CN118401552A - 人源化抗egfrviii抗体及其抗原结合片段 - Google Patents
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Abstract
提供了特异性结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗原结合剂,如人源化抗体或其抗原结合片段。EGFRvIII特异性人源化抗体或其抗原结合片段可用于癌症的治疗。
Description
技术领域
本公开内容提供了特异性结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的人源化抗原结合剂,如抗体或其抗原结合片段。本公开内容的EGFRvIII特异性抗体或其抗原结合片段可以用于,例如,治疗癌症,作为抗体-药物缀合物、放射免疫缀合物、嵌合抗原受体(CAR)和靶向EGFRvIII表达细胞的双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
背景技术
表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)被扩增、高度表达并存在于25-64%的多形性胶质母细胞瘤(GBM)中。应该注意的是,不同的检测方法产出不一致的结果,但是使用多种互补技术在乳腺癌的子集以及头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中检测到了EGFRvIII mRNA和蛋白表达(综述于Gan等人2013年)。与在上皮组织、间充质和神经元来源的组织中表达并在正常细胞过程(如增殖、分化和发育)中起主要作用的野生型(wt)表皮生长因子受体(EGFR)不同,EGFRvIII不在正常组织上表达。
EGFRvIII变体起源于EGFR基因的外显子2-7的框内缺失,导致编码细胞外结构域267个氨基酸残基的序列的去除。新形成的剪接连接点编码甘氨酸残基,该残基在野生型人EGFR中没有对应物,并因此形成新表位。此外,大量研究显示,正常组织缺乏EGFRvIII。因此,EGFRvIII含有新的肿瘤特异性细胞表面表位,其可被利用于抗体靶向治疗。然而,与人序列的剩余部分相比,EGFRvIII新表位不是很具有免疫原性,并且迄今为止生成的很多抗体尚未显示出特异性地识别EGFRvIII(综述于Gan等人2013年)。
在极少数情况下,已经描述了针对EGFRvIII新表位的单克隆抗体(mAb),包括抗体13.1.2(美国专利号7,736,644),其也被Amgen开发成抗体药物缀合物(ADC)(AMG 595:Hamblett K.J等人,Molecular Cancer Therapeutics,Vol.14(7),pp.1614-24,2015)。美国专利号9,562,102也描述了由Abbvie开发的806抗体(ABT-806,ABT-414),该抗体与EGFRvIII以及在过表达EGFR的肿瘤细胞上扩增的EGFR子集结合(Cleary,JM等人,InvestNew Drugs,33(3),pp.671-8,2015;Reilly,EB.,Molecular Cancer Therapeutics,Vol.14(5),pp.1141-51,2015)。尽管已显示该抗体在临床前期模型中优先与肿瘤EGFR结合,但已显示该抗体与人皮肤中存在的wt EGFR的结合解释了ABT-806在一些患者中展示出的皮肤毒性(Cleary等人,2015)。
特异性靶向EGFR表达细胞中不存在或不可接近的EGFRvIII表位的人源化抗体或其抗原结合片段将会有益于改善的治疗(即癌症治疗)。
发明内容
提供了特异性结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗原结合剂,如人源化抗体或其人源化抗原结合片段。
如下文更详细描述地,一些抗EGFRvIII人源化抗体或其抗原结合片段可能结合在癌细胞(例如,胶质母细胞瘤细胞)表面的EGFRvIII。在一些实施方案中,人源化抗体或其抗原结合片段不显着地结合在癌细胞上表达的EGFR(例如,U87MG-EGFR WT)。
本公开内容的人源化抗体或其抗原结合片段可以被癌细胞内化,并因此在其一个方面可用于货物分子的递送。特别考虑的是与治疗性部分缀合的抗EGFRvIII人源化抗体或其抗原结合片段。本文中描述的抗EGFRvIII人源化抗体可用于抑制表达EGFRvIII的肿瘤细胞的生长。
在本公开内容的一些实施方案中,抗EGFRvIII人源化抗体或其抗原结合片段可能能够结合在天然EGFRvIII(例如,天然重组EGFRvIII)和变性EGFRvIII(例如,变性重组EGFRvIII)两者中存在的表位。
本公开内容的实施方案特别地包括抗EGFRvIII人源化抗体或其抗原结合片段,其包含抗EGFRvIII 4E11抗体的互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中,特异性结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或其抗原结合片段,其中抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段包含:
重链可变区,包含氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWX1GYIGYNGRTSYNPSLKSRX2TISX3DTSKNQFSLKLSSVTA
ADTAVYYCARLGRGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3),其中
X1=I或M,X2=V或I,和X3=V或R;以及,
轻链可变区,包含氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGINSNIGWX4QQKPGKAX5
KX6LIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCV
QYAQFPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:4),其中X4=Y或L,X5=P
或F,X6=L或G。
在一些实施方案中,抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段包含:
重链可变序列是选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO 7中的任何一个;以及,
轻链可变序列是选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中的任何一个。
在一个实施方案中,抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段是嵌合抗原受体、双特异性T细胞衔接器、双特异性杀伤细胞衔接器、三特异性杀伤细胞衔接器或任何免疫治疗化合物,如抗体-药物缀合物(ADC)或用于检测的化合物,如放射免疫缀合物。
在一个实施方案中,抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、单链抗体或多特异性抗体。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含人IgG恒定区。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合片段包含人IgG4恒定区。
在一个实施方案中,抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段包含带有S228P突变的人IgG4恒定区。
在一个实施方案中,抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段特异性结合EGFRvIII,其中抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段包含重链序列和轻链序列,其中:
重链序列是SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15;以及,
轻链序列为SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
在一个实施方案中,抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段包含scFv、Fab、Fab'或(Fab')2。
在一个实施方案中,抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段与货物分子连接。在一些实施方案中,货物分子包含治疗性部分。在一些实施方案中,治疗性部分包含细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗癌剂或放射治疗剂。在一些实施方案中,抗原结合剂,抗原结合结构域,抗体或抗原结合片段与可检测部分缀合。
在一个实施方案中,提供了药物组合物,其包含本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个实施方案中,提供了编码本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区的核酸分子。
在一个实施方案中,提供了试剂盒,其包含本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段中的至少一种。
在一个实施方案中,提供了载体或载体组,其包含编码本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的核酸序列。在一个实施方案中,提供了包含该载体或载体组的分离细胞。在一些实施方案中,分离细胞能够表达、组装和/或分泌抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或其抗原结合片段。
还提供了试剂盒,其包含第一小瓶以及第二小瓶,所述第一小瓶包含编码本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的轻链的核苷酸或载体,所述第二小瓶包含编码本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的重链的核苷酸或载体。
还提供了治疗包含表达EGFRvIII的细胞的癌症的方法,该方法包括向需要的受试者施用本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中,抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段与化学治疗剂组合使用。在一个实施方案中,需要的受试者患有或疑似患有多形性胶质母细胞瘤,患有或疑似患有癌/上皮癌,乳腺癌或HNSCC。
还提供了一种检测EGFRvIII的方法,该方法包括将包含或疑似包含EGFRvIII的样品与本发明任何一种的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段接触。
在一个实施方案中,制备抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的方法包括培养包含编码所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的核酸的细胞,从而产生抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中,所提供的方法还包括将抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或其抗原结合片段与货物分子缀合。在一个实施方案中,货物分子包含治疗性部分或可检测部分。
还提供了治疗患有与EGFRvIII表达相关的癌症的受试者的方法,该方法包括施用表达本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的细胞,其中抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段是嵌合抗原受体、双特异性T细胞衔接器、双特异性杀伤细胞衔接器或三特异性杀伤细胞衔接器或抗体-药物缀合物。在一个实施方案中,需要的受试者患有或疑似患有胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、癌/上皮癌、乳腺癌、口腔癌或HNSCC。在一个实施方案中,所提供的方法包括T细胞、NK细胞或受试者自体的免疫细胞。在一个实施方案中,分离细胞群被工程化以表达本发明的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中,分离细胞群是人起源的。在一个实施方案中,分离细胞群包含T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞及其组合。在一个实施方案中,T细胞包含CD4+T细胞,CD8+T细胞或其组合。
在一个实施方案中,分离细胞群被工程化以表达对相同靶标或不同靶标的另一抗原具有亲和力的另一嵌合抗原受体。在一个实施方案中,分离细胞群包含宿主的免疫细胞。
提供了包含分离细胞群和药学上可接受的缓冲剂或赋形剂的药物组合物。
根据本公开内容,人源化抗体或其抗原结合片段可以具有例如,亲和力小于100nM,例如亲和力为50nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、5nM或更小等。
本公开内容的实施方案包括人源化抗体或其抗原结合片段,其可包含人IgG恒定区。本公开内容的人源化抗体或抗原结合片段可包含,例如且不限于人IgG1恒定区、人IgG2恒定区或人IgG4恒定区。
根据本公开内容,人源化抗体或其抗原结合片段可以是完整大小的IgG抗体、单链抗体或多特异性抗体(例如,双特异性抗体)。
本公开内容的双特异性抗体或其抗原结合片段包括可包含特异性结合第一人EGFRvIII表位的第一条臂和特异性结合第二(非重叠)人EGFRvIII表位的第二条臂的那些(例如,双互补位抗体)。
本公开内容的双特异性抗体或其抗原结合片段的其他实施方案包括可包含特异性结合第一人EGFRvIII表位的第一条臂和特异性结合另一抗原的第二条臂的那些。
本公开内容的双特异性抗体或其抗原结合片段包括双特异性免疫细胞衔接器,诸如包含特异性结合人EGFRvIII的第一条臂和特异性结合CD3的第二条臂的那些。
根据本公开内容,抗原结合片段包含,例如,scFv、Fab、Fab'或(Fab')2。
在另一个方面,本公开内容提供了可与货物分子连接的抗EGFRvIII人源化抗体或其抗原结合片段。
根据本公开内容,货物分子可包含治疗性部分,如例如细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗癌剂或放射治疗剂。在本公开内容的特定实施方案中,抗体-药物缀合物可包含细胞毒性剂。本公开内容的另一个特定实施方案涉及包含放射治疗剂的抗体-药物缀合物。
根据本公开内容,货物分子可包含可检测部分。
本公开内容的人源化抗体或其抗原结合片段可以以药物组合物的形式提供。药物组合物可包含,例如,药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开内容另外提供了编码本文中公开的人源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和/或重链可变区的核酸分子。
在另一个方面,本公开内容提供了试剂盒,其包含本文中公开的人源化抗体或其抗原结合片段中的至少一种。
本公开内容的其他方面涉及载体或载体组,其可包含编码本文中公开的人源化抗体或抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区的核酸。编码轻链可变区或轻链和重链可变区或重链的核酸可以被提供在相同载体或分别的载体上。
本公开内容的另一方面涉及包含本文中描述的载体或载体组的分离细胞。分离细胞可以能够表达、组装和/或分泌人源化抗体或其抗原结合片段。
本公开内容的其他方面涉及试剂盒,其包括第一小瓶以及第二小瓶,所述第一小瓶包含编码本公开内容的人源化抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸或载体,所述第二小瓶包含编码人源化抗体或其抗原结合片段的重链的核酸或载体。
本公开内容的其他方面涉及治疗包含表达EGFRvIII的细胞(例如肿瘤细胞)的癌症的方法。该方法可包括向需要的受试者施用本文中描述的人源化抗体或其抗原结合片段。在治疗方法中特别考虑了与治疗性部分缀合的抗体或抗原结合片段(ADC)。
本公开内容另外涉及本文中描述的人源化抗体或其抗原结合片段在癌症治疗中的用途。
本公开内容还涉及本文中描述的人源化抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
根据本公开内容,人源化抗体或其抗原结合片段可与化学治疗剂组合使用。
根据本公开内容,需要的受试者患有或疑似患有多形性胶质母细胞瘤。
进一步根据本公开内容,需要的受试者患有或疑似患有癌/上皮癌。
本公开内容的另外方面涉及检测EGFRvIII的方法。该方法可包括将包含或疑似包含EGFRvIII的样品与本文中描述的人源化抗体或抗原结合片段接触。
本公开内容的其他方面涉及制备本公开内容的人源化抗体或其抗原结合片段的方法,其通过培养包含编码人源化抗体或抗原结合片段的核酸或载体的细胞,从而产生人源化抗体或其抗原结合片段。人源化抗体或其抗原结合片段可以因此被分离和/或纯化。
所述方法还可包括将人源化抗体或其抗原结合片段与货物分子如例如治疗性部分缀合。
从下文给出的非限制性详细描述中,本公开内容的进一步的范围、适用性和有利之处将变得显而易见。然而,应当理解的是,该详细描述虽然表明了本公开内容的示例性实施方案,但仅以实例的方式参考附图给出。
附图说明
图1提供了来自VBASE2数据库(Retter等人,2005)的选定的人种系V区和J区序列的序列比对,该序列用于鼠4E11重链可变区(mVH)序列(SEQ ID NO:1)和鼠4E11轻链可变区(mVL)序列(SEQ ID NO:2)的人源化。
图2提供了鼠4E11抗体的可变区的3D模型。重链为黑色,轻链为灰色。CDR被分子表面网格高亮显示,以及CDR环被标记。箭头指向球棒模型,该模型高亮显示了框架区中的6个位置,这些位置被选择用于在一些人源化变体中的回复突变(即,如同在鼠序列中一样保留的氨基酸类型,如标记的)。
图3A-B提供了4E11抗体的人源化重链可变区(SEQ ID NO:5、6和7)之间(图3A)和4E11抗体的人源化轻链可变区(SEQ ID NO:8、9和10)之间(图3B)的序列比对。人源化重链可变区在图3A和本文中被称为hVH1、hVH2和hVH3。CDR环是根据Kabat定义划定的,除了CDR-H1是通过结合Kabat和Chothia定义划定的。人源化轻链可变区在图3B和本文中被称为hVL1、hVL2和hVL3。对于一些人源化序列,向在鼠4E11抗体中的这些位置发现的亲本氨基酸残基的回复突变在黑色背景上以白色字母高亮显示。回复突变的位置被标记并由序列比对上方的箭头指示。
图4显示了通过差示扫描量热法测定的嵌合4E11抗体(cH-cL)和本公开内容的9种人源化变体的重叠热谱图。对于各种变体的来源于各个热谱图的整合的相关熔化温度(Tm),参见表1。人源化轻链变体在本文中被称为hL1、hL2和hL3。人源化重链变体在本文中被称为hH1、hH2和hH3。为了明确起见,hVH1、hVH2、hVH3是指重链上的可变区以及hVL1、hVL2、hVL3是指轻链上的可变区。而hH1、hH2和hH3是指包含各自重链可变区的重链。例如,hH1包含hVH1和重链的恒定区,例如hH1=hVH1+CH1+CH2+CH3。类似地,hVL1、hVL2、hVL3是指轻链上的可变区,而hL1、hL2和hL3是指包含各自轻链可变区的轻链。例如,hL1包括hVL1和轻链的恒定区,例如hL1=hVL1+轻链恒定区。
图5显示了在过表达EGFR vIII(U87MG EGFR vIII)的U87MG胶质母细胞瘤细胞系上,从纯化的人源化和嵌合4E11抗体的流式细胞术数据获得的剂量-应答结合曲线。
图6显示了在过表达野生型EGFR(U87MG EGFR wt)的U87MG胶质母细胞瘤细胞系上,从选择的纯化的人源化和嵌合4E11抗体的流式细胞术数据获得的剂量-应答结合曲线。
发明详述
如本文中使用,术语“EGFRvIII”是指表皮生长因子受体变体III。术语“EGFRvIII”和“vIII”可互换使用。
如本文中使用,术语“EGFR”是指人表皮生长因子受体。术语“wt EGFR”、“WTEGFR”、“EGFR WT”或“EGFR wt”可互换使用并且是指野生型EGFR。
除非本文中另有表明或上下文明显矛盾,否则在描述本公开内容的上下文(尤其在权利要求书的上下文中)中术语“一”和“一个/一种”和“该”以及类似的指称的使用应被解释为涵盖单数和复数。
除非特别说明或从上下显而易见,否则本文中使用的术语“或”应被理解为是包括性的并且涵盖“或”和“和”。
本文中使用的术语“和/或”将被视为具体公开每个指定的特征或组件,具有或不具有另一个特征或组件。
除非另有提示,否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即,意味着“包括但不限于”)。术语“由…组成”应被解释为封闭式。
如本文中使用,对于诸如EGFRvIII或EGFR的蛋白质,术语“天然”是指蛋白质的天然构象和包括正确折叠和/或功能性的蛋白质。
如本文中使用,对于诸如EGFRvIII或EGFR的蛋白质,术语“变性的”是指已经失去其天然构象并且可能造成例如三级和二级结构损失的蛋白质。
如本文中使用,“包含EGFRvIII片段或由EGFRvIII片段组成的肽”的表述意味着该肽可包含除EGFRvIII片段以外的部分或其由EGFRvIII片段组成。
如本文中使用,靶向部分的术语“结合(bind)”或“结合(binding)”是指与靶标分子(例如,人EGFRvIII和/或EGFRvIII的突变变体)的至少暂时相互作用或关联,或至少暂时相互作用或关联于靶标分子,例如,如本文中描述。
如本文中使用,术语“结合包含氨基酸残基的表位”意味着所述氨基酸残基是表位的一部分或是抗体的结合所必需的。
如本文中使用,术语“无法结合”肽或蛋白质意味着抗体或抗原结合片段a)在被重组表达或在细胞中表达时不与肽或蛋白质显着结合,b)未观察到可检测的结合,c)具有与阴性对照抗体相似的结合性质,d)不特异性结合,或e)以通过流式细胞术实验测定的0%至15%之间的值结合。
如本文中使用,术语“自体”是指来源于同一个体的物质。
如本文中使用,术语“抗原结合结构域”是指允许特异性结合抗原的抗体或抗原结合片段的结构域。
如本文中使用,术语“抗体”涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、单结构域抗体(如VHH、VH、VL、纳米抗体或任何骆驼或美洲驼单结构域抗体)、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)等。术语“抗体”涵盖具有与自然界中存在的形式类似的分子(例如,人IgG等)。术语“抗体”在本领域中也被称为“免疫球蛋白”(Ig),如本文中所用,是指由成对的重链和轻链多肽链构建的蛋白质;存在各种Ig同种型,包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。当抗体被正确折叠时,每个链折叠成许多不同的球状结构域,这些结构域由更线性的多肽序列连接。例如,免疫球蛋白轻链折叠成可变(VL)和恒定(CL)结构域,而重链折叠成可变(VH)和三个恒定(CH1、CH2、CH3)结构域。重链和轻链可变结构域(VH和VL)的相互作用导致抗原结合区(Fv)的形成。每个结构域都有本领域技术人员熟悉的已确立的结构。
典型地,抗体由两条轻链和两条重链的配对构成。存在不同的抗体同种型,包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。人IgG被进一步分为四个不同的亚组;名为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。治疗性抗体一般开发为IgG1、IgG2或IgG4。
本公开内容的抗体或抗原结合片段可包含,例如,人IgG4恒定区或其片段。在示例性实施方案中,本公开内容的抗体或抗原结合片段可包含,例如,携带S228P突变的人IgG4恒定区或其片段。还考虑了其他抗体亚型的恒定区,包括人IgG1和人IgG2以及其他同种型的恒定区。
人抗体IgG同种型的轻链和重链各自包含具有3个名为互补决定区(CDR)的高变区的可变区。轻链CDR在本文中被鉴定为CDRL1、CDRL2和CDRL3。重链CDR在本文中被鉴定为CDRH1、CDRH2和CDRH3。互补决定区侧翼为框架区(FR),顺序为:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。轻链和重链可变区负责结合靶标抗原并因此显示抗体之间显着的序列多样性。恒定区显示较少的序列多样性并负责结合许多天然蛋白质以引发重要的生化事件。抗体的可变区包含分子的抗原结合决定簇,并因此决定了抗体对其靶抗原的特异性。大多数序列可变性发生在CDR中,其组合以形成抗原结合位点并促成抗原决定簇的结合和识别。框架区可能在CDR的三维中正确定位和比对中发挥作用,以实现最佳的抗原结合。抗体对其抗原的特异性和亲和力由高变区的结构,以及它们呈现给抗原的表面的大小、形状和化学性质决定。存在多种用于鉴定高变区的方案,最常见的两个是Kabat的方案以及Chothia和Lesk的方案。Kabat等人(1991)基于在VH和VL结构域的抗原结合区的序列可变性定义了“互补决定区”(CDR)。Chothia和Lesk(1987)基于VH和VL结构域中结构环区的位置定义了“高变环”(H或L)。这些单独的方案定义了相邻的或重叠的CDR和高变环区,抗体领域的技术人员通常互换地利用术语“CDR”和“高变环”,并且它们可以在本文中如此使用。除了通过组合Kabat和Chothia定义所划定的CDRH1环之外,本文中根据Kabat方案对CDR/环进行鉴定。
如本文中使用,“实质性的同一性”或“基本上相同”指的是多肽序列与参考序列分别具有相同的多肽序列,或当这两个序列被最佳地比对时,分别具有指定百分比的氨基酸残基,其与在参考序列内的相应位置上的氨基酸残基是相同的。例如,与参考序列“基本上相同”的氨基酸序列与参考氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。对于多肽,比较序列的长度一般为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350个连续氨基酸(例如全长序列)。序列同一性可以使用序列分析软件在默认设置下进行测定(例如,Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,WI53705)。这样的软件可以通过将同源程度分配给各种取代、缺失和其他修饰来匹配相似的序列。
重组DNA技术现在允许各种抗体形式的设计,如本公开内容所涵盖的单链抗体(例如,单结构域)、双抗体、微型抗体、纳米抗体等。
本文中所指的“抗原结合片段”可包括本领域已知的任何合适的抗原结合片段。抗原结合片段可以是天然存在的片段或可以通过操作天然存在的抗体或通过使用重组方法来获得。例如,抗体片段可包括但不限于Fv、单链Fv(scFv;由通过肽连接物连接的VL和VH组成的分子)、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体(sdAb;由单VL或VH构成的片段)、以及任何这些的多价呈现。诸如刚刚描述的抗体片段可能需要连接物序列、二硫键或其他类型的共价键来连接片段的不同部分;本领域技术人员将会熟悉不同类型片段的要求以及各种方法和用于其构建的各种方法。
本公开内容的抗原结合片段涵盖具有抗原结合位点的分子,该抗原结合位点包含赋予对抗原的特异性结合的氨基酸残基(例如,一个或多个CDR)。
本公开内容的抗原结合片段的示例性实施方案因此包括但不限于(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab’)2片段,包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;以及(vi)分离的互补决定区(CDR),例如VH CDR3。
抗原结合片段的具体实施方案可包括例如scFv、Fab、Fab'或(Fab')2。
术语“人源化抗体”涵盖完全人源化抗体(即,框架是100%人源化的)和部分人源化抗体(例如,至少一个可变区含有来自人抗体的一个或多个氨基酸,而其他氨基酸是非人亲本抗体的氨基酸)。典型地,“人源化抗体”含有非人亲本抗体(例如,小鼠、大鼠、兔、非人灵长类等)的CDR和与天然人抗体或人抗体共有的框架相同的框架。在这种情况下,那些“人源化抗体”被表征为完全人源化。“人源化抗体”还可以含有一个或多个与人抗体或人抗体共有的氨基酸不对应的氨基酸取代。这样的取代包括,例如,可保留抗体特征(例如,亲和力,特异性等)的回复突变(例如,重新引入非人氨基酸)。这样的取代通常在框架区中。“人源化抗体”通常还包含恒定区(Fc),其通常是人抗体的恒定区。典型地,“人源化抗体”的恒定区与人抗体的恒定区相同。人源化抗体可通过CDR移植获得(Tsurushita等人,2005;Jones等人,1986;Tempest等人,1991;Riechmann等人,1988;Queen等人,1989)。这样的抗体被认为是完全人源化的。
术语“嵌合抗体”是指具有来自与亲本抗体的起源不同的起源的恒定区的抗体。术语“嵌合抗体”涵盖具有人恒定区的抗体。典型地,“嵌合抗体”由起源于小鼠抗体的可变区和人恒定区组成。
术语“杂合抗体”是指以下抗体,其包含的重链或轻链可变区(其重链或轻链)之一来自某种类型的抗体(例如,人源化),而另一重链或轻链可变区(重链或轻链)来自另一种类型(例如,鼠、嵌合)的抗体。
本公开内容的抗体和/或抗原结合片段可起源于,例如小鼠、大鼠或任何其他哺乳动物或来自其他来源,如通过重组DNA技术。本公开内容的抗体或抗原结合片段可包括例如,合成抗体、非天然存在的抗体、非人哺乳动物免疫后获得的抗体等。
本公开内容的抗体或其抗原结合片段可被分离和/或基本上纯化。
变体抗原结合剂
本公开内容还涵盖了抗原结合剂的变体,其中所述抗原结合剂可被称为抗原结合化合物、构建体、多肽或包含本文中描述的抗体、抗原结合剂或抗原结合片段的任何化合物。
更具体地说,本公开内容涵盖了抗体或抗原结合片段、CAR和BiTE的变体,并且另外包括ADC、放射免疫缀合物或包含本文中提供的抗原结合剂、抗体或抗原结合片段的任何化合物。变体(例如,抗体或抗原结合片段、CAR、BiTE等)包括那些在其氨基酸序列中具有变化的变体,例如,在一个或多个CDR中、在一个或多个框架区中和/或在恒定区中。被包括在本公开内容中的变体(例如,抗体或抗原结合片段、CAR、BiTE等)是那些例如与原始的抗体或抗原结合片段相比具有相似的或改善的结合亲和力的变体。
本公开内容所涵盖的变体是那些可包含插入、缺失或氨基酸取代(保守或非保守)的变体。这些变体可能在其氨基酸序列中去除了至少一个氨基酸残基,并在其位置插入了不同的残基。
更具体地说,本公开内容所涵盖的变体包括具有与本文中公开的抗体或抗原结合变体的轻链可变区和/或重链可变区具有至少80%的序列同一性的轻链可变区和/或重链可变区的变体。变体抗体的CDR可与本文中公开的抗体或抗原结合片段的CDR相同。
本公开内容所涵盖的还有具有与本文中公开的抗体或抗原结合片段相同的CDR氨基酸残基和与其框架区至少80%、至少90%或至少95%序列相同的框架区的变体。
可以通过将来自下面列出的组(组1至6)中之一的(CDR、可变链、框架区或恒定区等的)氨基酸残基交换为同一组的另一个氨基酸来进行保守取代。
在下表中显示了保守取代的其他示例性实施方案。
(第1组)疏水性:正亮氨酸、蛋氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)
(第2组)中性亲水性:半胱氨酸(Cys),丝氨酸(Ser),苏氨酸(Thr)
(第3组)酸性:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)
(第4组)碱性:天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)
(第5组)影响链方向的残基:甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro);以及
(第6组)芳香族:色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)
非保守取代将致使这些组之一的成员交换为另一个组的成员。
百分比同一性表明了与原始肽相比相同的氨基酸和可以占据相同或相似位置的氨基酸。百分比相似性将会表明与在相同或相似位置上的原始肽相比,相同的氨基酸和被保守氨基酸取代的氨基酸。
一般,可变链之间的相似性和同一性程度在本文中是使用Blast2序列程序(Tatiana A.Tatusova,Thomas L.Madden(1999),"Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences",FEMS Microbiol Lett.174:247-250)使用缺省设置,即blastp程序、BLOSUM62矩阵(开放空位11和延伸空位罚值1;gapx下降50,期望10.0,字长3)和激活的过滤器,来确定的。
“基本上相同”的序列可包含一个或多个保守氨基酸突变,或允许生物学功能活性被维持的氨基酸缺失。本领域已知,与参考序列相比,对参考序列进行的一个或多个的保守氨基酸突变可以得到在生理学、化学、物理化学或功能性质上没有实质性变化的变体肽;在这种情况下,参考序列和变异序列将会被认为是“基本上相同”的多肽。
本公开内容的变体因此包含与原始序列或原始序列的一部分可具有至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的变体。
核酸、载体和细胞
抗体通常在细胞中制备,允许从包含编码轻链和/或重链的核酸序列的一种或多种载体表达轻链和重链。
本公开内容因此涵盖能够编码本文中描述的任何CDR、轻链可变区、重链可变区、轻链、重链的核酸。
如本文中使用,术语“核酸”是指RNA、DNA、cDNA等。
由于遗传密码的固有简并性,可以产生编码相同氨基酸序列的其他核酸序列并用于表达本公开内容的抗体或其抗原结合片段。可以使用本领域一般已知的方法对核苷酸序列进行工程化,来改变核苷酸序列以用于各种目的,包括但不限于克隆的修饰、加工和/或基因产物的表达。通过随机片段化以及基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新组装进行的DNA改组可用于工程化核苷酸序列。例如,寡核苷酸介导的定点诱变可用于导入突变,其建立新的限制位点、改变糖基化模式、改变密码子偏好、产生剪接变体等。
在又一个方面,本公开内容涉及包含本文中描述的核酸的载体。
根据本公开内容,载体可以是表达载体。
表达载体通常含有用于在特定宿主中插入的编码序列的转录和翻译控制的元件。这些元件可包括调控序列,如增强子、组成型和诱导型启动子、以及5'和3'非翻译区。本领域技术人员众所周知的方法可用于构建这样的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区可以由同一核酸分子(例如,同一载体)或分别的分子(例如,分别的载体)编码。
本公开内容因此提供了载体组,其中一种载体能够表达轻链或轻链可变区,以及另一种载体能够表达重链或重链可变区。
本公开内容的其他方面涉及试剂盒,其包括第一小瓶以及第二小瓶,所述第一小瓶含有编码本公开内容的抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的核酸或载体,所述第二小瓶含有编码抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的核酸或载体。
在另一个方面,本公开内容涉及可包含本文中描述的核酸、载体、抗体或抗原结合片段的分离细胞。
分离细胞可包含在分别的载体上或同一载体上的编码轻链可变区的核酸和编码重链可变区的核酸。分离细胞还可包含在分别的载体上或同一载体上的编码轻链的核酸和编码重链的核酸。
根据本公开内容,细胞可以能够表达、组装和/或分泌抗体或其抗原结合片段。
此外,根据本公开内容,细胞可包含和/或表达本文中描述的抗体。
另外,根据本公开内容,细胞可包含编码轻链可变区的核酸和编码重链可变区的核酸。
细胞中抗体或抗原结合片段的产生
本文中公开的抗体可以通过本领域技术人员熟悉的各种方法来制备,包括杂交瘤方法或重组DNA方法。
常规的杂交瘤技术涉及用抗原免疫啮齿动物,对脾细胞进行分离和用缺乏HGPRT表达的骨髓瘤细胞融合,并通过含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT)的培养基进行杂交细胞的选择。筛选杂交瘤以鉴定产生针对给定抗原特异的抗体的杂交瘤。杂交瘤被扩增和克隆。通过标准测序方法学获得轻链和重链可变区的核酸序列,并产生包含抗体的轻链和重链核酸序列的表达载体。
对于抗体的重组表达,用载体或载体组转化宿主细胞,所述载体或载体组包含抗体或其抗原结合片段的轻链和重链的核酸序列(在同一载体或分别的载体上)。
对于在哺乳动物系统中长期生产重组蛋白,可以获得稳定表达蛋白质的细胞系。例如,使用表达载体可以将能够编码本文中描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任一的核苷酸序列转化到细胞系中,所述表达载体可含有病毒复制起点和/或内源性表达元件以及在相同或分别载体上的可选择的或可见的标志物基因。本公开内容不受所用载体或宿主细胞的限制。在本公开内容的某些实施方案中,能够编码本文中描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任一的核苷酸序列可以被各自连接进分别的表达载体中并且每个链被分别地表达。在另一个实施方案中,能够编码本文中描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任一的轻链和重链均可以被连接进单个表达载体中并且被同时表达。
本领域已知用于检测和测量多肽表达的免疫学方法。这样的技术的实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)或流式细胞术。本领域技术人员可以容易地将这些方法学适用于本公开内容。
具有特定的细胞体系和翻译后活性的特征机制的不同宿主细胞(例如,中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa、MDCK、HEK293和WI-38)可从商业上和美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得,并且可以被选择以确保表达的多肽的正确修饰和加工。
典型地,抗体或其抗原结合片段在CHO细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人细胞中产生。
本发公开内容涉及制备抗体或其抗原结合片段的方法,其包括在培养细胞中表达本公开内容的抗体或抗原结合片段的轻链和重链。
所述方法可进一步包括纯化或分离本公开内容的抗体或抗原结合片段。所述方法还可进一步包括将本公开内容的抗体或抗原结合片段缀合至货物分子诸如治疗性或可检测部分。
抗体缀合物
本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以被包含在治疗或诊断化合物、构建体或组合物中,或者可以与货物分子连接。货物分子的示例性实施方案包括但不限于治疗性部分、可检测部分、多肽(例如,肽、酶、生长因子)、多核苷酸、脂质体、纳米粒子、纳米线、纳米管、量子点等。
更具体地说,本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以与治疗性部分缀合。治疗性部分通常通过可切割或不可切割的接头附接到抗体上。
治疗性部分的列表中包括细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗癌剂(化学治疗剂)和放射治疗剂(例如,放射性同位素)。
细胞毒性剂的示例性实施方案包括但不限于α-鹅膏蕈碱、隐藻胞菌素(cryptophycin)、双卡马嗪(duocarmazine)、双卡霉素(duocarmycin)、卡利奇霉素(chalicheamicin)、德鲁替康(deruxtecan)、吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine)(PBD)、多拉斯汀、假单胞菌内毒素、蓖麻毒素、澳瑞他汀(auristatin)(例如,单甲基澳瑞他汀E、单甲基澳瑞他汀F)、美登素类(maytansinoids)(例如,美登木素)、吡咯并苯并二氮杂(PBD)及其类似物。
放射治疗剂的示例性实施方案包括但不限于钇-90、钪-47、铼-186、碘-131、碘-125以及本领域技术人员公知的许多其他放射治疗剂(例如,镥(例如,Lu177)、铋(例如,Bi213)、铜(例如,Cu67)、砹-211(211At)、锕225(Ac-225)等)。
化学治疗剂的示例性实施方案包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿霉素、伊立替康、紫杉烷类、卡铂、顺铂等。
本公开内容的抗体或抗原结合片段也可以与可检测部分缀合(即,用于检测或诊断目的)。
“可检测部分”包含通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学和/或其他物理方法可检测的试剂。使用本领域众所周知的方法可以将可检测部分直接和/或间接地(例如通过连接,诸如但不限于DOTA或NHS连接)偶联至本公开内容的抗体及其抗原结合片段上。可以使用各种各样的可检测部分,其选择依赖于所需的灵敏度、缀合的容易性、稳定性要求和可用的仪器。合适的可检测部分包括但不限于荧光标记、放射性标记(例如且不限于125I、In111、Tc99、I131并且包括用于PET扫描仪的发射正电子的同位素等)、核磁共振活性标记、发光标记、化学发光标记、生色团标记、酶标记(例如且不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、量子点和/或纳米粒子。可检测部分可以造成和/或产生可检测信号,从而允许来自可检测部分的信号被检测。
嵌合抗原受体和其他免疫治疗剂
本公开内容的抗体及其抗原结合片段的序列可用于生成嵌合抗原受体(CAR)、双特异性T细胞衔接器(BiTE)或其他免疫治疗剂如例如且不限于双特异性杀伤细胞衔接器(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接器(TriKE)或任何免疫治疗化合物。
本公开内容的CAR可包含例如,a)特异性结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗体的抗原结合结构域,b)任选地间隔子,c)跨膜结构域,d)任选地至少一个共刺激结构域,以及e)至少一个细胞内信号传导结构域。
嵌合抗原受体还可包含连接抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区或间隔子。间隔子可以允许在细胞表面上更好地呈递抗原结合结构域。
根据本公开内容,间隔子可以是可选的。或者,间隔子可包含例如,1至200个氨基酸残基,典型地10至100个氨基酸残基以及更典型地25至50个氨基酸残基。间隔子可能来自人蛋白质。
根据本公开内容,间隔子或铰链区可以是,例如且不限于CD8铰链(例如,小鼠、人CD8)或IgG铰链(人免疫球蛋白铰链)或其组合。
跨膜结构域的示例性实施方案包括,例如且不限于T细胞受体复合物的α、β或CD3ζ链,CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。
在一些实施方案中,跨膜结构域可以至少包括例如,KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD 11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD 160、CD 19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB 1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C的跨膜区。
跨膜结构域的特定实施方案是CD28的跨膜结构域。
共刺激结构域可以,例如且不限于来自CD28、CD27、4-1BB、OX40、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、LyI08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D或其组合。
细胞内信号传导结构域可以,例如且不限于来自CD3ζ、CD3γ、CD3Δ、CD3ε、常见FcRγ(FCERIG)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRlla、DAP10或DAP12。
为了被靶向至分泌途径,嵌合抗原受体还可包含信号肽如,例如CD28的信号肽或适合于免疫细胞的任何其他信号肽。信号肽被切割(可切割的)。
BiTE,BiKE和TriKE分子可包含特异性结合EGFRvIII的抗原结合结构域(例如scFv)和结合特定免疫细胞的另一结构域(scFv),该特定免疫细胞包括但不限于T细胞特异性分子(例如,CD3)和NK细胞表面分子(例如CD16)。这些一般包含通过柔性接头串联连接的多个scFv。
药物组合物
本公开内容还涉及包含本文中公开的抗体或抗原结合片段(缀合或未缀合)的化合物、组合物、构建体和药物组合物。
除活性成分外,药物组合物可以含有药学上可接受的载体,其包括但不限于水、PBS、盐溶液、明胶、油、醇以及其他赋形剂和助剂,其促进将活性化合物加工成可以药学上使用的制剂。在其他情况下,这样的制剂可以被灭菌。
如本文中使用,“药物组合物”是指治疗有效量的药剂与药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体一起。本文中使用的“治疗有效量”是指为给定病况和施用方案提供治疗效果的量。这样的组合物是液体或被冻干或以其他方式干燥的制剂,并且包括各种缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)的稀释剂,pH和离子浓度,用于防止吸附至表面上的诸如白蛋白或明胶等添加剂,去污剂(例如,吐温20,吐温80,PluronicF68,胆汁酸盐)。增溶剂(例如,甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如,抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如,硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、膨大物质或张度调节剂(例如,乳糖、甘露醇)、诸如聚乙二醇的聚合物与蛋白质的共价连接、与金属离子的络合、或将材料掺入聚合化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等)的颗粒制备物中或颗粒制备物上,或掺入到脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。这样的组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。控释或持续释放的组合物包括亲脂贮库(例如,脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本公开内容还包括的是包被有聚合物(例如,泊洛沙姆或泊洛沙明)的颗粒组合物。本公开内容的组合物的其他实施方案并入了颗粒形式保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂,用于各种施用途径,包括胃肠外、肺、鼻、口服、阴道、直肠途径。在一个实施方案中,药物组合物经胃肠外、癌旁、经粘膜、透皮、肌内、静脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和肿瘤内进行施用。
此外,如本文中使用,“药学上可接受的载体”或“药物载体”在本领域中是已知的,并且包括但不限于0.01-0.1M或0.05M磷酸盐缓冲液或0.8%盐水。另外,这样的药学上可接受的载体可以是水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油,以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液,包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏或固定油。静脉内媒介物包括液体和营养补充物、电解质补充物(如基于林格氏右旋糖的补充物)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂,诸如,例如,抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂、惰性气体等。
对于任何化合物,可以最初在细胞培养测定或动物模型(如小鼠、大鼠、兔子、狗或猪)中估计治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定浓度范围和施用途径。然后可以使用这样的信息来确定在人类中有用的剂量和施用途径。这些技术对于本领域技术人员是众所周知的,并且治疗有效剂量是指改善症状或病况的活性成分的量。治疗功效和毒性可以通过在细胞培养中或使用实验动物的标准药物规程来确定,如通过计算和对比ED50(在50%的群体中治疗有效的剂量)和LD50(在50%的群体中致死的剂量)统计。上述的任何治疗组合物均可以应用于需要这样的治疗的任何受试者,包括但不限于哺乳动物,如狗、猫、牛、马、兔、猴和人。
本公开内容中使用的药物组合物可以通过任何数目的途径来施用,包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠的方式。
本公开内容的其他方面涉及试剂盒,其可包括含有本文中描述的一种或多种抗体或抗原结合片段或抗体-药物缀合物的一个或多个小瓶。
使用方法
本公开内容的方面包括向需要的受试者施用抗体或其抗原结合片段、CAR、BiTE、BiKE或TriKE分子。
本公开内容的其他方面包括向需要的受试者施用被工程化以表达CAR、BiTE、BiKE或TriKE分子的免疫细胞。
本公开内容的CAR,BiTE,BiKE或TriKE构建体可用于将工程化的免疫细胞重新靶向至EGFRvIII阳性肿瘤。
工程化的免疫细胞可以施用至需要的受试者。
根据本公开内容的一个方面,从受试者中分离出免疫细胞,工程化以表达CAR,BiTE,BiKE或TriKE构建体,并重新施用至同一受试者。
本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以在癌症治疗中以非缀合形式使用或与治疗性部分缀合使用。
更具体地说,本公开内容的抗体或其抗原结合片段可用于抑制表达EGFRvIII的肿瘤细胞的生长。为此目的,特别考虑了抗体药物缀合物和放射免疫缀合物。
本公开内容更具体地涉及了通过施用本文中公开的抗体或其抗原结合片段或抗体药物缀合物来治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法。
抗体或其抗原结合片段或抗体药物缀合物可以单独或与其他抗癌药物组合来作为药物组合物施用。
如本文中使用,术语“受试者”涵盖人类和动物,如非人灵长类、牛、兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、马、鸟类等。术语“受试者”特别地涵盖人类。
从治疗中将会受益的需要的受试者包括具有表达EGFRvIII的肿瘤细胞的人。更具体地说,可以将抗体或其抗原结合片段或抗体药物缀合物施用至疑似患有多形性胶质母细胞瘤(GBM)的受试者。需要的受试者还涵盖患有或疑似患有癌的受试者,如起源于乳腺、头颈或口腔的癌。
为了本公开内容的目的,术语“治疗”是指治疗性处理和防范性或预防性措施,其中目的是减缓(减轻)目标病理状况或疾病。需要治疗的受试者包括那些已经患有这种疾病的受试者,以及那些容易患上这种疾病的受试者或那些需要预防这种疾病的受试者。特别是,需要的受试者包括一种或多种癌症标志物水平升高的受试者。
或者,为了实施本公开内容和本领域已知的方法,本公开内容的抗体或抗原结合片段(缀合或不缀合)可以与第二分子(例如,第二抗体等)组合使用,该第二分子能够特异性结合本公开内容的抗体或抗原结合片段并且可以携带期望的可检测的、诊断性或治疗性部分。
本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以以未缀合的形式使用,或者可以在涉及EGFRvIII检测的测定或方法中与可检测部分缀合来使用。
特别考虑了治疗患有与EGFRvIII表达相关的癌症的受试者的方法。这样的方法可包括施用本文中公开的抗原结合剂或表达这样的抗原结合剂的细胞。
在示例性实施方案中,方法可包括施用抗体-药物缀合物。
在另一个示例性实施方案中,方法可包括施用表达嵌合抗原受体、双特异性T细胞衔接器、双特异性杀伤细胞衔接器或三特异性杀伤细胞衔接器的细胞。
本公开内容的另一个方面涉及检测EGFRvIII的方法,所述方法可包括将表达EGFRvIII的细胞、或包含或疑似包含EGFRvIII的样品(活检、体液诸如血清、血浆、尿液等)与本文中描述的抗体或抗原结合片段接触并测量结合。样品可来源于可能患有癌症(例如,多形性胶质母细胞瘤或癌)或可能疑似患有这样的癌症的哺乳动物(例如,人类)。样品可以是从哺乳动物获得的组织样品或细胞培养上清液。
根据本公开内容,样品可以是从哺乳动物获得的血清样品、血浆样品、血液样品或腹水。
从下文给出的非限制性详细描述中,本公开内容的进一步范围、适用性和有利之处将变得显而易见。然而,应当理解的是,该详细描述虽然表明了本公开内容的示例性实施方案,但仅以实例的方式参考附图给出。
实施例
实施例1:人性化V区序列的设计
鼠抗EGFRvIII特异性抗体4E11的可变区在这里被人源化。相应的鼠VH和VL氨基酸序列分别列在序列表表格中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2下,并且分别命名为mVH和mVL。嵌入在这些V区序列中的CDR环是根据Kabat定义在图1中划定的,除了CDR-H1环是根据结合的Kabat和Chothia定义划定的(Wu和Kabat,1970;Kabat和Wu,1991;Chothia和Lesk,1987;Al-Lazikani等人,1997)。该定义为通过CDR移植方法对mVH和mVL框架区(FR)进行人源化奠定了基础(Riechmann等人,1988)。
通过将来源mVH序列的三个CDR区段以适当的顺序缝合到人VH模板序列的四个FR区段来进行CDR移植;并将来源mVL序列的三个CDR区段以适当的顺序缝合到人VL模板的四个FR区段。我们首先鉴定的是,与4E11抗体的mVH和mVL序列最接近的人种系VH和VL家族分别是人VH-4家族和人Vk-1家族。然后使用VBASE2人种系数据库(Retter等人,2005)鉴定了若干人V基因和人J基因序列,其在与亲本鼠序列的FR的序列同源性方面得分很高。为人源化所选择的最终人种系模板序列如图1所示,其与相应的鼠序列比对,以及它们是:针对mVH序列的人IGHV312(V段)和人IGHJ4(J段),和针对mVL序列的人IGKV069(V段)和人IGKJ2(J段)。给定这些模板,完全人源化mVH FR需要20个小鼠至人的氨基酸突变,以及完全人源化mVL FR需要16个小鼠至人的氨基酸突变(参见图1中高亮显示的氨基酸)。突变所有这些36个氨基酸将导致100%人源化的V区,其由具有SEQ ID NO:5的hVH1(也包含在hH1中)变体和具有SEQ ID NO:8的hVL1(也包含在hL1中)变体代表。
在许多情况下,已经观察到100%人源化变体相对于亲本鼠变体具有稍微降低的抗原结合。为了减轻抗原结合亲和力损失的风险,设计了至原始亲本鼠氨基酸残基的“回复突变”。来源抗体框架中存在的氨基酸残基可直接或间接地影响抗原结合。为了协助回复突变的鉴定,使用合适的晶体结构作为模板(蛋白质数据库代码:3G5V),通过同源性建模建立了鼠4E11可变区的3D模型。该分子模型的渲染如图2所示。基于对该结构模型的仔细视觉检查和详细的结构分析,选择了以下回复突变:重链中的M49、I67和R71;和轻链中的L36、F44和G46(始终使用Kabat编号);这些回复突变氨基酸在图2中被高亮显示。
在VH中,在位置71处的回复突变(其中精氨酸氨基酸侧链直接地支撑CDR-H1并且还有CDR-H2的构象)可能被涉及在抗原结合中。在此位置的人源化所需的非保守R71V突变可能会在CDR中引起重大的结构变化。因此,该突变(R71)的实施导致了具有SEQ ID NO:6的人源化变体hVH2。更深埋藏位置49和67处的疏水残基关注度降低,但为了维持直接支撑CDR-H2环构象的正确堆积,其仍然很重要。尽管这在两个位置处的人源化将需要保守突变M49I和I67V,但正确的堆积将会受到损害。因此,除了较早描述的R71回复突变之外,这些回复突变(M49、I67)的实施导致了具有SEQ ID NO:7的人源化变体hVH3。
在VL中,回复突变以两个氨基酸的串联形式出现,这两个氨基酸L36和G46在空间上密切接近,其直接支撑来自配对链的高变CDR-H3环以及来自同一链的CDR-L2的构象;其很可能被直接涉及在抗原结合中。一个惊人的结构特征是,由于在相对较深埋藏的位置处的尺寸显着增加而可能会导致重大的结构改变,因此在这两个位置L36Y和G46L处所需的人源化无法在空间上被容纳。因此,这些回复突变(L36、G46)的实施导致了具有SEQ ID NO:9的人源化变体hVL2。在鼠氨基酸F44鉴定出了另一个回复突变,其也聚集在上述串联回复突变氨基酸周围,并且在该位置人源化需要突变为构象上更受限制且更小的脯氨酸氨基酸。因此,除了较早描述的串联回复突变(L36、G46)之外,该回复突变(F44)的实施导致了具有SEQ ID NO:10的人源化变体hVL3。
针对4E11抗体的设计的人源化V区序列被排列在图3中。进一步的计算机模拟分析表明,所有这些人源化序列都没有预测的T细胞表位(Dhanda等人,2018)。
实施例2:全长抗体的重组产生和纯化
在实施例1中描述的嵌合和人源化VH和VL区被克隆至pTT5TM载体中作为与人IgG4恒定区(分别为人IgG4重链和人κ轻链)的融合体,从而生成嵌合抗体。为了增强IgG4同源二聚体的稳定性,将人IgG4重链序列在228处从丝氨酸氨基酸残基突变为脯氨酸残基(即,S228P突变)。删除了重链的C端赖氨酸氨基酸残基以减少由于作为翻译后修饰的该C端赖氨酸的部分剪切所导致的异质性。所得的全长重链和轻链嵌合序列,分别为cH和cL,在序列表表格中分别以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12给出。所得的全长重链人源化的变体序列,hH1、hH2和hH3,在序列表表格中分别以SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15给出。所得的全长轻链人源化的变体序列hL1,hL2和hL3,在序列表表格中分别以SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18给出。所有轻链序列在N端包含可选的信号肽MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQ ID NO:20),而重链序列在N端包含信号肽MDWTWRILFLVAAATGTHA(SEQ ID NO:19)。这些是信号肽的非限制性示例性序列且本领域技术人员可以选择其他合适的信号肽用于这些抗体变体的重组产生。
嵌合抗体cH-cL和覆盖了3种人源化重链和3种人源化轻链(hH1-hL1、hH1-hL2、hH1-hL3、hH2-hL1、hH2-hL2、hH2-hL3、hH3-hL1、hH3-hL2、hH3-hL3)之间的所有可能组合的9种人源化抗体在CHO细胞中被重组产生。在这个实例中,在32℃下使用CHO55E1细胞以25-mL的规模产生。简而言之,用重链和轻链构建体(1:1比例)对CHO细胞进行瞬时转染。转染后第8天对条件培养基进行收集,此时活性细胞密度为1-3x107个细胞/mL且细胞活力为84-93%,如通过用Cedex自动细胞计数系统(Roche Innovatis)直接计数细胞样品测定出的。所有抗体变体由瞬时转染的CHO细胞得到了很好的表达。
使用在Protein Maker系统上并行的1-mL HiTrap MabSelect SuRe色谱柱(GEHealthcare)通过protein-A亲和色谱法进行从细胞培养上清液中的纯化。柱平衡和洗涤在DPBS(GE Healthcare Life Sciences)中进行。针对结合的线性流速被设定为~45cm/h(0.3mL/min)以获得~3.3分钟的停留时间。用柠檬酸盐缓冲液0.1M、pH 3.0进行洗脱,并在10%(v/v)1M HEPES中进行中和。合并含有抗体的级分,并用ZebaSpin TK MWCO色谱柱(ThermoFisher Scientific)将柠檬酸盐缓冲液与DPBS进行交换。纯化的抗体通过0.2μm过滤器的过滤进行灭菌。高效液相色谱-尺寸排阻色谱(UPLC-SEC)被用于评估所有洗脱液的纯度。5种人源化变体的纯度高于95%,以及嵌合变体和剩余3种人源化变体的纯度在89-95%之间。按照制造商的说明,在室温使用膜分子量截断为30kDa的涡轮离心浓缩器(GE Healthcare Life Sciences)通过超滤来浓缩选定的峰级分。在过程期间,在NanoDropTM2000分光光度计(ThermoFisher Scientific)上使用在280nm处的吸光度和计算出的每种变体的比消光系数来监测蛋白质浓度。纯度低于95%的变体通过在Superdex 20010/30色谱柱(GE Healthcare Life Sciences)上的制备SEC来进一步纯化。通过SDS-PAGE和UPLC-SEC来分析最终产物,并且最终纯度为99-100%。
实施例3:通过差示扫描量热法测量热稳定性
使用Malvern MicroCal DSC系统(Malvern Instruments),将差示扫描量热法(DSC)用于确定4E11人源化和嵌合抗体变体的热转变中点(Tm)。将在DPBS缓冲液中的样品在DPBS缓冲液中稀释至最终浓度为0.4mg/mL。通过以60℃/h的速率将温度从20℃升高至100℃进行热变性,其反馈模式/增益设置为“低”、过滤时段为8s、预扫描时间为3min并且在氮压为70psi下。所有数据均使用Origin 7.0软件(OriginLab)用手动基线分配进行分析,以及利用三个转变点拟合确定Tm。
热谱图的结果显示在图4中以及从整合热谱图中获得的熔化温度的结果显示在表1中。相对于嵌合变体,所有人源化变体有利地显示出改善的热稳定性(图4)。从嵌合抗体的热谱图可以明显看出,嵌合抗体具有完全不同的形状,其由具有多个肩部的单峰组成,而人源化变体具有两个分离良好的峰,其中第二个峰具有肩部并向更高温度移动。
由于这些变体之间的序列差异发生在是Fab片段的一部分的V区中,因此特别感兴趣的是观察到的所有人源化变体相对于嵌合变体的Fab结构域的有利的稳定性增加,如较高的Tm2值所反映(表1)。人源化后在Fab片段的稳定性中的这些改善的范围在1.1℃至6.2℃之间。本领域技术人员将会理解的是抗体人源化通常导致热稳定性的损失和/或不导致稳定性的改善。因此,现在提供的人源化变体在热稳定性上展示出的改善是有利的且意外的。
对于所有人源化变体,与嵌合变体相比,由Tm2值(表1)所反映的CH3结构域的稳定性都提高了,Tm3的增加在1.0℃至6.6℃之间。这一发现非常有趣且令人惊讶,因为所有这些变体之间的CH3结构域序列是相同的。这一意外的发现表明本发明中设计的人源化突变对4E11抗体的整体稳定性具有间接的变构作用,即使在远离引入的人源化突变的位点处。
进一步的结构-性质关系分析显示,具有hL1轻链变体的人源化变体相对于嵌合变体在稳定性上展示出最小的改善,而具有hL2轻链变体的人源化变体相对于嵌合变体在稳定性上展示出最大的改善。这适用于Tm2(Fab熔化)和Tm3(CH3熔化)两者。对于序列人源化的重链变体,没有检测到折叠稳定性的显著的依赖性。
表1.通过差示扫描量热法测定的热稳定性。
实施例4:通过流式细胞术评估表观亲和力
在过表达野生型EGFR(U87MG-EGFR wt或U87 wt)的人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和过表达EGFRvIII突变(EGFR的Δ2-7缺失突变;U87MG-EGFRvIII或U87vIII)的人胶质瘤细胞系U87MG上,通过流式细胞术以剂量依赖性结合曲线评估了4E11抗EGFRvIII单克隆抗体的重组纯化的嵌合型和9种人源化变体的结合特性的结合亲和力和特异性。过表达全长wtEGFR或EGFRvIII的细胞获得自W.Cavanee的实验室(Ludwig Institute for CancerResearch,University of California at San Diego)。细胞在含有10% FBS和400g/mlG418的DMEM高葡萄糖培养基中生长。
在分析之前,将细胞铺板,使得其在分析当天不超过80%汇合。除非另有说明,否则所有培养基均保持在4℃并且所有孵育均在湿冰上进行。将细胞在PBS中洗涤,通过加入细胞解离缓冲液(Sigma)进行细胞收集,离心并以细胞密度为2x106个细胞/mL重新悬浮于完全培养基中。将50μL/孔的细胞分布在聚丙烯v底96孔板中,并加入在100nM开始连续1/3稀释的纯化的mAb并孵育2小时。通过离心将细胞洗涤两次并进一步与FITC标记的F(ab’)2山羊抗小鼠抗体(Fc特异性,#115-096-071,Jackson Immunoresearch,Cedarlane)孵育一小时。洗涤细胞并将其重新悬浮于含有碘化丙啶的培养基中以从分析中排除死细胞。样品通过60μm尼龙网滤板(Millipore)过滤以去除细胞聚集体。根据制造商的说明,使用BDLSRFortessa流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences)和使用了BD FACSDivaTM采集软件的标准过滤器组,对在前向散射、侧向散射参数和碘化丙啶染料排除上门控的2000个活的单独细胞事件进行流式细胞术分析。
抗体结合的特异性检测被计算为在减去与人IgG ChromPure(Jackson Immuno#009-000-003用作阴性对照)的结合的平均荧光强度的背景水平后,结合至每个一抗的平均荧光强度。用GraphPad Prism v 8.4.3软件,使用与Hill斜率非线性回归曲线拟合模型的单位点特异性结合来分析数据,以确定每种被测抗体变体的Bmax(最大特异性结合)和KD-app(在平衡时实现半最大结合所需的浓度)。使用的模型根据以下公式:
Y=Bmax*Xh/(KD h+Xh),其中:
Bmax是最大特异性结合,与Y单位相同;
KD是在平衡时实现半最大结合所需的配体浓度,以与X相同的单位表示;以及
h是代表Hill斜率的变量“h”。
图5显示了流式细胞术实验的示例性结果,该实验确定了抗EGFRvIII单克隆抗体与细胞表面表达的EGFRvIII的结合性质。表2列出了在多个实验中平均的相应KD-app值。所有人源化抗EGFRvIII抗体均显示出与过表达EGFRvIII变体的细胞的强且相当的结合。尽管抗体人源化通常导致抗原结合亲和力的损失,但在该情况下,相对于嵌合变体(cH-cL),在9种人源化变体中,3种人源化变体具有统计学上显着改善的结合(hH2-hL1、hH2-hL3和hH3-hL1),4种人源化变体在统计误差内具有相同的结合(hH1-hL1、hH2-hL2、hH3-hL2和hH3-hL3),以及2种人源化变体仅具有在2-3倍范围内的略微降低的结合(hH1-hL2和hH1-hL3)。因此,就设计的大多数人源化变体的亲本结合亲和力的保留和甚至来自其的改善而言,这些数据代表了不寻常的和意外的人源化成功。现在提供的人源化变体展示出意外且有利的提高的热稳定性,并且在大多数情况下展示出相对于亲本抗体的意外且有利的提高的结合亲和力。考虑到在这些全长人源化变体的两条Fab臂中的每一条中导入的大量突变(相对于嵌合变体每条Fab臂有范围为30到36个的突变),这令人印象深刻。粗略的结构-活性关系表明,对于每种人源化重链,hL1轻链变体具有最强的结合而hL2轻链变体具有最弱的结合;并且对于每种人源化轻链,hH3重链变体具有最强的结合而hH1重链具有最弱的结合。
表2.通过流式细胞术测定抗EGFR vIII人源化和嵌合4E11抗体与U87-MG-EGFR-vIII细胞系的表观结合亲和力(KD-app)。
为了证实人源化变体针对表达野生型EGFR的细胞的特异性,通过流式细胞术U87MG EGFR wt细胞测试了与表达EGFR vIII的细胞具有最佳结合的五种人源化变体(hH2-hL1、hH2-hL3、hH3-hL1、hH3-hL2和hH3-hL3)。在图6和表3中显示的结果表明,嵌合变体优异的结合特异性已被保留在被测的人源化变体中,并且在hH2-hL1、hH3-hL1和hH3-hL3人源化抗体的情况下甚至进一步地改善了。由于与表达野生型EGFR的正常细胞和组织的可忽略不计的结合,该有利的特异性可导致本发明的这些人源化4E11抗体变体的甚至更低的毒性。
表3.使用U87-MG-EGFR-wt细胞系通过流式细胞术测定抗EGFR vIII人源化和嵌合4E11抗体针对野生型EGFR的结合特异性。
如现在所示,本发明的人源化抗体在热稳定性和抗原结合和特异性方面展示出优异的特性,鉴于相对于具有亲本4E11抗EGFRvIII抗体的鼠V区的嵌合抗体所观察到的这些性质的改善,这是意外的和令人惊讶的。
本文中描述的实施方案和实施例是说明性的并且不意味着限制所要求保护的本公开内容的范围。发明人旨在将前述的实施方案的变化(包括替代、修改和等同物)涵盖在权利要求书中。本申请中列出的引述通过引用并入本文。
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贯穿本申请中提及的所有专利、专利申请和公布均通过引用并入本文。
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序列表
Claims (47)
1.特异性结合表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段包含:
a.重链可变区,其包含氨基酸序列QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWX1GYIGYNGRTSYNPSLKSRX2TISX3DTSKNQFSLKLSSVTAADTAV
YYCARLGRGFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3),其中X1=I或M,
X2=V或I,且X3=V或R;以及,
b.轻链可变区,其包含氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGINSNIGWX4QQKPGKAX5KX 6LIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPYTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO:4),其中X4=Y或L,X5=P或F,且
X6=L或G。
2.根据权利要求1所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中:
a.所述重链可变序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO 7中的任何一个;以及,
b.所述轻链可变序列选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中的任何一个。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段是嵌合抗原受体、双特异性T细胞衔接器、双特异性杀伤细胞衔接器、三特异性杀伤细胞衔接器或任何免疫治疗化合物。
4.根据权利要求3所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、单链抗体或多特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG恒定区。
6.根据权利要求5所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG4恒定区。
7.根据权利要求4所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含带有S228P突变的人IgG4恒定区。
8.根据权利要求7所述的特异性结合EGFRvIII的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段包含重链序列和轻链序列,其中:
a.重链序列是SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15;以及,
b.轻链序列是SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段包含scFv、Fab、Fab'或(Fab')2。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段与货物分子连接。
11.根据权利要求10所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述货物分子包含治疗性部分。
12.根据权利要求11所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述治疗性部分包含细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗癌剂或放射治疗剂。
13.根据权利要求11所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段,其中所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段与可检测部分缀合。
14.药物组合物,其包含根据权利要求1至13中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
15.核酸分子,其编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区。
16.试剂盒,其包含根据权利要求1至15中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段中的至少一种。
17.载体或载体组,其包含编码根据权利要求1至11中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的核酸序列。
18.包含根据权利要求17所述的载体或载体组的分离细胞。
19.根据权利要求18所述的分离细胞,其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或其抗原结合片段。
20.试剂盒,其包含第一小瓶以及第二小瓶,所述第一小瓶包含编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的轻链的核苷酸或载体,所述第二小瓶包含编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的重链的核苷酸或载体。
21.治疗包含表达EGFRvIII的细胞的癌症的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1至14中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段与化学治疗剂组合使用。
23.根据权利要求21或22中任一项所述的方法,其中所述有需要的受试者患有或疑似患有多形性胶质母细胞瘤。
24.根据权利要求21或22中任一项所述的方法,其中所述有需要的受试者患有或疑似患有癌。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述癌包含乳腺癌或HNSCC。
26.检测EGFRvIII的方法,所述方法包括将包含或疑似包含EGFRvIII的样品与根据权利要求1至14中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段接触。
27.制备根据权利要求1至9中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的方法,包括培养包含编码所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的核酸的细胞,从而产生所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段。
28.根据权利要求27所述的方法,还包括将所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或其抗原结合片段与货物分子缀合。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述货物分子包含治疗性部分。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述货物分子包含可检测部分。
31.治疗患有与EGFRvIII表达相关的癌症的受试者的方法,所述方法包括施用表达根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的细胞,其中所述抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段是嵌合抗原受体、双特异性T细胞衔接器、双特异性杀伤细胞衔接器或三特异性杀伤细胞衔接器或抗体药物缀合物。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述有需要的受试者患有或疑似患有胶质瘤。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤。
34.根据权利要求31所述的方法,其中所述有需要的受试者患有或疑似患有癌。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述癌包括乳腺癌、口腔癌或HNSCC。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法,其中所述细胞是T细胞。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法,其中所述细胞是NK细胞。
38.根据权利要求31至47中任一项所述的方法,其中所述细胞是所述受试者自体的免疫细胞。
39.经工程化以表达根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合剂、抗原结合结构域、抗体或抗原结合片段的分离细胞群。
40.根据权利要求39所述的分离细胞群,其中所述分离细胞群是人起源的。
41.根据权利要求39或40所述的分离细胞群,其中所述分离细胞群包含T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞及其组合。
42.根据权利要求41所述的分离细胞群,其中所述分离细胞群包含T细胞。
43.根据权利要求42所述的分离细胞群,其中所述T细胞包含CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
44.根据权利要求41所述的分离细胞群,其中所述分离细胞群包含NK细胞。
45.根据权利要求39至44中任一项所述的分离细胞群,其中所述分离细胞群被工程化以表达对相同靶标或不同靶标的另一抗原具有亲和力的另一嵌合抗原受体。
46.根据权利要求39至44中任一项所述的分离细胞群,其中所述分离细胞群包含宿主的免疫细胞。
47.药物组合物,其包含根据权利要求39至46中任一项所述的分离细胞群和药学上可接受的缓冲剂或赋形剂。
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