g蛋白和714μgTGF-β/g蛋白。
通过应用如实施例4所描述的羟基磷灰石纯化步骤实现IGF和TGF的进一步分离。
实施例7:用Phenyl Sepharose Fast Flow high sub HIC树脂和不同的负载与洗脱条件从乳分离IGF-1、TGF-β和LP
向通过IEC洗脱获得的部分a)中加入硫酸钠,直到盐浓度达到0.6M。将该溶液的pH保持为6.5。用该溶液负载含有0.75L PhenylSepharose Fast Flow high sub(HIC树脂,Amersham Biosciences)的柱。用2L 0.025M磷酸盐和0.6M硫酸钠pH 6.5缓冲液洗涤柱。接着通过用:
i)3L 0.025M磷酸盐和0.2M硫酸钠pH 6.5,
j)3L pH 6.5的0.025M磷酸盐
洗脱柱来分级分离所吸附的蛋白。
未结合的部分和部分i)主要含有乳过氧化物酶和一些IGF-1。部分j)含有167μg IGF-1/g蛋白和2000μg TGF-β/g蛋白。
通过应用如实施例4所描述的羟基磷灰石纯化步骤实现IGF-1和TGF-β的进一步分离。
实施例8:用正丁基Sepharose从乳分离IGF-1、TGF-β和LP
向通过IEC洗脱获得的部分a)中加入氯化钠,直到达到2M的盐浓度。将pH调节为5.0。用该溶液负载含有0.75L正丁基Sepharose4Fast Flow(Amersham Biosciences)的柱。用3L 0.025M磷酸盐和1.5M pH 5.0的氯化钠洗涤柱。
接着用3L pH 5.0的0.025M磷酸盐洗脱所吸附的蛋白(部分k))。
未结合的部分和洗涤部分含有850mg LP/g蛋白(比活1200单位/mg)。
洗脱的部分k)含有725μg TGF-β/g蛋白和158μg IGF-1/g蛋白。
通过应用如实施例4所描述的羟基磷灰石纯化步骤实现IGF-1和TGF-β的进一步分离。
Claims (11)
1.从乳制品中提取含有生长因子的部分的方法,所述方法包括以下步骤:
a)通过阳离子交换色谱回收所述乳制品的碱性部分;
b)使含有步骤a)中获得的部分的溶液与包含载体和连接于所述载体的配体的疏水相互作用色谱树脂接触;其中所述疏水相互作用色谱树脂的配体选自正丁基和苯基;
c)用洗脱液洗脱所述疏水相互作用色谱树脂,获得含有生长因子化合物的部分;并且
其中步骤c)的洗脱液为0.02-2.0M盐的水溶液,所述盐选自磷酸钠或者磷酸钠与硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、醋酸铵或氯化钾的混合物,其中所述洗脱液的pH为4.0-7.0并含有少于15%(v/v)的醇,并且其中使步骤c)中获得的部分通过羟基磷灰石柱,并用pH为5.5-7.5,磷酸盐浓度为0.05-0.2M的磷酸盐缓冲液,接着用pH为5.5-7.5,磷酸盐浓度至少为0.2M的磷酸盐缓冲液逐步洗脱所述羟基磷灰石柱。
2.根据权利要求1的方法,其中所述步骤c)的洗脱液含有少于5%(v/v)的醇。
3.根据权利要求1或2的方法,其中所述步骤c)的洗脱液不含醇。
4.根据权利要求1或2的方法,其中所述配体是苯基。
5.根据权利要求1或2的方法,其中步骤b)中的溶液包含步骤a)中获得的部分,并且是pH为4-7的0.05-3M盐的水溶液。
6.根据权利要求5的方法,其中步骤b)中的溶液进一步含有0.01-0.2M缓冲剂。
7.根据权利要求1或2的方法,其中在步骤c)中用盐浓度或pH值逐渐或线性降低的至少两种洗脱液洗脱所述树脂,其中第一洗脱液的浓度为0.1-2.0M盐,而第二洗脱液的浓度为0.01-1.0M盐。
8.根据权利要求1或2的方法,其中所述乳制品是已将脂肪除去的任何哺乳动物乳,或者是乳清。
9.根据权利要求1或2的方法,其所提取的部分含有活性至少为1200单位/mg,含量为800-900mg/g蛋白的乳过氧化物酶。
10.由权利要求1-9之任一项的方法获得的乳基产品,其含有大于2000μgTGF-β/g蛋白,以及少于8μg IGF-1/g蛋白。
11.根据权利要求10的乳基产品,其含有的免疫球蛋白的量为300mg/g蛋白至500mg/g蛋白。
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