CN121249559B - 一种利用小分子水介导的椰枣体细胞悬浮体系构建的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于棕榈科植物繁殖技术领域，具体涉及一种利用小分子水介导的椰枣体细胞悬浮体系构建的方法。本发明使用培养基C、培养基M1、培养基M2、培养基SC、培养基SE、培养基P1、培养基P2和培养基T构建培养体系，在制备培养基的过程中以小分子水为溶剂，为外植体提供“高效的运输系统”，更为细胞悬浮培养提供了一个高度可控、优化且响应迅速的生长环境，极大程度上促进了椰枣体细胞胚发育的同步化。采用本发明提供的技术方案能够确保椰枣第八代胚性愈伤组织的诱导率达30%以上，第八代体胚发生率达40%以上，有利于激发细胞活力，因此使用整套方案后，不仅能够确保椰枣诱导率高，还有利于椰枣体细胞胚发育的同步化，科研价值明显。

Description

一种利用小分子水介导的椰枣体细胞悬浮体系构建的方法

技术领域

本发明属于棕榈科植物繁殖技术领域，具体涉及一种利用小分子水介导的椰枣体细胞悬浮体系构建的方法。

背景技术

椰枣树（Phoenix dactylifera）属于棕榈科刺葵属，果实为椰枣。椰枣树原产于北非的沙漠绿洲或是亚洲西南部的波斯湾周围地区，在阿拉伯国家随处可见，椰枣树和椰枣在阿拉伯人民日常生活中扮演了极为重要的角色，其不仅营养价值极高，同时果实还具有耐高温、耐干旱、耐盐碱的特性，可以生长在极端恶劣的环境中。因此，椰枣具有极高生态修复和经济价值。

然而，椰枣树是多年生热带棕榈植物，其不仅生活周期长，且由于雌雄异株、异花授粉，种子繁殖性别分化差异大，性状分离严重，因而生产应用中难以保持优良亲本的农艺性状；加之椰枣作为同纬度地区外来引进资源，国内母本资源缺乏，繁殖体系亟需构建，其超长的育种周期（30-40年）及严重受限的种苗繁育速度一直是椰枣品种更新及中国椰枣产业发展的主要制约因素。虽然组织培养是解决椰枣种苗繁育的有效途径，但椰枣传统固体培养方式细胞增殖效率低，多次继代后，细胞活力降低。例如，以固体培养基进行胚性愈伤诱导时，初代胚性愈伤组织的诱导率为50%-70%，第二代的胚性愈伤诱导率为42%-52%，而第四代胚性愈伤组织的诱导率却已经在20%以下，失去科研和生产价值。又如，以固体培养基进行胚性愈伤组织体胚诱导时，初代胚性愈伤组织体胚发生率为80%-93.3%，第二代胚性愈伤组织体胚发生率达60%-66.7%，而第四代开始胚性愈伤组织体胚发生率在30%以下，失去科研和生产价值。因此，开展椰枣胚性细胞悬浮体系研究显得尤为紧迫。

植物细胞悬浮培养技术是20世纪80年代之后发展起来重要的细胞离体培养技术。由于其分散性好，细胞或细胞团大小均匀，生长迅速，细胞状态可以相对保持一致，易于调控等，被广泛用于遗传学、生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及分子生物学等多个领域的研究。悬浮细胞体系 (suspension cell culture) 具有增殖快、去壁容易、次生代谢物易于收集、突变筛选彻底等优点，是机制研究较理想的离体材料。细胞悬浮培养不仅可以直接用于原生质体分离和培养、细胞杂交、基因转移、次生代谢产物的生产等，还可以在细胞水平筛选突变体，因此，细胞悬浮培养已成为生物技术研究开发的新热点，并被广泛应用于植物新品种的培育。而如何提供一种椰枣体细胞悬浮体系构建的方法，且经继代增殖后其仍有高的分生能力是本领域亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用小分子水介导的椰枣体细胞悬浮体系构建的方法，其第八代胚性愈伤组织的诱导率达30%以上，第八代体胚发生率达40%以上。

本发明提供了一种利用小分子水介导的椰枣体细胞悬浮体系构建的方法，包括如下步骤：

（1）制备培养基

培养基C以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖25-30g/L、肌醇90-100mg/L、6-苄氨基腺嘌呤5-8mg/L、异戊烯基腺嘌呤3-5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸100-150mg/L、活性炭0.5-1g/L、Na₂HPO₄·2H₂O 160-170mg/L和全量MS盐；

培养基M1以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖25-30g/L、6-苄氨基腺嘌呤3-5mg/L、异戊烯基腺嘌呤2-4mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸5-6mg/L、活性炭0.5-1g/L和全量MS盐；

培养基M2以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖25-30g/L、6-苄氨基腺嘌呤3-5mg/L、异戊烯基腺嘌呤2-4mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸2-3.5mg/L、活性炭0.5-1g/L和全量MS盐；

培养基SC以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖25-30g/L、肌醇90-100mg/L、盐酸硫氨素0.2-0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤5-8mg/L、萘乙酸8-10mg/L、活性炭0.5-1g/L和全量MS盐；

培养基SE以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖25-30g/L、盐酸硫氨素0.2-0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤2-4mg/L、萘乙酸0.5-2.5mg/L、活性炭0.5-1g/L和全量MS盐；

培养基P1以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖40-50g/L、肌醇90-100mg/L、盐酸硫氨素0.2-0.4mg/L、萘乙酸0.5-1.5mg/L、活性炭0.5-1g/L、KH₂PO₄·2H₂O 160-170mg/L和1/2MS盐；

培养基P2以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖40-50g/L、肌醇90-100mg/L、盐酸硫氨素0.2-0.4mg/L、赤霉素0.5-0.8mg/L、萘乙酸0.8-1.5mg/L、活性炭0.5-1g/L、KH₂PO₄·2H₂O 160-170mg/L和1/2MS盐；

培养基T以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖30-40g/L、萘乙酸0.08-0.12mg/L、活性炭0.5-1g/L、KH₂PO₄·2H₂O 160-170mg/L和1/2MS盐；

所述小分子水为核磁共振高宽幅≤50HZ的小分子水；

（2）以步骤（1）所述培养基构建椰枣体细胞悬浮体系

将茎尖生长组织进行脱毒处理后，依次接种于培养基C中进行诱导培养、培养基M1中进行第一次增殖培养、培养基M2中进行第二次增殖诱导培养、培养基SC中进行第一次悬浮培养、培养基SE中进行第二次悬浮培养、培养基P1中进行第一次萌发培养、培养基P2中进行第二次萌发培养、培养基T中进行生根培养，得到组培苗。

优选的，第一次悬浮培养时，所述胚性愈伤组织与培养基SC的质量体积比为1000-2000mg：60mL；

所述第一次悬浮培养的条件为：于100-120r/min、26-28℃黑暗下进行悬浮培养，每7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，并补充等量的新鲜培养液SC继续悬浮培养，连续培养21-28天，得到悬浮胚性愈伤细胞。

优选的，第二次悬浮培养时，所述悬浮胚性愈伤细胞与培养基SE的质量体积比为1000-2000mg：60mL；

所述第二次悬浮培养的条件为：于100-120r/min、26-28℃黑暗下进行悬浮培养，每7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，并补充等量的新鲜培养液SE继续悬浮培养，连续培养35-42天，得到体细胞胚胎。

优选的，所述第一次萌发培养的条件为：于27℃-30℃下，避光暗室培养60-90d，每30-45d更换新鲜培养基。

优选的，所述第二次萌发培养的条件为：于27℃-30℃下，每天于光合有效辐射强度35-45μmol/m²/s下光照16h，暗室培养8h，每30-45d更换新鲜培养基，培养总时间为90-120d。

优选的，生根培养时，完整芽体的长度为8-10cm；

所述生根培养的条件为：每天先在27-30℃下，光合有效辐射强度为35-45μmol/m²/s下光照16h，再于20-22℃下暗室培养8h；每30-45d更换新鲜培养基。

优选的，所述诱导培养的条件为：于27℃-30℃下，避光暗室培养120-140d；

所述第一次增殖培养的条件为：于27℃-30℃下，避光暗室培养42-56d；

所述第二次增殖诱导培养的条件为：于27℃-30℃下，避光暗室培养63-72d。

优选的，所述小分子水的制备方法为：

将去离子水依次进行低频磁场处理和超声处理，得到核磁共振高宽幅≤50HZ的小分子水。

优选的，所述低频磁场处理的条件为：频率为40-50Hz，磁场强度为1500-2000高斯，时间为30-40min；

所述超声处理的条件为：功率为600-800W，时间为40-50min。

优选的，所述脱毒处理的过程为：

将茎尖生长组织避光浸泡于抗褐化剂后，环剥掉1/2幼叶，后置于体积浓度为75%的酒精中浸泡、清洗，再以质量浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡、清洗，去除茎尖生长组织剩余的幼叶，得到预处理后的外植体；

所述抗褐化剂以小分子水为溶剂，由以下组分组成：95-105mg/L抗坏血酸和145-155mg/L柠檬酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

（1）本发明以小分子水为溶剂，具备“高效的运输系统”提升渗透与吸收效率：即小分子水团簇更小，表面张力更低，可能更容易穿透细胞壁和细胞膜上的微孔道，从而作为“更高效的载体”，将溶解在其中的营养物质和激素更快地运送到细胞内部。增强溶解性：可能使一些难以溶解的成分更好地分散，减少沉淀，确保成分均一。降低环境胁迫：更易进入细胞，可能有助于维持细胞的膨压，减少细胞在吸收水分时的能量消耗。小分子水渗透性强，溶解度高，不仅可以在细胞悬浮培养过程中提供一个高度可控、优化且响应迅速的生长环境，它模拟并优化了植物体内为细胞提供营养和信号的内环境；

（2）本发明提供特异性培养基组合（即培养基C、培养基M1、培养基M2、培养基SC、培养基SE、培养基P1、培养基P2和培养基T）进行培养，为外植体提供了一个均一、高效、低胁迫的动态环境。前期以固体培养基提供一个存在梯度、低效、高胁迫的静态环境，有利于外植体快速增殖细胞、诱导胚状体或生产次生代谢产物；中期以液体培养基进行液体悬浮培养，以实现体细胞胚发育的同步化，通过限制体细胞胚胎的发育来优化无性系生产，从而实现人工种子的研发。

因此，本发明的技术方案为细胞培养提供了一个营养极其均衡的“自助餐厅”，所有大量和微量元素都以易吸收的形式存在，满足细胞构建自身的一切原料需求（具体包括：一个信号清晰明确的“指挥中心”：植物激素像精确的指令，引导细胞进行分裂、分化、发育等复杂的生命活动；一个代谢高效顺畅的“反应环境”：优化的溶剂可促进物质交换，微量元素可确保酶促反应的高效进行，使细胞的能量代谢和物质合成顺利进行；一个高度可塑的发育平台：通过改变配方，这个环境可以诱导一个普通的体细胞逆转为未分化的愈伤组织，也可以命令它发育成一棵完整的植株，这在组织培养和人工种子技术中是不可或缺的），为椰枣体细胞悬浮体系构建提供精准的“人工胞外微环境”。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的愈伤组织进行第一次悬浮培养示意图；

图2为本发明提供的愈伤细胞的细胞切片图；

图3为本发明提供的悬浮胚性愈伤细胞进行第二次悬浮培养示意图；

图4为本发明提供的悬浮胚性愈伤细胞的细胞切片图；

图5为本发明提供的体胚诱导过程中悬浮培养示意图；

图6为本发明提供的悬浮培养获得的体细胞胚胎；

图7为本发明提供的体细胞胚胎的细胞切片图。

具体实施方式

在本发明中，如无特殊说明，所用到的试剂、原料和方法均为常规选择。

本发明所述全量MS盐即每升培养基中添加的MS盐总质量为4.43g，全量MS盐的标准配方为硝酸钾（KNO₃）1900mg/L、硝酸铵（NH₄NO₃）1650mg/L、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）170mg/L、硫酸镁（MgSO₄ 7H₂O）370mg/L、氯化钙（CaCl₂ 2H₂O）440mg/L、碘化钾（KI）0.83mg/L、硼酸（H₃BO₃）6.2mg/L、硫酸镁（MnSO₄ 4H₂O）22.3mg/L、硫酸锌（ZnSO₄ 7H₂O）8.6mg/L、钼酸钠（Na₂MoO₄ 2H₂O）0.25mg/L、硫酸铜（CuSO₄ 5H₂O）0.025mg/L、氯化钴（CoCl₂ 6H₂O）0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠（Na₂-EDTA）37.3mg/L、硫酸亚铁（FeSO₄ 7H₂O）27.8mg/L。

本发明所述小分子水的制备方法均为：于40Hz、1500高斯条件下，将去离子水低频磁场处理40min，后于600W下超声处理50min，得到核磁共振高宽幅≤50HZ的小分子水。

本发明所述培养基C、培养基M1、培养基M2、培养基SC、培养基SE、培养基P1、培养基P2和培养基T的pH值分别为5.5-5.7。

本发明构建椰枣体细胞悬浮体系时，其具体过程包括：将茎尖生长组织进行脱毒处理后，接种于培养基C中进行诱导培养，得到含有愈伤组织与原始外植体的混合体；将含有愈伤组织与原始外植体的混合体接种于培养基M1中进行第一次增殖培养，得到愈伤组织；将愈伤组织接种于培养基M2中进行第二次增殖诱导培养，得到胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织接种于培养基SC中进行第一次悬浮培养，得到悬浮胚性愈伤细胞；将悬浮胚性愈伤细胞接种于培养基SE中进行第二次悬浮培养，得到体细胞胚胎；将体细胞胚胎接种于培养基P1中进行第一次萌发培养，得到萌发芽体；将萌发芽体接种于培养基P2中进行第二次萌发培养，得到完整芽体；将完整芽体接种于培养基T中进行生根培养，得到组培苗。

本发明对各培养基的制备方法、灭菌方法没有特殊的要求，采用本领域熟知的技术即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

初始加液量对第一次悬浮培养的影响

试验例1

（1）外植体脱毒

在田间选择生长健壮、无病害的椰枣树，连根部一起砍伐，切掉根部，留下基部，外部叶片层层环剥，去掉木质部，直到裸露出白色幼嫩叶片包裹的茎尖生长组织；将茎尖生长组织放进抗褐化剂（抗褐化剂以小分子水为溶剂，含有100mg/L抗坏血酸+150mg/L柠檬酸）中避光浸泡3h，取出后放到超净工作台上继续环剥2层叶片后放进体积浓度为75%的酒精中浸泡30s，然后用无菌小分子水冲洗干净，放进质量浓度为5%的次氯酸钠中浸泡20min，期间不停摇晃消毒缸，保证外植体充分接触消毒液，取出后用无菌水冲洗干净，放置于干净的滤纸上，用手术刀将包裹茎尖生长组织的最后两层叶片剥开，露出金字塔形状的生长组织，根据生长组织的大小，纵切呈8-15个组织作为外植体，即每块组织为一个待培养的外植体。

（2）诱导培养

将步骤（1）中得到的外植体（即每块组织）接种于培养基C中进行诱导培养，得到含有愈伤组织与原始外植体的混合体；其中，培养基C以小分子水为溶剂，由以下浓度的组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖30g/L、肌醇100mg/L、6-苄氨基腺嘌呤8mg/L、异戊烯基腺嘌呤5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸150mg/L、活性炭1g/L、Na₂HPO₄·2H₂O 170mg/L和全量MS盐，pH为5.7；培养条件为：30℃下，完全避光，暗室培养120d。

（3）第一次增殖培养

将步骤（2）中得到的含有愈伤组织与原始外植体的混合体接种于培养基M1中进行第一次增殖培养，得到愈伤组织；其中，培养基M1以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖30g/L、6-苄氨基腺嘌呤5mg/L、异戊烯基腺嘌呤4mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸6mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.7；培养条件为：30℃下，完全避光，暗室培养42d。

（4）第二次增殖诱导培养

将步骤（3）得到的愈伤组织接种于培养基M2中进行第二次增殖诱导培养，得到胚性愈伤组织；其中，培养基M2以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖30g/L、6-苄氨基腺嘌呤5mg/L、异戊烯基腺嘌呤4mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸3.5mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.7；培养条件为：30℃下，完全避光，暗室培养63d。

（5）第一次悬浮培养

将步骤（4）得到的胚性愈伤组织1g接种于装有20mL培养基SC的三角瓶中进行第一次悬浮培养，得到悬浮胚性愈伤细胞；其中，培养基SC以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖30g/L、肌醇100mg/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤8mg/L、萘乙酸10mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.6；培养过程中，用无菌透气膜封口三角瓶，放置于120r/min的摇床上，在28℃黑暗下悬浮培养，7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，补充等量的新鲜液（培养基SC）继续悬浮培养，连续培养35天。

试验例2-试验例8与试验例1的区别均仅在于，各试验例步骤（5）中胚性愈伤组织初始与培养基SC的用量不同，具体如表1所示。

表1 各试验例的参数设置

每个处理设置六个平行重复，通过测定悬浮细胞的鲜质量（不含有培养基SC的质量），以说明各处理中的增殖效果，统计第一次悬浮培养的第7d、14d、21d、28d和35d的鲜质量，结果见表2。

表2 各试验例对增殖系数的影响

结合表2的数据可以看出，不论胚性愈伤组织为1g还是2g，以60mL培养基SC对其进行第一次悬浮培养时，增殖效果最好。

分别于第一次悬浮培养的第0d、7d、14d、21d、28d和35d测定各处理的pH，结果如表3所示。

表3 各试验例对PH的影响

结合表2-表3的数据可以看出，将胚性愈伤组织的初始接种量与培养基装液量控制为1-2g：60mL，有利于胚性愈伤组织快速增殖，且细胞的生长量达到最大，且在细胞悬浮培养中，增殖率的高低和生长快慢会影响液体的pH值，细胞代谢活动产生的酸性物质（如乳酸）会降低培养基pH值，而增殖率越高、生长越快，代谢产生的酸性物质越多，pH值下降越明显；此外，细胞分裂活跃时，糖酵解和三羧酸循环加速，乳酸等酸性代谢产物积累，导致培养基pH值快速下降，而低增殖率过程中，由于细胞代减缓，酸性物质生成减少，pH值下降速度较慢。

第一次悬浮培养对胚性愈伤组织诱导率的影响

获得胚性愈伤组织过程如下：

（1）外植体脱毒

与试验例1的方法相同；

（2）诱导培养

与试验例1的方法相同；

（3）第一次增殖培养

与试验例1的方法相同；

（4）第二次增殖诱导培养

与试验例1的方法相同，得到胚性愈伤组织备用。

试验例9

第一次悬浮培养

将步骤（4）得到的胚性愈伤组织1g接种于装有60mL培养基SC的三角瓶中进行第一次悬浮培养，得到悬浮胚性愈伤细胞；其中，培养基SC以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖30g/L、肌醇100mg/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤8mg/L、萘乙酸10mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.6；培养过程中，用无菌透气膜封口三角瓶，放置于120r/min的摇床上，在28℃黑暗下悬浮培养，7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，补充等量的新鲜液（培养基SC）继续悬浮培养，培养21d后得到初代胚性愈伤组织；

将初代胚性愈伤组织1g接种于装有60mL培养基SC的三角瓶中进行悬浮培养21d后，得到第二代胚性愈伤组织；并采用上述方法得到第三代胚性愈伤组织……第八代胚性愈伤组织。

试验例10

与试验例9的区别仅在于，试验例10步骤（5）中培养基SC小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖30g/L、肌醇90mg/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤8mg/L、萘乙酸8mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.6。

试验例11

与试验例9的区别仅在于，试验例18中的步骤（5）如下：

将步骤（4）得到的胚性愈伤组织接种于装有固体培养基SC中进行培养，得到悬浮胚性愈伤细胞；其中，固体培养基SC以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖30g/L、肌醇100mg/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤8mg/L、萘乙酸10mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.6；在28℃黑暗下培养，7天继代一次。

试验例12

与试验例10的区别仅在于，试验例12中的步骤（5）如下：

将步骤（4）得到的胚性愈伤组织接种于装有固体培养基SC中进行培养，得到悬浮胚性愈伤细胞；其中，固体培养基SC以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖30g/L、肌醇90mg/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤8mg/L、萘乙酸8mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.6。

试验例13

与试验例9的区别仅在于，试验例13中以去离子水替换试验例9中小分子水。

试验例9-试验例13每个试验中的每个样本（初代胚性愈伤组织……第八代胚性愈伤组织）为一个处理，每个处理有50个平行重复。分别统计初代胚性愈伤组织诱导率、第二代胚性愈伤组织诱导率……第八代中胚性愈伤组织诱导率，结果见表4。

表4不同处理中继代后的胚性愈伤组织诱导率

结合表4的数据可以看出，采用本发明提供的技术方案（试验例9和试验例10），以液体悬浮培养SC进行愈伤组织诱导培养，胚性愈伤组织在继代增殖到第8代仍然具备高分生能力，即液体培养期间初代胚性愈伤诱导率≥78%；第二代的胚性愈伤诱导率为60%-76%；第三代胚性愈伤组织的诱导率为54%-62%；第四代-第八代胚性愈伤组织的诱导率最低可维持在30%以上；而采用固体培养基进行培养后，第四代胚性愈伤组织的诱导率20%以下，失去科研和生产价值，也就是说，在固体培养基中开展愈伤组织增殖，随着继代次数增加，细胞的活力降低，愈伤组织的转化为胚性愈伤的能力也会随之降低；此外，试验例13中虽然也使用了液体培养基，但受去离子水的影响，其胚性愈伤组织诱导率也不理想。

第二次悬浮培养对悬浮胚性愈伤细胞体胚发生率的影响

试验例14

将试验例9得到的悬浮胚性愈伤细胞（初代悬浮胚性愈伤细胞、第二代悬浮胚性愈伤细胞……第八代悬浮胚性愈伤细胞）1g分别接种于装有60mL培养基SE的三角瓶中进行第二次悬浮培养，得到体细胞胚胎；其中培养基SE以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖30g/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤4mg/L、萘乙酸2.5mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.7；培养过程中用无菌透气膜封口三角瓶，放置于120r/min的摇床上，在28℃黑暗下悬浮培养，7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，补充等量的新鲜培养液SE继续悬浮培养，连续培养35天，统计各样本体细胞胚胎发生率。

试验例15

与试验例14的区别仅在于，试验例15中所用培养基SE以小分子水为溶剂，由以下组分组成：培养基SE以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖30g/L、盐酸硫氨素0.2mg/L、异戊烯基腺嘌呤2mg/L、萘乙酸2.5mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.7；

试验例16

与试验例14的区别仅在于，试验例16中所用培养基SE为固体培养基，即固体培养基SE以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖30g/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤4mg/L、萘乙酸2.5mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.7。

试验例17

与试验例15的区别仅在于，试验例17中所用培养基SE为固体培养基，即固体培养基SE以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖30g/L、盐酸硫氨素0.2mg/L、异戊烯基腺嘌呤2mg/L、萘乙酸2.5mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.7。

试验例14-试验例17每种悬浮胚性愈伤细胞样本为一个处理，每个处理进行30个平行重复，分别统计各处理中胚性愈伤组织的体胚发生率，结果见表5。

表5 不同处理中继代后的胚性愈伤组织体胚发生率

结合表5的数据可知，在固体培养基中开展相关试验后，胚性愈伤增殖超过3代，体胚发生能力明显下降。而试验例14和试验例15采用本发明提供的技术方案，初代胚性愈伤组织体胚发生率达90%以上，第二代胚性愈伤组织体胚发生率达60%-70%，第三代至第八代愈伤组织体胚可维持达到43.3%-53.3%，仍然具备科研和生产价值，即本申请的技术方案更有利于椰枣体细胞胚发育的同步化。

实施例1

一种利用小分子水介导的椰枣体细胞悬浮体系构建的方法，步骤为：

（1）外植体脱毒

与试验例1的方法相同；

（2）诱导培养

与试验例1的方法相同；

（3）第一次增殖培养

与试验例1的方法相同；将该过程中所得愈伤组织进行切片观察，结果见图2。

（4）第二次增殖诱导培养

与试验例1的方法相同；

（5）第一次悬浮培养

将步骤（4）得到的胚性愈伤组织1g接种于装有60mL培养基SC的三角瓶中进行第一次悬浮培养（培养体系如图1所示），得到悬浮胚性愈伤细胞；其中，培养基SC以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖30g/L、肌醇100mg/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤8mg/L、萘乙酸10mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.7；培养过程中，用无菌透气膜封口三角瓶，放置于120r/min的摇床上，在28℃黑暗下悬浮培养，7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，补充等量的新鲜液（培养基SC）继续悬浮培养，连续培养28天；将所得悬浮胚性愈伤细胞进行切片观察，结果见图4。

（6）第二次悬浮培养

将步骤（5）得到的悬浮胚性愈伤细胞1g分别接种于装有60mL培养基SE的三角瓶中进行第二次悬浮培养，得到体细胞胚胎（培养体系如图3所示）；其中培养基SE以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖30g/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤4mg/L、萘乙酸2.5mg/L、活性炭1g/L和全量MS盐，pH为5.7；培养过程中用无菌透气膜封口三角瓶，放置于120r/min的摇床上，在28℃黑暗下悬浮培养，7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，补充等量的新鲜培养液SE继续悬浮培养，连续培养35天。培养过中，体胚诱导过程如图5所示，悬浮培养获得的体细胞胚胎如图6所示，对体细胞胚胎进行细胞切片观察，结果如图7所示。

（7）第一次萌发培养

将步骤（6）得到的体细胞胚胎接种于培养基P1中进行第一次萌发培养，得到萌发芽体；其中，培养基P1以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖50g/L、肌醇100mg/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、萘乙酸1.5mg/L、活性炭1g/L、KH₂PO₄·2H₂O 170mg/L和1/2MS盐，pH为5.7；于30℃下暗室培养60d，每30d更换新鲜培养基。

（8）第二次萌发培养

将步骤（7）得到的萌发芽体接种于培养基P2中进行第二次萌发培养，得到完整芽体；其中，培养基P2以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖50g/L、肌醇100mg/L、盐酸硫氨素0.4mg/L、赤霉素0.8mg/L、萘乙酸1.5mg/L、活性炭1g/L、KH₂PO₄·2H₂O170mg/L和1/2MS盐，pH为5.7；于30℃下，每天光合有效辐射强度为45μmol/m²/s照射16h，并进行8h的暗室培养。每30天更换新鲜培养基，共计培养120d。

（9）生根培养

将步骤（8）得到的完整芽体接种于培养基T中进行生根培养，得到组培苗；其中，培养基T以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖40g/L、萘乙酸0.12mg/L、活性炭1g/L、KH₂PO₄·2H₂O 170mg/L和1/2MS盐，pH为5.7；于30℃下，每天光合有效辐射强度为45μmol/m²/s照射16h，并进行8h的暗室培养（此时温度为22℃）每30d更换新鲜培养基，直至得到10-15cm，具备可温室炼苗的组培苗。

对比例1

与实施例1的区别仅在于，对比例1步骤（8）以培养基P1替换实施例1中的培养基P2。

对比例2

与实施例1的区别仅在于，对比例2步骤（7）以培养基P2替换实施例1中的培养基P1。

对比例3

与实施例1的区别仅在于，对比例3步骤（9）中所述培养基T以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.5g/L、蔗糖40g/L、萘乙酸0.12mg/L、活性炭1g/L、KH₂PO₄·2H₂O170mg/L和全量MS盐，pH为5.7；于30℃下，每天光合有效辐射强度为45μmol/m²/s照射16h，并进行8h的暗室培养（此时温度为22℃）每30d更换新鲜培养基，直至得到10-15cm，具备可温室炼苗的组培苗。

对比例4

与实施例1的区别仅在于，对比例4中步骤（2）-（9）中以去离子水替换小分子水分别制备对应的培养基。

在实施例1、对比例1-对比例4中，第一次萌发培养时的初始平行重复均为100个，分别于第二次萌发培养后统计各处理中体细胞胚胎的萌发率，结果见表6；进行生根培养前，各处理的初始数量均为100个，且长势基本相同，并统计60d时各处理的生根率，结果见表6。

表6 不同处理中样本的萌发率和生根率

结合表6的数据可知，实施例1中采用本发明提供的技术方案后，在悬浮培养阶段有利于椰枣体细胞胚发育的同步化，后续萌发率高达95%、且生根率达100%。

综上可知，本发明以小分子水为溶剂制备培养基，为构建椰枣体细胞悬浮体系提供了了高效的运输系统，其易穿透细胞壁和细胞膜上的微孔道，有利于将植物素需要的养分和激素运送到细胞内部；同时本发明将固体培养基和液体培养基结合使用，前期为外植体提供静态环境，促进资本快速增殖，中期配合液体培养基为植物提供了高效、动态的人工胞外微环境，利于植物体细胞胚发育的同步化，经继代培养后也能维持样本具有较高的分生能力；后期又以固体培养基进行萌发、生根培养，确保椰枣悬浮体系维持高萌发率和生根率，从而实现人工种子的高效研发。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种利用小分子水介导的椰枣体细胞悬浮体系构建的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备培养基

培养基C以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖25-30g/L、肌醇90-100mg/L、6-苄氨基腺嘌呤5-8mg/L、异戊烯基腺嘌呤3-5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸100-150mg/L、活性炭0.5-1g/L、Na₂HPO₄·2H₂O 160-170mg/L和全量MS盐；

培养基M1以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖25-30g/L、6-苄氨基腺嘌呤3-5mg/L、异戊烯基腺嘌呤2-4mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸5-6mg/L、活性炭0.5-1g/L和全量MS盐；

培养基M2以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖25-30g/L、6-苄氨基腺嘌呤3-5mg/L、异戊烯基腺嘌呤2-4mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸2-3.5mg/L、活性炭0.5-1g/L和全量MS盐；

培养基SC以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖25-30g/L、肌醇90-100mg/L、盐酸硫氨素0.2-0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤5-8mg/L、萘乙酸8-10mg/L、活性炭0.5-1g/L和全量MS盐；

培养基SE以小分子水为溶剂，由以下组分组成：蔗糖25-30g/L、盐酸硫氨素0.2-0.4mg/L、异戊烯基腺嘌呤2-4mg/L、萘乙酸0.5-2.5mg/L、活性炭0.5-1g/L和全量MS盐；

培养基P1以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖40-50g/L、肌醇90-100mg/L、盐酸硫氨素0.2-0.4mg/L、萘乙酸0.5-1.5mg/L、活性炭0.5-1g/L、KH₂PO₄·2H₂O 160-170mg/L和1/2MS盐；

培养基P2以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖40-50g/L、肌醇90-100mg/L、盐酸硫氨素0.2-0.4mg/L、赤霉素0.5-0.8mg/L、萘乙酸0.8-1.5mg/L、活性炭0.5-1g/L、KH₂PO₄·2H₂O 160-170mg/L和1/2MS盐；

培养基T以小分子水为溶剂，由以下组分组成：植物凝胶3.2-3.5g/L、蔗糖30-40g/L、萘乙酸0.08-0.12mg/L、活性炭0.5-1g/L、KH₂PO₄·2H₂O 160-170mg/L和1/2MS盐；

所述小分子水为核磁共振高宽幅≤50HZ的小分子水；

（2）以步骤（1）所述培养基构建椰枣体细胞悬浮体系

将茎尖生长组织进行脱毒处理后，依次接种于培养基C中进行诱导培养、培养基M1中进行第一次增殖培养、培养基M2中进行第二次增殖诱导培养、培养基SC中进行第一次悬浮培养、培养基SE中进行第二次悬浮培养、培养基P1中进行第一次萌发培养、培养基P2中进行第二次萌发培养、培养基T中进行生根培养，得到组培苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一次悬浮培养时，胚性愈伤组织与培养基SC的质量体积比为1000-2000mg：60mL；

所述第一次悬浮培养的条件为：于100-120r/min、26-28℃黑暗下进行悬浮培养，每7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，并补充等量的新鲜培养液SC继续悬浮培养，连续培养21-28天，得到悬浮胚性愈伤细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第二次悬浮培养时，悬浮胚性愈伤细胞与培养基SE的质量体积比为1000-2000mg：60mL；

所述第二次悬浮培养的条件为：于100-120r/min、26-28℃黑暗下进行悬浮培养，每7天继代一次，每次继代倾倒2/3的上层液，并补充等量的新鲜培养液SE继续悬浮培养，连续培养35-42天，得到体细胞胚胎。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次萌发培养的条件为：于27℃-30℃下，避光暗室培养60-90d，每30-45d更换新鲜培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二次萌发培养的条件为：于27℃-30℃下，每天光合有效辐射强度35-45μmol/m²/s下光照16h，暗室培养8h，每30-45d更换新鲜培养基，培养总时间为90-120d。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生根培养时，完整芽体的长度为8-10cm；

所述生根培养的条件为：每天先在27-30℃下，光合有效辐射强度为35-45μmol/m²/s下光照16h，再于20-22℃下暗室培养8h；每30-45d更换新鲜培养基，培养总时间为60-90d。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的条件为：于27℃-30℃下，避光暗室培养120-140d；

所述第一次增殖培养的条件为：于27℃-30℃下，避光暗室培养42-56d；

所述第二次增殖诱导培养的条件为：于27℃-30℃下，避光暗室培养63-72d。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子水的制备方法为：

将去离子水依次进行低频磁场处理和超声处理，得到核磁共振高宽幅≤50HZ的小分子水。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述低频磁场处理的条件为：频率为40-50Hz，磁场强度为1500-2000高斯，时间为30-40min；

所述超声处理的条件为：功率为600-800W，时间为40-50min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱毒处理的过程为：

将茎尖生长组织避光浸泡于抗褐化剂后，环剥掉1/2幼叶，后置于体积浓度为75%的酒精中浸泡、清洗，再以质量浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡、清洗，去除茎尖生长组织剩余的幼叶，得到预处理后的外植体；

所述抗褐化剂以小分子水为溶剂，由以下组分组成：95-105mg/L抗坏血酸和145-155mg/L柠檬酸。