CN1259938A - crambescidin化合物 - Google Patents

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孙富荣
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Abstract

通过FABMS指导的分离,已经从地中海海绵动物甘蓝海绵Crambe crambe的提取物中,获得2种新的具有一个氯代亚精胺单位的低量成分crambescidin 834 (7)、818(8)和4种新的没有亚精胺衍生单位的低量成分crambescidin673(9)、687(10)、657(11)和13,14,15－isocrambescidin 657(12)以及已知的crambescidins(1－5)和ptilomycalin A(6)。通过波谱数据解析(参见图4－9),阐述了它们的结构。在对L1210鼠白血病细胞的平行测定中,crambescidins 834(7)、818 (8)和657(11)表现出的细胞毒性是已知的crambescidin 816(1)的5倍。具有亚精胺单位或亚精胺衍生单位的crambescidins均表现出对红酵母的抗菌活性。

Description

crambescidin化合物
                      发明背景
在从海洋海绵动物筛选新型生物活性剂的过程中，已经描述了一组新的有效的细胞毒性和抗病毒化合物：来自海绵动物甘蓝海绵Crambe crambe的crambescidins(1-5)1-4和来自海绵动物羽轴海绵Ptilocaulis spiculifer和Hemimycale sp.的ptilomycalin A(6)5-7，它们具有配合物五环胍，所述五环胍通过线性ω-羟基脂肪酸连接至一个羟基亚精胺或亚精胺单位上。广泛的NMR研究已经表明，crambescidins(1-4)和ptilomycalin A(6)的五环胍部分的相对立体化学是相同的，同时crambescidin 816(1)2的氧化降解和ptilomycalin A(6)8的对映选择性全合成已经精确地确立了它们相同的中心胍部分的绝对构型。
最近，在海绵动物Batzella物种中发现crambescidins和ptilomycalin A同时存在9。已经描述了crambescidin1-4和ptilomycalinA5-7显著的细胞毒性、抗病毒和抗真菌的活性，并且已经表明crambescidin 816是有效的钙通道阻断剂4。
为了获得大量的crambescidin 816(1)用于临床前实验和临床实验，将三种甘蓝海绵Crambe crambe样品经过类似于先前描述的(参见实验部分)分离步骤1-2。通过FABMS指导的分离，分离出总共1.48g的crambescidin 816(1)以及已知的crambescidins(2-5)、ptilomycalin A(6)和6种新发现的crambescidin化合物(7-12)。
                         发明概述
新的crambescidins(7-12)的结构和生物活性是本发明的主题。crambescidins 834(7)和818(8)的氯代亚精胺单位是天然来源中从未得到过的。所述crambescidins的结构如下：1  R1＝OH，R2＝OH，n＝142  R1＝OH，R2＝OH，n＝153  R1＝OH，R2＝OH，n＝164  R1＝OH，R2＝H， n＝146  R1＝H， R2＝H， n＝147  R1＝Cl，R2＝OH，n＝148  R1＝Cl，R2＝h， n＝14
Figure A9880608000071
9  R＝OH11 R＝H
Figure A9880608000072
Figure A9880608000081
新的crambescidins(7-12)的结构
根据高分辨快速原子轰击质谱(HRFABMS)数据[m/z 835.5821(M+H)，Δ0.7mmu)]，确定crambescidin 834(7)的分子式为C45H79N6O6Cl。由于在7的FABMS和FABMS/碰撞诱导的离解(CID)/MS谱中，观察到丧失氯化氢(M+H-HCL，799.6075，Δ-1.4mmu)和H2O(M+H-HCL-H2O，781.5984，Δ-2.9mmu)的碎片离子，显然存在一个氯和一个游离的羟基。
根据FABMS和NMR数据，确定7的羟基五环胍部分的结构与1的相同。7的在FABMS和FABMS/CID/MS谱中观察到于m/z420、374、358、264和246的碎片离子，它们是crambescidins(1-4)中羟基五环胍部分的特征1。通过COSY、HMQC和HMBC NMR实验，确定羟基在所述五环胍单位中的位置几乎与在crambescidins(1-4)中的相同，提示该羟基的位置和所述羟基五环胍部分的立体化学在所有这些crambescidins中是相同的。
在7的FABMS和FABMS/CID/MS中，于m/z 398.3729(C23H48N3O2，Δ1.8mmu)和380.3636(C23H46N3O，Δ0.5mmu)观察到来自C-23至C-45侧链的碎片离子强峰，它们在其它氯代crambescidins的光谱中不存在。NMR和尤其是FABMS/CID/MS数据显示出来自C-23至C-37的多亚甲基链，所述数据提供来自连续的亚甲基裂解的一系列几乎连续的碎片离子，由m/z 380至198.1616(C10H48N3O，Δ-1.0mmu)。由m/z 614.4549(C36H60N3O5，Δ-1.6mmu)的碎片离子提示的所述侧链和所述羟基五环胍单位之间的酯键，被7的HMBC谱中δ168.12(C-22)的羧基碳和δ3.48(s，H-14)及4.16(t，H2-23)的质子之间的远程相关所证实。由COSY和HMQC数据，鉴别出两个独立的自旋系统(从H-39b至H2-41和从H-42a、H-42b至H2-45)和氯代亚精胺单位中氯的位置。根据HMBC谱中观察到的C-42(δ57.83)和H-39b(δ3.62)之间和C-39(δ47.19)和H-42a、H-42b(δ3.36，3.62)之间的远程C-H相关，这两个自旋系统相互连接。此外，根据在HMBC谱中观察到于δ165.49(C-38)的第二个羧基碳和于δ3.36(H-42a)、2.49(H-37a)和2.76(H-37b)的质子之间的相关，确立了7中的酰胺键。
根据HRFABMS(M+H，819.5889，Δ-1.0mmu)确定的crambescidin 818(8)的分子式C45H79N6O5Cl，比crambescidin 834(7)少一个氧(羟基)。8的FABMS和FABMS/CID/MS谱显示于m/z783.6145(Δ-3.3mmu)的碎片离子，它对应于M+H-HCL，鉴别出存在一个氯。同时，存在m/z 404和358以及不存在m/z 420、374、264和246，表明crambescidin 818(8)具有与crambescidin 800(4)相同的五环胍部分，这一点通过8与4的1H和13C数据比较得到证实1。由8中的COSY数据确定的氯代亚精胺单位的1H和13C NMR的化学位移，几乎与7中的化学位移相同，提示该氯在crambescidin 818和834中的位置和立体化学是相同的。
根据HRFABMS数据(M+H，674.4734，Δ1.0mmu)，crambescidin673(9)的分子式确定为C38H63N3O7。9的FABMS和FABMS/CID/MS谱显示于m/z 420、358、264和246的crambescidins中羟基五环胍单位的特征峰以及来自连续的亚甲基裂解的从m/z 628至420的一系列几乎连续的同系碎片离子，提示crambescidin 673(9)具有一个羧酸末端，缺少一个亚精胺单位。由10和9的1H和13C NMR数据完全支持提出的这一结构，表明crambescidin 687(10)是crambescidin 673(9)的甲酯。在10的NMR谱中观察到于δH3.65和δc51.44的所述甲氧基。与9中相应的信号(δ181.60)相比，10中的C-38信号(δ174.39)向高磁场位移。
crambescidin 687(10)(HRFABMS，688.4907，M+H；Δ-0.6mmu，对于C38H66N3O7，HRFABMS数据(M+H，674.4734，Δ1.0mmu))。9的FABMS和FABMS/CID/MS谱显示于m/z 420、358、264和246的crambescidins中羟基五环胍单位的特征峰以及来自连续的亚甲基裂解的从m/z 628至420的一系列几乎连续的同系碎片离子，提示crambescidin 673(9)具有一个羧酸末端，缺少一个亚精胺单位。1H和13C NMR数据(参见表1和表2)完全支持提出的这一结构，该结构借助于COSY数据确定。于δ181.60观察到所述羧基的碳基信号。
crambescidin 687(10)(对于C39H66N3O7，HRFABMS，688.4907，M+H；Δ-0.6mmu)因一个CH2基团而不同于9，显示出与9相似的FABMS和FABMS/CID/MS碎片离子。10和9的1H和13C NMR数据的比较表明，crambescidin 687(10)是crambescidin 673(9)的甲酯。在10的NMR谱中观察到于δH3.65和δc51.44的所述甲氧基。与9中相应的信号(δ181.60)目比，10中的C-38信号(δ174.39)向高磁场位移。
根据HRFABMS (M+H，658.4797，Δ-0.2mmu)，crambescidin 657(11)的分子式确定为C38H66N3O7)、因CH38H63N3O6而不同于9，与9的差异在一个氧(羟基)。11的FABMS和FABMS/CID/MS谱显示于m/z 404和358的碎片离子以及来自连续的亚甲基裂解的从m/z 612至404的一系列几乎连续的碎片离子，表明在所述五环胍部分中的C-13缺乏一个氧，这由表1和表2中的1H和13C NMR数据证实。
根据HRFABMS数据(m/z 658.4790，M+H，Δ0.5mmu)，确定13，14，15-isocrambescidin 657(12)的分子式C38H63N3O6与11的分子式相同。12的FABMS和FABMS/CID/MS谱数据也与11的数据相同。然而，11和12的层析特性和NMR图形相似，但可清楚地区分，表明它们互为异构体。通过COSY和TOCSY实验确定的12中五环胍单位中的1H和13C NMR化学位移和偶合常数，与5的数据2非常相似，提示12的五环胍部分的立体化学由NOESY实验进一步证实，其中观察到H-10和CH3-1之间以及H-14和H-13、H-19之间的NOE效应，同时缺乏H-10和H-13之间的NOE效应。1，2
crambescidin 9、11或12具有一个酸性的羧酸末端和一个强碱性的五环胍部分6，因此，它们作为内盐形式存在。在7、8或10的1HNMR波谱(在CDCl3中)中，观察到根据COSY实验分别与H-9b和H-14相关的两个低磁场可交换的质子，表明这些crambescidins的五环胍部分为盐形式。未确定相反离子的性质，但这可推测为Cl-1，因为几个分离步骤涉及与NaCl的接触。
发明详述
如上所述，本发明涉及6种新的crambescidins(化合物7-12)的分离和鉴定(即结构和生物活性)。这些如下测定：
一般描述。用U-500或UI-500(500-Mhz，1H；125-MHz，13C)光度计获得NMR波谱；化学位移(δ)以相对溶剂峰的ppm报告。高分辨和低分辨快速原子轰击质谱(FAB)在ZAB-SE光度计上测量，而FABMS/CID/MS谱在70 SE-4F仪器上进行，用二硫苏糖醇-二硫赤藓糖醇作为基质10。使用C-18柱(25×0.8cm，5-μm的粒度)和CH3OH∶0.1M NaCl(8∶2)的溶剂进行HPLC分离。
提取和分离。通过对提取物和所分离部分的FABMS测量结果，指导分离。涉及三种甘蓝海绵Crambe crambe样品。
通过SCUBA，于西班牙Murcia收集第一种样品，并由M.J.Uriz-Lespe博士鉴定(Centred’Estudis Avancats de Blanes，Blanes，西班牙)。用CHCl3∶甲苯(3∶1)萃取所述冷冻样品(100.2g)。真空蒸发该萃取物，得到残余物(6.5g)，使其在CHCl3和1.0M NaCl(1∶1，50ml×3)之间分配。使有机层(3.2g)在下层之间进一步分配，下相通过HLPC纯化，得到1(12.0mg)、2(7.0mg)、3(2.4mg)、4(0.4mg)和5(5.4mg)。
于西班牙Ibiza收集的第二种冷冻样品(500.0g)按照相同的方法分离，得到crambescidin 816(1，104.5mg)。
于西班牙Isla de Formentor(Cueva)Palma de Mallorca收集第三种样品(3208.0g)。该冷冻样品用CHCl3∶甲苯(3∶1)萃取，得到一萃取物(143.0g)，使其在CHCl3和1.0M NaCl(1∶1，1000ml×3)之间分配。使CHCl3层(55.4g)在己烷∶EtOAc∶MeOH∶H2O(4∶7∶4∶3)之间进一步分配。下相(18.2g)于m/z 817，801显示主峰，将下相在快速C-18(200g)柱上层析。该柱用所述混合溶剂[己烷∶EtOAc∶MeOH∶H2O(4∶7∶4∶3)]的下层洗脱，得到两个部分，将其通过HPLC纯化，产生crambescidin 816(1，1367.4mg)、843(7，4.4mg)、818(8，3.1mg)和ptilomycalin A(6，2.9mg)。上相(37.2g)于m/z 658和674显示小峰，将其通过硅胶(300g，230-400目)快速层析柱分离，用CHCl3(100％-0％)中增加MeOH(0％-100％)的溶剂梯度体系洗脱。将于m/z 658、674和688显示峰的部分通过重复的硅胶(230-400目)柱层析进一步纯化，用CHCl3∶EtOAc∶MeOH(9∶9∶1)、CHCl3∶MeOH(15∶1)和CHCl3∶MeOH(9∶1)作为溶剂体系洗脱进一步纯化，产生crambescidin 673(9，23.8mg)、687(10，14.7mg)、657(11，3.4mg)和13，14，15-isocrambescidin657(12，6.6mg)。
crambescidin 834(7)：无色树胶，[α]25D-24.7°(c 0.44，MeOH)；FABMS m/z 835(M+H)，799(M+H-HCl，C45H79N6O6，HRFABMS799.6075，Δ-1.4mmu)，781(M+H-HCL-H2O，C45H79N6O6，HRFABMS799.6075，Δ-2.9mmu)，694，655，614(C36H60N3O5，HRFABMS781.5984，Δ-2.9mmu)，694，655，614(C36H60N3O5，HRFABMS614.4549，Δ-1.6mmu)，426，420，398(C23H48N3O2，HRFABMS398.3729，Δ1.8mmu)，380(C23H46N3O，HRFABMS 380.3636，Δ0.5mmu)，374，358，314，264，246，198(C10H20N3O，HRFABMS 198.1616，Δ-1.0mmu)；1H NMR(CD3OD)参见表1；13C NMR(CD3OD)参见表1；13C NMR(CD3OD)参见表2；1H NMR(CDCl3)δ：0.88(t，J＝7，H3-1)，1.46(m，H-2a)，1.54(m，H-2b)，4.51(br d，J＝10，H-3)，5.49(br d，J＝11，H-4)，5.67(br dd，J＝11，7.5，H-5)，2.19(m，H-9a)，2.34(m，H-6b)，1.94(m，H-7a)，2.47(br t，J＝14，H-7b)，1.42(t，J＝12.5，H-9a)，2.56(dd，J＝12.5，5，H-9b)，4.32(m，H-10)，1.57(m，H-11a)，2.33(m，H-1 1b)，2.04(ddd，J＝14，10，4.5，H-12a)，2.16(m，H-12b)，3.36(s，H-14)，1.62(m，H-16a)，1.77(ddd，J＝14，14，4.5，H-16b)，1.76(m，H-17a)，2.32(m，H-17b)，1.23(m，H-18a)，1.76(dddd，J＝14，7，7，2，H-18b)，4.09(m，H-19)，1.10(d，J＝6，H-20)，4.09(m，H2-23)，1.61(m，H2-40)，3.43(br，H2-41)，3.27(br，H2-42)，3.79(br，H-43)，1.68(m，H-44a)，2.15(m，H-44b)，2.75(br，H-45a)，2.86(br，H-45b)，5.83(s，H-130H)，10.01(br s，H-8N)，10.07(br s，H-15N)；13C NMR(CDCl3)δ：10.16(C-1)，29.09(C-2)，71.29(C-3)，133.66(C-4)，129.84(C-5)，23.44(C-6)，36.90(C-7)，83.56(C-8)，37.03(C-9)，52.41(C-10)，29.53(C-11)，37.19(C-12)，88.68(C-13)，54.55(C-14)，83.04(C-15)，32.09(C-16)，18.00(C-17)，31.56(C-18)，68.84(C-19)，21.43(C-20)，148.13(C-21)，167.17(C-22)，65.93(C-23)，28.38(C-24)，25.78(C-36)，32.19(C-37)，165.01(C-38)，47.21(C-39)，19.10(C-40)，38.74(C-41)，57.50(C-42)，65.05(C-43)，31.71(C-44)，37.04(C-45)；HRFABMS C45H80N6O6Cl的Mr计算值835.5828(M+H)+，Mr实测值835.5821。
crambescidin 818(8)：无色树胶，[α]25D-11.4°(c 0.31，MeOH)；FABMS m/z 819(M+H)，783(M+H-HCl，C45H79N6O5，HRFABMS783.6145，Δ-3.3mmu)，696(C41H70N5O4，HRFABMS 696.5437，Δ-.09mmu)，639，612，598，404，430，398，380，358，288，260，206；1H NMR(CD3OD)参见表1；13C NMR(CD3OD)参见表2；1H NMR(CDCl3)δ：0.83(t，J＝7，H-1)，1.42(m，H-2a)，1.53(m，H-2b)，4.50(br d，J＝9.5，H-3)，5.48(br d，J＝11，H-4)，5.68(br dd，J＝11，7，H-5)，2.18(m，H-6a)，2.34(m，H-6b)，1.69(m，H-7a)，2.46(br t，J＝13，H-7b)，1.41(t，J＝12.5，-9a)，2.55(dd，J＝12.5，4.5，H-9b)，3.96 m，H-10)，1.61(m，H-11a)，2.21(m，H-11b)，1.79(m，H-12a)，2.27(m，H-12b)，4.28(ddd，10，5，5，H-13)，2.94(d，J＝5，H-14)，1.79(m，H2-16)，1.79(m，H2-17)，1.20(m，H-18a)，1.71(m，H-18b)，3.96(m，H-19)，1.05(d，J＝6，H-20)，4.09(m，H2-23)，1.61(m，H2-24)，1.60(m，H2-36)，2.02(m，H2-37)，3.48(br，H2-40)，3.43(br，H2-41)，3.28(br，H2-42)，3.80(br，H-43)，1.75(m，H-44b)，2.77(br，H-45a)，2.85(br，H-45b)，9.53(br s，H-8n)，9.77(br s，H15N)；13C NMR(CDCl3)δ：10.09(C-1)，29.11(C-2)，71.03(C-3)，133.69(C-4)，129.94(C-5)，23.42(C-6)，36.97(C-7)，83.59(C-8)，36.99(C-9)，53.95(C-10)，30.66(C-11)，26.84(C-12)，51.84(C-13)，49.67(C-14)，80.71(C-15)，31.92(C-16)，18.40(C-17)，31.96(C-18)，67.29(C-19)，21.46(C-20)，148.85(C-21)，168.39(C-22)，65.46(C-23)，28.47(C-24)，25.79(C-36)，31.92(C-37)，165.04(C-38)；HRFABMS C45H80N6O5Cl的Mr计算值819.5879(M+H)+，Mr实测值819.5889。
crambescidin 673(9)：无色树胶，[α]25D-16.6°(c 0.50，MeOH)；FABMS m/z 674(M+H)，576，420，358，314(C19H28N3O，HRFABMS314.2240，Δ-0.8mmu)，264，246，168；1H NMR参见表1；13C NMR参见表2；HRFABMS C38H64N3O7的Mr计算值674.4744(M+H)+，Mr实测值674.4734。
crambescidin 687(10)：无色树胶，[α]25D-18.2°(c 0.52，MeOH)；FABMS m/z 688(M+H)，630，590，420，374，358，314，264，246，168；1HNMR参见表1；13C NMR参见表2；HRFABMS C39H66N3O7的Mr计算值688.4901(M+H)+，Mr实测值688.4907。
crambescidin 657(11)：无色树胶，[α]25D-12.1°(C 0.34，MeOH)；FABMS m/z 658(M+H)，612，560，404(C22H34N3O4，HRFABMS404.2541，Δ0.8mmu)，360，358，288，206(C13H20NO，HRFABMS206.1547，Δ-0.2mmu)；1H NMR参见表1；13C NMR参见表2；HRFABMS C38H64N3O6的Mr计算值658.4795(M+H)+，Mr实测值658.4797。crambescidin 657的甲烷化：
将溶于MeOH(1ml)中的11(1mg)和Et2O(2ml)中的重氮甲烷的混合物于室温下保持24小时。去除溶剂(N2)，残余物进行硅胶层析，用CHCl3∶MeOH(9∶1)作为溶剂体系洗脱，产生11的甲酯(0.7mg)。无色树胶，FABMS m/z 672(M+H)，574，404，358，288，206；HRFABMSC39H66N3O6的Mr计算值672.4952(M+H)+，Mr实测值672.4984。
13，14，15-isocrambescidin 657(12)：无色树胶，[α]25D-32.7°(c0.29，MeOH)；FABMS m/z 658(M+H)，612，560(C32H54N3O5，HRFABMS 560.4034，Δ2.9mmu)，404，360，358(C21H32N3O2，HRFABMS 358.2494，Δ0.1mmu)，288，206；1H NMR参见表1；13CNMR参见表2；HRFABMS C38H64N3O6的Mr计算值658.4795(M+H)+，Mr实测值658.4790。
表1提供化合物7-12的1H NMR数据。表2提供化合物7-12的
                   13C NMR数据。
                                  表1.  化合物7-12的1H NMR数据H No.     7(CD3OD)          8(CD3OD)             9(CDCl3)             10(CDCl3)        11(CDCl3)          12(CDCl3)1         0.89，t，7         0.85，t，7             0.86，t，7            0.87，t，7         0.82，t，7          0.94，t，7.52a        1.49，m            1.48，m                1.45，m               1.46，m            1.42，m             1.47，m2b        1.57，m            1.55，m                1.54，m               1.55，m            1.53，m             1.51，m3         4.46，br d，10     4.42，br d，9.5        4.52，br d，10        4.51，br d，10     4.38，br d 9.5      4.63，br s4         5.52，br d，11     5.51，br d，11         5.48，br d，11        5.48，br d，11     5.48，br d，11      5.50，br d，115         5.72，br dd，11，7 5.72，br dd，11，7     5.64，br dd，11，7    5.66，br dd，11，7 5.64，br dd，11，7  5.62，br dd，11，76a        2.18，m            2.18，m                2.12，m               2.18，m            2.14，m             2.10，m6b        2.44，m            2.42，m                2.33，m               2.34，m            2.32，m             2.30，m7a        2.02，m            2.02，m                1.81，m               1.92，m            1.84，m             1.78，m7b        2.37，br t，13.5   2.33，br t，13.5       2.73 br t，14         2.51，br t，14.5   2.74，br t，14      2.73，br t，13.59a        1.44，t，12.5      1.44，t，13            1.32，t，12.5         1.41，t，12.5      1.31，t，12.5       1.35，t，12.510        4.32，m            4.05，m                4,32，m               43.2，m            3.98，m             3.89，m11a       1.61，m            1.60，m                1.55，m               1.57，m            1.61，m             1.55，m11b       2.43，m            2.29，m                2.30，m               2.33，m            2.14，m             2.19，m12a       2.06，m            1.86，m                1.98，m               2.03，m            1.78，m             1.62，m12b       2.18，m            2.31，m                2.14，m               2.16，m            2.24，m             2.15，m13                           4.35，m                                                         4.26，m             3.98，m14        3.48，s            3.08，d，5             3.31，3               3.35，s            2.89，d，4          3.48，d，3.516a       1.65，m            1.68，m                1.68，m               1.62，m            1.62，m             1.62，m16b       1.87，m            1.76，m                1.74，m               1.76，m            2.02，m             1.71，m17a       1.84，m            1.75，m                1.67，m               1.76，m            1.67，m             1.69，mH No.    7(CD3OD)            8(CD3OD)         9(CDCl3)     10(CDCl3)    11(CDCl3)     12(CDCl3)17b      1.96，m              1.82，m            2.44，m       2.32，m        2.44，m        2.01，m18a      1.33，m              1.26，m            1.21，m       1.23，m        1.21，m        1.29，m18b      1.73，m              1.72，m            1.66，m       1.76，m        1.67，m        1.59，m19       3.97，m              3.84，m            4.00，m       4.08，m        3.99，m        3.69，m20       1.14，d，6           1.04，d，6         1.05，d，6    1.09，d，6.5   1.04，d，6.5   1.17，d，623a      4.16，t，6.5         4.13，dt，6.5，2   4.01，m       3.96，m        3.96，m        3.97，m24       1.66，m              1.65，m            1.60，m       1.60，m        1.60，m        1.57，m36       1.64，m              1.65，m            1.56，m       1.60，m        1.60，m        1.54，m37a      2.49，m              2.50，m            2.22，t，7    2.23，t，7     2.23，t，7     2.23，t，737b      2.76，m              2.76，m            2.22，t，7    2.23，t，7     2.23，t，7     2.23，t，739a      3.53，dt，13，5      3.45，dt，14，539b      3.62，dt，13，5      3.61，dt，14，540       2.05，m              2.05，m41       3.40，t，5           3.40，t，542a      3.36，dd，15，3      3.36，dd，15，342b      3.62，dd，15，10     3.61，dd，15，1043       4.06，m              4.05，m44a      1.74，m              1.73，m44b      1.85，m              1.84，m45       3.13，m              3.13，m13 OH    5.86，s              5.84，sOme                                                            3.65，s
                       表2.  化合物7-12的13C NMR数据C No.    7(CD3OD)     8(CD3OD)   9(CDCl3)    10(CDCl3)  11(CDCl3)   12(CDCl3)1        10.26         10.12        10.22        10.14        10.17        10.302        29.70         29.57        29.06        29.10        29.18        29.143        71.83         71.64        70.70        71.26        70.57        70.364        133.54        133.62       133.84       133.67       133.91       133.895        130.59        130.66       129.78       129.75       129.88       129.626        23.73         23.74        23.72        23.45        23.77        24.377        36.88         37.19        36.78        36.88        36.83        37.418        84.44         84.41        83.53        83.60        83.66        85.009        38.98         37.67        37.77        37.11        37.78        37.3410       53.41         54.90        52.21        52.40        53.80        52.8811       30.00         30.78        29.66*      29.67        30.66*      30.2612       37.52         26.88        35.70        36.88        26.85        29.64*13       89.86         53.47        88.44        88.69        51.58        51.9914       55.17         49.97        55.59        54.64        50.64        41.4815       83.82         81.48        83.15        83.08        80.64        83.2016       31.90         31.91        29.45*      32.08        31.91*      29.68*17       18.46         18.77        17.60        17.94        17.95        19.9018       31.76         32.27*      31.67*      31.53        32.19**     31.58**19       69.34         67.75        68.09        68.82        66.71        68.8120       21.00         21.09        21.49        21.41        21.59        22.2521       148.86        149.54       148.85       148.12       149.48       149.74C No.     7(CD3OD)    8(CD3OD)   9(CDCl3)    10(CDCl3)11(CDCl3)    12(CDCl3)22        168.12       169.54       167.37       167.16    168.59         168.1723        66.38        65.85        65.57        65.91     65.07          65.0624        28.83        28.95        28.24        28.39     28.66          28.3036        26.98        26.33        25.65        25.79     25.61          25.5337        32.08        32.38*      32.18**     34.10     32.09**       31.91**38        165.49       165.56       181.60       174.39    181.38         180.5339        47.19        47.1940        19.15        19.1441        39.26        39.2642        57.83        57.8343        66.38        66.4244        32.02        32.0845        37.69        37.69Ome                                              51.44标记*或**的信号可以交换。
生物活性。crambescidins(1-4)抑制L1210细胞的生长1，crambescidin 816(1)也表现出对单纯疱疹(Herpes simplex)、I型病毒(HSV-I)的抗病毒活性，并且表明是一种强Ca2+通道的阻断剂4。13，14，15-isocrambescidin 800(5)对L1210细胞的细胞毒性明显较低，并且未观察到抗病毒活性2。ptilomycalin A(6)显示出对L1210、P388和KB细胞的细胞毒性，表现出对白色念珠菌(Candida albicans)的抗真菌活性以及抗病毒活性(HSV)5，6。
在针对L1210鼠白血病细胞细胞的平行测定(参见表3)中，采用crambescidin 816(1)作为标准，具有一个氯代亚精胺单位的crambescidins 834(7)和818(8)的活性比1高5倍。然而，没有亚精胺衍生单位的crambescidin 674(9)和687(10)的活性比1低5倍。13，14，15-isocrambescidin 657(12)如预期的一样，其活性显著低于(于5μg/ml下没有抑制)其它crambescidins。ptilomycalin A(6)的活性略低于1的活性。
同时，在对红酵母(Rhodotorula glutinis)的抗微生物测定中，具有亚精胺衍生物衍生单位的crambescidins和ptilomycalin A于2μg/孔下表现出活性，其它crambescidins于20μg/孔下不表现出任何活性。这些观察揭示出：crambescidins和ptilomycalin A中所述五环部分和所述亚精胺或其衍生物单位的笼状结构，在其强的生物活性中起重要作用。
令人感兴趣的是，在该测定中crambescidin 657(11)表现出是细胞毒性最强的化合物。尤其参见表4。用重氮甲烷甲烷化，显著降低该活性。因为在内盐形式的11中，侧链的酸性末端向所述碱性五环胍部分折叠，并且该内盐的构象不同于其它crambescidins，所以11的细胞毒性可以来自对所述细胞的不同作用机制。
所述新的crambescidin化合物将具有与先前已知的crambescidin化合物相当的药用用途，特别是作为抗肿瘤化合物，如表3和表4所示。表3.化合物1、6-12和甲基11对L1210细胞的细胞毒性
浓度                               抑制(％)(μg/ml) 1      6      7      8      9    10     11     12   甲基11
1.0    100    100    100    100    100  100    100    100    0
0.5    97     99     95     95     0    0      100    0      0
0.25   70     60     95     95     0    0      100    0      0
0.1    0      20     90     90     0    0      93     0      0
              表4.  对肿瘤细胞系的细胞毒性
                           μg/mlcrambescidins    P-388    A-549   HT-29    MEL-28
834(7)         0.05     0.05    0.05     0.05
818(8)         0.1      0.1     0.1      0.1
673(9)         Nd       Nd      Nd       Nd
687(10)        Nd       Nd      Nd       Nd
657(11)        0.25     0.05    0.05     0.05
816(1)         0.5      0.5     0.4Nd：活性未检测。
本发明的化合物已经以基本纯的形式分离(或半合成制备)，即其纯度水平足以允许进行其物理学和生物学鉴定。如上所述，已经发现这些化合物具有特定的抗肿瘤活性，因此它们可用作哺乳动物、特别是人类的药物。因此，本发明的另一方面涉及含有本文鉴定的活性化合物的药用组合物和使用这类药用组合物的治疗方法。
在体外，已经在小鼠白血病P-388、人肺癌A-549、人结肠癌HT-29和人黑素瘤MEL-28的细胞培养物中测定了所述化合物的抗肿瘤活性。采用Bergeron等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，121：848，1984和Schroeder等，J.Med.Chem.，24：1078，1981中描述的方法，进行该步骤。
本发明的活性化合物对哺乳动物肿瘤表现出抗肿瘤活性，所述哺乳动物肿瘤诸如P-388鼠白血病、A-549人肺癌、HT-29人结肠癌和MEL-28人黑素瘤。本发明因此包括对哺乳动物的治疗方法，所述哺乳动物为受对这些化合物敏感的恶性肿瘤影响的任何哺乳动物，该方法包括给予所述受影响个体治疗有效量的活性化合物或化合物的混合物、或其药用组合物。
本发明也涉及药用组合物，所述药用组合物包含作为活性组分的一种或多种本发明的化合物，本发明也涉及制备所述药用组合物的方法。
药用组合物的实例包括具有合适组成的任何固体(片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂等)或液体(溶液、悬浮液或乳液)即用于经口、局部或胃肠外给药的组合物，它们可以含有纯化合物，或与任何载体或其它药理学活性的化合物结合使用。当胃肠外给予时，这些组合物可能需要是无菌的。
包含本发明化合物的药用组合物的准确的剂量，将根据具体制剂、应用方式以及特别是部位、宿主和待治疗的细菌或肿瘤而改变。应该考虑其它因素，如年龄，体重、性别、饮食、给药时间、排泄速率、该宿主的身体状况、药物组合、反应敏感性和该疾病的严重性。可以在最大耐受的剂量范围内，进行连续或定期给药。参考文献
以下参考文献提供涉及本发明的背景信息。(1)Jares-Erijiman，E.A.；Sakai，R；Rinehart，K.L.J.Org.Chem.1991，56，5712-5715.(2)Jares-Erijiman，E.A.；Ingrum，A.L.；Carney，J.R.；Rinehart，K.L.；Sakai，R.J.Org.Chem.1993，58，4805-4808.(3)Taveras，R.；Daloze，D.；Braekman，J.C.；Hajdue，E.Biochem.Syst.Ecol.1994，22，645.(4)Berlinck，R.G.S.；Braekman，J.C.Daloze，D.；Bruno，I.；Riccio，R.；Ferri，S.；Spampinato，S.；Speroni，E.J.Nat.Prod.，1993，56，1007-1015.(5)Kashman，Y.；Hirsch，S.；McConnell，O.J.；Ohtani，I.；Kusumi，T.；Kakisawa，H.J.Am.Chem.Soc.，1989，111，8925-8926.(6)Ohtani，I.；Kusumi，T.；Kakisawa，H.；Kashman，Y.；Hirsch，S.J.Am.Chem.Soc.，1992，114，8472-8479.(7)Ohtani，I.；Kusumi，T.；Kakisawa，H.Tetrahedron Lett.，1992，33，2525-2528.(8)Overman，L.E.；Rabinowitz，M.H.；Renhowe P.A.J.Am.Chem.Soc.，1995，117，2657-2658.(9)Patil，A.D.；Kumar，N.V.；Kokke，W.C.；Bean，M.F.； Freyer，A.J.；Brosse，C.D.；Mai，S.；Truneh，A.；Faulkner，D.J.；Carte，B.；Breen，A.L.；Hertzberg，R.P.；Johnson，R.K.；Westley，J.W.；Potts B.C.M.J.Org.Chem.1995，60，1182-1188.(10)Witten，J.L.；Schaffer，M.H.；O’Shea，M.；Cook，J.C.；Hemling，M.E.；Rinehart，K.L.，Jr.Biochem.Biophys，Res.Commun..1984，124，350-358.
已经详细描述了本发明，包括其优选的实施方案。然而，本领域技术人员会认识到，考虑本说明书时，可以对本发明进行修改和/或改进，这仍在以下权利要求书中提出的本发明的范围和精神内。

Claims (21)

1.基本纯的crambescidin 834。
2.基本纯的crambescidin 818。
3.基本纯的crambescidin 673。
4.基本纯的crambescidin 687。
5.基本纯的crambescidin 657。
6.基本纯的13，14，15isocrambescidin 657。
7.基本纯的甲基crambescidin 657。
8.药用组合物或兽医用组合物，它包含有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 834的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.药用组合物或兽医用组合物，它包含有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 818的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.药用组合物或兽医用组合物，它包含有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 673的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
11.药用组合物或兽医用组合物，它包含有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 687的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
12.药用组合物或兽医用组合物，它包含有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 657的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
13.药用组合物或兽医用组合物，它包含有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为13，14，15isocrambescidin 657的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.药用组合物或兽医用组合物，它包含有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为甲基crambescidin 657的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
15.有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 834的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂用于药物生产的用途，所述药物用于治疗性或预防性治疗患有哺乳动物肿瘤的患者。
16.有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 818的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂用于药物生产的用途，所述药物用于治疗性或预防性治疗患有哺乳动物肿瘤的患者。
17.有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 673的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂用于药物生产的用途，所述药物用于治疗性或预防性治疗患有哺乳动物肿瘤的患者。
18.有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 687的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂用于药物生产的用途，所述药物用于治疗性或预防性治疗患有哺乳动物肿瘤的患者。
19.有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为crambescidin 657的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂用于药物生产的用途，所述药物用于治疗性或预防性治疗患有哺乳动物肿瘤的患者。
20.有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为13，14，15isocrambescidin 657的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂用于药物生产的用途，所述药物用于治疗性或预防性治疗患有哺乳动物肿瘤的患者。
21.有效抗肿瘤量的、基本纯的、本文命名为甲基crambescidin657的化合物和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂用于药物生产的用途，所述药物用于治疗性或预防性治疗患有哺乳动物肿瘤的患者。
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