CN119899269B - 一种单克隆抗体及其检测应用 - Google Patents

一种单克隆抗体及其检测应用

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Abstract

本发明公开了一种单克隆抗体及其检测应用。本发明还公开了抗体衍生物、编码该抗体的核酸序列、抗体的检测应用，尤其是在ELISA以及FACS检测中的应用；还公开了制备该抗体的方法。本发明的单克隆抗体具有广泛的应用前景和实用价值。

Description

一种单克隆抗体及其检测应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，本发明涉及一种单克隆抗体及其检测应用。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR3DL2）是杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）家族中的一员，主要在记忆性T细胞和自然杀伤（NK）细胞上表达，是NK细胞功能的关键调节因子。KIR3DL2与其配体之间的相互作用，在多种疾病的发生率、进展和结果中起着重要作用，包括妊娠并发症、病毒感染、自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤等。KIR3DL2的抗体或抗原结合片段在诊断、治疗和研究领域中具有广泛的应用潜力。
单克隆抗体在医学诊断、治疗和研究中扮演着重要角色。用于治疗各种疾病，包括癌症、自身免疫疾病和感染性疾病。然而，传统的单克隆抗体生产方法往往成本高昂且生产过程复杂。因此，开发一种高效的核酸分子编码单克隆抗体具有重要意义。目前，已有多项技术用于生产单克隆抗体，并且这些抗体在诸如酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术（FACS）等应用中显示出其独特的价值。
尽管现有的单克隆抗体技术在许多方面已经取得了显著的进展，但在提高特异性和扩大应用范围方面，仍存在对新型单克隆抗体的需求。目前，针对KIR3DL2蛋白的高特异性单克隆抗体的开发仍然是一个挑战。此外，对于这些抗体的衍生物、编码其氨基酸序列的核酸分子，以及它们在ELISA和FACS等实验技术中的应用，也存在着进一步研究和开发的必要。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明目的在于提供一种新型的单克隆抗体，该抗体针对KIR3DL2蛋白具有高特异性，并且在其氨基酸序列、衍生物以及应用方面均有所创新。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗KIR3DL2蛋白的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3。
在本发明的上下文中，术语“抗体”在本发明中以最广义使用，而且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、人源性抗体、嵌合抗体和自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（例如双价抗体），只要它们展现期望的生物学活性。在本发明中，经修饰得到的抗体序列也属于本发明的保护范畴。术语“修饰”是指对氨基酸序列任何形式的修饰，例如氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加。术语“取代”是指用不同的氨基酸替换一个或多个原本氨基酸序列中的氨基酸。术语“缺失”是指在原本氨基酸序列中减少一个或多个氨基酸。术语“插入”或“添加”是指在氨基酸序列中的改变导致与原本氨基酸序列相比，一个或多个氨基酸的添加。在本发明中，修饰优选发生在可变区以外的区域，例如抗体的恒定区或框架区，且经过修饰的抗体依然保留本发明抗体或其抗原结合片段期望的功能特性，或具有改进的与抗原结合的特性。
进一步，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或鼠源抗体。
进一步，本发明所述抗体为单克隆抗体。
所述重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SFPMA、TIISSGGSSYYRDSVKG和GGSFAY所示；所述轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如KASQNINNYLN、NTNNLQM和FQHNNWPLT所示。
在本发明中，术语“抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。所述“抗原结合片段”可以是Fab、Fv、ScFv等形式的抗体片段，它们保留了与KIR3DL2蛋白结合的能力，同时具有更小的分子尺寸，便于穿透组织或用于特定的治疗应用。
所述抗体的“重链可变区和轻链可变区”分别包含氨基酸序列，这些序列能够与KIR3DL2蛋白的特定表位特异性结合。
本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子能够编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，术语“核酸分子”是指具有任何长度并由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸构成的任何聚合物形式。通常，核酸分子是编码序列，编码序列可包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核（例如哺乳动物）DNA的基因组DNA序列以及甚至重组DNA序列。转录终止序列将通常位于编码序列的3’处。
进一步，编码上述抗体的核酸分子包括重链可变区（VH）编码序列、轻链可变区（VL）编码序列、重链恒定区（CH）编码序列、轻链恒定区（CL）编码序列。
本发明提供了一种或多种用于制备单克隆抗体的来源物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、仓鼠、人类、非人灵长类、山羊、转基因动物、体外培养的细胞系等。
进一步，本发明制备单克隆抗体的来源为大鼠。
本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体包括前面所述的核酸分子。
在本发明中，提供了一种包含本发明所述的核酸分子的载体。术语“载体”是指一种人工构建体，其能够在宿主细胞中递送并优选表达一种或多种目的基因或序列。本发明的载体可以是质粒载体、病毒载体等。在一些实施方案中载体指代直链或圆形核酸分子，其包含可操作地连接于提供在重组宿主细胞中的自主复制的其它链段的本发明的核酸，或根据核酸分子的表达盒。“可操作地连接”意味着所关注的核酸序列以允许核苷酸序列表达的方式连接到调节序列（例如在体外转录/翻译系统中或在将载体引入宿主细胞中）。
进一步，所述载体包括质粒、噬菌体、哺乳动物细胞表达载体、杆状病毒、酵母病毒、植物表达载体等。
本发明所述载体为用于在哺乳动物细胞中表达蛋白的pcDNA系列载体。
进一步，本发明所述载体为pcDNA3.1载体。
本发明的第四方面提供了一种重组细胞，所述重组细胞包括前面所述的单克隆抗体、前面所述的核酸分子，和/或前面所述的载体。
进一步，所述细胞包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞、杂交瘤细胞、CHO细胞、HEK293细胞、昆虫细胞系等。
本发明的第五方面提供了一种抗体衍生物，所述抗体衍生物包括本发明第一方面所述的单克隆抗体上直接或间接的偶联可检测标记物。
所述可检测标记物包括酶标记物、荧光标记物、放射性标记物、化学发光标记物、磁性标记物等。
进一步，所述可检测标记物为酶标记物。
进一步，所述酶标记物为辣根过氧化酶。
本发明的第六方面提供了一种检测KIR3DL2蛋白的产品，所述产品包括前面所述的抗体或其抗原结合片段，前面所述的核酸分子，前面所述的载体，和/或前面所述的重组细胞。
进一步，所述产品通过ELISA和FACS方法检测。
本发明的第七方面提供了一种制备前面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养本发明第四方面所述的重组细胞。
进一步，具体步骤包括：1）使用前面所述的载体转化到宿主细胞中；2）在适合条件下培养步骤1）中的宿主细胞；3）从宿主细胞的培养液中分离纯化获得前面所述的单克隆抗体。
本发明的第八方面提供了一种检测KIR3DL2蛋白或其功能结构域的方法，所述方法包括使用前面所述的抗体或其抗原片段与所述KIR3DL2蛋白或其功能结构域共同孵育。
优选地，所述KIR3DL2蛋白的功能结构域是KIR3DL2蛋白第22-337位氨基酸所在的胞外结构域。
优选地，所述KIR3DL2蛋白是鼠源的。
进一步，所述大鼠抗小鼠KIR3DL2抗体为12C5E6。
本发明的第九方面提供了前面所述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备产品中的应用，所述应用为在制备检测KIR3DL2蛋白的产品中的应用。
优选地，所述KIR3DL2蛋白为游离蛋白或在细胞膜上表达的蛋白。
优选地，所述产品是通过ELISA和FACS方法来检测的。
优选地，所述KIR3DL2蛋白的功能结构域是KIR3DL2蛋白第22-337位氨基酸所在的胞外结构域。
进一步，所述抗体可梯度依赖的结合mKIR3DL2-His重组蛋白。
进一步，所述抗体可很好的结合过表达mKIR3DL2蛋白的细胞。
本发明中使用的术语“CDR序列”指的是抗体分子的互补决定区中的氨基酸序列。这些序列是抗体可变区的一部分，它们在抗体与抗原的结合中起着决定性作用。CDR序列是抗体能够识别并结合特定抗原的关键区域。在抗体分子中，CDR序列分为三个区域，分别是：CDR1 、CDR2、CDR3。“CDR”这个术语可以指代根据本领域内公认的任何方法所确定的CDR。
本发明的优点和有益效果：本发明提供了一种12C5E6抗体，所述12C5E6抗体与过表达mKIR3DL2蛋白的细胞具有良好的结合活性，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是Elisa检测12C5E6抗体与抗原结合活性图。
图2是流式细胞术分析细胞凋亡图（Ctrl表示未处理细胞，Flag抗体作为阳性对照，横坐标PE表示细胞上特定PE标记抗体的荧光强度，纵坐标SSC表示细胞的内部颗粒性和复杂性）。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例 mKIR3DL2-His重组蛋白的制备与理化性质检测
一、实验材料
试剂：HAT（Sigma，H0262）；完全培养基（中科迈晨（北京）科技有限公司，CM10040）；96孔透明平底聚苯乙烯微孔板（Corning，CLS 9018）；抗小鼠二抗（Jackson ImmunoResearch，115-035-003）；HT（Sigma，H0137）；人胚肾HEK293T细胞（System Biosciences）；中国仓鼠卵巢癌CHO细胞（ECACC，85051005）；Protein A亲和层析（纳微科技，NMabTM ProProtein A，17010-150100）法；高亲和96孔板（Corning，3590）；PBST（PBS，西安赫特生物，BF001；Tween-20，生工生物，A100777）；BSA（生工生物，A500023-0100）；TMB（北京梅科万德，1001）。
二、实验方案
1. 抗体制备
（1）制备mKIR3DL2-His重组蛋白：将小鼠KIR3DL2胞外结构域（第22-337位氨基酸，）构建到pCDNA3.1载体，C端加上His标签。将构建好的载体转染到HEK293瞬时转染细胞中，经过细胞样品处理、亲和纯化与多步纯化得到mKIR3DL2-His重组蛋白。
mKIR3DL2-His重组蛋白的序列号SEQ ID NO:1：HVGSHDKPFLYAWPSYVVPLGQNVTLTCDSHRGSNIFKLYKEEGSPIPQLHETTFQKSQVFGPVTTEHAGTYRCFHPQYANVLSAHSEPLKIIISGIYLKPFLLILQSPLVNSGGNVTLECHSENMFDTYILISHRMGIIKNSVQVSAEHHESGSHVTYSIGPMTPDLVGTYTCYGANSYYPYEWSDPSDPIDIKITGVYKKPSLSVLMGPVLMMSGETMTLSCISDHQFDMFHMSREGVPQGQGMPGVQIHSGKFEAKFLLSSMIQKGNYRCYGSFRNSSHVWSSPSDPLYLPAKGNCPACTEEDPKIHNCKNLRHHHHHHHH。
（2）制备小鼠KIR3DL2单克隆抗体：①免疫：将mKIR3DL2-His重组蛋白与佐剂乳化，免疫6-8周龄雌性大鼠，背部2点，腹腔1点，各注射1/3体积，避免注射到小鼠左侧脾脏部位。第一次免疫剂量100 μg，第2-4次免疫剂量50 μg，每14天免疫一次。ELISA检测大鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的大鼠用不含佐剂的100 μg蛋白腹腔注射冲击免疫。
②细胞融合：无菌制备免疫达标的大鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例进行融合，然后置于96孔细胞培养板，用含HAT的完全培养基筛选，一周左右半量换液，2周可见克隆形成。
③杂交瘤上清筛选：采用酶联免疫吸附测定ELISA技术筛选杂交瘤细胞培养上清液：用重组mKIR3DL2-His蛋白包被96孔透明平底聚苯乙烯微孔板，封闭后加入前一步骤所得的杂交瘤细胞培养上清液，然后加入辣根过氧化酶（HRP）标记的抗小鼠二抗。选择其上清液与mKIR3DL2-His蛋白反应阳性，而与对照His蛋白反应阴性的克隆孔，即分泌大鼠抗小鼠KIR3DL2抗体的杂交瘤细胞，用含HT的完全培养液进行培养，并进行亚克隆。
④亚克隆：对于所选的每株杂交瘤细胞系，将细胞计数并在含HT的完全培养液中稀释成1个细胞/200 μL，在96孔细胞培养板中铺板，并置于37℃培养。单克隆形成后，再次通过ELISA筛选上清液与mKIR3DL2-His蛋白反应阳性的杂交瘤亚克隆。
⑤流式细胞术检测抗体与细胞表面N1结合能力：通过使用外源表达mKIR3DL2-Flag的人胚肾HEK293T细胞，使用BD Accuri™ C6经FACS筛选阳性杂交瘤株。用杂交瘤上清液样品对细胞染色，随后用与FITC连接的山羊抗-大鼠IgG进行二抗结合。用相应的转染空载体质粒的细胞系作为阴性对照。流式仪检测后使用FlowJo软件进行分析，选取FACS与ELISA均为阳性的杂交瘤细胞株定株。
⑥杂交瘤细胞测序及抗体纯化：测定FACS及Elisa均为阳性的杂交瘤细胞株所分泌抗体的cDNA编码序列，并翻译成氨基酸序列。最终得到克隆号为12C5E6的杂交瘤进行抗体纯化，选择中国仓鼠卵巢癌CHO细胞偏爱的密码子分别进行反向翻译，从而确定12C5E6的编码cDNA序列，合成后插入pcDNA3.1载体 ，通过电穿孔转染入CHO细胞进行表达。表达后，收获CHO细胞培养上清液，采用Protein A亲和层析法分离纯化细胞培养上清液中抗体蛋白，并进行纯度等质控检测并定量。
2. 抗体的结合能力分析
（1）Elisa检测12C5E6抗体结合能力
①抗原包被：向高亲和96孔板中加入1 μg/mL浓度的mouse KIR3DL2-His重组蛋白，共8孔，每孔100 μL，共16孔，每孔100 μL，封板后于4°C孵育过夜。
②洗去抗原：去除抗原溶液，用0.05% PBST缓冲液洗涤孔板3次，每次200 μL/孔。
③封闭：吸出或倒置孔板去除全部洗涤液；用含1% BSA的PBS缓冲液封闭，每孔300μL，封板后于室温孵育1小时；去除封闭溶液，用0.05% PBST缓冲液洗涤孔板2次，每次200 μL/孔，吸出或倒置孔板去除全部洗涤液。
④孵育一抗：加入实验组抗体12C5E6或对照组抗体Blank，每组首孔为200 ng/mL，以2倍梯度稀释依次至7个孔，末孔为空白缓冲液，共8孔，每孔100 μL，封板后于室温孵育1小时；去除抗体溶液，用0.05% PBST缓冲液洗涤板5次，每次200 μL/孔，吸出或倒置孔板去除全部洗涤液。
⑤孵育二抗：加入二抗Goat Anti-Rat IgG-HRP，以1:5000稀释，每孔100 uL，封板后于室温孵育1小时；去除二抗溶液，用0.05% PBST缓冲液洗涤孔板5次，每次200 μL/孔，吸出或倒置孔板去除全部洗涤液。
⑥显色：加入TMB底物溶液，每孔100 uL，避光于室温显色；达到所需的强度后，加入1 M H2SO4溶液终止反应，每孔50 μL；用酶联仪测量450 nm吸光度；用样品读数与两组抗体浓度的相关性绘制曲线。
（2）FACS检测12C5E6抗体结合细胞能力 ①人胚肾HEK293T细胞中转染mKIR3DL2-Flag质粒，转染24 h后将细胞消化成单细胞。
②使用5 μg/mL的浓度稀释12C5E6抗体，使用Flag抗体作为阳性对照，抗体室温孵育1 h。
③按照1:500稀释Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor™ 546二抗，室温孵育1h。
④使用BD Accuri™ C6经FACS验证12C5E6抗体结合细胞能力。流式仪检测后使用FlowJo软件进行分析。
三、实验结果
筛选出一种单克隆抗体12C5E6抗体的序列。
编码抗体12C5E6的氨基酸序列如下所示：编码重链可变区的氨基酸序列，序列号SEQ ID NO:2：EVQLVESGGVLVQPGRSMKLSCTASGFSFSSFPMAWVRQAPTRGLEWVATIISSGGSSYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCATGGSFAYWGQGTLVTVSS。
其中，编码重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SFPMA、TIISSGGSSYYRDSVKG、GGSFAY，序列号分别为SEQ ID NO:3、4、5。
编码轻链可变区的氨基酸序列，序列号SEQ ID NO:6：DIQMTQSPSLLSAYVGDGVTINCKASQNINNYLNWYQQKLGEAPKLLIYNTNNLQMVTPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFGTYFCFQHNNWPLTFGSGTTLEIK。
其中，编码轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为KASQNINNYLN、NTNNLQM、FQHNNWPLT，序列号分别为SEQ ID NO:7、8、9。
通过Elisa检测12C5E6抗体结合能力，结果如图1所示，抗体的吸光值＞2，远远大于阴性对照组，说明12C5E6抗体对重组蛋白抗原有很好的亲和力，12C5E6抗体可梯度依赖的结合mKIR3DL2-His重组蛋白。
通过FACS分析，如图2所示，我们观察到荧光标记的12C5E6抗体可很好的与过表达mKIR3DL2蛋白的细胞结合。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围。

Claims (19)

1. 一种抗KIR3DL2蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SFPMA、TIISSGGSSYYRDSVKG和GGSFAY所示；所述轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如KASQNINNYLN、NTNNLQM和FQHNNWPLT所示。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为嵌合抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为人源化抗体。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为鼠源抗体。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求7所述的核酸分子。
9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求7所述的核酸分子、和/或权利要求8所述的载体。
10.一种抗体衍生物，其特征在于，所述抗体衍生物包括权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段，和与所述抗体或抗原结合片段直接或间接偶联的可检测标记物。
11.根据权利要求10所述的抗体衍生物，其特征在于，所述可检测标记物包括酶标记物、荧光标记物、放射性标记物、化学发光标记物、磁性标记物。
12.根据权利要求11所述的抗体衍生物，其特征在于，所述酶标记物为辣根过氧化酶。
13.一种检测KIR3DL2蛋白或其功能结构域的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、和/或权利要求9所述的重组细胞；
所述KIR3DL2蛋白的功能结构域是KIR3DL2蛋白第22-337位氨基酸所在的胞外结构域。
14.根据权利要求13所述的产品，其特征在于，所述产品通过ELISA或FACS方法检测。
15.一种制备权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法是指培养权利要求9所述的重组细胞。
16.一种非疾病诊断或治疗目的的检测KIR3DL2蛋白或其功能结构域的方法，其特征在于，使用权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原片段与所述KIR3DL2蛋白或其功能结构域共同孵育；
所述KIR3DL2蛋白的功能结构域是KIR3DL2蛋白第22-337位氨基酸所在的胞外结构域。
17.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备产品中的应用，其特征在于，所述应用为在制备检测KIR3DL2蛋白或其功能结构域的产品中的应用；
所述KIR3DL2蛋白的功能结构域是KIR3DL2蛋白第22-337位氨基酸所在的胞外结构域。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述KIR3DL2蛋白为游离蛋白或在细胞膜上表达的蛋白。
19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述产品是通过ELISA和FACS方法来检测的。
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