CN118697937B - 一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料及其制备方法 - Google Patents

一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料及其制备方法

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Abstract

本发明公开了一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料及其制备方法。其制备方法包括如下：1)使用沉淀法制备介孔二氧化锰MMD，随后结合循环超声负载法在MMD的孔道中负载促成骨药物，并利用原位自由基聚合法在其表面包覆缓释聚多巴胺PDA涂层得到MMD‑O‑PDA；2)将MMD‑O‑PDA与带有氨基的可紫外光固化聚合物溶液混合均匀，置于具有特殊图案化表面的定制PDMS模具之上，覆盖透明石英片后UV固化，脱模；3)结合交联剂在复合水凝胶材料表面原位接枝黏附蛋白，超频透析后即得所述水凝胶材料。所述材料具有高效促细胞黏附作用，可在缺损原位迅速富集成骨细胞，同时兼具抗炎、全周期促成骨作用，从而高效促进颅骨缺损部位修复。

Description

一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料及其 制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料制备领域，具体涉及一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料及其制备方法。
背景技术
颅骨缺损一直是临床所面临的难题之一，发病率逐年上升。颅骨缺损常见于外伤或去骨瓣减压术后，临界尺寸的颅骨缺损无法自行愈合，需要依靠骨修复材料进行修补。临床上常见的颅骨修复材料为钛合金网或者PEEK材料，其中钛网的生物相容性相对一般，缺损边缘愈合时间长，且力学性质与自体骨相差甚远；PEEK材料有更好的生物相容性与力学性质，但价格过于昂贵，大多数患者难以接受。为此，设计一种能高效促进颅骨缺损修复的生物材料迫在眉睫。
随着组织工程的迅猛发展，涌现出多种多样的促颅骨缺损修复的生物活性水凝胶材料。然而，常见的水凝胶材料存在缺损局部细胞招募能量差，细胞黏附效率低下的问题，且对于局部的异物炎症反应抑制能力极其有限，导致修复效率低下，甚至直接导致修复失败。此外，成骨是一个长周期过程，大多数载药水凝胶仅在初期发挥促成骨作用，对后期的骨痂重建几乎不起作用。为此，本发明设计了一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料，通过图案化表面与黏附蛋白包覆，极大程度地促进了局部细胞黏附，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料及其制备方法，该方法使用带有氨基的可紫外光固化聚合物、MMD、促成骨药物、黏附蛋白等原料，通过沉淀法、超声负载法、原位自聚合法、化学接枝法等组合工艺成功制备了一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料，能够高效促进局部细胞黏附，在缺损原位迅速富集成骨细胞，且兼具抗炎、全周期促成骨作用，可高效促进颅骨缺损部位修复。
该水凝胶材料的制备方法包括如下：
1)MMD与MMD-O-PDA的制备：以高锰酸钾与过氧化氢为原料，使用沉淀法制备MMD材料；经过清洗与透析后，利用循环超声负载法在MMD孔道内负载促成骨药物；负载完成后，利用原位自由基聚合法在MMD表面包覆缓释聚多巴胺涂层，得到MMD-O-PDA；
2)复合水凝胶材料的制备：在避光和加热条件下溶解带有氨基的可紫外光固化聚合物，待温度降低至室温后将MMD-O-PDA、MMD与带有氨基的可紫外光固化聚合物溶液预混合，将预混液置于事先涂覆脱模剂的具有图案化表面的PDMS模具之上，覆盖接触面涂覆有脱模剂的透明石英片后进行UV固化，循环冷冻脱模后得到复合水凝胶材料；
3)复合水凝胶表面黏附蛋白的接枝：将上述水凝胶材料浸入交联剂中，随后迅速取出且立刻浸入黏附蛋白溶液之中，使用超纯水去除表面残余的黏附蛋白后重复上述过程3-5次；接枝黏附蛋白后进行透析去除残留交联剂与辐照灭菌，即得到所需具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料。
进一步的，步骤1)中，MMD与MMD-O-PDA制备过程如下：配制0.05-0.2mol/L的KMnO4水溶液，随后缓慢滴加30％过氧化氢，同时使用1mol/L KOH或NaOH维持溶液pH为弱碱性(约8-10)；待不再产生明显气泡后停止滴加过氧化氢，室温持续搅拌至少30min，静置陈化2-8h；将产物抽滤，去离子水清洗3-5次后重新分散于去离子水中，搅拌清洗24-48h，停止搅拌后自然沉降；上述抽滤-清洗-沉降步骤重复1-2周，制得MMD。
进一步的，步骤1)中，将制得的MMD重新研磨后置于含有促成骨药物的PBS溶液中，超声负载使得药物进入微孔中，离心得到沉淀后冻干，其中MMD的浓度为0.1-0.5wt％；促成骨药物可为BMP-2、BMP-7、SGF、IGF等的一种或几种，浓度为2-10mg/ml；超声负载功率为80-120w，负载时间为30-60min，负载温度为0-4℃；以上超声负载-离心冻干过程重复4-10次。上述载药MMD经过PBS清洗3-5次后，置于含多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液(pH＝8.5)中，室温条件下摇床上反应4-8h，其中DA的浓度为4-8mg/ml；反应结束后，使用PBS清洗3-5次；
进一步的，步骤2)中，带有氨基的可紫外光固化聚合物可为GelMA、SilMA中的一种或两种的组合物，浓度为5-25％，如果是组合物，其质量比范围为3：1-1：3；MMD-O-PDA的添加量为0.1-0.2wt％，空白MMD(即所述MMD材料)的添加量为0.1-0.2wt％；聚合物溶液中含光引发剂，光引发剂为LAP、Irgacure2100、Darocur 1173中的一种或几种，浓度为0.1-0.25wt％；
进一步的，所述PDMS模具表面的图案为微米尺度的沟槽或柱的阵列结构，其中沟槽的宽度为1-5um，沟槽的深度为0.5-3um，沟槽之间的间距为400nm-4um；柱的直径为4-12um，高度为10-50um，柱之间的间距为10-20um；将上述带有氨基的可紫外光固化聚合物滴加至PDMS模具图案上部，结合超声扩散工艺使聚合物溶液均匀渗入微图案表面中，随后使用平整无菌的石英片轻轻覆盖至上方，超声功率60-100W，超声时间5-10min；脱模剂为丙三醇、乙二醇中的一种或两种；UV波长为405nm，功率为20-50w，时间为5-10min；固化后循环冷冻脱模，将模具置于-80℃冰箱内速冻3-5min，随后取出待其自然解冻，冷冻-解冻过程重复2-3次，之后将凝胶从模具上轻轻取下，浸泡于无菌PBS溶液中待用；
进一步的，步骤3)中，交联剂可为戊二醛或京尼平，浓度为0.05-0.25wt％，复合水凝胶在交联剂中的浸泡时间为3-5s；黏附蛋白可为Fibronectin、Laminin、ColⅢ等中的一种或几种，浓度为0.1-0.5wt％，浸泡时间为1-2h；所述透析为超高频透析，即使用PBS溶液，每15-30min换液一次，透析3-6h。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
1.本发明使用生物降解水凝胶、MMD、促成骨药物、黏附蛋白等原料，通过模板法、沉淀法、循环超声负载法、原位自聚合法、表面接枝法、超频透析等组合工艺成功制备了一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料，上述原料选择以及组合工艺为本发明独创；
2.本发明着眼于颅骨缺损修复的全周期闭环修复策略，初期招募成骨细胞为缺损修复提供细胞基础，且锰离子的抗炎作用可提供良好的成骨微环境；后期缓释的促成骨药物可为成骨提供良好的全周期支持，同时持续缓释的锰离子起到长效抗炎作用；良好的生物降解性可在后期为新生骨组织连接提供空间基础，此全周期修复策略具有高度创新性；
3.细胞是骨修复的基础。本发明针对常规水凝胶材料细胞迁移速率低，黏附效率低下等问题，开创性地设计凝胶微图案化表面以及黏附蛋白接枝双重结构。通过微图案化表面增加成骨细胞的增殖活性与定向迁移能力，使得细胞成分可以更快地填补缺损，同时表面黏附蛋白的引入进一步使得细胞黏附效率大大增加，增加其生物相容性，与微图案化表面形成协同作用，极大地促进缺损修复效果；4.本发明考虑到植入初期面临的感染风险，加入了空白MMD，使其在早期即可释放足够浓度的锰离子；锰离子同时具有抗炎、抗组织水肿作用，同时也具有微弱的促成骨作用，可显著提高植入成功率；同时考虑到常规的载药水凝胶存在药物释放不可控、载药效率低下、药物半衰期短等问题，使用了MMD-O-PDA作为纳米载药填料：MMD-O-PDA同时具有聚合物外层和多孔结构，形成双重缓释作用，使其内含的促成骨因子初期释放较慢，且作用时间较长，可以在缺损修复的全周期发挥作用，与生理性成骨过程相匹配；而且在MMD自身可缓慢释放锰离子的同时，外层的水凝胶基质对其的物理包覆作为第三重缓释作用，使其在成骨全周期均可持续释放锰离子，起到长效抗炎作用。
5.本发明通过对各种工艺技术的合理组合，实现了工艺创新：使用循环浸渍工艺，在含有氨基的水凝胶表面接枝黏附蛋白，克服了传统吸附工艺蛋白附着强度低的问题；MMD具有纳米多孔结构，表面张力较大，常规药物负载手段难以实现足量、均一载药，本发明利用超声负载法，巧妙地解决了这一问题；原位自聚合法形成的PDA涂层与MMD的多孔结构形成双重缓释作用；图案化PDMS模板结合UV固化法，操作简便，避免了昂贵的3D打印法；快速透析法(即超频透析)脱除残留交联剂，既快速脱除了交联剂，又最大程度地保留了MMD内负载的药物。
附图说明
图1MMD的TEM图片；
图2具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料的图案化模具的几种具体实例设计示意图；
图3具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料制备流程示意图；
图4具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料中锰离子释放曲线(对应实施例3)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。本发明的具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料的制备方法流程如图3所示，其中所涉及的模具，其图案化为微米尺度的沟槽或柱的阵列结构，如图2为本发明一些具体实施例中所用到的模具图案示意图，在本发明的其他实施例中，也可采用其他的微米尺度的沟槽或柱的阵列结构图案，在此不再赘述。
实施例1
1)MMD与载药缓释MMD的制备：配置0.1mol/L的KMnO4水溶液，随后缓慢滴加30％过氧化氢，同时使用1mol/L KOH维持溶液pH为弱碱性(约8-10)；待不再产生明显气泡后停止滴加过氧化氢，室温持续搅拌30min，静置陈化4h；将产物抽滤，去离子水清洗3次后重新分散于去离子水中，搅拌清洗24h，停止搅拌后自然沉降；上述抽滤-清洗-沉降步骤重复1周，制得MMD。将MMD重新研磨后置于含有5mg/ml BMP-2的PBS溶液中(含0.5％MMD)，超声负载60min使得药物进入微孔中，超声过程重复5次后，离心得到沉淀后冻干。所得载药MMD使用PBS清洗3次，随后置于含4mg/ml DA的Tris-HCl溶液(pH＝8.5)中，室温条件下摇床上反应8h；反应结束后，使用PBS清洗3次，得到载药缓释MMD材料即MMD-O-PDA；
2)复合水凝胶材料的制备：在避光和60℃加热条件下使用含0.25％LAP的PBS溶液溶解GelMA(GelMA浓度10％wt)得GelMA溶液，待温度降低至室温后将载药缓释MMD、空白MMD(预混液中二者浓度均为0.1wt％)与GelMA溶液预混合，将预混液置于事先涂覆微量丙三醇的普通PDMS模具(未经过微图案化处理)之上，覆盖接触面涂覆有微量丙三醇的透明石英片后进行UV固化，循环冷冻脱模后得到复合水凝胶材料；
3)复合水凝胶表面黏附蛋白的接枝：将上述水凝胶材料浸入0.1wt％的京尼平溶液中，随后迅速取出且立刻浸入0.1wt％Fibronectin溶液之中，1h后使用超纯水去除表面残余的黏附蛋白后重复上述过程5次；之后PBS透析6小时，每30分钟换液一次；最后进行辐照灭菌、封装，即得到复合颅骨修复水凝胶材料。
该复合水凝胶材料体外28天降解率为75％，表面接种细胞后，12h可见细胞完全黏附，培养7天后，活死细胞荧光染色显示活细胞占比92％；用于大鼠颅骨缺损模型修补，术后4周显示缺损修复程度一般，HE染色显示局部炎症反应较轻微。
实施例2
1)MMD与载药缓释MMD的制备：配置0.1mol/L的KMnO4水溶液，随后缓慢滴加30％过氧化氢，同时使用1mol/L KOH维持溶液pH为弱碱性(约8-10)；待不再产生明显气泡后停止滴加过氧化氢，室温持续搅拌30min，静置陈化4h；将产物抽滤，去离子水清洗3次后重新分散于去离子水中，搅拌清洗24h，停止搅拌后自然沉降；上述抽滤-清洗-沉降步骤重复1周，制得MMD。将MMD重新研磨后置于含有5mg/ml BMP-2的PBS溶液中(含0.5％MMD)，超声负载60min使得药物进入微孔中，超声过程重复5次后，离心得到沉淀后冻干。上述载药MMD使用PBS清洗3次，随后置于含4mg/ml DA的Tris-HCl溶液(pH＝8.5)中，室温条件下摇床上反应8h；反应结束后，使用PBS清洗3次，得到载药缓释MMD材料即MMD-O-PDA；
2)复合水凝胶材料的制备：在避光和60℃加热条件下使用含0.25％LAP的PBS溶液溶解GelMA(GelMA浓度10％wt)，得GelMA溶液，待温度降低至室温后将载药缓释MMD、空白MMD(预混液中二者浓度均为0.1wt％)与GelMA溶液预混合，将预混液置于事先涂覆微量丙三醇的定制图案化PDMS模具(图案形状为微槽，槽的宽度为5um，槽的深度为3um，槽之间的间距为4um)之上，覆盖接触面涂覆有微量丙三醇的透明石英片后进行UV固化，循环冷冻脱模后得到复合水凝胶材料；
3)复合水凝胶表面黏附蛋白的接枝：将上述水凝胶材料浸入0.1wt％的京尼平溶液中，随后迅速取出且立刻浸入0.1wt％Fibronectin溶液之中，1h后使用超纯水去除表面残余的黏附蛋白后重复上述过程5次；之后PBS透析6小时，每30分钟换液一次；最后进行辐照灭菌、封装，即得到所需具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料。
与实施例1相比，增加了复合水凝胶表面微图案化，该复合水凝胶材料体外28天降解率为77％，表面接种细胞后，8h可见细胞完全黏附，培养7天后，活死细胞荧光染色显示活细胞占比91％；用于大鼠颅骨缺损模型修补，术后4周显示缺损修复程度较好，HE染色显示局部炎症反应较轻微。
实施例3
1)MMD与载药缓释MMD的制备：配置0.1mol/L的KMnO4水溶液，随后缓慢滴加30％过氧化氢，同时使用1mol/L KOH维持溶液pH为弱碱性(约8-10)；待不再产生明显气泡后停止滴加过氧化氢，室温持续搅拌30min，静置陈化4h；将产物抽滤，去离子水清洗3次后重新分散于去离子水中，搅拌清洗24h，停止搅拌后自然沉降；上述抽滤-清洗-沉降步骤重复1周，制得MMD。将MMD重新研磨后置于含有5mg/ml BMP-2的PBS溶液中(含0.5％MMD)，超声负载60min使得药物进入微孔中，超声过程重复5次后，离心得到沉淀后冻干。上述载药MMD使用PBS清洗3次，随后置于含4mg/ml DA的Tris-HCl溶液(pH＝8.5)中，室温条件下摇床上反应8h；反应结束后，使用PBS清洗3次，得到载药缓释MMD材料即MMD-O-PDA；
2)复合水凝胶材料的制备：在避光和60℃加热条件下使用含0.25％LAP的PBS溶液溶解GelMA(GelMA浓度10％wt)，得GelMA溶液，待温度降低至室温后将载药缓释MMD、空白MMD(预混液中二者浓度均为0.1wt％)与GelMA溶液预混合，将预混液置于事先涂覆微量丙三醇的定制图案化PDMS模具(图案形状为微柱，柱的直径为10um，高度为50um，柱之间的间距为20um)之上，覆盖接触面涂覆有微量丙三醇的透明石英片后进行UV固化，循环冷冻脱模后得到复合水凝胶材料；
3)复合水凝胶表面黏附蛋白的接枝：将上述水凝胶材料浸入0.1wt％的京尼平溶液中，随后迅速取出且立刻浸入0.1wt％Fibronectin溶液之中，1h后使用超纯水去除表面残余的黏附蛋白后重复上述过程5次；之后PBS透析6小时，每30分钟换液一次；最后进行辐照灭菌、封装，即得到所需具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料。
与实施例1相比，增加了复合水凝胶表面微图案化，且图案与实施例2有差异，该复合水凝胶材料体外28天降解率为74％，表面接种细胞后，5h可见细胞完全黏附，培养7天后，活死细胞荧光染色显示活细胞占比92％；用于大鼠颅骨缺损模型修补，术后4周显示缺损修复程度较好，HE染色显示局部炎症反应较轻微。
实施例4
1)MMD与载药缓释MMD的制备：配置0.1mol/L的KMnO4水溶液，随后缓慢滴加30％过氧化氢，同时使用1mol/L KOH维持溶液pH为弱碱性(约8-10)；待不再产生明显气泡后停止滴加过氧化氢，室温持续搅拌30min，静置陈化4h；将产物抽滤，去离子水清洗3次后重新分散于去离子水中，搅拌清洗24h，停止搅拌后自然沉降；上述抽滤-清洗-沉降步骤重复1周，制得MMD。将MMD重新研磨后置于含有5mg/ml BMP-2的PBS溶液中(含0.5％MMD)，超声负载60min使得药物进入微孔中，超声过程重复5次后，离心得到沉淀后冻干。上述载药MMD使用PBS清洗3次，随后置于含4mg/ml DA的Tris-HCl溶液(pH＝8.5)中，室温条件下摇床上反应8h；反应结束后，使用PBS清洗3次，得到载药缓释MMD材料即MMD-O-PDA；
2)复合水凝胶材料的制备：在避光和60℃加热条件下使用含0.25％LAP的PBS溶液溶解GelMA(GelMA浓度为10％wt)，得GelMA溶液，待温度降低至室温后将载药缓释MMD、空白MMD(二者浓度均为0.1wt％)与GelMA溶液预混合，将预混液置于事先涂覆微量丙三醇的定制图案化PDMS模具(图案形状为微槽，槽的宽度为5um，槽的深度为3um，槽之间的间距为4um)之上，覆盖接触面涂覆有微量丙三醇的透明石英片后进行UV固化，循环冷冻脱模后得到复合水凝胶材料；
3)复合水凝胶表面黏附蛋白的接枝：将上述水凝胶材料浸入0.1wt％的京尼平溶液中，随后迅速取出且立刻浸入0.2wt％Fibronectin溶液之中，1h后使用超纯水去除表面残余的黏附蛋白后重复上述过程10次；之后PBS透析6小时，每30分钟换液一次；最后进行辐照灭菌、封装，即得到所需具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料。
与实施例2相比，增加了黏附蛋白的浓度与循环浸渍次数，该复合水凝胶材料体外28天降解率为75％，表面接种细胞后，4h可见细胞完全黏附，培养7天后，活死细胞荧光染色显示活细胞占比96％；由于大鼠颅骨缺损模型修补，术后4周显示缺损修复程度较好，HE染色显示局部炎症反应较轻微。
实施例5
1)MMD与载药缓释MMD的制备：配置0.1mol/L的KMnO4水溶液，随后缓慢滴加30％过氧化氢，同时使用1mol/L KOH维持溶液pH为弱碱性(约8-10)；待不再产生明显气泡后停止滴加过氧化氢，室温持续搅拌30min，静置陈化4h；将产物抽滤，去离子水清洗3次后重新分散于去离子水中，搅拌清洗24h，停止搅拌后自然沉降；上述步骤重复1周，制得MMD。将MMD重新研磨后置于含有5mg/ml BMP-2的PBS溶液中(含0.5％MMD)，超声负载60min使得药物进入微孔中，超声过程重复5次后，离心得到沉淀后冻干。上述载药MMD使用PBS清洗3次，随后置于含4mg/ml DA的Tris-HCl溶液(pH＝8.5)中，室温条件下摇床上反应8h；反应结束后，使用PBS清洗3次，得到载药缓释MMD材料即MMD-O-PDA；
2)复合水凝胶材料的制备：在避光和60℃加热条件下使用含0.25％LAP的PBS溶液溶解GelMA(GelMA浓度为10％wt)得GelMA溶液，待温度降低至室温后将载药缓释MMD、空白MMD(预混液中二者浓度均为0.2wt％)与GelMA溶液预混合，将预混液置于事先涂覆微量丙三醇的定制图案化PDMS模具(图案形状为微槽，槽的宽度为5um，槽的深度为3um，槽之间的间距为4um)之上，覆盖接触面涂覆有微量丙三醇的透明石英片后进行UV固化，循环冷冻脱模后得到复合水凝胶材料；
3)复合水凝胶表面黏附蛋白的接枝：将上述水凝胶材料浸入0.1wt％的京尼平溶液中，随后迅速取出且立刻浸入0.1wt％Fibronectin溶液之中，1h后使用超纯水去除表面残余的黏附蛋白后重复上述过程5次；之后PBS透析6小时，每30分钟换液一次；最后进行辐照灭菌、封装，即得到所需具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料。
与实施例2相比，增加了MMD与MMD-O-PDA的用量，该复合水凝胶材料体外28天降解率为69％，表面接种细胞后，8h可见细胞完全黏附，培养7天后，活死细胞荧光染色显示活细胞占比84％；由于大鼠颅骨缺损模型修补，术后4周显示缺损修复程度较好，HE染色显示局部几乎无炎症反应。
以上所述仅为本发明的部分较佳实施例，仅用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）MMD与MMD-O-PDA的制备：以高锰酸钾与过氧化氢为原料，使用沉淀法制备介孔二氧化锰MMD材料；经过清洗与透析后，利用循环超声负载法在MMD孔道内负载促成骨药物；负载完成后，利用原位自由基聚合法在MMD表面包覆缓释聚多巴胺涂层，得到MMD-O-PDA；
2）复合水凝胶材料的制备：在避光和加热条件下溶解带有氨基的可紫外光固化聚合物，待温度降低至室温后将所述MMD-O-PDA、所述MMD材料与带有氨基的可紫外光固化聚合物溶液预混合，将预混液置于事先涂覆脱模剂的具有图案化表面的PDMS模具之上，覆盖接触面涂覆有脱模剂的透明石英片后进行UV固化，循环冷冻脱模后得到复合水凝胶材料；其中，PDMS模具表面的图案为微米尺度的沟槽或柱的阵列结构，其中沟槽的宽度为1-5um，沟槽的深度为0.5-3um，沟槽之间的间距为400nm-4um；柱的直径为4-12um，高度为10-50um，柱之间的间距为10-20um；将所述预混液滴加至PDMS模具图案上部，结合超声扩散工艺使预混液均匀渗入微图案表面中，随后使用平整无菌的石英片轻轻覆盖至PDMS模具上方，超声功率60-100W，超声时间5-10min；脱模剂为丙三醇、乙二醇中的一种或两种；UV波长为405nm，功率为20-50w，时间为5-10min；固化后循环冷冻脱模，将模具置于-80℃冰箱内速冻3-5min，随后取出待其自然解冻，冷冻-解冻过程重复2-3次，之后将凝胶从模具上轻轻取下，浸泡于无菌PBS溶液中待用；
3）复合水凝胶表面黏附蛋白的接枝：将上述复合水凝胶材料浸入交联剂中，随后迅速取出且立刻浸入黏附蛋白溶液之中，取出后使用超纯水去除表面残余的黏附蛋白，重复上述过程3-5次；接枝黏附蛋白后进行透析去除残留交联剂与辐照灭菌，即得到所述具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料。
2.根据权利要求1所述的具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中，配制0.05-0.2mol/L的KMnO4水溶液，随后缓慢滴加30%过氧化氢，同时维持溶液pH为8-10；待不再产生明显气泡后停止滴加过氧化氢，室温持续搅拌至少30min，静置陈化2-8h；将产物抽滤，去离子水清洗3-5次后重新分散于去离子水中，搅拌清洗24-48h，停止搅拌后自然沉降；上述抽滤-清洗-沉降步骤重复1-2周，制得MMD材料。
3.根据权利要求1所述的具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中，将制得的MMD材料重新研磨后置于含有促成骨药物的PBS溶液中，超声负载使得药物进入MMD材料的微孔中，离心得到沉淀后冻干得到载药MMD，所述溶液中MMD的添加浓度为0.1-0.5wt%；促成骨药物为BMP-2、BMP-7、SGF、IGF中的一种或几种，浓度为2-10mg/ml；超声负载功率为80-120w，负载时间为30-60min，负载温度为0-4℃；以上超声负载-离心冻干过程重复4-10次；上述载药MMD经过PBS清洗3-5次后，置于pH8.5的含多巴胺（DA）的Tris-HCl溶液中，室温条件下摇床上反应4-8h，其中DA的浓度为4-8mg/ml；反应结束后，使用PBS清洗3-5次，得到MMD-O-PDA。
4.根据权利要求1所述的具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于：步骤2）中，带有氨基的可紫外光固化聚合物为GelMA、SilMA中的一种或两种的组合物，浓度为5-25%，当为两种组合物，则两组分质量比为3：1-1：3；所述预混液中MMD-O-PDA的添加量为0.1-0.2wt%，MMD材料的添加量为0.1-0.2wt%；光引发剂为LAP、Irgacure 2100、Darocur 1173中的一种或几种，浓度为0.1-0.25wt%。
5.根据权利要求1所述的一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于：步骤3）中，交联剂为戊二醛或京尼平，浓度为0.05-0.25wt%，复合水凝胶在交联剂中的浸泡时间为3-5s；黏附蛋白为Fibronectin、Laminin、Col Ⅲ中的一种或几种，浓度为0.1-0.5wt%，浸泡时间为1-2h；所述透析使用PBS溶液，为每15-30min换液一次，透析3-6h。
6.一种具有图案化促黏附表面的复合颅骨修复水凝胶材料，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述的方法制得。
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