CN1456045A - 电场克服植物交配不亲和性的工艺方法 - Google Patents

Abstract

一种电场克服植物交配不亲和性的工艺方法，采集成熟的花药，在通风干燥的条件下，干燥1－3小时，待花粉开始散出时，对花粉进行电场处理，处理之后在1－5小时内授粉于成熟的柱头上。该工艺方法简单方便，易于重复，可操作性强。通过电场处理后的花粉，其生物活性提高，并对远缘杂交不亲和性及自交不亲和性强的植物均可不同程度的提高交配亲和率，远缘杂交结实率提高10－30％，自交结实率提高幅度较大，结实率可提高20－40％。

Description

电场克服植物交配不亲和性的工艺方法

所属技术领域

本发明涉及一种电场处理工艺方法，特别是涉及电场克服植物交配不亲和性的工艺方法。

背景技术

自交不亲和性是植物界的一种普遍现象，是植物在其长期进化过程中形成的有利于异花授粉的一种生殖隔离。植物的自交不亲和性指能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同体植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能完成受精的现象。自交不亲和性在植物的生殖生物学和杂种优势利用方面具有重要的理论和实际意义。

自交不亲和系的选育和利用是杂种优势利用上的一个重要发现，可以节省人工去雄的劳力，降低种子生产成本，提高制种效率，保证较高的杂种率，利用其杂种优势，至今仍是许多作物杂种优势利用的主要方式。利用自交不亲和系生产杂种是一种非常简便的制种方法。但是，由于自交不亲和性的存在，对自交不亲和系的繁殖和保持存在一定的困难。因此，克服自交不亲和性的方法也是自交不亲和性利用的重要组成部分之一。纵观已发表的研究报告和文献，应用于克服自交不亲和性的方法已有20余种，可归纳为四类：

1、生物学方法

(1)蕾期授粉，Pearson(1929)报道的蕾期授粉法是众多育种专家广泛采用的克服自交不亲和性的基本方法之一，蕾期授粉在孢子体和配子体系统中均有效，效果好坏因物种而异。具有简易、直观、可操作性强的特点，该方法效率低，费工费时，生产成本很高，制约制种效率。

(2)延迟授粉，即用不亲和的同种植物花粉给开花后几天的老龄雌蕊授粉。原理在于开花后几天的老龄雌蕊仍然有接受雄配子的能力，但是产生或贮藏有活性的不亲和性物质的能力已下降或柱头乳突细胞解体有关。

(3)子房内授粉，即将花粉或萌发花粉做成悬浮液直接注入子房使之受精这样就绕过了自交不亲和的障碍区——柱头和花柱。

(4)体外受精，即将花粉与未受精的胚珠放在合适的培养基上，使花粉萌发，完成受精。这种方法也排除了柱头和花柱对自交不亲和的阻碍作用。

生物学方法中的前二种方法比较简易，可以直接应用于生产活动中，但工作量都很大，从而导致生产效率低，而生产成本高，后二种方法每次处理量有限，可以作为自交不亲和机制的研究方法，对克服自交不亲和方法的研究具有指导意义，但是应用与生产实践还有一段距离。

2、化学方法

(1)激素，胡繁荣等用100mg/L的BA喷施白菜，对克服自交不亲和具有一定效果。

(2)CO₂处理，增加植株周围大气中CO₂的浓度，能有效地诱导自交结实。此法已被种子公司成功地应用于育种工作中。不同地区、不同植物，以及不同局部环境及其它影响因素下处理的最适浓度都是变动的，都需要具体试验来重新制定。

化学方法的喷施作用其直接处理范围可以很广，但化学成分可能会产生一些药害，从而使该种方法的应用存在一些潜在的危害。

3、物理学方法

(1)辐射。

(2)电助授粉和热辅助授粉法，荷兰的Rogsconl和A.T.Vandilk分别利用了这些方法来克服自交不亲和性。

物理学方法的利用中剂量是关键，对不同植物其最有效范围均需具体试验得出。

4、机械方法

(1)切除柱头和截短花柱，Sears(1937)和Tatabe(1939)报道的柱头移植和切断柱头法，切除柱头或截短花柱，对于孢子体型不亲和的物种，切除柱头后就消除了自交不亲和的障碍。对于因花粉管长度不够而达不到胚囊产生的自交不亲和，截短花柱后，可使花粉管长度足以到达胚囊。这种方法处理量有限，工作量较大，生产实践利用范围有限。

(2)钢刷授粉，国外有人用直径0.1mm、长4mm的细丝制成的钢刷，在花期先在成熟花药上擦取花药，然后将花粉在雌蕊柱头上摩擦，这样可以稍稍擦伤柱头，破坏妨碍自交的“隔离层”，促进甘蓝等自交结实。钢刷授粉不象蕾期授粉只能利用花蕾，而是所有的花都可以利用，显著提高了单株的结子率，但是其工作量也很大，而且容易造成机械损伤。

(3)盐水授粉，开花期用一定浓度的盐水喷雾处理，任其自由授粉。张文邦等(1984)介绍的用5％NaCl喷甘蓝花，安彩泰等(1983)用10％NaCl喷施油菜。本课题组选用成本低、操作简便、便于推广的NaCl溶液处理自交不亲和系材料，取得明显效果。曹必好(1998)，对甘蓝花期喷洒5％NaCl和8％NaCl均可克服甘蓝自交不亲系的不亲和性，5％NaCl+0.3％硼砂水溶液后使其花期自交，可以提高自交不亲和系的亲和指数，增加种子的千粒重，提高种子的生活力。陈越(1997)NaCl溶液可克服白菜型油菜自交不亲和性，试验结果表明，NaCl溶液确有克服自交不亲和，提高亲和指数的作用，其处理的最适浓度是4％～6％。曹寿椿(2002)，用碘盐(5％)+硼砂(0.2％)水溶液喷洒甘蓝自交不亲和系的花序，再行授粉，结实率增效明显，且可比蕾期自交授粉节约费用，可在生产上推广应用。

克服自交不亲和性的若干种方法中以蕾期授粉、盐水授粉、CO₂处理最为常用。虽然克服植物自交不亲和的方法很多，但每一种方法仅在某一些植物上适用，而且一般来讲受环境影响较大，且都有一定的局限性，因此，急需找到一种具有广泛适应性，能够完善自交不亲和性的利用系统和克服自交不亲和性的方法。

杂交育种以基因型不同的植物种或品种进行交配或结合形成杂种，通过培育选择，获得新品种的方法。它是培育新品种的主要途径，是近代育种工作最重要的方法之一。

但是，种间杂交在育种工作中的作用却因为种间的生殖隔离而受到严重的限制。因此，就要寻求克服不育的最佳途径，总结前人的经验有以下方法：

(1)亲和性规律和调整杂交方向。

变更杂交方向可以改变杂种胚乳中的基因剂量，调整胚及胚乳细胞中的核质矛盾，以及改变胚、胚乳和母体之间在染色体数目上的不平衡状况。孟金陵等在芸薹属中以芥菜型油菜×甘蓝型油菜杂交高度亲和，反交则高度不亲和。

(2)筛选和创造可交配基因型。

在茄属和番茄属中均在自交不亲和种内发现了可以接受自交亲和种花粉的植株。鲍文奎等测定了29个小麦品种与黑麦的可杂交性，鉴定出结实率可达70％以上的三种小麦品种：中国春、Penkop和Srutnik。已经成为小麦和黑麦、大麦等近缘种杂交时克服不亲和性的“国际通用型”。此种方法寻找合适的物种难度较大，成功机率较小。

(3)改变杂交亲本染色体倍数。

植物生殖遗传学曾写到孟金陵等将亚洲棉加倍为同源四倍体后再授以陆地棉花粉，大多数胚均能正常分化发育，产生具有一定生活力的杂种种子。此种方法，染色体加倍难度较大，周期较长。

(4)桥梁杂交。

桥梁法首先应用于果树方面。栽培桃与蒙古桃之间的杂交不成功，米丘林先将蒙古桃与山桃杂交获得杂种，再用该杂种与栽培桃杂交，获得后代。此种方法较为繁琐，费力费时，不可预见行强。

(5)遗传转化。

遗传转化是避开各种种间不可交配基因或不协调性表达的条件，而让异源基因进入异种基因组的一类特殊的远缘杂交方法。其中包括卵细胞转化法、亲和花粉管导入法、DNA注入法和质粒转化法。Hess用亲和花粉管作载体完成了花色苷基因的种间转移。此种方法难度较大。

(6)混合授粉。

Beasley在过量的父本花粉中混入6-12粒母本花粉，成功的获得了棉属二倍体与异源四倍体种间的杂种。

(7)提前或延迟授粉的方法。

母本柱头对花粉的识别或选择能力，一般在未成熟和过熟时最低。所以，提早开花前1-5天或延迟到开花后数天授粉，可提高远缘杂交结实率。但这种方法受到了植物本身开花时间的限制，要求严格。

(8)射线处理的方法。

用γ射线辐射花粉或柱头，能克服番茄的栽培种和野生种间杂交的难交配性，如用处理花粉授粉者获得了1.8％的杂种，而用未经处理的花粉授粉者，只获得了0.19％的杂种。此种方法适当剂量不容易找到，往往导致花粉变异或死亡，成功的几率较小。

(9)用生理活性物质处理雌蕊。

A、促进异源花粉粒萌发和花粉管生长，提高受精频率；B、加快受精过程，使杂种合子或幼胚不至于因延迟受精而造成配子或子房退化；C、刺激子房发育，使多胚珠子房中的个别受精胚珠中的杂种胚不至于因子房早期脱落而失去继续发育的机会；D、协调杂种胚或胚乳的发育，协调胚、胚乳和母体组织三者的平衡。

无论是克服自交不亲和性的方法还是克服远缘杂交的方法均不完善，因此我们力求探索一种行之有效，且可重复的方法。随着科学技术的发展，电场等生物技术作为最有前途的技术手段，正在被广泛的应用。我们早在80年代开始对高压静电场克服植物交配不亲和性进行的大胆深入的尝试，经过大量的实践研究开发出了高压静电场处理花粉的可行性技术方案，并完善了简化了试验步骤。成为一种简单易行的技术手段，易于推广普及。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处提供一种高压静电场将成熟的花粉进行处理，提高花粉生物活性和交配亲和率。

为达到上述目的本发明采用的技术方案是：采集成熟的花药，在通风干燥的条件下，干燥1-3小时，待花粉开始散出时，对花粉进行电场处理，处理之后在1-5小时内授粉于成熟的柱头上。

本发明的优点是：

1、通过电场处理后的花粉，其生物活性提高，即电场处理的花粉比对照组合提早萌发，且萌发率提高。

2、电场处理后的花粉的生物效应具有较高的重复性。

3、电场处理花粉对交配不亲和性强的植物均可不同程度的提高亲和率，远缘杂交的亲和率提高，结实率可提高10-30％；自交亲和率提高，结实率的提高幅度较大，结实率可提高20-40％。

4、经过电场处理的花粉，其自交所获得的种子质量明显高于对照组合。

5、工艺方法简单方便，易于重复，适合于大量处理生物试材，可操作性强。

具体实施方式

下面将对本发明的实施例作进一步详细描述：

1、首先采集成熟的花药，在通风干燥的条件下，干燥1-3小时，待花粉开始散出时，对花粉进行电场处理，处理之后在2-5小时内授粉于成熟的柱头上。

2、所述的电场处理输出电压为5KV-30KV，电场强度为100KV/m-900KV/m。

3、所述电场处理时间为10-60分钟。

4、电场处理使用的种类为高压平板静电场、高频电场、匀强半波整流电场、工频交流电场。

实施例1：

采集成熟的黑芥花药，在通风干燥的条件下1.5-2小时，待花粉开始散出时对花粉进行高压平板静电场处理，授粉于羽衣甘蓝成熟的柱头上。选用电场输出电压为20KV，处理场强是200KV/m，处理时间为30min，比对照组合的杂交结实率提高两倍。

实施例2：

采集成熟的草原龙胆花药，在通风干燥的条件下2-3小时，待花粉开始散出时对花粉进行高压平板静电场处理，授粉于成熟的柱头上。选用电场输出电压为5KV，处理场强是500V/m，处理时间为30min，结实率提高20％

实施例3：

采集成熟的百合花药，在通风干燥的条件下2-2.5小时，待花粉开始散出时对花粉进行高频电场处理，授粉于成熟的柱头上。选用高频电场的输出功率为20W，处理时间为1-3min。

Claims (4)

1、一种电场克服植物交配不亲和性的工艺方法，其特征在于：采集成熟的花药，在通风干燥的条件下，干燥1-3小时，待花粉开始散出时，对花粉进行电场处理，处理之后在1-5小时内授粉于成熟的柱头上。

2、按照权利要求1所述的电场克服植物交配不亲和性的工艺方法，其特征在于：所述的电场处理输出电压为5KV-30KV，电场强度为100KV/m-900KV/m。

3、按照权利要求1所述的电场克服植物交配不亲和性的工艺方法，其特征在于：所述电场处理时间为10-60分钟。

4、按照权利要求1所述的电场克服植物交配不亲和性的工艺方法，其特征在于：电场处理使用的种类为高压平板静电场、高频电场、匀强半波整流电场、工频交流电场。