CN119013003A - 用于改善肠道健康和功能的包含作为活性成分的乳源性外泌体的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于改善肠道健康和功能的组合物，包括：乳源性外泌体；和治疗剂，其中所述治疗剂是DNA、RNA或小分子，并且所述治疗剂被定位和包封在外泌体内部的空间中。此外，提供了一种制备用于改善肠道健康和功能的组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)从乳汁中分离外泌体；(b)通过对分离的外泌体进行电穿孔，在外泌体表面形成微孔；(c)将步骤(b)中经电穿孔的外泌体与治疗剂混合；和(d)除去没有被包封在外泌体内部的治疗剂。

Description

用于改善肠道健康和功能的包含作为活性成分的乳源性外泌 体的组合物及其制备方法
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年1月21日提交的韩国专利申请号10-2022-0009019的优先权、于2022年8月10日提交的韩国专利申请号10-2022-0099821的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。
国家支持研究与开发的说明
本研究在韩国科学技术研究院(Korea Institute of Science and Technology，KIST)的管理下进行，并得到了由科学和ICT部(Ministry of Science and ICT)资助的KIST研究和运营费用支持(R&D)(重大项目费用)项目(计划ID:1711152094，超互联医疗设备逆向转化研究计划)、由科学和ICT部资助的KIST研究和运营费用支持(重大项目费用)项目(计划ID:1711173292，个性化诊断、治疗、再生、康复和新药开发)，以及由科学和ICT部资助的创新新药基础技术开发项目(计划ID:1711160075，治疗炎症性肠病的创新型siRNA口服治疗剂的开发)的支持。
本公开涉及一种用于改善肠道健康功能的组合物，其包括作为活性成分的乳源性(milk-derived)外泌体。
背景技术
外泌体是一种直径为30至150nm的细胞外囊泡，由各种类型的细胞分泌。这些外泌体开始用于下一代药物递送技术，因为人们认识到它们在细胞间的信息传递中起着重要作用。但细胞分泌的外泌体量太少，难以达到高纯度，且性质相对不稳定，限制了其大量生产。最近，食源性(food-derived)外泌体备受瞩目。这些食源性外泌体可能是现成的，并且通常是安全的。在这些外泌体中，特别是乳源性外泌体，具有抗炎特性，并且在外泌体本身中包含对介导其病理和生理活动很重要的microRNA。乳源性外泌体可以以高产率从乳汁中分离和纯化外泌体，并且即使面对剧烈的环境变化，如pH或温度，也能保持高稳定性。此外，乳源性外泌体是高度生物可利用的，允许药物的口服施用，特别是当胃肠道中存在病灶时，如炎症性肠病。
发明内容
【技术问题】
在一方面，提供了一种用于改善肠道健康功能的组合物。
在一方面，提供了一种用于改善肠道健康功能的组合物，其中治疗剂被定位和包封在外泌体的内部空间中。
在一方面，提供了一种可口服施用的用于改善肠相关疾病或功能的组合物。
在一方面，提供了一种制备用于改善肠道健康功能的组合物的方法。
【技术解决方案】
在一方面，本发明旨在提供一种用于改善肠道健康功能的组合物，包括：乳源性外泌体；和治疗剂，其中治疗剂可以是DNA、RNA或小分子，并且所述治疗剂可以被定位和包封在外泌体内部的空间中。
在另一方面，提供了一种制备用于改善肠道健康功能的组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)从乳汁中分离外泌体；(b)通过对分离的外泌体进行电穿孔，在外泌体表面形成微孔；(c)将步骤(b)中经电穿孔的外泌体与治疗剂混合；和(d)除去没有被包封在外泌体内部的治疗剂。
【有益效果】
外泌体可以容易地从现成的和容易获得的乳汁中以高产量分离和纯化，以克服细胞来源的胞外囊泡的低产量和高维护成本。此外，代替具有相对不稳定特性的细胞来源的细胞外囊泡，可以使用电穿孔方法将治疗剂包封到乳源性外泌体中，所述外泌体具有即使在pH、温度等剧烈的环境变化下也能保持高稳定性的特性。这些乳源性外泌体具有高生物利用度的优点，允许药物的口服施用，这在胃肠道中存在病灶时特别有用，如在炎症性肠病中。
附图说明
图1a显示了外泌体蛋白标志物(Alix、Tsg-101和CD9)和非外泌体蛋白标志物(GM130)的表达水平。
图1b是乳源性外泌体的尺寸分布图。
图1c显示了乳源性外泌体的代表性TEM图像。
图2a是用0.05或0.1mg/mL的Cy5.5标记的Col-exo培养RAW264.7和NCM460细胞0、1、4、8、12或24h的共聚焦显微镜图像。在该图中，较暗的小圆圈表示DAPI，较亮的圆圈表示Col-exo。
图2b显示了用0、0.1、0.2、0.5或1mg/ml的乳源性外泌体培养NCM460和RAW264.7细胞24小时的细胞增殖率(n＝6；ns＝不显著，**p<0.01和****p<0.0001)。
图2c是显示NCM460的细胞活力的图。
图3a是确认细胞内ROS减少的图像。
图3b是显示编码炎性细胞因子的mRNA在M1型巨噬细胞中的表达的图(n＝4；*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001)。
图4a和4b是Cy5.5标记的乳源性外泌体的生物分布图像。图4a是完整的器官图像，图4b是器官的横截面图像。
图4c是显示DSS结肠炎诱导治疗和乳源性外泌体口服施用的方案的示意图。
图4d是显示(从左起)DSS结肠炎诱导的小鼠的体重减轻、DAI变化(n≥10；ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01和****p<0.0001)，和在第27天处死小鼠并测量的结肠长度(n≥10；ns＝不显著，***p<0.001和****p<0.0001)。
图5a至5c显示了实施例1在减轻DSS诱导的结肠炎的严重程度方面的有效性。图5a是在第27天通过苏木精和伊红(H&E)染色分析的结肠组织的组织病理学图像(○表面上皮的损失，▲溃疡，↑炎性细胞的浸润)。图5b是COX-2的代表性免疫组织化学(IHC)图像，箭头表示COX-2蛋白高表达的位置。图5c是通过TUNEL染色检测的结肠坏死的代表性图像。
图6a显示了通过化学发光测定法测量的结肠中的ROS(n≥7；ns>0.05，***p<0.001和****p<0.0001)。
图6b是iNOS的免疫荧光(IF)染色的代表性图像(图中的蓝色、深灰色：DAPI；图中的绿色、浅灰色：iNOS)。
图6c显示了结肠组织中编码炎性细胞因子的mRNA的表达(n＝4；*p<0.05和***p<0.001)。
图7是显示乳源外泌体对电穿孔方法的稳定性的图。
图8是琼脂糖凝胶上携带在乳源外泌体中的siRNA的图像。
图9是根据电穿孔变量比较siRNA在乳源外泌体中的包封效率的图。
图10a和10b是包封有TNF-αsiRNA的乳源性外泌体的可视化照片和显示相对荧光面积大小的图。
图11是包封有TNF-αsiRNA(Cy3标记)的乳源性外泌体的细胞内摄取的图。
图12是共聚焦图像和荧光强度图，显示包封有TNF-αsiRNA的乳源性外泌体的细胞内递送率。
图13是显示包封有TNF-αsiRNA的乳源性外泌体的基因沉默效应(体外)的图。
图14a是显示IBD诱导和治疗方案的示意图。
图14b和14c是在IBD诱导的小鼠中体重减轻和DAI指数变化的观察图。
具体实施方式
术语定义
如本说明书中所用，术语“细胞内递送率”是指将包封的TNF-αsiRNA递送至细胞中的程度，以百分比表示，通过测量细胞中TNF-αsiRNA的相对荧光强度相对于作为参照用Lipofectamin转染的TNF-αsiRNA染色的细胞中TNF-αsiRNA的相对荧光强度(100％)。
下文将详细描述本发明。
在一方面，本发明旨在提供一种用于改善肠道健康功能的组合物，包括：乳源性外泌体；和治疗剂，其中治疗剂可以是DNA、RNA或小分子，并且治疗剂可以被定位和包封在外泌体内部的空间中。在本说明书中，“通过位于外泌体的内部空间而被包封”是指物质，如治疗剂，完全进入外泌体的内部空间并被包封，而不是通过诸如附着、吸附或粘附的方法仅存在于外泌体的表面。
在本发明的另一个方面，提供了一种改善受试者肠道健康功能的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的乳源性外泌体和治疗剂的步骤，其中治疗剂可以是DNA、RNA或小分子，并且其中治疗剂可以被定位并包封在外泌体的内部空间中。
在本发明的另一方面，提供了乳源性外泌体和治疗剂在制备用于改善肠道健康功能的组合物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了用于改善肠道健康功能的乳源性外泌体和治疗剂。
在一个示例性实施方案中，乳汁可以是人、牛、绵羊、长尾山羊、山羊、骆驼、水牛或牦牛来源的乳汁，或初乳，但不限于此。
在一个示例性实施方案中，RNA可以是一种或多种选自但不限于由siRNA、miRNA、mRNA、shRNA、ncRNA和反义RNA组成的组的RNA。
在一个示例性实施方案中，siRNA可以是一种或多种选自由TNF-αsiRNA、TGF-βsiRNA、JAK3 siRNA和IL-6R siRNA组成的组的siRNA。
在一个示例性实施方案中，miRNA可以是一种或多种选自由Let-7b-5p、miR-320a-3p和miR-21组成的组的miRNA。
在一个示例性实施方案中，该组合物可以是液体制剂，并且包括包封有浓度为100至1000μg/ml的治疗剂的乳源性外泌体。具体地，乳源性外泌体的浓度为100μg/ml或更高、150μg/ml或更高、200μg/ml或更高、250μg/ml或更高、300μg/ml或更高、350μg/ml或更高、400μg/ml或更高、450μg/ml或更高、或500μg/ml或更高，并且浓度可以为1000μg/ml或更低、950μg/ml或更低、900μg/ml或更低、850μg/ml或更低、800μg/ml或更低、750μg/ml或更低、700μg/ml或更低、650μg/ml或更低、600μg/ml或更低、或550μg/ml或更低。
在一个示例性实施方案中，该组合物可以是冻干制剂，并且可以包括包封有基于组合物总重量的0.001至100wt％的治疗剂的乳源性外泌体。具体地，本领域技术人员可以根据包封有治疗剂的乳源性外泌体的浓度或溶剂类型来调整含量。例如，该含量可以是0.001wt％或更高、0.01wt％或更高、0.1wt％或更高、1wt％或更高、5wt％或更高、10wt％或更高、15wt％或更高、20wt％或更高、25wt％或更高、30wt％或更高、35wt％或更高、40wt％或更高、45wt％或更高或50wt％或更高，并且可以是100wt％或更低、95wt％或更低、85wt％或更低、80wt％或更低、75wt％或更低、70wt％或更低、65wt％或更低、60wt％或更低、或55wt％或更低。
在一个示例性实施方案中，该组合物可以口服施用。
在另一方面，提供了一种制备用于改善肠道健康功能的组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)从乳汁中分离外泌体；(b)通过对分离的外泌体进行电穿孔，在外泌体表面形成微孔；(c)将步骤(b)中经电穿孔的外泌体与治疗剂混合；和(d)除去没有被包封在外泌体内部的治疗剂。
在一个示例性实施方案中，步骤(b)的电穿孔可以施加250至350V的电压。具体地，电压可以是250V或更高、255V或更高、260V或更高、265V或更高、270V或更高、275V或更高、280V或更高、285V或更高、290V或更高、295V或更高、或300V或更高，并且可以是350V或更低、345V或更低、340V或更低、335V或更低、330V或更低、325V或更低、320V或更低、315V或更低、310V或更低、或305V或更低。
在一个示例性实施方案中，步骤(b)的电穿孔可以施加3至7次脉冲。具体地，脉冲可以是3次或更多、4次或更多、5次或更多，并且可以是7次或更少、或6次或更少。
在一个示例性实施方案中，步骤(b)的电穿孔可以施加20至40ms时间段的脉冲。具体地，该脉冲可以是20ms或更长、21ms或更长、22ms或更长、23ms或更长、24ms或更长、25ms或更长、26ms或更长、27ms或更长、28ms或更长、29ms或更长、或30ms或更长，并且可以是40ms或更短、39ms或更短、38ms或更短、37ms或更短、36ms或更短、35ms或更短、34ms或更短、33ms或更短、32ms或更短、或31ms或更短。
在一个示例性实施方案中，步骤(a)的乳汁可以是人、牛、绵羊、长尾山羊、山羊、骆驼、水牛或牦牛来源的乳汁，或者可以是初乳。
在一个示例性实施方式中，步骤(c)的治疗剂可以是DNA，并且步骤(d)可以是添加脱氧核糖核酸酶以去除未包封的治疗剂。
在一个示例性实施方案中，步骤(c)的治疗剂可以是RNA，并且步骤(d)可以是添加核糖核酸酶以去除未包封的治疗剂。
在一个示例性实施方案中，步骤(c)的RNA可以是一种或多种选自由siRNA、miRNA、mRNA、iRNA、ncRNA和反义RNA组成的组的RNA。
在一个示例性实施方案中，步骤(c)的siRNA可以是一种或多种选自由TNF-αsiRNA、TGF-βsiRNA、JAK3 siRNA和IL-6R siRNA组成的组的siRNA。
在一个示例性实施方案中，步骤(c)的miRNA可以是一种或多种选自由Let-7b-5p、miR-320a-3p和miR-21组成的组的miRNA。
在下文中，将参照示例性实施方案更详细地描述本发明。这些实施方案仅旨在说明性地描述本发明，并且本发明的范围不受这些实施方案的限制。与本发明的权利要求中公开的技术本质在构造和操作效果上基本相同的任何构造都属于本发明的技术范围。
实施例
1.牛初乳来源的外泌体在预防和治疗炎症性肠病中有效性的确认
(1)细胞培养
NCM460细胞和RAW264.7细胞(40071，韩国细胞系库)在含有高葡萄糖(SH30243.01，Hyclone，美国)的Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)中生长，所述培养基含有10％胎牛血清(FBS，FP-0500-A，Atlas Biologicals，美国)和1％抗生素-抗真菌剂(15240096，ThermoFisher Scientific，美国)。细胞在含5％二氧化碳(CO2)的37℃培养箱中培养。为了诱导M1样巨噬细胞，用100ng/ml LPS(L4524，Sigma，美国)和20ng/ml IFN-γ(315-05，PeproTech，英国)刺激RAW264.7细胞24h。
(2)从初乳中分离外泌体
在4℃下连续离心制备外泌体。使用具有JA-14转子的高速离心机(Avanti J-E，Beckman Coulter，美国)将牛初乳(获自Lee Sung-young Changbuk Ranch，1-ro 20，Bongsangwan-dong，Gyeongsung-myeon，Changnyeong-gun，Gyeongnam，韩国)以5000×g离心30min，以12000×g离心1h。将上清液通过40μm过滤器(93040，SPL，韩国)并储存在-80℃直至使用。过滤后的乳汁通过具有45Ti转子的超速离心机(Optima XE-100，BeckmanCoulter，美国)以35,000x g离心1h，以70,000x g离心3h。将溶液分成三层，中间层依次通过孔径为0.8、0.45和0.2μm的注射器过滤器(16592-K、16555-K、16534-K，SartoriusStedim Biotech，德国)过滤。通过以100,000×g离心1h获得被认为是外泌体的沉淀。将外泌体重悬于Dulbecco磷酸盐缓冲生理盐水(DPBS，LB001，Welgene，韩国)中，并在4℃下旋转过夜。如此获得的外泌体在下文中称为牛初乳来源的外泌体(Col-exo，实施例1)。
为了制备不含外泌体的乳汁(Exo-free milk，对比例1)，将除去外泌体沉淀的澄清溶液以200,000×g离心3h以除去剩余的外泌体，上清液被认为是不含外泌体的乳汁。
(3)蛋白质印迹
使用BCA测定试剂盒(23225，Thermofisher Scientific，美国)定量外泌体蛋白质的浓度，并用SDS-PAGE上样缓冲液使蛋白质变性。样品在十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用5％脱脂乳汁封闭该膜。初级抗体与靶蛋白结合24h。用tris缓冲生理盐水、0.1％ Tween 20去污剂(TBST)冲洗膜，蛋白质显示为与HRP标记的第二抗体在室温下孵育40min。用Clarity Western ECL底物(1705061，Bio-Rad，美国)对显示的蛋白质进行可视化。
使用的抗体是Alix(1:500，NB100-65678，Novus，美国)、Tsg-101(1:1000，ab83，Abcam，美国)、CD9(1:1000，NB500-494，Novus，美国)、GM130(1:500，PA1077，ThermofisherScientific，美国)、山羊抗小鼠IgG抗体(HRP)(1:1000，GTX21311-01，GeneTex，美国)和山羊抗兔IgG抗体(HRP)(1:1000，GTX21310-01，GeneTex，美国)。
根据实施例1和对比例1的结果，如图1a所示，在实施例1中识别了Alix、Tsg-101和CD9，它们是外泌体蛋白的标志物。相反，在对比例1中发现了GM130，它是非外泌体蛋白质。这些结果表明外泌体的存在或不存在区分了对比例1(无外泌体的乳汁)和实施例1(外泌体)。
(4)动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)
对于DLS，外泌体用蒸馏水稀释至0.1μg/μl，并转移至一次性比色皿中(art.01960-00，Kartell LABWARE，意大利)。外泌体的尺寸分布由DLS(Zetasizer NanoZS，Malvern Instruments，英国)在173°的固定角度测量。对于每个样品，进行三次独立的测量并取平均用于软件分析。
为了确认TEM图像，在室温下将10μg外泌体沉积在碳涂层的铜网(CF200-Cu，Emgrid Australia，澳大利亚)上30min。对于外泌体的阴性染色，铜网与乙酸铀酰对比一分钟。通过TEM(FEI Tecnai F20 G2，Philips，荷兰)观察外泌体的形态。
如图1b和图1c所示，实施例1的外泌体具有85.2nm的平均直径，并且被发现是球形的。
(5)外泌体的细胞摄取
通过在4℃下旋转过夜，用650nM花青5.5NHS酯标记外泌体。使用Airfuge将未结合的片段清洗两次。将细胞以RAW264.7细胞2×105细胞/皿和NCM460细胞3×105细胞/皿的密度铺在共聚焦培养皿上。用每个浓度(0.05和0.1mg/ml)处理外泌体，并在每个时间点用DPBS洗涤。为了捕获图像，用甲醛固定细胞，然后加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以对核酸染色15min。图像是用共聚焦显微镜(Leica TCS SP6，Leica，德国)拍摄的。
(6)细胞增殖和活力分析
根据细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(CK04，Dojindo，日本)指南进行细胞活力测定。将NCM460和RAW264.7细胞分别以6,000和8,000细胞/孔的密度接种在96孔板中，并使其附着24h。用不同浓度的对比例1(不含外泌体的乳汁)或实施例1的外泌体(在活力测定中为0.5mg/ml)处理细胞24h。作为活力分析的附加步骤，将细胞与2.5％ DSS(0216011080，MPBiomedicals，美国)溶液(w/v)一起孵育24h。用含有10％ CCK-8溶液的无血清培养基替换培养基。用酶标仪(SpectraMAX 340，Molecular Devices，美国)测量450nm波长处的吸光度。在用外泌体处理之前，RAW264.7细胞与100ng/ml LPS和20ng/ml INF-γ一起孵育24h。
研究了实施例1(Col-exo)的细胞内递送效率。将RAW264.7细胞与用浓度为0.05或0.1mg/ml的Cy5.5标记的实施例1一起孵育0、1、4、8、12或24h(图2a)。在图2a中，较暗的小圆圈表示DAPI，较亮的圆圈表示Col-exo。共聚焦图像显示实施例1(Col-exo)的显著细胞内摄取发生在8h内，并且图像显示摄取在24h内饱和。此外，NCM460细胞显示了类似的模式。基于这些数据，在随后的体外和体内实验中将实施例1(Col-exo)的摄取时间设定为24h。
接下来，为了研究实施例1(Col-exo)和细胞生长之间的关系，对NCM460细胞和RAW264.7细胞进行细胞增殖测定(图2b)。可以看出，当用浓度为0.1mg/ml的实施例1(Col-exo)处理NCM460细胞时，细胞增殖显著增加至113.1±3.4％。在实施例1中，这种细胞增殖直到浓度为1mg/ml时仍几乎保持不变。另一种细胞系RAW264.7在0.5mg/ml的浓度下显示出细胞生长的显著增加，特别是在1mg/ml的浓度下增加至121.8±4.7％。
此外，观察到实施例1(Col-exo)在用葡聚糖硫酸钠(DSS，36,000-50,000Da)(一种引起炎症性肠病(IBD)的化学物质)损伤结肠上皮细胞后修复外部损伤的能力(图2c)。用2.5％ DSS处理24h造成细胞损伤，导致细胞生长率下降至82.7±3.7％。用实施例1(不含外泌体的乳汁)处理的组显示出与DSS处理相似的细胞活力水平，相反，实施例1(Col-exo)能够将细胞活力恢复至91.8±2.6％。结果，发现实施例1(Col-exo)增加了NCM460和RAW264.7细胞的增殖。
(7)确认抗炎效果
接下来，使用DCF-DA测定证实牛初乳来源的外泌体是否能够降低细胞内活性氧物质(ROS)浓度。将RAW264.7细胞以2×105细胞的密度接种在共聚焦培养皿中，并用100ng/mlLPS和20ng/ml IFN-γ处理24h以诱导M1巨噬细胞。NCM460细胞以3×105细胞/孔的密度培养24h。用浓度为0.1mg/ml的无外泌体乳汁或外泌体处理每个细胞24h。通过提供100μM的H2O2 30min，并用50μM的2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFDA)孵育细胞30min，诱导氧化应激。用DPBS洗涤细胞后，用共聚焦显微镜获得荧光图像。
如图3a所示，在NCM460细胞和RAW264.7细胞中，实施例1(Col-exo)处理组的细胞内ROS水平(浅色圆圈)与过氧化氢处理组或对比例1(无外泌体乳汁)处理组相比显著降低。
(8)体外细胞因子水平的定量
此外，分析了参与炎症反应的编码细胞内细胞因子的mRNA的表达水平。将RAW264.7细胞(2.5×105细胞/ml)涂板在培养皿中，并用100ng/ml LPS和20ng/ml IFN-γ刺激24h。用不含外泌体的乳汁或外泌体处理M1诱导的细胞24h，然后用DPBS洗涤两次。根据制造商的指南用TrizolTM试剂提取总RNA，在逆转录后用oligo(dT)引物产生cDNA。使用SYBR Green qPCR premix(RT501S，enzynomics，韩国)和各自的引物(表1)通过定量实时PCR(qRT-PCR)进行细胞因子的定量，并根据预混合方案设定PCR循环。
【表1】
首先，将RAW264.7细胞分化成M1巨噬细胞，并分别用实施例1(Col-exo)和对比例1(不含外泌体的乳汁)处理。如图3b所示，定量实时PCR(qRT-PCR)数据表明，与对照组相比，实施例1中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的mRNA表达水平分别降低了0.69倍和0.61倍。相反，与对照组相比，实施例1(Col-exo)组中作为抗炎细胞因子的白介素-10(IL-10)的mRNA表达水平增加了1.7倍。因此，发现实施例1在细胞水平上具有抗炎作用。
(9)初乳来源的外泌体的体外生物分布
在确认实施例1(Col-exo)在结肠炎小鼠模型中的效果之前，在口服施用Cy5.5标记的实施例1(Col-exo)后，测量器官中的相对生物分布。向BALB/c小鼠口服施用Cy5.5标记的外泌体。对小鼠进行经口胃管饲养，5h和24h后，收集胃肠道和其他器官，包括心脏、肺、脾、肾和肝。使用体内成像系统(IVIS)(Lumina Series IIIPerkin Elmer，美国)评估分离器官的荧光强度。在福尔马林固定、石蜡包埋的胃肠器官中观察到外泌体的摄取。石蜡包埋的组织被切成5μm厚的切片。使用共焦显微镜捕捉代表性图像。
结果，如图4a所示，当在饲喂Cy5.5标记的Col-exo后5h测量荧光强度时，其在胃肠道中，特别是在结肠中显示出强信号。此外，确认了荧光信号在24h时间点在胃和结肠中显著保持。同时，从图4b中可以看出，分别将胃、小肠和结肠切片，并观察器官对用Cy5.5标记的实施例1(Col-exo)的摄取。用Cy5.5标记的实施例1(Col-exo)的摄取主要在胃和结肠中发现。24h后，确认摄取外泌体显著减少。因此，每天向小鼠口服施用实施例1。
(10)结肠炎小鼠模型中炎症反应的评估
八周龄的BALB/c雌性小鼠(Orient Bio，韩国)用于溃疡性结肠炎模型。将小鼠随机分成三组，健康对照(生理盐水)、DSS诱导的结肠炎(DSS)和Col-exo预处理(实施例1)，并经历10天的环境适应期。实施例1(Col-exo)组通过经口胃管饲养每天用1mg初乳来源的外泌体预处理一周，而其他组仅给予盐水。炎症性肠病(IBD)是通过在饮用水中随机施用2.5％的DSS溶液一周而化学诱导的。在第27天，处死小鼠并评估结肠长度(图4c)。
1)疾病活动指数(DAI)
从第18天到第27天，每天由三名独立的观察者对每只小鼠的体重减轻、粪便粘度和粪便出血特征进行疾病活动指数评估(表2)。总分从0到12分不等，得分越高表明疾病越严重。
【表2】
根据建立的方案进行动物实验，结果显示与DSS组(显示了快速的体重减轻)相反，实施例1(Col-exo)组有效地抑制了DSS诱导的结肠炎小鼠的体重减轻。(图4d)。2)体外ROS成像
在第27天，通过在DPBS中溶解制备L-012(120-04891，Fujifilm Wako Chemicals，日本)，并在室温下储存在黑暗的隔室中。以20mg/kg的剂量腹膜内注射L-012溶液，15min后分离小鼠的结肠。通过体内成像系统(IVIS)(Lumina Series IIIPerkin Elmer，美国)对分离的结肠中的ROS进行成像。数据显示了5min测量的平均辐照效率(p/s/cm2/sr)。
根据建立的方案进行动物实验，结果显示与DSS组(显示了快速的体重减轻)相反，实施例1(Col-exo)组有效地抑制了DSS诱导的结肠炎小鼠的体重减轻。此外，实施例1(Col-exo)组的疾病活动指数(DAI)得分显著低于DSS组。实施例1(Col-exo)组的结肠长度明显长于DSS组，并恢复到与生理盐水组相似的水平(图4d)。通过上述实验，确认了实施例1减轻了DSS诱导的结肠炎。
(11)组织学分析
采用Swiss-roll技术制备分离的小鼠结肠组织。结肠样品在福尔马林中浸泡固定过夜，脱水，并包埋在石蜡中。将所有组织标本切成5μm厚的切片。
1)H&E(苏木精和伊红)
切片在二甲苯中脱蜡并用苏木精染色。用自来水冲洗后，用上蓝剂进行的核染色已经完成。蛋白质通过伊红(ab245880，Abcam，美国)进行非特异性染色。将载玻片固定在甲苯中，用光学显微镜(BX51，Olympus Corporation，日本)观察。
结果，在DSS组的结肠中发现了严重的表面上皮损伤、溃疡和免疫细胞浸润(图5a)。相反，实施例1组显示轻微的上皮增生。
2)免疫组织化学(IHC)
因为COX-2是引发炎症的关键分子，所以使用免疫组织化学(IHC)来检测各组中COX-2蛋白的表达水平。根据制造商的方案，使用小鼠和兔特异性HRP/DAB(ABC)检测IHC试剂盒(ab64264，Abcam，美国)检测结肠组织中COX-2的表达。用含1％ BSA和0.5％ TritonX-100的PBS中的COX-2抗体(1:500，ab15191，Abcam，美国)标记靶蛋白。组织切片用DAB底物染色，并用苏木精复染。这些图像是用光学显微镜拍摄的。
如图5b所示，与DSS组相比，实施例1(Col-exo)组的结肠中COX-2蛋白的表达减少。
3)免疫荧光(IF)
为了观察组织细胞死亡的程度，根据荧光TUNEL系统(G3250，Promega，美国)的制造商说明书进行TUNEL测定。也就是说，用甲醛固定再水合的组织切片，并加入蛋白酶K溶液进行透化。重复甲醛固定，并用平衡缓冲液进行孵育。用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应标记细胞凋亡区域，并用DAPI复染。
如图5c所示，如TUNEL染色数据所示，结肠细胞的细胞死亡在DSS组中严重发生，并且绝大多数在实施例1(Col-exo)组中恢复。结果，实施例1有效降低了结肠炎和细胞死亡的严重程度。
(12)体内细胞因子水平的定量
为了确认Col-exo减轻结肠炎症的效果，使用基于鲁米诺的化学发光探针测量结肠中的ROS水平。使用带有TrizolTM试剂的均质器(HG-15D，Wise Tis，韩国)将小鼠结肠组织匀浆。匀浆后，根据TrizolTM试剂的操作手册从结肠组织中获得总RNA。cDNA合成后，使用SYBR Green(RT501M，Enzynomics，韩国)根据制造商的方案进行qRT-PCR。所有的qRT-PCR均使用QuantStudioTM1实时PCR仪(Applied Biosystems，美国)进行。每个引物总结在(表1)中。
结果，发现ROS水平在DSS组中显著增加，而在实施例1(Col-exo)组中减少不到一半(图6a)。
(13)确认肠道炎症改善
接下来，为了确认Col-exo对改善肠道炎症的作用，使用免疫荧光(IF)确认了iNOS蛋白的表达，其是促炎性M1型巨噬细胞的标志物。通过iNOS染色检测小鼠结肠组织中的巨噬细胞浸润。脱蜡后的组织在抗原修复缓冲液(柠檬酸缓冲液pH 6.0)(ab93678，Abcam，美国)中再水合并煮沸。载玻片用PBS、0.05％ Tween 20去污剂(PBST)洗涤，并用含有5％ BSA(w/v)的PBST在室温下封闭10min。在含有1％ BSA(w/v)和0.5％ Triton-100(v/v)的PBS中制备的Alexa fluor 488缀合的iNOS单克隆抗体(53-5920-82，eBiosience，美国)用于在4℃下过夜染色切片。核酸在室温下用DAPI染色15min。载玻片用水溶性固定溶液(0100-01，Southern Biotech，美国)固定，在共聚焦显微镜下拍照。结果，如图6b所示，iNOS蛋白在DSS组中过量表达，而在实施例1(Col-exo)组中几乎没有观察到。
此外，使用qRT-PCR检测炎性细胞因子的mRNA表达(图6c)。qRT-PCR结果显示，与生理盐水组相比，DSS组TNF-α和IL-6的mRNA水平分别增加了3.8倍和3.6倍。相比之下，他们的mRNA表达水平与生理盐水组相似。然而，抗炎细胞因子的qRT-PCR结果显示了相反的趋势，与生理盐水组相比，DSS组的IL-10mRNA表达降低了约20倍。值得注意的是，实施例1(Col-exo)处理组中的IL-10表达水平稍微恢复到大约是DSS处理组的5倍的水平。这些结果表明实施例1减少了过度的肠道炎症反应。
(14)统计分析
使用具有参数化单向ANOVA分析和双向ANOVA分析的Prism 8.0进行数据的统计分析。所有结果都表示为平均值±标准偏差。所有的图都是在Prism 8.0(GraphPad SoftwareInc，美国)中构建的。
2.包封有RNA的乳源性外泌体对炎症性肠病的治疗作用
(1)外泌体的提取
使用商业巴氏灭菌乳汁，并且使用与实施例1.(2)中描述的相同方法进行外泌体的提取。
(2)外泌体对电穿孔的稳定性确认
将0.1mg/ml的细胞来源的外泌体(HEK外泌体)和乳源性外泌体(乳汁外泌体)分别进行300V、30ms、5次脉冲、1s间隔的电击，并在4℃下孵育3h。使用与实施例1.(4)中的动态光散射(DLS)实验相同的方法来观察电击前后外泌体的尺寸变化。
结果，如图7所示，确认了细胞来源的外泌体在电穿孔后尺寸变小，而乳源性外泌体在电穿孔前后外泌体的尺寸分布几乎没有变化。
(3)siRNA的包封
在通过电穿孔在外泌体中产生微孔后，将TNF-αsiRNA混合到外泌体溶液中，以将TNF-αsiRNA包封在外泌体内部，然后使用核糖核酸酶除去未被包封在外泌体内部的siRNA。将未经历电穿孔的外泌体、经历电穿孔的外泌体、未经历电穿孔的外泌体中TNF-αsiRNA的所得混合物、以及用混合在经历电穿孔的外泌体中的TNF-αsiRNA包封的外泌体加载到1％琼脂糖凝胶上，并在电泳装置中于100V下电泳10min。然后，用凝胶图像分析仪进行视觉确认。结果，确认了当外泌体经受电穿孔时，TNF-αsiRNA被有效地包封在外泌体内部，如图8所示。在下文中，包封有TNF-αsiRNA的外泌体将被称为实施例2，未包封有TNF-αsiRNA的外泌体将被称为对比例2。
(4)根据电穿孔变量比较siRNA的包封效率
为了确认电压条件，对于0.1mg/ml的乳源性外泌体，固定5次电穿孔和30ms的电穿孔时间，并且施加200、250、300、350和400V的电压以比较TNF-αsiRNA的包封率。为了确认电穿孔条件的次数，固定300V的电压和30ms的电穿孔时间，并且当施加1、2、3、4和5次电穿孔时，比较TNF-αsiRNA的包封效率，并且为了确认电穿孔的时间条件，固定300V的电压和5次电穿孔，当电击施加10、20、30、40、50和60ms的时间时，比较TNF-αsiRNA的包封效率。当电穿孔以300V施加5次，持续30ms时，确认了TNF-αsiRNA被最有效地包封到外泌体中(图9)。
(5)可视化包封有TNF-αsiRNA的乳源性外泌体
乳源性外泌体分别接受300V、30ms、5次脉冲和1s间隔的电击，然后用TNF-αsiRNA(FAM标记)包封并孵育3h，并用Cy5.5标记乳源性外泌体。将用TNF-αsiRNA(实施例2)包封的乳源性外泌体与Fluoromount-G溶液混合，并固定在载玻片上。然后，通过超分辨率显微镜(SRM)在x、y和z方向上测量和可视化用TNF-αsiRNA包封的乳源性外泌体(图10a)，并绘制相对荧光面积(图10b)。当回顾TNF-αsiRNA包封后的数据时，确认了在实施例2中，用绿色(图中暗灰色)FAM标记的TNF-αsiRNA位于用红色(图中白色)Cy5.5标记的外泌体的中心。此外，在相对荧光面积中，确认了当TNF-αsiRNA被包封时，在仅具有外泌体的对比例2中显示100或更大的荧光面积的Cy5.5降低至100或更小，并且FAM标记的荧光面积相对增加。这意味着TNF-αsiRNA不是通过诸如粘附等方法携带在外泌体的表面上，而是通过电穿孔产生的微孔精确地进入并包封在外泌体内部区域的中间。
(6)确认了包封有TNF-αsiRNA的乳源性外泌体的细胞摄取
通过与实施例2中相同的电穿孔方法在乳源性外泌体中形成孔，但是乳源性外泌体包封有Cy3标记的TNF-αsiRNA并孵育3h。然后，用外泌体处理NCM460细胞，24h后通过共聚焦显微镜观察细胞摄取的程度。如图11所示(图中深灰色表示DPAI，浅色小点表示siRNA)，可以看出，与单独用TNF-αsiRNA处理细胞的情况相比，在实施例2中有效地发生了向细胞中的导入，其中TNF-αsiRNA被包封在外泌体中。
(7)通过电穿孔确认包封有TNF-αsiRNA的乳源性外泌体的细胞内递送率
通过与实施例2中相同的电穿孔方法在乳源性外泌体中形成孔，并且分别包封有Cy3标记的TNF-αsiRNA，并在4℃下稳定3h。将RAW264.7细胞以3×105细胞/皿的密度涂板在共聚焦培养皿上。使用lipofectamin作为对照来转染TNF-αsiRNA。分别用对照和实施例2处理RAW264.7细胞，24h后，用DPBS洗涤细胞，固定在甲醛中，用Hoechst33342将细胞核染色10min。使用共聚焦显微镜拍摄染色细胞的相对荧光强度(n＝4)。使用Image J程序测量拍摄图像的荧光强度。
如图12所示(图中深灰色表示Hoechst，浅灰色表示TNF-si-RNA)，对照处理细胞中的相对TNF-αsiRNA荧光强度设定为100(Lipofectamin：100±17.19)，其被设定为100％的细胞内递送率。相比之下，用实施例2处理的细胞中的相对TNF-αsiRNA荧光强度显示约75％(实施例2：75.04±11.25)。也就是说，可以看出实施例2的细胞内递送率约为75％(t-检验：ns)。
(8)确认用TNF-αsiRNA包封的乳源性外泌体的基因沉默效果(体外)
用与电穿孔法相同的条件在乳源性外泌体上形成孔，并将乳源性外泌体和TNF-αsiRNA以1mg:14μg的比例混合，并孵育3h。用不同浓度的包封有TNF-αsiRNA(实施例2)的乳源性外泌体处理用LPS预激活(1μg/ml，24h)的RAW264.7细胞。24h后，通过qRT-PCR测量TNF-αmRNA水平。结果，确认了TNF-αmRNA的表达以浓度依赖性方式降低(图13)。
(9)确认抗炎效果(体内)
用DSS2.5％诱导炎症性肠病(IBD)动物模型(BALB/c，雌性，8w)。以3天为间隔腹膜内注射乳源性外泌体(对比例2)和包封有TNF-αsiRNA的乳源性外泌体(实施例2)，并测量体重变化和疾病活动指数(DAI)(图14a)。评分表如表2所示。此外，通过H&E观察肠道长度和结肠组织，并且H&E实验方法与实施例1.(12)的相同。
确认了以3天间隔腹膜内注射实施例2导致体重减轻，这在IBD模型中是典型的(图14b)，并且可以看出用TNF-αsiRNA包封的乳源性外泌体具有IBD炎性治疗效果(图14c)。
实施方案
-实施方案1：一种用于改善肠道健康功能的组合物，包括：乳源性外泌体；和治疗剂，其中治疗剂是DNA、RNA或小分子，并且治疗剂被定位和包封在外泌体内部的空间中。
-实施方案2：实施方案1的组合物，其中所述组合物具有60％至90％的细胞内递送率。
-实施方案3：实施方案1或2中任一项的组合物，其中所述乳汁是人、牛、绵羊、长尾山羊、山羊、骆驼、水牛或牦牛来源的乳汁或初乳。
-实施方案4：实施方案1至3中任一项的组合物，其中所述RNA是一种或多种选自由siRNA、miRNA、mRNA、shRNA、ncRNA和反义RNA组成的组的RNA。
-实施方案5：实施方案4的组合物，其中所述siRNA是一种或多种选自由TNF-αsiRNA、TGF-βsiRNA、JAK3 siRNA和IL-6R siRNA组成的组的siRNA。
-实施方案6：实施方案4的组合物，其中所述miRNA是一种或多种选自由Let-7b-5p、miR-320a-3p和miR-21组成的组的miRNA。
-实施方案7：实施方案1至6中任一项的组合物，其中所述组合物是液体制剂，并且包括包封有浓度为100至1000μg/ml的治疗剂的乳源性外泌体。
-实施方案8：实施方案1至7中任一项的组合物，其中所述组合物是冻干制剂，并且包括包封有基于组合物总重量的0.001至100wt％的治疗剂的乳源性外泌体。
-实施方案9：实施方案1至8中任一项的组合物，其中所述组合物是口服施用的。
-实施方案10：一种制备实施方案1至9中任一项的组合物的方法，包括以下步骤：(a)从乳汁中分离外泌体；(b)通过对分离的外泌体进行电穿孔，在外泌体表面形成微孔；(c)将步骤(b)中经电穿孔的外泌体与治疗剂混合；和(d)除去没有被包封在外泌体内部的治疗剂。
-实施方案11：实施方案10的方法，其中步骤(b)的电穿孔施加250至350V的电压。
-实施方案12：实施方案10至11中任一项的方法，其中步骤(b)的电穿孔施加3至7次脉冲。
-实施方案13：实施方案10至12中任一项的方法，其中步骤(b)的电穿孔施加20至40ms时间段的脉冲。
-实施方案14：实施方案10或13中任一项的方法，其中步骤(a)的乳汁是人、牛、绵羊、长尾山羊、山羊、骆驼、水牛或牦牛来源的乳汁或初乳。
-实施方案15：实施方案10至14中任一项的方法，其中步骤(c)中的治疗剂是DNA，并且其中步骤(d)是加入脱氧核糖核酸酶以除去未包封的治疗剂。
-实施方案16：实施方案10至15中任一项的方法，其中步骤(c)中的治疗剂是RNA，并且其中步骤(d)是加入核糖核酸酶以除去未包封的治疗剂。
-实施方案17：实施方案16的方法，其中所述RNA是一种或多种选自由siRNA、miRNA、mRNA、shRNA、ncRNA和反义RNA组成的组的RNA。
-实施方案18：实施方案17的方法，其中所述siRNA是一种或多种选自由TNF-αsiRNA、TGF-βsiRNA、JAK3 siRNA和IL-6R siRNA组成的组的siRNA。
实施方案19：实施方案17的方法，其中所述miRNA是一种或多种选自由Let-7b-5p、miR-320a-3p和miR-21组成的组的miRNA。

Claims (19)

1.一种用于改善肠道健康功能的组合物，包括：
乳源性外泌体；和
治疗剂，
其中所述治疗剂是DNA、RNA或小分子，并且
其中所述治疗剂被定位和包封在外泌体内部的空间中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有60％至90％的细胞内递送率。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乳汁是人、牛、绵羊、长尾山羊、山羊、骆驼、水牛或牦牛来源的乳汁或初乳。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA是一种或多种选自由siRNA、miRNA、mRNA、shRNA、ncRNA和反义RNA组成的组的RNA。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述siRNA是一种或多种选自由TNF-αsiRNA、TGF-βsiRNA、JAK3 siRNA和IL-6R siRNA组成的组的siRNA。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述miRNA是一种或多种选自由Let-7b-5p、miR-320a-3p和miR-21组成的组的miRNA。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是液体制剂，并且包括包封有浓度为100至1000μg/ml的治疗剂的乳源性外泌体。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是冻干制剂，并且包括包封有基于组合物总重量的0.001至100wt％的治疗剂的乳源性外泌体。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是口服施用的。
10.一种制备权利要求1至9中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从乳汁中分离外泌体；
(b)通过对分离的外泌体进行电穿孔，在外泌体表面形成微孔；
(c)将步骤(b)中经电穿孔的外泌体与治疗剂混合；和
(d)除去没有被包封在外泌体内部的治疗剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(b)中所述的电穿孔施加250至350V的电压。
12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(b)中所述的电穿孔施加3至7次脉冲。
13.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(b)中所述的电穿孔施加20至40ms时间段的脉冲。
14.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(a)中所述的乳汁是人、牛、绵羊、长尾山羊、山羊、骆驼、水牛或牦牛来源的乳汁或初乳。
15.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(c)中所述的治疗剂是DNA，并且
其中步骤(d)是加入脱氧核糖核酸酶以除去未包封的治疗剂。
16.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(c)中所述的治疗剂是RNA，并且
其中步骤(d)是加入核糖核酸酶以除去未包封的治疗剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述RNA是一种或多种选自由siRNA、miRNA、mRNA、shRNA、ncRNA和反义RNA组成的组的RNA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述siRNA是一种或多种选自由TNF-αsiRNA、TGF-βsiRNA、JAK3 siRNA和IL-6R siRNA组成的组的siRNA。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述miRNA是一种或多种选自由Let-7b-5p、miR-320a-3p和miR-21组成的组的miRNA。
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