CN1307482A - 干扰素α5在治疗病毒性肝脏疾病中的应用 - Google Patents

干扰素α5在治疗病毒性肝脏疾病中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1307482A
CN1307482A CN99807866A CN99807866A CN1307482A CN 1307482 A CN1307482 A CN 1307482A CN 99807866 A CN99807866 A CN 99807866A CN 99807866 A CN99807866 A CN 99807866A CN 1307482 A CN1307482 A CN 1307482A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ifn
compositions
application
alpha
interferon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN99807866A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1173738C (zh
Inventor
赫苏斯·普列托·巴尔图埃纳
M·皮拉尔·西韦拉·穆里略
埃斯特·拉雷亚·莱奥斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inst of Application Medicine
Original Assignee
Instituto Cientifico y Tecnologico de Navarra SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Instituto Cientifico y Tecnologico de Navarra SA filed Critical Instituto Cientifico y Tecnologico de Navarra SA
Publication of CN1307482A publication Critical patent/CN1307482A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1173738C publication Critical patent/CN1173738C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及干扰素α5在治疗病毒性肝脏疾病的应用。本发明描述了IFNα5在丙型肝炎患者肝中与健康肝中(作为对照)的还原合成。与在患病肝中表达的不同亚型相比,在所述健康肝中表达的IFN亚型只有亚型α5相一致。序列SEQID NO:1显示了与IFNα5一致的cDNA序列。这些肝中表达型间明显区别说明了这些干扰素亚型在制备用于治疗病毒性肝脏疾病组合物的应用。本发明详细公开了不同类型和加工中的应用,包括从SEQ ID NO:1序列制备重组蛋白的应用。

Description

干扰素α5在治疗病毒性肝脏疾病中的应用
发明领域
本发明涉及干扰素α5的制品在用于治疗起源于病毒的肝脏疾病的组合物中的应用。
已知干扰素α5是由健康肝脏产生的干扰素α的唯一亚型，其水平在慢性丙型肝炎中明显降低，这表明该物质可能对该疾病和其它类型的病毒性肝炎具有治疗价值。已知该干扰素的编码基因序列，使用它在不同宿主通过DNA重组技术的制品有可能研制出有效的药物，用于在不同的发展阶段治疗该类肝病。
现有技术
感染的细胞可以通过发送信号识别病毒的存在，该信号可以导致I型干扰素(IFNα和IFNβ)的转录和分泌。IFNα是一个通过不同基因编码的十三多肽(亚型)家族。IFNβ是通过单一基因产生的糖蛋白。不同的细胞类型可同时产生出IFNα和IFNβ(1，2)。
病毒感染是产生I型干扰素的主要刺激物，尽管还有其它可以增加其合成的因素，如细菌成分，双链RNA，生长因子和其它细胞因子(1)。除了具有抗病毒作用，IFNα可以与某些细胞因子和在免疫系统(3)调控细胞生长和分化的T细胞相互作用。IFNα基因在健康个体人组织中正常表达(4)，然而特殊亚型的表达受到某些细胞类型的限制(5，6)。IFN通过病毒的诱导主要在转录水平上被调控。通过病毒诱导的细胞因子与调控IFNα基因启动子的区域相互作用发生转录的特定激活(7)。
所有的IFNα和IFNβ在细胞表面具有共同的受体。对于不同IFNα亚型在受体部位的竞争性结合表明所有这些亚型在同一受体结合，但具有不同的亲和性(8)。对于IFNα不同亚型的生物学活性所知甚少。IFNα5和IFNβ8干扰素亚型显示具有更强的抗病毒活性。不同亚型间的抗增殖反应也不同(9)。在人类中，未刺激的外周血单核细胞表达不同的IFNα亚型(10)。
病毒感染的持续性的一般机理是IFN系统的缺乏。许多病毒已发展出避免IFN的抗病毒作用的策略。具体地说，在被人免疫缺陷病毒感染的单核细胞中报道了在产生IFNα中的选择性缺陷(11)。
丙型肝炎病毒(HCV)是单链RNA病毒，导致超过三分之二的被感染患者的慢性感染。被HCV感染的发病率占西方人口的大约2-3％。在欧洲的研究表明，33％的慢性HCV感染患者在之后平均小于20年的时间内发展成肝硬化(12)。这些患者中的很大一部分发展成肝癌，每年发病率为1.4％(13)。很难发现HCV感染持续性高发的原因。病毒的高速突变和与Th1相比Th2细胞因子占优势分布的产生，被认为是感染持续性高发的原因。应用IFN治疗在大约30％慢性丙型肝炎的患者中诱导持续的反应。对于应用IFN治疗导致反应或非反应的机理所知甚少。
仅在慢性HCV感染中研究过IFN系统。对于慢性HCV感染没有合适的动物模型，因此，对人进行的研究只能来源于慢性丙型肝炎病理生理学和发病机理的信息。本发明描述了IFNα和IFNβ基因在健康对照和慢性丙型肝炎患者的肝脏和外周血液单核细胞(PBMC)中的表达。另外，我们还分析了IFNα亚型在正常肝组织和慢性丙型肝炎患者肝组织中的表达。在健康对照和慢性丙型肝炎患者的PBMC中还分析了不同IFNα亚型的表达。
参考文献
1.Maeyer E，Maeyer-Guignard J.lnterfercris.Zn Thomson A，等，细胞因子手册，伦敦，Academic Press Limited 1991：215-239。
2.Samuel CE.，干扰素的抗病毒活性，干扰素调控的细胞蛋白及其奇怪的选择性抗病毒活性。病毒学(virology)1991；183：1-11。
3.Tile H.，干扰素α机理的新观察：免疫调控和抗炎细胞因子，胃肠病学(Gastroenterology)1997；112：1017-1021。
4.Tovey MG，Streuli M，Gresser I，Gugenheim I，Blanchard B，Guymarho J，Vignaux F和Gigou M，在正常个体器官中生产干扰素信使RNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987；84：5038-5042。
5.Bisat F，Raj NB，Pitha PM.，小鼠干扰素α基因的变异和特殊细胞表达在转录水平上的调控，核酸研究(Nucleic Acids Res)1988；16：6067-6083。
6.Hiscott J，Cantell K，Weissmann C.，人干扰素基因的变异表达，核酸研究(Nucleic Acids Res)，1984；12：3727-3746。
7.Au WC，Su Y，Raj NBK和Pitha PM.，病毒调控的干扰素A基因需要干扰素α启动子区中多个结合因子的合作，生物化学杂质(TheJournal of Biological Chemistry)1993，268：24032-24040。
8.Aguet M，Grobke M，Dreiding P.，不同的人干扰素α类浴场坚守体的相互作用：与其特异性生理活性相关的结合亲和性，病毒学(Virology)1984；132：211-216。
9.Foster OR，Rodrigues 0，Ghouze F，Schulte-Frohlinde D，Testa D，Liao MJ，Stark OR，Leadbeater L，Thomas HC，来源于干扰素α亚型人细胞的不同相对活性：干扰素α8具有非常高的抗病毒活性，干扰素和细胞因子研究杂质(J Interferon and Cytokine Res.)1996；16：1027-1033。
10.Brandt ER，Linnane AW，Devenish RJ.，干扰素A基因在外周血液细胞分组中的表达，Br Haematol 1994；86：717-725。
11.Gendelman HE，Friedman RM，Joe 8，Baca LM，Turpin JA，Dveksker G，Meltzer MS和Dieffenbach C.干扰素α制品在人免疫缺陷病毒感染的单核细胞中的选择性缺陷，实验医学杂志(The Journalof Experimental Medicine)1990；172：1433-1442。
12.Poynard T，Eedossa P，Opolon P.，慢性丙型肝炎患者中肝纤维化进程的自然历史，OBSVIRC，METAVIR，CLINIVIR，和DOSVIRC组，Lancet 1997；349：825-832。
13.Fattovich G，Giustina G，Degos F等，在补偿硬化C型中的发病率和死亡率：384名患者的回溯跟踪研究，肠胃病学，(Gastroenterology)1997；112：463-472。
14.Gil B，Qian Ch，Riezu-Boi JI，Civeira MP，Prieto J.，在慢性丙型肝炎中的肝和肝外的HCV RNA链：对干扰素治疗不同类型的反应，肝脏病学(Hepatology)1993；18：1050-1054。
15.Lopez S.，Reeves R，Island ML，Bandu MT，Christeff N，Doly J和Navarro S.，干扰素A基因启动子中的失活，生物化学杂志(Journalof Biological Chemistry)，1997；272：22788-22799。
16.Knodell R，Ishak K，Black W，Chen T，Craig R，Kaplowitz N，Kiernan T等，对于评价无症状慢性活性肝炎中的组织学活性的数字评分的形成和应用，肝脏病学(Hepatology)1981；1：431-435。
17.Chomczynsky P；Sacchi N.，通过酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取的RNA单步分离，Anal.Biochem.1987；162：156-159。
18.Weissmann C，Weber H.，干扰素基因，Prog Nucleic Acid ResMol Biol 1986；33：231-300。
19.Goeddel DV，Leung DW，Dull TJ，Gross M，Lawn RM.，McCandliss R，Seeburg PH，Ullrich A，Yelverton E，Gray PW.，8个明显克隆人白细胞干扰素cDNAs的结构，自然(Nature)1981；290：20-26。
20.Derynck R，Content J，DeClercq E，Volckaert G，Tavernier J，Devos R，Fiers W.，人纤维原细胞干扰素基因的分离和结构，自然(Nature)1980；285：542-547。
21.Ng SY，Gunning P，Eddy R，Ponte 9，Leav～tt J Shows T，Kedes L.，功能性人b-肌动蛋白及其假遗传因子家族的演变：非编码区的转变和假遗传因子的染色体分散，Mol Cell Biol 1985；5：2720-2732。
22.Larrea E，Garcia N，Qian Ch等，肿瘤坏死因子α基因表达及其对慢性丙型肝炎中的反应，肝脏病学(Hepatology)1996；23：210-217。
23.Viazov S，Zibert A，Ramakrishnan K；Widell A；Cavicchini A，Schreier E；Roggendord M.，通过DNA酶免疫检测分离丙型肝炎病毒，J.Viral.Methods 1994；48：81-92。
24.Sarobe P，Jauregui JI，Lasarte JJ，Garcia N，Civeira MP，Borras-Cuesta  F和Prieto J.，白细胞间介素产品对来自慢性丙型肝炎患者丙型肝炎病毒E1蛋白合成肽的反应：与干扰素治疗反应的关系，J Hepatol 1996；25：1-9。
发明描述患者和对照
对16个慢性丙型肝炎患者(男9人，女7人，年龄范围24-71)肝脏活组织样品，进行了IFNα和IFNβ基因表达分析。患者中5人显示硬化。测定了14个患者的病毒基因型，10个患者为1b，2个患者为1a，1个患者为3。
另外，还测定了12名对照患者(男9人，女3人，年龄范围49-70)通过剖腹手术获得的12个正常肝样品的IFNα和IFNβ基因表达。剖腹手术是由于10名患者存在消化道肿瘤(4人结肠直肠癌，5人胃癌，1人胰腺癌)，1名患者患有慢性胰腺炎，另一人患有包虫囊肿。12例中肝组织学正常。这些对照病例在获得肝样品前没有接受治疗。
还测定了25名慢性丙型肝炎患者(男14人，女11人，年龄范围24-69)和23名健康对照(男10人，女13人，年龄范围25-66)PBMC中的IFNα和IFNβRNAm水平。这些患者的病毒基因型，22个患者为1b，2个患者为1a，1个患者为3。
慢性丙型肝炎的诊断基于血清转氨酶增加持续6个月，抗-HCV抗体结果为正(2nd generation ELISA，Ortho Diagnostic System，Raritan，NJ，USA)，血清中存在丙型肝炎病毒RNA(逆转录聚合酶链反应)，和慢性肝炎的组织学证据。肝损伤的严重性应用Knodell指标评价。排除了除丙型肝炎病毒外其它慢性肝炎的原因。在研究前至少6个月患者未接受IFNα治疗。肝，PBMC和血清样品的制备
肝样品通过应用Tru-cut活检针进行肝活检获得(Baxter，Deerfield，IL)。三分之一的样品迅速进行液氮冷冻，保持在-30℃直到全部RNA提取完成。其余样品用于组织学研究。
PBMC应用具有Lymphoprep的密度梯度(Nycomed Pharma As，Oslo，Norway)从肝素化血液中分离，600g离心30分钟。离心后收集PBMC，用0.9％NaCl洗涤5次，应用UbtraspecTM蛋白变性溶液(BiotechLaboratories，Houston，USA)进行细胞溶解。细胞溶解物在-80℃下保存，直到应用Chomcznski和Sacchi(17)方法，全部RNA提取完成。
血清样品通过静脉血离心，无菌管收集获得。血清在-40℃下保存，直到应用。IFNα和IFNβ基因在肝和PBMC中表达的分析
通过应用热循环仪(PerkinElmer Gene Amp PCR system 2400)，采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，测定了IFNα和IFNβRNAm水平。在逆转录前，2μg总RNA(来自肝和PBMC)用1单位脱氧核糖核酸酶(DNAse I扩增级，Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA)处理，以消除可能的DNA污染。通过包括没有逆转录的对照反应，检查痕量DNA的存在。需要该步是由于不存在IFNα和IFNβ基因中的内含子(18)，这使我们不可能分辨出来自RNA的PCR产物或是可能的DNA污染。所有没有逆转录的对照反应为负，表明没有可能的DNA污染。应用400单位M-MuLV逆转录酶(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA)，最终体积为40μl的5×盐溶液(250mMTris-HCI pH 8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，补充有5mM DTT，0.5mM二氧核糖核苷酸三磷酸盐(Eoehringer Mannheim，Mannheim，Germany)，48单位RNAsas抑制剂(Promeaa Corporation，MD，US)，和400ng随机六聚物(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)，对总RNA进行转录(60分钟，37℃)。逆转录酶变性后(95℃，1分钟)，迅速用冰冷却，10μl等份(0.5μg)cDNA用于扩增IFNα和IFNβ，通过50μl 10×PCR缓冲液中的PCR(160mM(NH4)SO4，670mM Tris-HClpH8.8，0.1％Tween 20)，补充有定向和反定向引物(40ng的每个IFNα和60 ng的IFNβ)，1.2mM MgCl2和2单位BiotaqTMDNA聚合酶(Biobine，London，LTK)。所有实验均进行没有RNA的对照实验。作为每个样品的内部对照，应用事先得到的10μl等份cDNA，扩增cDNAβ-肌动蛋白片段。IFNα扩增通过进行30或33周期(分别对应于PBMC或肝)(94℃，60℃和72℃分别为20，15和30秒)IFNβ扩增通过进行30或35周期(分别对应于PBMC或肝)(94℃，58℃和72℃分别为20，15和30秒)，β-肌动蛋白扩增通过反应18或25周期(分别对应于PBMC或肝)(94℃，55℃和72℃分别为20，15和30秒)，这些方案避免了与PCR反应饱和阶段相关的干扰。寡核苷酸(5’-3’)d(TCCATGAGATGATCCAGCAG)和d(ATTTCTGCTCTGACA ACC TCCC)分别用于定向和反定向引物，扩增位于人IFNα基因中240-514核苷酸间274碱基对的片段(19)。这些寡核苷酸的定向引物被设计成扩增IFNα的所有亚型。寡核苷酸d(TCTAGCACTGGCTGGAATGAG)和d(GTTTCGGAGGTAACCTGTAAG)为用于扩增位于人IFNβ基因中cDNA 349-625核苷酸间的276碱基对的片段的引物(20)。d(TCTACAATGAGCTGCGTGTG)和d(GGTGAGGATCTTCATGAGGT)为用于扩增β-肌动蛋白基因314碱基对(核苷酸1319-2079)片段的引物(21)。
扩增反应后，20μl产物通过含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶。应用紫外灯显示得到的带，使用能够将得到的图像数字化和分析的商业程序进行分析(Molecular Analyst/PC，Bio-Rad)。最后，对应于IFNα和IFNβ基因表达的值，用其相关的β-肌动蛋白校准。结果表示为IFNα和IFNβ值与相关β-肌动蛋白的比值。之前我们证明了β-肌动蛋白的RNAm在慢性丙型肝炎患者肝和PBMC中恒定表达(22)，这样我们可以应用得到的β-肌动蛋白校准IFNα和IFNβ值。
PCR技术的验证曲线应用已知量的总RNA(从0到1μg)制作。从图3所示，用于IFNα、IFNβ和β-肌动蛋白(0.5μg，在肝和PBMC中)的初始RNA总量，位于PCR扩增曲线的线性范围内。IFNα/β-肌动蛋白的交互实验变异系数为22％，IFNβ/β-肌动蛋白为24％。应用自动测序，对IFNα和IFNβ检查得到的PCR产物的同一性(ABIprismTM 310基因分析仪，Perkin Elmer)。IFNα亚型的鉴别
总RNA提取，逆转录，和PCR反应如上所述进行，应用上述的IFNα定向引物。获得的PCR产物应用商业的TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，Holland)进行克隆。应用Dye Rhodamine TerminatorCycle Sequencing Kit(Perkin Elmer，Foster，CA)，在自动ABI PRISM310测序仪(Perkin Elmer，Foster，CA)上测定每个插入物的至少6个克隆物。丙型肝炎病毒RNA的检测，量化和基因型确定
应用RT-PCR技术(14，22)，使用两对用于丙型肝炎病毒基因组非编码5’区的特异性引物，测定血清中丙型肝炎病毒RNA的存在。应用我们上述的竞争性PCR技术(22)，定量丙型肝炎病毒RNA。应用上述的Viazov’s方法(23)，测定病毒基因型(22，24)。测试5’G(A，G)CCGTCTTGGGGCC(A，C)AAATGAT用于测定基因型4。统计学分析
IFNα和IFNβ结果表示为平均值±标准差。应用Shapiro-Wilks试验研究了变量常态。应用非参数实验(Mann-Whitney Utest)或参数实验(Student’s T)，对PBMC或肝脏IFNα和IFNβ值的进行统计学分析。如果适合，应用Pearson或Spearman相关系数研究定量变量间的联系。使用Windows SPSS 6.0程序进行统计学分析。重组蛋白制品大肠杆菌中人干扰素α5的表达和纯化
尽管通常来源于大肠杆菌真核细胞有机体的cDNA的表达，可使涉及复杂程序和低产率的所需蛋白质具有高水平的产量、分离和纯化。因此，表达载体的使用有助于获得结合蛋白，其纯化减少至一个亲和色谱步骤，具有高的产量和效率。表达载体的建立和重组细菌的获得
将编码干扰素α5的cDNA克隆到pET14b载体(从Novagen通过商业途径获得)中。该载体提供了编码一系列与克隆cDNA同框翻译的组氨酸残基(1kDa)的序列，以产生一种在其氨基末端包括1kDa组氨酸尾巴然后是干扰素α5的融合蛋白，在二者之间具有一个能被凝血酶切开的位点。
一旦获得表达载体，制备BL21(DE3)菌株的感受态细菌，因为该菌株含有可以被T7 RNA聚合酶诱导的基因，其对于之后的蛋白质的产生是必须的。将该感受态细菌用事先得到的载体(具有克隆的干扰素α5cDNA的pET14b)转化。通过在含有氨苄青霉素的LB培养基中的生长，选择转化细胞，因为该载体含有对这种抗生素抗性的基因。干扰素α5的表达和纯化
转化细菌在含有氨苄青霉素的LB介质中37℃下生长，直到达到600nm下0.4的光密度。在最终浓度0.5mM下诱导具有IPTG的重组蛋白的表达。以这种方式乳糖启动子被诱导，结果含有该载体的并且调节克隆的cDNA表达的T7 RNA聚合酶启动子被诱导。培养物在同样条件下进一步生长4小时。
为了获得提取物，细菌培养后，在4℃下进行离心。将沉淀细菌再悬浮在10mM Tris/HCl缓冲液，10％蔗糖，2mM 2-巯基乙醇，和蛋白酶抑制剂。在4℃下与溶菌酶培养30分钟，进行超声均化。这可以打碎细菌壁，增加提取过程的产量。通过离心匀浆100,000g 90分钟，得到胞质溶胶提取物。通过SDS-PAGE分析胞质溶胶组份，检查蛋白质产物。
通过2ml镍柱中的胞质溶胶提取物层析，纯化组氨-干扰素α5融合蛋白。通过用1M咪唑洗柱，洗脱蛋白。应用凝血酶加工纯蛋白，随后通过分子排阻色谱法再纯化干扰素α5。人干扰素α5在Solanum tuberosum中的的表达和纯化
表达载体的建立和转基因植物的获得
在根瘤农杆菌表达载体上克隆编码为干扰素α5的cDNA。该载体中含有Solanum tuberosum启动子(在Solanum tuberosum块茎中含有最多的蛋白质)，以及编码一系列组氨酸并且与克隆cDNA同框翻译的序列(1kDa)，以产生一种在其氨基末端包括1Kda组氨酸尾巴然后是干扰素α5的融合蛋白，在二者之间具有一个能被凝血酶切开的位点。
一旦获得表达载体，制备根瘤农杆菌GV2260菌株的感受态细菌。使用事先得到的载体转化该感受态细菌。通过在含有卡那霉素的LB培养基中的生长，选择转化细胞，因为该载体含有对这种抗生素具有抗性的基因。
随后将转化细菌和植物材料(在体外培养的Solanum tuberosum叶)进行共培养，选择对抗卡那霉素的的植物细胞。再生这些细胞，直到获得转基因植物。干扰素α5的获得和纯化
从表达干扰素α5的转基因植物块茎中进行全蛋白提取。
通过2ml镍柱中获得的蛋白质提取物层析，纯化组氨-干扰素α5融合蛋白。通过用1M咪唑洗柱，洗脱蛋白。应用凝血酶加工纯蛋白，随后通过分子排阻色谱法再纯化干扰素α5。健康个体中正常肝组织和PBMC的IFNα亚型
正常肝组织样品的全RNA提取后，应用对所有IFNα亚型通用的引物扩增IFNα的RNAm。然后将PCR扩增产物进行克隆和测序。对四个不同正常肝脏的41个克隆进行分析，我们观察到41个克隆的IFNα序列是相同的，并且与IFNα5亚型相一致(表1)。该结果表明IFNα5是正常肝脏表达的唯一IFNα亚型。从所有克隆获得的IFNα5部分cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
为了比较肝和PBMC中表达的IFN亚型的分布，对5个健康对照PBMC中的全RNA进行提取，应用对所有IFNα亚型通用的引物扩增IFNα的RNAm。在43个分析克隆中，15个与IFNα5亚型相一致，14个与IFNα1/13相一致，6个与IFNα21相一致，8个与其它IFNα亚型相一致(表1)。该结果表明，在PBMC中表达的IFNα亚型分布与正常肝脏中表达的不一致。慢性丙型肝炎患者的肝组织和PBMC中的IFNα亚型
上面结果表明正常肝表达IFNα5，而PBMC表达多种IFNα亚型。在慢性丙型肝炎患者肝实质中，含有单核细胞渗入物，一种重要的IFNα源。这表明由慢性丙型肝炎患者肝脏表达的IFNα亚型分布可能不同于正常肝的分布。为了研究IFNα亚型在慢性丙型肝炎中的表达，我们从3个不同患者肝样品和2个PBMC样品中提取了总RNA。在将IFNα RNAm用对所有亚型通用引物扩增后，我们克隆并测序了24个肝组织克隆和18个PBMC克隆。如表1所示，慢性丙型肝炎患者PBMC表达IFNα21、IFNα5和IFNα7(分别为5，12，和1个克隆)。除了IFNα5亚型，在这些患者的肝组织中，我们还发现了IFNα21、IFNα17和IFNα1/13(分别为8，1，和2个克隆)(表1)。
这些数据表明IFNα通过单核细胞渗入物制备，可以引起慢性丙型肝炎患者肝组织中表达的IFNα亚型分布的改变。在慢性丙型肝炎患者和对照的PBMC和肝组织中的IFNαRNAm表达的水平
从慢性丙型肝炎患者PBMC和肝组织样品(n分别为25和16)，健康对照的PBMC样品(n＝20)，从剖腹手术获得的肝组织样品(n＝12)中提取了全RNA。应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术(应用对扩增所有IFNα亚型通用的引物)，测定了IFNα亚型的RNAm水平。结果表示为IFNαRNAm与β-肌动蛋白的比。
与健康对照相比，我们发现IFNα在从慢性丙型肝炎患者PBMC中的表达水平明显增加(3.2±0.48对1.14±0.26；p＝0.001)(图1A)。在病毒感染中如PBMC感染的丙型肝炎中预期得到该结果(14)。另一方面，与正常肝中表达的相比，慢性丙型肝炎患者肝组织中IFNαRNAm的表达水平明显减少。(0.12±0.03对0.43±0.12；p＝0.003)(图1B)。
如上所观察，IFNα5是在正常肝组织中检测到的唯一IFNα亚型，而在慢性丙型肝炎患者肝组织中观察到多种亚型的混合物。结果表明HCV感染明显减少通常在肝组织中表达的IFNα亚型的表达。令人感兴趣的是，慢性丙型肝炎患者肝组织中的IFNαRNAm水平与Knodell指数的直接相关性(r＝0.54；p＜0.05)。该发现，以及在慢性丙型肝炎患者肝组织中检测到的IFNα亚型为在PBMC所观察到的那些，表明大多数在慢性丙型肝炎患者肝组织中发现的IFNαRNAm来自炎性渗入物。这表明IFNα(IFNα5)在肝中表达的减少可能对HCV慢性感染起到部分作用。因此，考虑到其它作者描述的IFNα5的明显抗病毒和抗增生活性(9)，这些观察可以具有治疗性暗示。在慢性丙型肝炎患者和对照的PBMC和肝组织中的IFN RNAm表达的水平
IFNβ，1型感染的第二种主要类型，是由单基因产生的糖蛋白。在IFNα和IFNβ基因的病毒感染转录中，可以通过不同的机理激活或抑制(15)。为了分析IFNβ在慢性丙型肝炎中的表达，我们测定了以前用于测定IFNα表达的肝组织和PBMC同样样品中的IFNβRNAm水平。
如图2所示，与健康对照和正常肝组织发现的PBMC相比，我们观察到IFNβ RNAm水平(表示为与β-肌动蛋白的比)在慢性丙型肝炎患者PBMC和肝中明显更高(在PBMC中1.66±0.2对0.88±0.16；p＝0.008，和在肝中1.37±0.23对0.97±0.16；p＝0.011)。这些结果表明当HCV引起IFNα在肝中被抑制，在肝组织和PBMC中IFNβ的表达都增加。这表明VHC以不同方式调控肝中不同的I型IFN基因，阻滞IFNα的生产，以使IFNβ过多表达。具有病毒负荷的IFNα和IFNβ基因表达间的关系，基因型和慢性丙型肝炎的肝损伤
为了测定IFNα或IFNβ基因的表达与负荷病毒或基因型的相关性，我们应用竞争性PCR技术量化了所有患者血清中的丙型肝炎病毒RNA，应用与特殊实验材料的杂交方法，测定了VHC基因型。我们发现在IFNα或IFNβ基因的表达(在肝或PBMC中)与血清中的丙型肝炎病毒RNA水平或病毒基因型之间没有相关性。
分析I型IFN基因的表达与慢性丙型肝炎患者肝损伤的严重性之间的关系，我们发现肝中IFNβRNAm水平直接与血清天门冬氨酸氨基转移酶值(r＝0.64，p＝0.008)和Knodell指数(r＝0.66，p＝0.006)相关。同样，肝中IFNαRNAm值表明与如上所述的Knodell指数具有直接的正相关。
    表1对照和慢性丙型肝炎患者中IFNα亚型
 肝 PBMC
对照1  9 IFNA5克隆
对照2  9 IFNA5克隆
对照3  11 IFNA5克隆
对照4  12 IFNA5克隆
对照5  3 IFNA5克隆4 IFNA21克隆2 IFNA1克隆
对照6  8 IFNA5克隆
对照7  10 IFNA1/13克隆1 IFNA8克隆
对照8  3 IFNA5克隆2 IFNA21克隆2 IFNA1/13克隆1 IFNA22克隆
对照9  2 IFNA10克隆1 IFNA5克隆1 IFNA2克隆1 IFNA7克隆1 IFNA8克隆1 IFNA4克隆
RNA-VHC(+)1  6 IFNA5克隆2 IFNA21克隆1 IFNA17克隆  7 IFNA5克隆1 IFNA21克隆1 IFNA7克隆
RNA-VHC(+)2  2 IFNA5克隆4 IFNA21克隆  5 IFNA5克隆4 IFNA21克隆
RNA-VHC(+)3  5 IFNA5克隆2 IFNA21克隆2 IFNA1克隆
附图描述
图1：α干扰素/β-肌动蛋白RNAm(纵坐标)在健康对照和慢性丙型肝炎患者(HCV-RNA+)在外周血液单核细胞(A)和肝(B)中(横坐标)的表达。
图2：β干扰素/β-肌动蛋白RNAm(纵坐标)在健康对照和慢性丙型肝炎患者(HCV-RNA+)在外周血液单核细胞(A)和肝(B)中(横坐标)的表达。
图3：全RNA起始量(横坐标)与通过扩增PBMC(A)和肝(B)样品中IFNα(·)，IFNβ(▲)和β-肌动蛋白(◆)(纵坐标，以x mm2计算)RNAm获得的PCR产物带强度间的关系。
                           序列表一般信息申请人：名称：INSTITUTO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO DE NAVARRA，S.A.街道：Avenida Pio XII，53城市：Pamplona州或省：纳瓦拉国家：西班牙邮政编码：31008电话：948-10 56 00传真：948-17 52 23题目“干扰素α5在治疗病毒性肝脏疾病的应用”序列编号：1联系地址名称：INSTITUTO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO DE NAVARRA，S.A.街道：Avenida Pio XII，53城市：Pamplona州或省：纳瓦拉国家：西班牙邮政编码：31008计算机可读型：介质类型：3.5时盘计算机：PC操作系统：WINDOWS字处理：WORD律师/代理人信息：名称：ALBERTO DE ELZABURU注册号：232/1参考注册号：P-99043电话联系信息：电话：91 7009400传真：91 3193810电子信箱号：elzaburu@elzaburu.esSEQ ID NO.：1信息：序列特征：274个碱基对类型：核苷酸链数：1构型：线性分子类型：cDNA假设：否反方向：否有机体来源：有机体：Homo Sapiens组织类型：肝基因组位置：染色体9特征：名称/关键词：IFNα5鉴别方法：RT-PCR，测序其它信息：
IFNα5基因序列的核苷酸672-945在Genbank数据库中公开，编号为X02956。序列SEQ ID NO.：1的描述TC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA        50His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser
1               5                  10                   15TCT GCT ACT TGG GAT GAG ACA CTT CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTT TAC       101Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr
        20                   25                  30CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT ATG ATG CAG GAG GTT GGA GTG GAA      152Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu
 35                  40                  45                  50GAC ACT CCT CTG ATG AAT GTG GAC TCT ATC CTG ACT GTG AGA AAA TAC TTT      203Asp Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe
            55                   60                  65CAA AGA ATC ACC CTC TAT CTG ACA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCA TGG       254Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp
     70                  75                  80GAG GTT GTC AGA GCA GAA AT                                                274Glu Val Val Arg Ala Glu85                 90

Claims (10)

1.IFNα5或编码它的基因序列和/或基本上来源于它的基因序列在制备用于治疗肝病的组合物中的应用。
2.按照权利要求1的应用，用于制备用于治疗慢性丙型肝炎的组合物。
3.按照权利要求1的应用，用于制备用于治疗病毒引起的肝硬化的组合物。
4.按照权利要求1的应用，用于制备用于治疗肝细胞肿瘤的组合物。
5.按照权利要求1-4任何一个的应用，其中制备的组合物用于遗传诱导干扰素α5在细胞核水平的生理合成，在患病的肝细胞中缺乏这种合成。
6.按照权利要求1-4任何一个的应用，其中这种组合物的制备包括通过在一种适当的宿主中克隆一种表达载体产生施用于人类的重组蛋白质。
7.按照权利要求6的应用，其中克隆的宿主为真核细胞有机体，优选大肠杆菌。
8.按照权利要求6的应用，其中克隆的宿主为原核生物有机体，优选Solanum tuberosum。
9.按照前述权利要求任何一个的应用，其中制备的组合物为可以与食物一起摄取的组合物。
10.按照权利要求1-4任何一个的应用，其特征在于制备的组合物为用于体细胞基因治疗的组合物。
CNB998078662A 1998-05-13 1999-05-13 干扰素α5在制备治疗病毒性肝脏疾病的组合物中的应用 Expired - Fee Related CN1173738C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP9801003 1998-05-13
ES009801003A ES2138565B1 (es) 1998-05-13 1998-05-13 Uso del interferon alfa 5 en el tratamiento de las hepatopatias viral es.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1307482A true CN1307482A (zh) 2001-08-08
CN1173738C CN1173738C (zh) 2004-11-03

Family

ID=8303773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998078662A Expired - Fee Related CN1173738C (zh) 1998-05-13 1999-05-13 干扰素α5在制备治疗病毒性肝脏疾病的组合物中的应用

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6995133B1 (zh)
EP (1) EP1077068B9 (zh)
JP (1) JP2002514606A (zh)
CN (1) CN1173738C (zh)
AT (1) ATE214941T1 (zh)
AU (1) AU753463B2 (zh)
BR (1) BR9911774A (zh)
CA (1) CA2335645C (zh)
DE (2) DE69901099D1 (zh)
DK (1) DK1077068T5 (zh)
ES (2) ES2138565B1 (zh)
PT (1) PT1077068E (zh)
RU (1) RU2209079C2 (zh)
SE (1) SE1077068T5 (zh)
WO (1) WO1999058143A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103732242A (zh) * 2011-06-23 2014-04-16 迪格纳生物技术公司 用与IFN-α2b组合的IFN-α5在患者群体中治疗慢性丙型肝炎

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110179530A1 (en) * 2001-01-23 2011-07-21 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Pharmaceutical Proteins, Human Therapeutics, Human Serum Albumin Insulin, Native Cholera Toxin B Subunit on Transgenic Plastids
FR2824333B1 (fr) * 2001-05-03 2003-08-08 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'ifn alpha 5
WO2006032711A1 (es) * 2004-08-18 2006-03-30 Instituto Científico Y Tecnológico De Navarra S.A. Uso del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo i y de interferón alfa en el tratamiento de una enfermedad hepática crónica, kit y composiciones que los comprenden
ES2303492A1 (es) * 2004-08-18 2008-08-01 Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra S.A. Uso del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo i y de interferon alfa en el tratamiento de una enfermedad hepatica cronica, kit y composiciones que los comprenden.
KR101858598B1 (ko) 2010-02-01 2018-05-16 디그나 비오테크, 에스.엘. 인터페론 알파 5의 제조방법
LT6164B (lt) 2013-10-15 2015-06-25 Uab Biotechnologinės Farmacijos Centras "Biotechpharma" Sulieti interferono-alfa 5 baltymai su kitu citokinu ir jų gamybos būdas

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4973479A (en) * 1982-01-15 1990-11-27 Cetus Corporation Interferon-α61
CA2081028C (en) * 1991-03-12 1999-12-14 Barbara P. Wallner Cd2 binding domain of lymphocyte function associated antigen 3
AU1854695A (en) * 1994-03-07 1995-09-25 Imperial College Of Science, Technology And Medicine The use of interferon subtypes in the preparation of medicaments to treat viral infections
US6172046B1 (en) * 1997-09-21 2001-01-09 Schering Corporation Combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic Hepatitis C infection

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103732242A (zh) * 2011-06-23 2014-04-16 迪格纳生物技术公司 用与IFN-α2b组合的IFN-α5在患者群体中治疗慢性丙型肝炎

Also Published As

Publication number Publication date
ES2138565A1 (es) 2000-01-01
DK1077068T3 (da) 2002-07-22
DK1077068T5 (da) 2002-10-14
CA2335645C (en) 2011-01-04
US6995133B1 (en) 2006-02-07
AU753463B2 (en) 2002-10-17
RU2209079C2 (ru) 2003-07-27
ES2138565B1 (es) 2000-08-16
EP1077068B1 (en) 2002-03-27
SE1077068T5 (sv) 2003-03-04
WO1999058143A9 (es) 2002-08-22
ES2174604T3 (es) 2002-11-01
PT1077068E (pt) 2002-07-31
SE1077068T3 (sv) 2002-07-02
EP1077068B9 (en) 2002-10-02
WO1999058143A1 (es) 1999-11-18
CA2335645A1 (en) 1999-11-18
US7501392B2 (en) 2009-03-10
EP1077068A1 (en) 2001-02-21
ATE214941T1 (de) 2002-04-15
US20060188477A1 (en) 2006-08-24
DE69901099T4 (de) 2003-03-13
BR9911774A (pt) 2001-02-06
DE69901099T2 (de) 2002-11-07
AU3711199A (en) 1999-11-29
DE69901099D1 (de) 2002-05-02
JP2002514606A (ja) 2002-05-21
CN1173738C (zh) 2004-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6204022B1 (en) Low-toxicity human interferon-alpha analogs
US6461605B1 (en) Continuous low-dose cytokine infusion therapy
JP2000504010A (ja) 共通インターフェロンを用いたｃ型肝炎患者の再治療法
CN1261806A (zh) 聚乙二醇－干扰素α结合物治疗传染性疾病
Balkwill et al. Differential action of six human interferons against two human carcinomas growing in nude mice
US7501392B2 (en) Method of treatment of viral hepatitis C with interferon alpha 5
US6300474B1 (en) Modified interferons
Weigent et al. Recombinant gamma interferon enhances natural killer cell activity similar to natural gama interferon
Fiers et al. The human fibroblast and human immune interferon genes and their expression in homologous and heterologous cells
SAMUEL et al. Mechanism of interferon action: ability of cloned human type-alpha interferons to induce protein phosphorylation and inhibit virus replication is specified by the host cell rather than the interferon subspecies
CN1092322A (zh) 治疗对干扰素治疗无反应者的丙型肝炎的方法
CN1251043A (zh) 可从动物器官中提取的蛋白质在制备可用于治疗疾病的药物中的用途
MXPA00011012A (en) Utilization of interferon alpha 5 in the treatment of viral hepatopathies
Gillespie et al. Levels of interferon in blood serum and toxicity studies of bacteria-derived bovine alpha I1 interferon in dairy calves
Schellekens et al. The chimpanzee as a model to test the side effects of human interferons
US6001589A (en) Method of identifying proteins modified by disease states related thereto
PROIETTI et al. Specific interferon genes are expressed in individual cells in the peritoneum and bone marrow of normal mice
WOODROW et al. Human interferons active on murine cells induce pulmonary cysts in A2G mice
CN1109908A (zh) 抗肿瘤的新型人α型干扰素及其突变体的制法和用途
US20030199007A1 (en) Super proteins including interferons, interleukins, et al.
CA1320129C (en) Synergistic behavior of csf-1 and g-csf
Schellekens et al. Interferons: past, present and future
Creasey et al. Functional properties of proteins coded by three human α-interferon genes and a pseudogene
Schellekens Interferon as an Antiviral Agent

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: INST OF APPLICATION MEDICINE

Free format text: FORMER OWNER: INSTITUTO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO DE NAVARRA S A

Effective date: 20030228

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20030228

Address after: Navarra Spain

Applicant after: Inst of Application Medicine

Address before: Navarra Spain

Applicant before: Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra S A

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: TOP BIOLOGICAL MEDICAL ENGINEERING CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: INST OF APPLICATION MEDICINE

Effective date: 20050513

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20050513

Address after: Pamplona

Patentee after: Inst of Application Medicine

Address before: Navarra Spain

Patentee before: Inst of Application Medicine

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20041103

Termination date: 20150513

EXPY Termination of patent right or utility model