CN1357536A - 用于核酸的选择性金属化的连接分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有一个或多个核酸结合基团和一个或多个纳米颗粒结合基团的连接分子,这些基团通过间隔基团共价连接。构成本发明基础的问题是提供可控制的选择性核酸金属化的方法,以及纳米线的生产方法,该纳米线可以用于,例如,构成允许高密度排列的电子网络和电子线路,以及构成可以整合到该网络和线路中的装置的元件。这一问题是通过连接分子而解决的,该连接分子含有一个或多个核酸结合基团和一个或多个纳米颗粒结合基团,这些基团通过间隔基团共价连接。这样的连接物可以用于制造核酸/连接分子结合物、纳米颗粒/连接分子结合物和纳米颗粒/连接分子/核酸复合物,以及进一步制造纳米线、含有该纳米线的电子网络、电子线路和结合点。

Description

用于核酸的选择性金属化的连接分子及其应用
发明领域
本发明涉及含有一个或多个核酸结合基团和一个或多个纳米颗粒结合基团的连接分子，上述基团通过间隔基团(Spacer group)共价连接在一起，本发明还涉及核酸/连接分子结合物，纳米颗粒/连接分子结合物以及可以由其得到的纳米颗粒/连接分子/核酸复合物，制造纳米线的方法，以及可以由该方法制得的纳米线，含有上述纳米线的电子网络(electronic network)，电子线路和连结点(junction)。
电子工业在朝着更高密度配线和线路的方向不断发展。保持其发展的关键点是使单个线路尽可能小。现有技术中一种已知的方法是核酸的金属化，该核酸一旦被金属化，即可作为导电线。
设计能够导向DNA，以及DNA分子中特定区域或片段的分子的策略是众所周知的。在当前医学应用中的许多抗癌药物的功效归功于它们结合DNA的能力。上述药物的结合模式通常可以分为共价(不可逆的)或非共价(可逆的)的。非共价结合模式还广义地细分为3类：(i)在相邻碱基对中的插入，(ii)在某个沟中(通常在富含AT区域的较小的沟中)进行外部结合，以及(iii)仅仅通过与磷酸酯主链的静电相互作用进行外部结合。能与天然来源的DNA结合的分子也往往能与合成DNA，RNA，寡聚核苷酸等结合，尽管结合模式可能不同。
例如，核酸的“金属化”是已知的，它是指在金属原子和核酸内的位点，尤其是嘌呤核苷酸(G和A)的N-7原子之间直接结合的过程。由于与抗癌药物，通常为Pt(II)或Pt(IV)配合物(铂酸盐)的机制相关，上述反应，已被广泛地研究。表现上述性能的其它金属配合物包括Pd、Ru、Au，以及Rh的配合物。上述配合物要求至少有一个“易变”的配基，作为“离去基团”以便以上述方式结合。
背景技术
发表于1999年1月28日的WO 99/04440描述了用于DNA的金属化的三步法。首先，通过在Ag+和DNA核酸碱基之间的Ag+/Na+离子互换并形成配合物，将银离子(Ag+)沿着DNA定位。然后用碱性对苯二酚溶液将银离子/DNA复合物还原以形成与DNA骨架结合的银纳米颗粒。与常规摄影方法类似，随后利用对苯二酚的酸溶液和Ag+在弱光条件下将银纳米颗粒“显影”。上述方法产生宽度大约为100nm，微分电阻大约为10MΩ的银线路。
但是，根据WO 99/04440所描述的方法，产生宽度为100nm以及特别是微分电阻大约为10MΩ的银线路，该线路不能满足与高密度配线和高密度线路相关的工业的需要。
WO 99/04440中所描述的金属化方法类似于用银染探测DNA片段的方法。已知上述方法导致DNA片段的非特异性染色，并且不能区分不同的DNA序列。因此，使核酸链上的特定区域而非其它区域金属化的能力对基于DNA的纳米电子设备的发展可能是至关重要的。
此外，Pompe等.(Pompe et al.(1999)Z.Metallkd.90，1085；Richter et al.(2000)Adv.Mater.12，507)描述了用DNA作为模板进行金属化，以便产生金属纳米线。他们的金属化方法包括用Pd(CH3COO)2的水溶液处理DNA 2小时，然后加入二甲胺硼烷(DMAB)溶液作为还原剂。加入还原剂的几秒钟内在DNA上长出直径为3-5nm的钯纳米颗粒。大约1分钟后，得到准连续的覆盖层，含有粒度为20nm的金属聚集体。尽管上述方法比WO 99/04440中的方法表现出显著的进步，但是最初长出的钯纳米颗粒实际上宽于DNA本身(双链DNA约为2nm)。因此，构成本发明的基础的问题是提供可控制的选择性核酸金属化的方法，以及纳米线的生产方法，该纳米线可以用于，例如，构成允许高密度排列的电子网络和线路，以及构成可以整合入上述网络和线路的设备的元件。
发明内容
上述问题是通过连接分子来解决的，该分子含有一个或多个核酸结合基团和一个或多个纳米颗粒结合基团，这些基团通过间隔基团共价连接在一起。
在优选的实施方案中，上述核酸结合基团选自插入试剂、沟结合试剂(grooving-binding agent)、烷基化试剂和它们的组合物。
在本发明连接分子的进一步的优选实施方案中，插入试剂选自吖啶，蒽醌，重氮核仁素(diazapyrenium)衍生物，呋喃香豆素(补骨脂素)，萘二酰亚胺，萘单酰亚胺，菲啶，卟啉，以及含有平面芳香族配基的金属配位化合物(metallointercalators)。
进一步优选的是连接分子，其中的沟结合试剂选自bis-苄脒、双苯并咪唑、lexitropsins、二萘嵌苯、苝二酰亚胺(perylene diimide)、苯基苯并咪唑、卟啉、吡咯寡肽，和viologens。
进一步优选的是连接分子，其中的烷基化试剂选自氮丙啶、2-氯乙烷衍生物、环氧化物、氮芥子气、硫芥子气和含有至少一个离去基团配基的金属配位化合物。
进一步优选的是本发明的连接分子，其中作为烷基化试剂的金属配位化合物选自Pt2+、Pt4+、Pd2+、Au2+、Au3+Ru2+、Ru3+、Rh+、Rh2+，和Rh3+的配合物，上述配合物具有至少一个选自卤化物、(二烷基)亚砜、二羧酸盐、β-二酮酯、羧酸盐、烯烃、硒酸盐、方形酸盐(squarate)、抗坏血酸盐、和氢氧化物的配基。
在本发明的连接分子中，纳米颗粒结合基团可以与纳米颗粒上的表面配基形成共价键，或取代纳米颗粒上现存的表面配基，或两种方式的结合。
更进一步的实施方案中，纳米颗粒结合基团含有至少一个形成共价键的功能基团，上述功能基团选自羧酸及其衍生物、磺酸及其衍生物、胺类、醇类、硫醇类、醛类、酮类、异氰酸盐、异硫氰酸盐、醚和卤化物。
进一步优选的是连接分子，其中纳米颗粒结合基团含有至少一个结合金属的基团，上述金属结合基团选自胺、膦、硫醇类、二硫化物、二硫代氨基甲酸盐、二硫代磷酸盐、二硫代膦酸盐、硫醚、硫代硫酸盐，和硫脲。
本发明的另一方面是通过制造纳米颗粒/连接分子结合物的方法，解决本发明的问题，其中纳米颗粒与本发明的连接分子结合，从而形成纳米颗粒/连接分子结合物。本发明进一步包括制造纳米颗粒-核酸复合物的方法，其中上述纳米颗粒/连接分子结合物进一步与核酸反应，形成纳米颗粒-核酸复合物。
本发明还有一个方面是通过制造核酸/连接分子结合物的方法，解决本发明的问题，其中核酸分子与本发明的连接分子反应，从而形成核酸/连接分子结合物。在此方面，本发明还进一步包括制造纳米颗粒-核酸复合物的方法，其中核酸/连接分子结合物进一步与纳米颗粒反应，形成纳米颗粒-核酸复合物。
根据本发明的一个实施方案，上述方法的进一步特征在于核酸溶解于溶液中，优选溶于水溶液中，或固定在基底上，优选地为非金属基底或电极结构。
本发明的方法进一步的优选实施方案中，其特征在于核酸是选自天然的、修饰的、合成的、和重组的核酸，如寡核苷酸、引物、DNA、RNA、同源双链、异源双链、三倍体、四倍体或多倍体、核酸的T形结合点，非核酸多聚体-核酸嵌段共聚体的结构域，(blockcopolymers)以及它们的组合。适合于嵌段共聚体的非核酸多聚体可以是多肽、多糖、葡聚糖、合成聚合物如聚乙二醇(PEG)，通常它们对于本领域的技术人员是已知的。优选上述核酸是双链或单链的。
在本发明的方法的优选实施方案中，上述纳米颗粒对于无电镀敷是有催化活性的。
本发明方法的另一个实施方案的特征在于，上述纳米颗粒含有的金属选自Fe、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt、Ag、Au和它们的合金。
在本发明方法的进一步实施方案中，上述纳米颗粒的尺寸小于10nm。在最为优选的方法中上述纳米颗粒的尺寸为大约0.5nm-大约3nm。
本发明的另一个方面涉及可由本发明的方法之一得到的纳米颗粒，该纳米颗粒含有结合物或含结合物的核酸，而且，根据上述发明方法之一得到的纳米颗粒-核酸复合物包括在本发明的范围之内。
本发明的另一方面是制造纳米线的方法，该方法包括将金属无电沉积到本发明的纳米颗粒-核酸复合物上。
本发明方法的另一实施方案的特征在于，纳米颗粒-核酸复合物是溶于溶液中的，优选溶于水溶液中，或固定在基底上，优选为非金属基底或电极结构。
通过无电镀敷沉积的金属选自Fe、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt、Ag、Au和它们的合金。
进一步，通过无电镀敷沉积的金属可以选自磁性的和/或磁化的Fe、Co、Ni和它们的合金，以及它们与B或P的合金，以便得到磁性的纳米结构。
更进一步的方面，本发明的问题是通过可从上述发明方法之一得到的纳米线解决的。本发明的纳米线可以形成含有至少一个纳米线的电子网络，或含有至少一个本发明的电子网络的电子线路。
此外，本发明的纳米线可以以它们的不完全金属化的形式作为电子元件，在该形式中，定位于核酸链上的单个纳米颗粒之间或多或少存在绝缘空间。在另一方面，纳米线可以是完全导电的或可以在一端或两端含有绝缘部分，或绝缘部分可以在线的本身内，以致纳米线是由单一的导电岛组成的。本发明的这些结构可以形成，或可以成为含有至少一个纳米线的电子网络或电子线路的一部分。在该电子网络或电子线路中，在两条或更多条线之间可以形成结合点，其中每条线具有接近于结合点的连接片段，该结合点含有纳米线。进一步说，组成网络的纳米线可以是混合电子结构的部分。
更进一步的方面，本发明的问题是通过本发明的核酸选择性金属化的方法解决的。
本发明涉及一种制造核酸-模板纳米线的新方法。具体而言，本发明提供了新的化合物(在本文仅仅指“连接分子”或“连接物”)，通过分子自装配的原理，上述化合物令人意想不到地使基于金属的纳米颗粒与核酸偶联。在现有技术中，纳米颗粒也被称为“簇”，“纳米簇”，或“纳米晶体”，这某种程度上取决于它们的大小和结晶度。在本文中所有上述种类都被简单地称为“纳米颗粒”。
在本文中所使用的纳米颗粒对于金属的无电沉积，也称为“无电镀敷(electroless plating)”，是有催化活性的。如下面的实施例所表明，纳米颗粒和核酸通过本发明的连接分子的偶联提供了纳米颗粒-核酸复合物，在该复合物中，纳米颗粒沿着核酸主链排成一行。尽管这样的纳米颗粒链可以作为纳米线，但是本发明的优选的实施方案中，用无电镀敷浴的溶液处理了纳米颗粒-核酸复合物以便增大纳米颗粒，从而增强其导电性或赋于它们磁性的性能。基于这种无电镀敷处理的核酸/连接物/纳米颗粒复合物的制造方法，便可进行纳米线的制造，该纳米线可以被有利地用于构建高密度网络和线路。其优点主要是与用现有技术的方法可得到的纳米线相比，这些纳米线的直径减小了。
进一步，本申请的发明者已惊奇地发现，由于采用这些核酸/连接物/纳米颗粒复合物或无电镀敷处理的核酸/连接物/纳米颗粒复合物，提供了核酸和寡聚核苷酸的选择性金属化的方法，该方法由于有选择性，使被金属化的核酸进行控制性的金属化，该核酸提供了导电通路，即，电线，更具体而言是纳米线。
附图说明
现通过附图对本发明作进一步阐明，从该附图可以领会到进一步的实施方案，特征和优点。
图1显示本发明的连接分子的示意图；
图2阐明4个碱基在作为DNA碱基对形式时的结构，也阐明特定的氢键相互作用(在RNA中胸腺嘧啶被替换为尿嘧啶)；
图3显示将核酸，连接分子，和纳米颗粒装配成本发明的纳米颗粒-核酸复合物的示意图。还显示了被称为连接物/核酸和连接分子/纳米颗粒结合物的中间结合物；
图4显示基于插入试剂(蒽醌)，沟结合试剂(阳离子卟啉)，和烷基化试剂(氮芥子气)的特定的连接分子的结构；
图5显示以基于铂和钯配位化合物作为烷基化试剂的特定连接分子的结构；
图6显示本发明的两个纳米颗粒-核酸复合物的AFM影像图；
图7显示两个对照实验的影像图；
图8显示本发明的纳米颗粒-核酸复合物在无电镀敷之后的AFM影像图；
图9显示本发明的纳米颗粒-核酸复合物在无电镀敷之前(a)和之后(b)的两个AFM影像图；
图10也是显示本发明的纳米颗粒-核酸复合物在无电镀敷之前(a)和之后(b)的两个AFM影像图；
图11显示两个对照实验的AFM影像图；以及
图12显示本发明的连接分子/核酸结合物(a)和本发明的纳米颗粒/核酸复合物(b)的AFM影像图。
具体实施方式
本发明提供的连接分子的一般特征显示在图1中。基本上，连接物具有一个或多个核酸结合基团和一个或多个纳米颗粒结合基团。如图所显示的，两种结合基团在连接分子中是分离的，被间隔基团分开。间隔基团的主要功能是提供连接核酸结合基团与纳米颗粒结合基团所必需的分子框架。根据现有技术，发明者预期，对于任何特定配置的结合基团，在它们之间存在最佳的距离和取向。现有技术也提出在间隔基团内包含某些可以与核酸的糖-磷酸酯主链相互作用的亚基例如胺，可能是有利的。但是，间隔基团的最佳分子特征是不能预知的，因为它们将取决于核酸结合基团和纳米颗粒结合基团的特性以及与它们连接的方式。因此间隔基团的主要功能、连接物的功能可以通过各种基团来实现，包括单键，烷基链，芳香环，肽，等等。通常，连接分子的两个结合区域之间的距离优选为大于0.3nm，并小于3nm。
本发明提供的与连接分子连接的核酸结合基团分为3种：插入试剂，沟结合试剂和烷基化试剂。根据现有技术，已知每个类型的结合试剂提供了对核酸特殊的结合亲合力和选择性。插入试剂通常倾向于结合核酸的双链和富含GC的片段。沟结合试剂通常倾向于结合核酸的双链和富含AT的片段。鸟嘌呤：胞嘧啶(GC)和腺嘌呤：胸腺嘧啶(AT)碱基对的结构显示在图2中。烷基化试剂与核酸共价结合，倾向于在G和A的N-7原子形成共价加合物(adduct)，而不论核酸是双链或是单链的。N-7的位置在图2中显示为黑三角形。
根据现有技术进一步已知，通过在同一分子内结合两种或多种结合试剂可以调节分子对核酸的结合亲合力和选择性。这些结合试剂可以是同种或不同种类的。因此，通过仔细选择核酸结合基团，便可调节本发明提供的连接分子使其导向特定的核酸及其结构域。采用本发明提供的进一步的实施方案，上述导向能力使核酸选择性地金属化，并由此制造纳米线成为可能。
插入试剂和外部(沟)结合试剂与核酸进行非共价相互反应。尽管是可逆结合过程，但是结合常数可以很大。现有技术中众所周知的插入试剂包括吖啶，蒽醌，和菲啶。本发明的一个优选实施方案是利用9，10-蒽醌的衍生物作为连接分子。现有技术表明可以直接从市售的取代蒽醌合成各种插入试剂。现有技术中已知的沟结合试剂包括二苯并咪唑，例如从Hoechst，Frankfurt，Germany得到的并作为DNA探针的染料，US 5,821,258中所公布的苯基苯并咪唑以及吡咯寡肽，例如天然存在的抗生素纺锤菌素和偏端霉素。新近，作为核酸结合试剂的阳离子卟啉，更为引人注意，因为通过改变金属中心和外周取代物这种结合模式可以很容易调节成插入型或外部型。本发明的一个优选的实施方案是采用含有与核酸外部结合的阳离子卟啉基团的连接分子。
本发明利用两类普通的烷基化试剂作为连接分子中核酸结合基团：有机化合物和金属离子的配位化合物。这两类化合物对可以合成的连接分子提供了相当大的灵活性。在现有技术中众所周知的有机烷基化试剂是氮丙啶，环氧化物，和2-氯乙烷衍生物。后者的例子是所谓的氮芥子气和硫芥子气。本发明的一个优选实施方案所利用的连接分子是被称为“苯丁酸氮芥”(4-[双(2-氯乙烷)氨基]苯丁酸)的氮芥子气药物的衍生物。现有技术表明该化合物的羧酸基团容易与乙醇或其它化合物的胺基团偶联。由于作为抗癌药物的广泛应用，铂(2+)的配位化合物可能是最著名的DNA烷基化试剂，并且这些药物中最著名的是最初发现的一种，即“顺式氯氨铂”(顺-二氨二氯铂(II))。这些配合物含有至少一个作为“离去基团”的配基，使得铂离子能结合到例如，鸟嘌呤和腺嘌呤中N-7位置上。本发明的另一个优选实施方案是采用与顺式氯氨铂相关的铂配合物连接分子。已知其它几种金属，特别是钯，金，钌和铑，也能形成具有核酸烷基化特性的配位化合物，并可以代替铂。用于合成混合-配基铂(II)配合物的实施例公布在，例如，US 5,985,566和US 6,110,907中。本发明的另一个优选的实施方案是采用具有至少一个离去基团和至少一个非配位的(“悬挂的”)纳米颗粒结合基团的铂或钯配合物连接分子。
制造纳米颗粒-核酸复合物的一般概要过程在图3中显示。通常，可以选择两种不同的产生复合物的路线，该路线导致不同的中间结合物。在第一个实施方案中，纳米颗粒与本发明的连接分子结合，从而形成纳米颗粒/连接分子结合物(图3，右边的途径)。在第二个实施方案中，核酸分子与本发明的连接分子反应，从而形成核酸/连接分子结合物(图3，左边的途径)。然后两种结合物都可以与其所缺少的的核酸或者纳米颗粒结合，以便得到所需的纳米颗粒/连接分子/核酸复合物。然后上述纳米颗粒/连接分子/核酸复合物可以溶于溶液中，优选溶在水溶液中，或固定在基底上，优选为非金属基底或电极结构。
用在核酸结合物或复合物中的核酸，在本文中也称为核酸分子，可以是DNA或RNA。这种在许多情况下适用的互换性是由于DNA和RNA之间的物理化学相似性。当然，它们的任何聚合物或衍生物也可以用于本发明，例如，但不限于，DNA和RNA各自的寡聚核苷酸，它们的引物和上述两种核酸各自的多聚核苷酸。此外，可以用于本发明的核酸可以呈现各种构象，例如A-DNA，B-DNA和Z-DNA，它们的不同主要在直径和特殊种类的螺旋结构、核酸的T-结合点、非核酸多聚体-核酸嵌段共聚物的结构域以及它们的组合。适合于嵌段共聚体的非核酸多聚体可以是多肽、多糖，如葡聚糖或人造聚合物，如聚乙二醇(PEG)，通常它们对于本领域的技术人员是已知的。应当理解任何上述的核酸种类可以是单链，双链，或多链的形式。与此相关的特别是指核酸的各种构型，例如A-DNA，B-DNA和Z-DNA或其它结构，例如锤头结构等，该结构主要由单链核酸分子形成。
这样的纳米颗粒具有能催化无电金属化的组合物，因此在合适的金属离子化合物和还原剂存在时，它能增大。同时，合适的纳米颗粒在处于环境条件下的水溶液中是稳定的。根据上述限制，纳米颗粒优选由以下的金属之一组成：Fe、Co、Ni、Ru、Pd、Os、Ir、Pt、Ag或Au以及它们的合金。无电镀敷沉积的金属选自Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Pt、Ag、Au和它们的合金。进一步，使用磁性的和/或磁化的金属颗粒，如Fe、Co、Ni或它们的合金，或它们与B或P的合金，也是可能的。
纳米颗粒也可以由这些金属的前体组成，这些金属前体在无电金属化浴中被还原剂还原成催化的(金属的)状态。实际上，在本发明的大多数实施方案中，可以使用任何符合下面标准的纳米颗粒：(i)直径约10nm或更小，优选为约3nm-0.5nm；(ii)在水(或合适的水-有机溶剂混合物或与核酸相容的溶剂)中具有稳定性和可溶性，(iii)表面修饰的能力，以及(iv)通过无电沉积增大的能力。该颗粒足够小以致它们可以被称为“簇”，并且组成颗粒或簇的金属原子不需要完全处于零价状态。有关基于金属的纳米颗粒和簇的合成及特性的文献已有很多。在EP 0426 300中讨论了一些与生物学相关的应用，其公布的内容在此引入作为参考。
纳米颗粒/簇材料也可通过市售从Nanoprobes，Inc(Stony Brook，New York)得到，同时参见US 5,728,590，其公布内容在此引入作为参考。还可以得到的是在表面上含有氨基和/或羧酸基团的水溶的金纳米颗粒，上述基团保证了在连接分子和纳米颗粒之间的共价连接。
本发明的连接分子/核酸结合物和连接分子/纳米颗粒结合物以及由此得到的纳米颗粒/核酸复合物，以及本发明的用于生产上述物质的方法构成了核酸选择性金属化的基础。按照本文提出的任何方法，通过提供连接分子所导向的合适的核苷酸序列，即可以达到选择性的结果。现有技术的金属化方法缺乏使核酸的特定区域金属化的特异性。
在纳米线的制造中，只要纳米颗粒沿着核酸链的分布对于金属化过程是关键性的话。提供含有无电金属化催化活性的纳米颗粒的核酸是关键步骤，在本发明中上述金属化过程被认为是“无电”(非电)的过程。无电金属沉积(“金属化”或“镀”金属)是一个过程，在该过程中金属从溶液中沉积到基底表面而不需要使用外源的电流。该过程是一个氧化还原反应，在该反应中金属离子(或配合物)在表面上被化学还原成金属。尽管金属离子和还原剂之间的反应从热力学上分析是自动发生的，它选择性地在“接种”了催化剂的表面位点上开始。然后每一层新沉积的金属成为下一层沉积的催化剂(“自催化”)。在印刷电路板上进行无电铜镀时最经常使用的催化剂是Pd金属，但也可以使用其它金属如Pt和Au。
在印刷电路板的无电铜镀中经常使用的还原剂是甲醛，其效用如反应1所示：
  (1)
在这些溶液中，铜离子与一种有机配基络合以增加它们在高度碱性的溶液中的溶解性。也可以使用其它还原剂，如次磷酸盐和二甲基氨基硼烷(dimethylaminoborane)。无电镀敷过程的例子进一步在，例如，US 5,318,621；US 5,292,361和US 5,306,334中公开。
图4显示适合用作本发明的连接分子的七种化合物的结构。这些化合物在一端含有蒽醌(插入试剂)、阳离子卟啉(沟结合试剂)或氮芥子气(烷基化试剂)作为核酸结合基团。在连接分子的另一端的纳米颗粒结合基团为氨基(-NH2)、二硫代氨基甲酸盐(-NHC(S)SH)、巯基(-SH)或氯化酰基(-COCl)。例如，在化合物1，4和7中的胺基团可以直接与金或铂纳米颗粒的表面结合；例如，它们也可以与磺基-N-羟基-琥珀酰亚胺基Nonogold®颗粒的活性羧酸基团共价反应。例如，化合物2和5的硫代氨基甲酸盐基团和化合物3的硫醇基团可以直接与金，银或铂纳米颗粒的表面结合。例如，化合物3的硫醇基团也可以与单马来酰亚胺Nanogold®颗粒的马来酰亚胺基团共价反应。例如，化合物6的酰基氯基团是可以与单胺Nanogold®的胺基团共价反应的活性基团。
化合物1的合成是通过1-氨基-9，10蒽醌(AQ-NH2)与过量的琥珀酰二氯化合物(ClOCCH2COCl)反应，得到AQ-NHCOCH2CH2COCl，然后AQ-NHCOCH2CH2COCl与过量的1，4-二氨基丁烷(H2NCH2CH2CH2CH2NH2)反应。在每个步骤后除去过量的试剂以防止副产物的形成。优选的溶剂是二氯甲烷(CH2Cl2)和N，N-二甲基甲酰胺(CHCON(CH3)2)；优选的反应温度为20-80℃，反应时间为1-4小时。化合物2的铵盐是通过1与二硫化碳(CS2)以及氨(NH4OH)反应而制备的。优选的溶剂是乙醇(CH3CH2OH)；优选的反应温度为20-40℃，反应时间为1-2小时。化合物3的合成方法是将中间产物AQ-NHCOCH2CH2COCl与过量的1，2-二氨基乙烷(H2NCH2CH2NH2)结合以得到AQ-NHCOCH2CH2CONHCH2CH2NH2。在每个步骤后除去过量的试剂以防止副产物的形成。将化合物AQ-NHCOCH2CH2CONHCH2CH2NH2相继与溴乙酰基溴(BrCH2COBr)，硫代醋酸钾(KSCOCH3)，甲醇钠(NaSCH3)，以及盐酸(HCl)反应，即可转化为化合物3。优选的溶剂是N，N-二甲基甲酰胺和甲醇(CH3OH)；优选的反应温度为20-80℃，反应时间为0.5-2小时。
化合物4的合成方法是将锌(II)-5，10，20-四个-(4-吡啶基)-21H，23H-卟吩(ZnP(Py)4)与过量的溴乙酰基溴反应以得到[ZnP(Py-CH2COBr)4]Br4。优选的溶剂是N，N-二甲基甲酰胺；优选的反应温度为150℃(回流)，反应时间为3-10小时。通过丙酮(CH3COCH3)沉淀，将产物与过量的溴乙酰基溴和副产物分离，并随后立即与过量的1，2-二氨基乙烷反应以形成化合物4。优选的溶剂是N，N-二甲基甲酰胺；优选的反应温度为10-30℃，反应时间为0.5-1小时。通过丙酮沉淀将产物与过量的1，2-二氨基乙烷和溴化氢(HBr)盐分离。化合物5的铵盐是将4与二硫化碳和氨反应而制备的。优选的溶剂是乙醇；优选的反应温度为20-40℃，反应时间为1-4小时。
化合物6是将苯丁酸氮芥(4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸)与过量的草酰基氯(ClOCCOCl)反应而制备的。优选的溶剂是二氯甲烷；优选的反应温度为30-40℃，反应时间为10-20小时。将反应混合物蒸发至干分离出该化合物，随后直接使用。化合物7是由化合物6与过量的1，2-二氨基乙烷反应而得到的。优选的溶剂是二氯甲烷；优选的反应温度为0-20℃，反应时间为0.5-1小时。将反应混合物蒸发至干，将产物与过量的1，2-二氨基乙烷和溴化氢(HBr)盐分离并用水洗涤固体。
图5显示适合用作本发明的连接分子的两种金属配位化合物(8和9)的结构。这些化合物在一端含有Pt(II)或Pd(II)配合物作为核酸结合基团，该配合物以氯离子配基作为离去基团。这些连接分子另一端的纳米颗粒结合基团是氨基(-NH2)基团，例如，它可以与磺基-N-羟基-琥珀酰亚胺基Nonogold®颗粒的活性羧酸基团共价反应。Valsecchi等人在US 5,744,497中描述了化合物8的合成，化合物9的合成由Rombeck和Lippert在Inorganica Chimica Acta 273，31(1998)中描述。
图4和图5中的特定化合物(1-9)仅仅是作为代表性实施例提出的，这些代表性实施例与图1中所表示的一般类别的连接分子一致。
图6-12是AFM影像，这些图示明了用插入连接分子(1或3)形成纳米颗粒/核酸复合物和纳米颗粒随后通过无电镀敷使其生长的情况。对照实验的结果也包括在这些图内。在这些实验中，小牛胸腺DNA用作核酸组分，GoldEnhance®用作无电镀敷浴的溶液。纳米颗粒组分是Nanogold®或膦稳定的金纳米颗粒，它根据Duff等人在Languir 9，2302(1993)中所描述的方法制备。实验细节在实施例1-10中给出。
图6显示的是纳米颗粒/核酸复合物的AFM影像，该复合物是按实施例1和实施例2所描述，通过连接分子和Nanogold®的结合而得到的。该图显示了在(a)5μm×5μm和(b)1.5μm×1.5μm区域扫描得到的影像。可以见到颗粒(大小大约为1-1.5μm)沿着DNA分子排列，以及颗粒在基底上随机分布的清晰证据。
图7显示的是如实施例3所描述的无连接物的纳米金颗粒对照样品的AFM影像；在1.5μm×1.5μm区域扫描了两个影像(a)和(b)。在这种情况下，基底上的颗粒密度要大得多，而未见颗粒沿着DNA分子排列的明显趋势。
图8显示了将图6中的样品如实施例4所描述，用GoldEnhance®溶液处理5分钟后得到的AFM影像。此影像表明沿着DNA的颗粒增大了大约40％。
图9和图10显示了由连接分子3和小牛胸腺DNA结合得到的纳米颗粒/核酸复合物用GoldEnhance®溶液处理15分钟之前(a)，和之后(b)的AFM影像。在本实验中，膦稳定的金纳米颗粒与结合物结合以形成复合物是在溶液相中进行的。实施例5-7提供了实验细节。图9显示了在5μm×5μm区域扫描的影像，图10显示了在1.5μm×1.5μm区域扫描的影像。在无电镀敷之前得到的影像(a)显示彼此连接的DNA链上线性排列着颗粒(粒度大约为1-1.5μm)。显然膦稳定的颗粒对硅基底的亲和性很小。无电镀敷后得到的影像(b)表明颗粒较均一地生长到大约10-30nm，并且在上述基底自身上沉积的金即使有也很少。
图11显示了对照样品的AFM影像，该样品中仅有的小牛胸腺DNA，如实施例8所描述，用GoldEnhance®溶液处理了15分钟。在这种情况下没有颗粒生长的明显证据。
图12显示了连接分子3和小牛胸腺DNA结合得到的纳米颗粒/核酸复合物用膦稳定的金纳米颗粒处理1小时之前(a)和之后(b)的AFM影像。实施例9和10提供了实验细节。(b)中的影像表明了连接分子/核酸结合物固定在硅基底上时与纳米颗粒结合从而形成了复合物的情况。
实施例
实施例1：化合物1和Nanogold®的连接物/纳米颗粒结合物
将几毫克的蒽醌衍生物1溶于大约0.5ml的二甲亚砜中。稀释后，通过UV-可见光吸收测得1在溶液中的浓度，假设其在380nm的摩尔消光系数为Breslin和Schuster在J.American Chemical Soc.118，2311(1996)，中报道的某种类似化合物的消光系数，7000M-1cm-1。在含有6nmoles磺基-N-羟基-琥珀酰亚胺基Nonogold®(Nanoprobes Inc.，目录号2025A)的小瓶中加入25μl未稀释的1的溶液，该溶液中含有30nmoles的上述化合物1和15μL的二甲亚砜。混合，使Nanogold粉末完全溶解后，加入160μL的水，再混合该溶液，然后在室温暗处放置。1.3小时后通过凝胶过滤对上述溶液进行层析(Sephadex G-25，0.02MHEPES/NaOH缓冲液，pH7.5)以便从金颗粒中除去过量的，未结合的1，其中上述金颗粒首先洗脱下来。用上述缓冲液将金纳米颗粒的级分稀释到1.0mL，并在4℃储存。
实施例2：实施例1中的结合物和DNA的纳米颗粒/核酸复合物
将DNA(小牛胸腺，Sigma-Aldrich，产品号D-1501)溶于含有0.02M HEPES/NaOH缓冲液，pH7.5的水溶液中。根据UV-可见光吸收测量估计，溶液中核苷酸碱基的当量浓度为80μM。将一片硅片(半导体级，p-型，硼掺入，表面天然氧化)的抛光表面用O2-等离子体(GalaInstruments，PlasmaPrep-5)处理4分钟(0.4mbar，ca 33W)。然后将处理后的硅片装到旋转镀膜机上(Mikasa，Spincoater 1H-D3)。加入几滴DNA溶液覆盖基底。2分钟后，上述样品在1000rpm旋转10秒，然后立即在5000rpm旋转90秒。在第二次旋转阶段，将两滴水滴到样品上以除去盐。将几滴实施例1所得的连接分子/纳米颗粒结合物溶液涂到上述基底上，放置1小时，然后用水洗涤，并用压缩N2干燥。用氮化硅悬臂(Olympus Optical，Micro Cantilever OMCL-AC160TS-W，ca250kHz共振频率，ca25 N/m弹簧常数)通过tapping-modeAFM(Digital Instruments，Multimode Atomic Force Microscope)检验上述样品。得到的AFM影像的例子见图6。
实施例3：实施倒2的对照实验
按实施例1将磺基-N-羟基-琥珀酰亚胺基Nanogold®溶于二甲亚砜-水混合物，但无化合物1，以制备不含接连接分子的纳米金颗粒。这种方法仅导致颗粒上的磺基-N-羟基-琥珀酰亚胺基(活性酯)部分的水解。如实施例2所描述，用这些颗粒的溶液处理固定在硅基底上的DNA。得到的AFM影像的例子在图7显示。
实施例4：将金通过无电镀敷沉积到实施例2所得的纳米颗粒-核酸复合物上
根据制造商的说明书制备GoldEnhance®(Nanoprobes Inc.，目录号2113)溶液。然后将几滴上述溶液加到实施例2所得样品的表面，放置5分钟后用水洗涤，并用压缩N2干燥。经这些处理后得到的AFM影像之一的例子在图8中显示。
实施例5：化合物3和膦稳定的金纳米颗粒的连接分子/纳米颗粒结合物
在乙醇中制备蒽醌衍生物3的溶液；如实施例1所描述，通过稀释后的UV-可见光吸收检测，估计其浓度为1.3mM。20μL上述溶液与20μL膦稳定的金纳米颗粒胶体溶液在一个小瓶中混合以得到澄清的溶液，并在4℃储存18小时。
实施例6：实施例5所得的结合物和DNA的纳米颗粒-核酸复合物
将DNA(小牛胸腺，Sigma-Aldrich，产品号D-1501)溶于含有磷酸盐缓冲液，pH7.4的水溶液中，(Sigma-Aldrich，产品号P-4417)。根据UV-可见光吸收测量估计，溶液中核苷酸碱基的当量浓度为250μM。80μL的这种溶液与实施例5所得的连接分子/纳米颗粒结合物混合以得到澄清的溶液，并在4℃储存至少24小时。将上述复合物沉积到等离子体处理的硅上，然后如实施例2所述进行AFM分析。得到的AFM影像在图9(a)和图10(a)中显示。
实施例7：将金无电沉积到实施例6所得的纳米颗粒-核酸复合物上
根据制造商的说明书制备GoldEnhance®(Nanoprobes Inc.，目录号2113)溶液。然后将几滴该溶液加到实施例6所得的样品的表面，放置15分钟后用水冲洗并用压缩N2干燥。经这些处理后得到的AFM影像的例子在图9(b)和图10(b)中显示。
实施例8：实施例7的对照实验
如实施例2所描述，将DNA(小牛胸腺，Sigma-Aldrich，产品号D-1501)通过旋转铺在等离子体处理的硅上。如实施例7所描述，用GoldEnhance®溶液处理上述样品15分钟。这样处理后得到的AFM影像的两个例子在图11中显示。
实施例9：化合物3和DNA的连接分子/核酸结合物
将实施例6所得的溶于磷酸盐缓冲液的0.28ml DNA溶液滴加(10滴)到含有13nmoles溶于20μL乙醇的蒽醌衍生物3的小瓶中，并混合。得到的澄清溶液储存于4℃至少24小时。将结合物固定在O2-等离子体处理的硅上，并用AFM观看。得到的影像之一在图12(a)显示。
实施例10：实施例9的结合物和膦稳定的金纳米颗粒的纳米颗粒/核酸复合物
将几滴膦稳定的金纳米颗粒溶液加到实施例9所得的样品上并放置1小时，然后用水冲洗并用压缩N2干燥。此后得到的AFM影像之一在图12(b)显示。

Claims (30)

1.一种连接分子，含有
一个或多个核酸结合基团和一个或多个纳米颗粒结合基团，上述基团通过间隔基团共价连接。
2.权利要求1所述的一种连接分子，其中所述的核酸结合基团选自插入试剂、沟结合试剂、烷基化试剂以及它们的组合。
3.权利要求2所述的一种连接分子，其中的插入试剂选自吖啶、蒽醌、重氮核仁素衍生物、呋喃香豆素(补骨脂素)、萘二酰亚胺、萘单酰亚胺、菲啶、卟啉、以及含有平面芳香族配基的金属配位化合物(金属插入物)。
4.权利要求2所述的一种连接分子，其中的沟结合试剂选自bis-二苄脒、二苯并咪唑、lexitropsins、苝二酰亚胺、苯基苯并咪唑、卟啉、吡咯寡肽，和viologens。
5.权利要求2所述的一种连接分子，其中的烷基化试剂选自氮丙啶、2-氯乙烷衍生物、环氧化物、氮芥子气、硫芥子气和含有至少一个离去基团配基的金属配位化合物。
6.权利要求5所述的一种连接分子，其中的金属配位化合物选自Pt2+、Pt4+、Pd2+、Ru2+、Ru3+、Rh+、Rh2+，和Rh3+的配合物，上述配合物含有至少一个选自卤化物、水、二(烷基)亚砜、硝酸盐、硫酸盐、羧酸盐、聚代的羧酸盐、碳酸盐、磷酸盐、亚硝酸盐、亚硫酸盐和氢氧化物的配基。
7.权利要求1所述的一种连接分子，其中纳米颗粒结合基团与纳米颗粒表面上的配基形成共价键，或取代纳米颗粒上现有的表面配基，或两种方式的组合。
8.权利要求1或7所述的一种连接分子，其中的纳米颗粒结合基团含有至少一个形成共价键的功能基团，上述功能基团选自羧酸及其衍生物、磺酸及其衍生物、胺类、醇类、硫醇类、醛、酮、异氰酸盐、异硫氰酸盐、醚和卤化物。
9.权利要求1或7所述的一种连接分子，其中纳米颗粒结合基团含有至少一个金属结合基团，上述金属结合基团选自胺、膦、硫醇类、二硫化物、二硫代氨基甲酸盐、二硫代磷酸盐、二硫代膦酸盐、硫醚、硫代硫酸盐，和硫脲。
10.制造含有结合物的纳米颗粒的一种方法，其中纳米颗粒与权利要求1-9中任何一项所述的连接分子结合形成纳米颗粒/连接物结合物。
11.制造纳米颗粒-核酸复合物的一种方法，其中权利要求10所述的纳米颗粒/连接分子结合物进一步与核酸反应形成纳米颗粒-核酸复合物。
12.制造含有结合物的核酸的一种方法，其中核酸分子与 1-9中任何一项所述的连接分子反应，形成核酸/连接分子结合物。
13.制造纳米颗粒-核酸复合物的一种方法，其中权利要求12所述的核酸/连接分子结合物进一步与纳米颗粒反应形成纳米颗粒-核酸复合物。
14.权利要求11-13中任何一项所述的一种方法，其特征在于上述核酸溶解于溶液中，优选溶于水溶液中，或固定在基底上，优选固定在非金属基底或电极结构上。
15.权利要求11-14中任何一项所述的一种方法，其特征在于上述核酸选自天然的、修饰的、合成的和重组的核酸，DNA、RNA、PNA、CNA、寡聚核苷酸、DNA的寡聚核苷酸、RNA的寡聚核苷酸、引物、A-DNA、B-DNA、Z-DNA、DNA的多聚核苷酸、RNA的多聚核苷酸、核酸的T形结合点、核酸的三倍体、四倍体、非核酸多聚体-核酸嵌段共聚体的结构域和它们的组合。
16.权利要求11-15中任何一项所述的一种方法，其特征在于上述核酸是双链的或单链的。
17.权利要求10，11，或13中任何一项所述的方法，其特征在于上述纳米颗粒对于无电镀敷(electroless plating)是有催化活性的。
18.权利要求10，11，13或17中任何一项所述的方法，其特征在于上述纳米颗粒含有的金属选自Fe、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt、Ag、Au和这些金属的组合(例如合金)。
19.权利要求10，11，13，17或18中任何一项所述的方法，其特征在于上述纳米颗粒的尺寸小于10nm。
20.权利要求19所述的方法，其特征在于上述纳米颗粒的尺寸为大约0.5nm～约3nm。
21.可以根据权利要求10，12，和14～20中任何一项所述的方法得到的核酸/连接分子结合物或纳米颗粒/连接分子结合物。
22.可以根据权利要求11，13，和14～20中任何一项所述的方法得到的纳米颗粒-核酸复合物。
23.制造纳米线的一种方法，包括将金属无电沉积到权利要求22所述的纳米颗粒-核酸复合物上。
24.权利要求23的一种方法，其特征在于纳米颗粒-核酸复合物溶解于溶液中，优选溶于水溶液中，或固定在基底上，优选固定在非金属基底或电极结构上。
25.权利要求23或24所述的一种方法，其特征在于通过无电镀敷沉积的金属选自Fe、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt、Ag、Au和这些金属的组合(例如合金)，以及磁性和/或磁化的Fe、Co、Ni，和这些金属的组合(例如合金)，以及这些金属与B或P的组合(例如合金)。
26.可以通过权利要求23～25中任何一项所述的方法得到的纳米线。
27.含有至少一种权利要求26所述的纳米线的电子网络。
28.含有权利要求27所述的电子网络的电子线路。
29.电子线路的两条或多条线之间的结合点，其中上述每条线的接近结合点的末端部分含有权利要求26所述的纳米线。
30.权利要求10～20所述的核酸选择性金属化方法的应用。
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