CN1251529A - 细菌细胞壁提取物在预防,治疗,或排除原生动物或寄生虫疾病上的应用 - Google Patents

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Abstract

预防,治疗或排除动物的原生动物或寄生虫疾病的方法,其中对患有原生动物或寄生虫疾病的动物以足够量的细菌细胞壁提取物给药。细胞壁提取物优选地是分支杆菌细胞壁提取物或棒状杆菌细胞壁提取物。细胞壁提取物最优选的是草分支杆菌细胞壁提取物。

Description

细菌细胞壁提取物在预防，治疗， 或排除原生动物或寄生虫疾病上的应用
相关申请的交叉参考
本申请要求以1997年4月2日递交的美国暂定申请号60/040,908为优先权。
发明领域
本发明涉及微生物学和免疫学领域，更具体地说涉及利用细菌细胞壁提取物作为预防，治疗或排除动物中的原生动物疾病的治疗试剂。
发明背景
动物的原生动物和寄生虫疾病是难于治疗的。已经利用各种药剂治疗各种原生动物和寄生虫疾病，成功的例子有限。在很大程度上，这些药剂的安全性和有效性取决于给药的途径和原生动物或寄生虫疾病的类型和严重性。
巴贝虫病是这样的疾病的一个例子。在热带地区，巴贝虫病是感染家养动物包括，但不限于，马、牛和狗的最流行的疾病。巴贝虫在红细胞中寄生和增倍。受感染动物抵抗这一生物体的固有防御机制包括通过吞噬作用特别是通过巨噬细胞和毒性淋巴细胞裂解感染的红细胞。
感染马的巴贝虫的两个最普通的种类是babesia caballi和马巴贝虫。马巴贝虫是这两个种类的中更有致病性的致病原。几个载体如壁虱，蚊子和一些种类的吸盘蝇将马巴贝虫生物体从马转移到马。巴贝虫病的临床现象包括发烧，不适，厌食，贫血，黄疸和血红蛋白尿。在南美国家，估计全部赛马的50％感染了巴贝虫，导致赛跑性能的下降。
许多药剂已经用于治疗巴贝虫病。所以至今，利用化学治疗剂咪多卡(3，3’-二-2-咪唑啉-2-基对称二苯脲)已经获得了最好的结果。咪多卡在治疗B.caballi时是非常有效的，但在治疗马巴贝虫时只有适度效果，不幸的是，以咪多卡给药引起一些不想要的副作用如过量的分泌唾液，流泪，排便次数增加，呼吸急促和腹痛，导致毒性起源的绞痛。非常重要的是用于治疗巴贝虫病的药物不仅减轻了疾病的症状，而且还能完全去除动物的感染。动物传播巴贝虫尽管没有症状，但载体的遗留，可以将疾病传播给健康动物，所以抑制这种传播是必要的。
血吸虫病是感染动物的原生动物(扁虫)疾病的一个例子，并且是一个巨大比例人群的健康问题。该疾病是感染了血吸虫如曼氏血吸虫，日本血吸虫和尿路血吸虫种类引起的。该疾病的特征是肺炎，不适，发烧，贫血，腹泻和腹痛。大多数感染的个体经过了可能导致死亡的慢性感染的变弱的过程。
已经将许多药剂用于治疗血吸虫病。所以，至今利用药物吡喹酮(2-(环己基碳酰基)-1，2，3，6，7-11b-六氢化-4H-吡嗪并[2，1-a]异喹啉-4-酮])已经获得最好结果。但是，由于这一药物不能预防再感染，所以它不能防止这一疾病的进一步转移和传播。
旋毛虫病是原生动物(线虫)疾病的例子。旋毛虫属成员引起的旋毛虫病感染了100多种脊椎动物，包括人，并且具有世界范围的分布。旋毛虫在感染的动物的大肠中引起严重的炎症反应。这一炎症反应似乎是从非特异免疫应答产生的。这一免疫应答是依赖T细胞(Miller，HRP.1984，兽医免疫学和免疫病理学，6：167)。
已知原生动物和寄生虫疾病的许多其它病例具有各种后遗症，并且在感染的个体中导致虚弱。另外，因为在世界的一些地方，这些疾病是地方性的，导致这些地方社会和经济发展的明显破坏。
所以，需要的是通过各种给药途径，将安全，有效，并且引起的副作用最小或无不利副作用的治疗试剂给动物给药，预防，治疗或排除各种原生动物和寄生虫疾病的方法。
发明概要
正如本文所用，术语“疾病”是指中断或修饰动物或它的成分的性能或功能的活动物或任何它的成分的正常状态的损伤，并且对特异的感染试剂如原生动物和寄生虫的应答。
提供了预防，治疗或排除动物中原生动物或寄生虫疾病的方法。根据该方法，对动物给药足够的预防，治疗或排除疾病量的细菌细胞壁提取物。细菌细胞壁提取物是安全的，具有最小或没有不利的副作用，可以对动物，但不限于哺乳动物，包括人，鸟，鱼，两栖动物和甲壳动物给药，所述动物已经感染了原生动物或寄生虫生物体。
由于免疫应答涉及整个身体并且是调节的，和受许多复合物反应的影响，非特异免疫刺激能够加速和扩增许多免疫应答。不限于酵母，细菌，病毒，植物，生物技术和化学起源的制剂都能够非特异地刺激免疫系统。来自但不限于分支杆菌，棒状杆菌(丙酸杆菌)，诺卡氏菌，红球菌，博得特氏菌，利斯特氏菌，和卡介苗(BCG)的制剂已经用于非特异地刺激免疫活性。分支杆菌，红球菌和诺卡氏菌是优选的细菌。草分支杆菌是最优选的细菌。通过本领域已知的途径包括，但不限于局部，口服，鼻，静脉内，皮下，和肌肉内给药可以给药细菌细胞壁提取物。
当给药动物时，细菌细胞壁提取物的作用是非特异免疫刺激物。即，由于免疫应答涉及整个身体，并且是调节的，并且受许多复合物相互作用的影响，非特异免疫刺激能够加速和扩增许多免疫应答。所以是预防，治疗或排除各种原生动物或寄生生物体引起的疾病的有效治疗试剂，所述原生动物或寄生生物体如但不限于，边虫属，巴贝虫属，肠袋虫属，Besnoitia，衣原体，球虫，似隐孢菌(Cryptospondiun)，cytauxzoon，艾美球虫属，内变形虫属，上红虫属，Erlichia，贾第鞭毛虫属(Giardia)，血巴尔通体属，Hammondia，isopora，利什曼虫，新立克次氏体，疟原虫，肺炎球菌(Pneumocystis)，立克次氏体，血吸虫，肉孢子虫，泰勒氏梨浆虫(Theileria)，旋毛虫，弓浆虫，毛滴虫，锥体虫属，Unicaria，复孔绦虫属，棘球绦虫属，绦虫，钩虫(Ancylostoma)，蛔虫，蛲虫(Enterobius)，类园线虫，园线虫，弓蛔虫，弓蛔线虫和鞭虫属。
简要地说，如下制备了细菌细胞壁提取物。将细菌生长在液体培养基中并且收集。裂解细菌制备细胞壁，然后离心沉降收集裂解的细菌。利用蛋白酶消化将细胞壁部分(来自离心步骤的沉淀)去蛋白质，利用去垢剂处理，洗涤和冻干。这一组分可以吸附到悬浮于适当佐剂/稳定剂的脂类小滴用于对感染动物或接触原生动物疾病的动物给药。本文叙述的细菌细胞壁提取物的给药在治疗血液滋生的原生动物和寄生虫疾病中特别有用。
本文叙述的细菌细胞壁提取物的给药与传统的治疗区别在于它非特异地引起免疫系统活化。这增强了免疫系统的防御能力，从而减轻了各种原生动物和寄生虫疾病。所以，细菌细胞壁提取物在治疗动物的原生动物和寄生虫疾病中是有效的，所述动物没有抗感染生物体的抗体。
因此，本发明的一个目的是提供预防或治疗原生动物或寄生虫疾病的有效的方法。
本发明的另一个目的是提供用于预防原生动物或寄生虫疾病再现的有效方法。
本发明的另一个目的是提供用于预防原生动物或寄生虫疾病的再感染的有效的方法。
本发明的另一个目的是提供用于排除原生动物或寄生虫疾病的有效的方法。
本发明的另一个目的是通过排除动物中的原生动物或寄生虫疾病来降低原生动物或寄生虫疾病的传播的有效的方法。
本发明的另一个目的是提供刺激免疫系统的有效的方法。
本发明的另一个目的是提供在受体中不引起不利的副作用包括过敏反应的方法。
本发明的另一个目的是提供对受体非毒性的方法。
本发明的另一个目的是提供使受体对结核菌素皮肤测试不敏感的方法。
本发明的另一个目的是提供可以成功利用的各种给药途径的方法。
在研究下列公开的实施方案和附加的权利要求的详细说明后，本发明的这些和其它目的，特征和优点将显而易见。
发明的详细说明
本文叙述了预防，治疗或排除动物的原生动物或寄生虫疾病的方法。根据本方法，对感染原生动物或寄生虫的动物以足以预防，减弱或排除感染的量的细菌细胞壁提取物给药。对动物，如但不限于人和其它哺乳动物，鸟，鱼，两栖动物，和甲壳动物以细菌细胞壁提取物给药以便治疗或预防原生动物或寄生虫感染。将细菌细胞壁提取物通过本领域技术人员已知的途径包括但不限于，局部，口服，鼻，静脉内，皮下和肌肉内给药。
原生动物或寄生虫感染的治疗方法对于各种原生动物和寄生生物体如但不限于边虫属，巴贝虫属，肠袋虫属，Besnoitia，衣原体，球虫，似隐孢菌，cytauxzoon，艾美球虫属，内变形虫属，上红虫属，Erlichia，贾第鞭毛虫属，血巴尔通体属，Hammondia，isopora，利什曼虫，新立克次氏体，疟原虫，肺炎球菌，立克次氏体，血吸虫，肉孢子虫，泰勒氏梨浆虫，旋毛虫，弓浆虫，毛滴虫，锥体虫属，Unicaria，复孔绦虫属，棘球绦虫属，绦虫，钩虫，蛔虫，蛲虫，类园线虫，园线虫，弓蛔虫，弓蛔线虫和鞭虫属引起的疾病的预防，治疗或排除是有效的。该方法对于治疗血液滋生的原生动物和寄生虫疾病是特别有用。
本文叙述的方法与常规治疗的区别在于非特异地刺激或导致原生动物或寄生虫感染的动物的免疫系统的活化。这一免疫系统的活化增强了免疫系统的防御能力，从而减轻了各种原生动物和寄生虫疾病。所以，该方法在治疗预先没有接触和没有抗感染生物体的抗体的动物中的原生动物和寄生虫疾病是有效的。
本发明的治疗方法在受体中没有引起阳性结核菌素反应，甚至在重复给药细菌细胞壁提取物时很少引起过敏应答，并且具有最小的或没有不利的副作用。有待理解的是给药细菌细胞壁提取物不是免疫接种过程，而是一般的刺激免疫系统的过程，所以受体自身的免疫系统可以排除原生动物或寄生虫疾病。像这样，本发明的原生动物和寄生虫疾病治疗方法不是理想地适于治疗原生动物和寄生虫疾病的，并且提供了新的方法，该方法中没有利用常规的药剂或免疫接种。
细菌细胞壁都提取物的制备
任何细菌种类都可以用于制备本发明的细菌细胞壁提取物，包括但不限于分支杆菌，棒状杆菌，丙酸杆菌，诺卡氏菌，红球菌，博得特氏菌，利斯特氏菌，和卡介苗(BCG)属。分支杆菌，红球菌和诺卡氏菌是优选的细菌。草分支杆菌是最优选的细菌。引入本文作为参考的美国专利号4,744,984叙述了生产细菌细胞壁提取物的优选的方法。分支杆菌细胞壁提取物可以从Bioniche(London，Ontario)公司买到。
简要地说，如下制备细菌细胞壁提取物。将细菌生长在液体培养基中并且收集。通过裂解细菌然后通过离心沉降收集裂解的细菌制备细胞壁。利用蛋白酶消化利用去垢剂处理，洗涤和冻干将来自离心步骤的沉淀的细胞壁组分去蛋白质。在给药感染动物或接触原生动物或寄生虫感染的动物之前，可以将这一组分吸附到悬浮于适当的佐剂或稳定剂中的脂质小滴。可替代地，使用之前可在佐剂中乳化细菌细胞壁提取物。佐剂可以是本领域技术人员已知的许多佐剂中的任何一种。优选的佐剂是油和水乳剂，可以通过混合油和细菌细胞壁提取物，加入具有去垢剂的含水缓冲液，和通过本领域技术人员已知的几种方法中的任意一种乳化混合物制备。这些方法包括但不限于在高速混合器或Potter-Elvehjem匀浆器中匀浆，超声波处理和微液体化。另外，可以在许多油包括但不限于矿质油(Drakeol 6-VR，Penreco，Butler，PA)，角鲨烷，角鲨烯，和合成矿质油正十六烷乳化细菌细胞壁提取物。本领域技术人员将理解制备乳状液的方法不是关键。油和水相的组合物，它们的比例和乳化方法的许多变化是本领域技术人员显而易见的，并且可以在实施本发明中与细菌细胞壁提取物一起使用。
将约5克和15之间的干燥，去蛋白质的细菌细胞壁加入到干燥，1升大烧杯中可以制备细菌细胞壁提取物的优选的乳状液。在以每克细胞壁约10毫升和50毫升之间的量加入矿质油，角鲨烯、角鲨烷，或正十六烷。覆盖悬浮液，并且混合约30分钟，过夜。将约10毫升细胞壁/油混合物等分试样转移到1升大烧杯中。在每个等分试样中加入500毫升无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)。利用M110-Y型Microfluidics TabletopMicrofluidizerTM在约20,000psi到30,000psi一次流量通过微液体化匀浆约6毫升到7毫升混合物等分试样，转移到无菌瓶中，储藏在4℃。
非强制性地，可以在细菌细胞壁提取物乳状液中加入氢氧化铝稳定剂。从Reheis化学公司(Berkeley Heights，NJ)获得以9.4％压缩凝胶形式的氢氧化铝，通过加入去离子水水合成1.3％氧化铝。在它加入到细菌细胞壁提取物乳状液中之前，在高压灭菌器中120℃灭菌凝胶20分钟。1升最后的乳状液含有约900毫升乳化细菌细胞壁提取物，50毫升1.3％氧化铝和40毫升加入的PBS。硫柳汞钠(乙基汞硫代水杨酸钠，西格玛化学公司，St.Louis，MO)和抗生素包括但不限于庆大霉素和两性霉素B可以作为防腐剂加入细菌细胞壁提取物乳状液中。硫柳汞钠的优选的浓度是约0.1克/每升，庆大霉素是约30微克/毫升，两性霉素B是约2.5微克/毫升。
在本方法中给药的细菌细胞壁提取物的已知活性成分包括胞壁酰二肽和海藻糖二霉菌酸，以及可以存在于细菌的去蛋白质细胞壁主链中的任何未知活性成分。本发明在治疗寄生或原生动物紊乱中是有效的，其中存在身体的免疫成分包括但不限于嗜中性白细胞，淋巴细胞和巨嗜细胞。虽然不愿意结合下面的假说，但认为该方法在预防，治疗和排除原生动物或寄生虫疾病中是有效的，因为感染生物体不断接触身体的免疫系统的细胞。另外，还认为细菌细胞壁提取物对免疫系统的这些细胞起作用以刺激细胞因子的生产增强。
细菌细胞壁提取物配制和给药
利用本领域技术人员已知的配制方法可以提供药物可接受组合物形式的细菌细胞壁提取物。例如在引入本文作为参考的H.C.Ansel等人，药物剂量形式和药物递送系统，第6版(Williams和Wilkins，Philadelphia1995)中可以发现配制方法的例子。也可以利用本领域技术人员已知的其它配方。配方包括但不限于那些适于口服，直肠，尿道，眼的(包括玻璃体内，或形成层内)，鼻内，局部(包括颊和舌下)，阴道或肠胃外(包括皮下，肌肉内，静脉内，真皮内，气管内，和硬膜外)给药的制剂。
配方便于以常规药物技术制备的单位剂量形式存在。这样的技术包括导致活性成分和药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过均一地和密切地导致活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者结合制备成配方，如果需要，使产品成型。
不管用于在对应的免疫细胞中表现它们的载体/媒介物，该方法可以与这些成分的任何一个，所有或任何联合一起使用，其中媒介物包括但不限于载体如脂质体，各种非降解多聚体和等渗微泵。另外，联合成分可掺入可生物降解多聚体，以允许化合物持续释放，在邻近药物递送的地方植入多聚体是需要的。例如在Brem，等人1991，神经外科杂志，74：441-446中叙述了可生物降解的多聚体和它们的用途，该文献引入本文作为参考。
适于口服给药的本方法的配方可以以分立的单位提供，所述单位包括但不限于胶囊，扁囊剂或片剂，各含预定量的活性成分；粉末或颗粒；以水成液或非水溶液形式的溶液或悬浮液；水包油液体乳剂或油包水乳剂和大丸药。
片剂可通过压制或模压非强制性地用一种或几种必需的成分制成。通过用合适的机械压缩可制备压制片剂。可以将自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒非强制性地与粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，表面活性或分散剂混合。通过用适当的机器模压用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物可以制成模制片剂。片剂可以非强制性地被包衣或标记，并且经过配制以提供其活性成分缓慢的或控制释放。
适于在口腔局部给药的本发明的配方包括含有调味组分，通常是蔗糖和金合欢油或黄氏胶的成分的锭剂，含有惰性组分如明胶和甘油，或蔗糖和金合欢油的活性成分的锭剂；和含有以适当的液体载体给药的活性成分的漱口剂。
适于皮肤局部给药的本方法的配方可以如本领域技术人员已知的这样的载体中含有活性成分的乳化剂，软膏，奶液，凝胶，洗液和膏剂形式提供。
用于直肠给药的本方法的配方可以以含有活性成分与适当组分例如可可黄油或水杨酸的栓剂提供。
其中载体是固体的适于鼻内给药的本方法的配方，包括具有粒轻例如在范围20到500微米的粗粉末，它的给药方式是嗅，即通过从靠近鼻的粉末的容器中经鼻通道快速吸入给药。对于给药的其中载体是液体的适当的配方，如鼻用喷雾剂或鼻用滴剂包括活性成分的水溶液或油溶液。
适于阴道给药的本方法的配方可以是阴道药栓，棉塞，奶液，凝胶，膏剂，泡沫或喷雾剂配方形式提供，所述制剂除了活性成分另外含有如本领域已知适当的载体。
适于肠胃外给药的配方包括水溶液和非水溶液无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化剂，缓冲液，制菌剂和使配方与目的受体的血液等渗的溶质，可以包括含水和非含水的无菌悬浮液，其中包括悬浮剂和增稠剂。肠胃外给药的配方可以单位剂量或多个剂量容器存在，例如在封口的安瓿和小瓶中，并且可以储藏在只需要在使用之前加入无菌液体载体，例如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下。即时注射的溶液和悬浮液可以从无菌粉末，颗粒和前面叙述的种类的片剂制备。
待给药的细菌细胞壁提取物的最适剂量根据待处理的动物的大小和给药的方法而变化。只需要足以刺激免疫系统的量。单个剂量是约0.01到10毫克细菌细胞壁提取物/毫升，更优选地从约0.05到6毫克细菌细胞壁提取物/毫升和最优选地是约0.1到4.0毫克细菌细胞壁提取物/毫升。细菌细胞壁提取物以总体积约0.01到10毫升，更优选地从约0.05到7.5毫升，最优选地是从约0.1到5.0毫升的量给药。
本方法的细菌细胞壁提取物可以对同样的受体给药一次或多次。通过本领域的技术人员可以容易地确定剂量和剂量供应方式。优选的剂量配方是那些含有一个剂量或单位，亚剂量或亚单位的那些，或在不限于本文公开的配方中的细菌细胞壁提取物的其它部分。另外，应该理解除了本文特别提到的成分，本方法可以包括涉及待利用的配方类型的本领域的常规其它试剂。
下面的实施例用于进一步解释本发明而同时不构成任何限制。
                        实施例1
                制备草分支杆菌细胞壁提取物
正如实施例1中概括的草分支杆菌细胞壁提取物的制备是从其它细菌种类制备细胞壁提取物的代表。
从实验生物学和医学研究院，Borstel，西德获得草分支杆菌，并且以悬浮液形式储藏在-60℃的无菌牛奶中。在1976和1985之间约11次转移分离物而没有任何修饰细胞壁的生物活性的减小。在Petragnani培养基上培养草分支杆菌(Difco实验室，Detroit，MI)。
利用XL 2015型热系统超声波处理器(前面称为Branson超声波处理器)制备草分支杆菌细胞壁。约将400克潮湿细胞团放置于容量约为1200毫升的清洁混合器中。在30到60秒的时间内高速混合细胞团。在混合后，在细胞混合物中加入6毫升吐温80和200到400毫升之间的无菌水。然后在混合器中以低速将全部细胞悬浮液混合约10秒。
利用热系统超声波处理器和3/4角制杯(tapped horn)超声波细胞裂解完成细胞裂解。将其中细胞含有约50％到70％体积的500毫升细胞悬浮液放置于1升大烧杯中，在设定8上超声波处理约5分钟。将超声波处理物在分级分离过程中储藏在冰上的无菌烧瓶中。
将超声波处理物转移到250毫升离心瓶中，在具有GSA离心管的中速离心机中，在15℃，以27,500×g离心1小时。滗去和丢弃来自离心的上清液液体。丢弃最下的，未破碎的细胞的白色沉淀。将沉降的粗细胞壁部分转移到混合器中，并且通过在低速混合悬浮于无菌，去离子水中。通过再悬浮和在15℃在27,500×g离心1小时洗涤粗制细胞提取物组分。再次，丢弃最下的未破碎的细胞的白色沉淀。
在洗涤粗细胞壁组分后，在无菌，去离子水中再悬浮沉淀，并且在350×g离心5分钟沉降未破碎的细胞，而在上清液液体中保留细胞壁。滗去上清液液体，并且在15℃在27,500×g离心1小时沉降粗细胞壁部分。
利用蛋白酶消化将粗细胞壁组分分去蛋白。将起源于约400克完全细胞的粗细胞壁组分通过在低速混合再悬浮于1升0.05摩尔/升的Tris-HCl，pH7.5。在粗细胞壁组分完全再悬浮于Tris缓冲液后，加入50毫克胰蛋白酶(胰腺蛋白酶，西格玛化学公司，St.Louis，MO)，利用磁性搅拌棒在35℃搅拌悬浮液6小时。在胰蛋白酶处理后，在每升胰蛋白酶处理的细胞壁悬浮液中加入50毫克链霉蛋白酶(灰色链霉菌蛋白酶，西格玛化学公司，St.Louis，MO)。利用磁性搅拌棒在35℃搅拌悬浮液12到18小时。
利用去垢剂和苯酚处理蛋白酶消化的细胞壁组分。在每升细胞壁悬浮液中，加入60克(J.T.Baker化学公司，Phillipsburg，NJ)，2.0毫升100％Triton X-100(聚氧化乙烯醚，西格玛化学公司，St.Louis，MO)，和100克苯酚结晶(Fisher科学公司，Fair Lawn，NJ)。利用铝箔松弛覆盖含有悬浮液的烧瓶，加热到60-80℃，搅拌1小时。在16,000×g在GSA离心管中离心去蛋白质细胞壁部分10分钟。滗去和丢弃上清液部分，利用可任意处置的吸管移出沉淀下面的暗色液体。通过在约1升无菌水中再悬浮将细胞壁沉淀洗涤3次，并且在GSA离心管中在16,000×g离心10分钟。
转移悬浮液到具有小量去离子无菌水冻干烧瓶冻干经洗涤，修饰的分支杆菌细胞壁提取物(MCWE)或细胞壁沉淀。每30克湿细胞壁起始物质利用一个300毫升的冻干烧瓶。在已经利用固体二氧化碳冷冻的乙醇中旋转烧瓶冷冻使细胞壁悬浮液剥落。在冷冻烧瓶的内容物后，将烧瓶连接到冻干仪器(Virtis公司，Gardiner，NY)和冻干。在冻干后，将样品转移到无菌，有螺旋帽的容器中，在含有无水硫酸钙的干燥瓶中在-20℃储藏。
                       实施例2
                细菌细胞壁提取物的乳化
分四个步骤制备分支杆菌细胞壁提取物(MCWE)的乳化剂：(1)将干燥，去蛋白质的分支杆菌细胞壁提取物和角鲨烷加入到乳化容器中，(2)
在油中悬浮细胞壁提取物，(3)在细胞壁提取物和油的混合物中加入含有去垢剂的缓冲盐溶液，和(4)将油细胞壁提取物混合物乳化成为含水去垢剂盐溶液。
利用M-110Y型Microfluidics tabletop microfluidizer以10,700-23,000psi一次流量通过微液体化完成乳化。典型的体积流动是每次流动6到7升。在干燥，无菌，1升大烧杯中加入几克冻干MCWE(如上述实施例1中所述制备)。以每克MCWE20毫升的浓度加入角鲨烷，覆盖混合物，并且允许停留过夜。油和水悬浮液中油的最适浓度在约1％和7％之间。将10毫升油MCWE混合物的等分试样转移到无菌的1升大烧杯中。在每10毫升等分试样的油MCWE中加入500毫升无菌，磷酸盐缓冲盐水(0.05摩尔/升磷酸钠，pH7.2，9克NaCl，和2毫升吐温80/每升去离子水)。通过微液体化匀浆混合物和转移到无菌，带帽的瓶中储藏在4℃。在光学显微镜的盖玻片下检测乳状液样品以便证实油滴是小的，并且颗粒的外观因边界暗不清楚。出现小滴的颗粒表明细胞壁正确吸附到油载体。
在无菌混合容器中合并瓶装水包油乳状液中的细胞壁制剂，并且肌肉内使用，在每升细胞壁乳状液中加入50毫升的1.3％氧化铝，50毫升磷酸盐缓冲盐水，30微克/毫升庆大霉素和2.5微克/毫升两性霉素B作为防腐剂。利用Filamatic Vial Filler(国家仪器公司，Baltimore，MD)无菌空气层流条件下将1.5毫升到10毫升稳定乳状液充满无菌1型玻璃小瓶和塑料针筒。小瓶和针筒盖上帽子，封口和储藏在4℃。
                       实施例3
                利用MCWE治疗马巴贝虫
马的治疗
在本研究中，利用了在补充固定测试中马巴贝虫阳性的5匹母马。在72小时的间隔肌肉内给予一匹母马四个剂量的4毫克/公斤咪多卡。约14天间隔肌肉内注射给予四匹母马两个剂量的1500克MCWE(如上面实施例2中所述制备)。在给药MCWE后24小时的期间每6小时监测一次每个动物的体温。体温增加从不超过1.0℃到1.2℃，并且在18到24小时内是正常的。
                      母马1-咪多卡
在利用咪多卡治疗之前，在1/20稀释度时母马1具有马巴贝虫抗体效价++++。在利用咪多卡治疗后6个月，母马1再次测试对马巴贝虫呈阳性。
                      母马2-MCWE
母马2在利用MCWE治疗之前，在1/5稀释度时马巴贝虫抗体效价是+。在利用MCWE治疗后6个月，测试的母马2对马巴贝虫呈阴性。
                      母马3-MCWE
在利用MCWE处理之前，在1/20稀释度时母马3具有马巴贝虫抗体效价为++++。在利用MCWE治疗5个月后，测试的母马3对马巴贝虫呈阴性。
                      母马4-MCWE
在利用MCWE治疗之前，在1/5的稀释度时母马4具有的马巴贝虫抗体效价为+++。在利用MCWE治疗后3个月，测试的母马4对马巴贝虫呈阴性。
                      母马5-MCWE
在利用MCWE治疗之前，在1/40稀释度时母马5具有的马巴贝虫抗体效价为++++。在利用MCWE治疗后3个月，测试的母马5对马巴贝虫呈阴性。
                      牛的治疗
在这一研究中利用20头马巴贝虫呈阳性的母牛。在Medellin，哥伦比亚畜牧学校利用肌肉内MCWE(按实施例2叙述制备)治疗动物。在MCWE治疗后，测试动物对马巴贝虫呈阴性。
这些数据显示MCWE是治疗马巴贝虫，和从动物中排除马巴贝虫有效的治疗试剂。
                       实施例4
                  利用MCWE治疗锥虫病
在这一研究中利用感染了锥虫病的30头马。将马分成三组，并且利用醋尿酸重氮氨苯脒(diminazine)MCWE(按实施例2中所述制备)或MCWE(按实施例2中所述制备)加醋尿酸重氮氨苯脒肌肉内治疗马。单独MCWE和MCWE加醋尿酸重氮氨苯脒在排除马中的锥体虫时是同样有效的。单独醋尿酸重氮氨苯脒与MCWE或MCWE加醋尿酸重氮氨苯脒相比在排除马中的锥体虫的效果低些。
这些数据显示MCWE是治疗锥虫病和排除动物中的锥虫的有效治疗试剂。
                   实施例5
          利用MCWE治疗里氏埃里希氏体
在这一研究中，利用单个剂量的MCWE治疗感染了里氏埃里希氏体的马。在治疗的4天内，动物从里氏埃里希氏体感染中恢复。利用常规的药剂，恢复时间通常为2到3星期。
这些数据显示MCWE是治疗锥虫里氏埃里希氏体的有效的治疗试剂。
                   实施例6
       用MCWE治疗曼氏血吸虫(S.mansoni)病
在这一研究中利用了6星期大的C57BL/5小鼠(CharlesRiver，Quebec)。将小鼠分成4组，并且如表1所示治疗。
                           表1
                          治疗组
组 星期
0 2 4 6 8 10 12 16 18
I接触后A 0微克MCWEB 20微克MCWEC 100微克MCWE CCC OMM TOTMTM
II接触后A 0微克MCWEB 20微克MCWEC 100微克MCWE C/MC/MC/M OMM TOTMTM
III接触前A 0微克MCWEB 20微克MCWEC 100微克MCWE OMM OMM CCC TTT
IV接触前接触后A 0微克MCWEB 20微克MCWEC 100微克MCWE OMM OMM CCC OMM OMM OMM TTT
C＝曼氏血吸虫尾蚴，从Biomphalaria glabrata螺(Lowell大学，Lowell，MA)收集，浓缩和计数。在小鼠的腹腔皮下注射溶于0.1毫升盐水中的200曼氏血吸虫尾蚴等分试样。M＝MCWE，在角鲨烷和水中乳化(如上面实施例2中所述制备)，以剂量0微克，20微克，或100微克腹膜内注射到小鼠。T＝终止。通过颈错位杀死小鼠，从每个小鼠回收虫，确定它们的数目和性别。
表2显示了在感染的小鼠中MCWE对虫负载量的影响。
                          表2
            MCWE对曼氏血吸虫虫负载量的影响
组 虫回收和减少a
A B C
MCWE 0微克 20微克 100微克
组I 25.67(±4.71，18) 30.88  0％(±3.70，17) 28.33  0％(±3.20，15)
组II 48.73(±5.08，15) 25.60  47.5％*(±2.51，15) 42.47  13.3％(±3.20，15)
组III 24.53(±2.62，15) 17.29  29.5％*(±1.56，17) 19.94  18.7％*(±1.92，16)
组IV 19,45(±3.60，11) 18.08  7％(±2.34，13) 10.06  48.3％*(±1.48，17)
*如学生t-测试确定的显著性
在圆括号中表明了每个组的小鼠的数目和标准误差。如[对照虫-实验虫]/对照虫×100％计算a虫的减少。*如学生t-测试确定的显著性。
在组1(接触后)，对照(A)小鼠的虫负载量，20微克MCWE(B)处理小鼠和100微克MCWE处理(C)的小鼠没有明显不同。在组2(接触后)，在20微克MCWE处理(B)小鼠虫负载量中有明显减少，但在100微克MCWE处理(C)小鼠时不明显。在组3(接触前)，在20微克MCWE处理(B)小鼠和100微克MCWE处理(C)小鼠中虫负载量明显减少。在组4(接触前和接触后)，在100微克MCWE处理(C)小鼠虫负载量有明显减少，但在20微克MCWE处理小鼠中不明显。
这些数据证明在利用血吸虫属曼氏血吸虫感染之前和之后，给药MCWE明显减少虫负载量。
在尾蚴攻击之后，确定组IV(接触前和接触后)的小鼠的生存率。在16星期感染后，组IV-A小鼠(PBS)的生存率是55％，组IV-B小鼠(20微克MCWE)是80％，和组IV-C小鼠(100微克MCWE)是85％。这些数据证明MCWE对曼氏血吸虫感染的小鼠的生存率具有明显的效果，并且这个效果是依赖剂量的。
这些数据显示了MCWE是治疗血吸虫属曼氏血吸虫的有效治疗试剂。
                     实施例7
   利用MCWE预防旋毛虫(Trichinella spiralis)感染
在这一研究中，将28个重20-25克的无寄生虫的近亲交配NIH雌性小鼠分成四组。组FCA腹膜内接受溶于0.1毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.2中的0.1毫升弗氏完全佐剂(西格玛化学公司，St.Louis，MO)。组Con A腹膜内接受20微克Conconavalin A(西格玛化学公司，St.Louis，MO)。组MCWE腹膜内接受100微克MCWE(实施例II)。对照组腹膜内接受0.1毫升PBS。7天后，利用300个感染性的旋毛虫幼虫口服感染每个动物。42天后，杀死动物，并且确定了每克肌肉组织中幼虫的数目。利用ANOVA进行统计分析。
表3显示了在组FCA，组ConA，组MCWE和对照组在利用旋毛虫感染后42天每克肌肉组织中幼虫的数目。
                           表3
                     每克肌肉幼虫数目
组 范围 幼虫平均数目±SD 相对于对照减少％ P值
FCA 42-79 59.8±13.1 15.5 ＞0.05
ConA 8-28 17±8.5 76 ＜0.001
MCWE 0-16 3.3±6.2 95.3 ＜0.001
对照(PBS) 54-86 71±11.5 ---- -------
这些数据显示对比对照小鼠组，组ConA和组MCWE小鼠组中每克肌肉组织中幼虫明显减少。在对照组和FCA小鼠组之间每克肌肉组织幼虫没有明显减少。
这些数据显示MCWE是预防旋毛虫感染的有效的治疗试剂。
                        实施例8
             制备马红球菌细胞壁提取物(RCWE)
如实施例1制备以前命名为马棒状杆菌的棒状杆菌生物体马红球菌细胞壁提取物。
                        实施例9
        马红球菌细胞壁提取物(RCWE)的免疫刺激特性
利用溶于正常盐水乳状液中的0.5毫升2％油中的200微克RCWE腹膜内注射32个CD1远交小鼠(RCWE小鼠)。利用0.5毫升正常盐水(盐水对照小鼠)腹膜内注射16个CD1远交小鼠并且8个CD1小鼠维持为环境对照(环境对照小鼠)。在72小时后，利用出血败血性巴斯德氏菌的5×LD50攻击16 RCWE小鼠和8个盐水对照小鼠并且利用脑心肌炎(EMC)病毒的20×LD50攻击16 RCW小鼠和8个盐水对照小鼠。在攻击后14天，10/32 RCWE小鼠，0/16盐水对照小鼠和8/8环境对照小鼠存活。
这些数据证明RCWE是非特异免疫刺激剂。
                        实施例10
               RCWE和MCWE刺激氧化氮的产生
在24孔组织平板中平板培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞。当细胞形成融合的单层，从孔中除去培养基，利用含有5-80微克RCW或5-80微克MCW的新鲜培养基1ml取代。在含有5％CO2的大气中37℃温育24小时后，利用Griess的比色反应确定氧化氮(NO)的产生(Griess，P.Demerkungen zu der Abhandlung der HH.Wesdlsky und Benedikt.UEBER EINIGE AZOVERDINDUNGEN.Chem.Ber.12：426-428，1987)。
                           表4
      平均氧化氮(NO)的生产率(nMol/106细胞/24小时)
样品 5微克 10微克 20微克 40微克 80微克
RCWE1 0.0336 0.0986 0.1926 0.2540 0.2773
MCWE2 0.1650 0.2124 0.2600 0.2910 0.3107
1针对RCWE的所有样品的平均值2针对MCWE的所有样品的平均值
表4中的数据证明非特异免疫刺激剂RCWE在促进由RAW 264.7细胞产生NO时与MCWE非特异刺激剂具有同样的非特异免疫刺激特性。
疮疱丙酸杆菌的细菌细胞制剂(Eqstim，Immunomed，Florida)，卡介苗(BCG)，百日咳博得特氏菌和其它博得特氏菌种类以及麻疹病毒产物RVI(Eudaemonic，Omaha，NE)已经用作非特异免疫刺激剂，并且具有与非特异免疫刺激剂RCWE和MCWE相似的非特异免疫刺激特性。
利用非特异免疫刺激剂MCWE获得的结果可作为利用其它非特异免疫刺激剂获得的结果的代表。
当然，应该理解的是前面的内容只涉及本发明的优选实施方案，正如附加的权利要求中所述，不脱离本发明的精神和范围，可以制备许多改进或更替方案。

Claims (21)

1.预防动物中原生动物或寄生虫疾病的方法，包括对动物以有效地防止动物中原生动物或寄生虫疾病的非特异免疫刺激剂的量给药。
2.根据权利要求1所述的方法，其中非特异性免疫刺激剂是细菌细胞壁提取物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中细菌细胞壁提取物选自包括分支杆菌细胞壁提取物和棒状杆菌细胞壁提取物的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中分支杆菌细胞壁提取物是草分支杆菌细胞壁提取物。
5.根据权利要求3所述的方法，其中棒状杆菌细胞壁提取物是马红球菌细胞壁提取物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中疾病是选自包括边虫属，巴贝虫属，肠袋虫属，Besnoitia，衣原体，球虫，似隐孢菌(Cryptospondium)，cytauxzoon，艾美球虫属，内变形虫属，上红虫属，Erlichia，贾第鞭毛虫属(Giardia)，血巴尔通体属，Hammondia，isopora，利什曼虫，新立克次氏体，肺炎球菌(Pneumocystis)，疟原虫，立克次氏体，血吸虫，肉孢子虫，泰勒氏梨浆虫(Theileria)，旋毛虫，弓浆虫，毛滴虫，锥体虫属，Unicaria，复孔绦虫属，棘球绦虫属，绦虫，钩虫(Ancylostoma)，蛔虫，蛲虫(Enterobius)，类园线虫，园线虫，弓蛔虫，弓蛔线虫和鞭虫属的组中的生物体引起的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中疾病由生物体旋毛虫感染引起。
8.治疗动物中的原生动物或寄生虫疾病的方法，包括对动物以治疗动物中原生动物疾病有效的非特异免疫刺激剂的量给药。
9.根据权利要求8所述的方法，其中非特异免疫刺激剂是细菌细胞壁提取物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中细菌细胞壁提取物选自包括分支杆菌细胞壁提取物和棒状杆菌细胞壁提取物的组。
11.根据权利要求10所述的方法，其中分支杆菌细胞壁提取物是草分支杆菌细胞壁提取物。
12.根据权利要求10所述的方法，其中棒状杆菌细胞壁提取物是马红球菌细胞壁提取物。
13.根据权利要求8所述的方法，其中疾病是由选自包括边虫属，巴贝虫属，肠袋虫属，Besnoitia，衣原体，球虫，似隐孢菌，cytauxzoon，艾美球虫属，内变形虫属，上红虫属，Erlichia，贾第鞭毛虫属，血巴尔通体属，Hammondia，isopora，利什曼虫，新立克次氏体，肺炎球菌，疟原虫，立克次氏体，血吸虫，肉孢子虫，泰勒氏梨浆虫，旋毛虫，弓浆虫，毛滴虫，锥体虫属，Unicaria，复孔绦虫属，棘球绦虫属，绦虫，钩虫，蛔虫，蛲虫，类园线虫，园线虫，弓蛔虫，弓蛔线虫和鞭虫属的组中的生物体引起的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中疾病是选自包括巴贝虫属，锥体虫属，立克次氏体，和血吸虫的组的生物体引起的。
15.排除患有原生动物或寄生虫疾病的动物的原生动物或寄生虫疾病的方法，包括对患有原生动物或寄生虫疾病的动物以有效排除动物中的原生动物或寄生虫疾病的非特异免疫刺激剂的量给药。
16.根据权利要求15所述的方法，其中非特异免疫刺激剂是细菌细胞壁提取物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中细菌细胞壁提取物是选自包括分支杆菌细胞壁提取物和棒状杆菌细胞壁提取物的组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中分支杆菌细胞壁提取物是草分支杆菌细胞壁提取物。
19.根据权利要求17所述的方法，其中棒状杆菌细胞壁提取物是马红球菌细胞壁提取物。
20.根据权利要求16所述的方法，其中疾病是利用选自包括边虫属，巴贝虫属，肠袋虫属，Besnoitia，衣原体，球虫，似隐孢菌，cytauxzoon，艾美球虫属，内变形虫属，上红虫属，Erlichia，贾第鞭毛虫属，血巴尔通体属，Hammondia，isopora，利什曼虫，新立克次氏体，肺炎球菌，疟原虫，立克次氏体，血吸虫，肉孢子虫，泰勒氏梨浆虫，旋毛虫，弓浆虫，毛滴虫，锥体虫属，Unicaria，复孔绦虫属，棘球绦虫属，绦虫，钩虫，蛔虫，蛲虫，类园线虫，园线虫，弓蛔虫，弓蛔线虫和鞭虫属的组中的生物体引起的。
21.根据权利要求20的方法，其中疾病是生物体旋毛虫引起的。
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