CN118064438A - 一种靶向IGF1R的aptamer的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向IGF1R的aptamer，所述aptamer具有靶向IGF1R的能力。所述aptamer的制备方法包括以下步骤：1)通过多轮蛋白筛选的方式获得靶向IGF1R的aptamer文库；2)在aptamer文库中选出多条丰度较高的aptamer；3)挑选进化较好的aptamer进行结合验证，得到亲和力较高的aptamer。所述aptamer用于胰腺肿瘤的诊断及靶向治疗。本发明的aptamer针对IGF1R蛋白，可以保证结合亲和力高，特异性好，易于修饰和人工合成，稳定性好，使用便利。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是一种靶向IGF1R的核酸适体的制备方法及应用。
背景技术
胰腺癌是全球发病率和致死率最高的肿瘤之一。随着诊疗水平的提高，很多肿瘤的死亡率已呈现降低的趋势，但胰腺癌的死亡率依然在缓慢增加，预计到2030年将成为致死率第二的肿瘤[1,2]。胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺癌的主要类型，占胰腺癌的90％，其危险因素主要包括吸烟、饮酒、肥胖以及遗传等。当前针对胰腺癌的主要治疗方式包括手术、化疗、免疫治疗和靶向治疗，手术是唯一可治愈的方式，但80％-85％的病人发现时已经处于晚期，出现了转移，丧失了手术机会[1,2]。
胰岛素样生长因子受体(IGF1R)，属于受体酪氨酸激酶家族(RTK)，定位于细胞膜，包含了胞外α亚基(配体结合位点)，胞内β亚基(酪氨酸激酶结构域)，亚基之间二硫键连接形成单体。两个单体可以形成稳定的同源二聚体(α2β2)进而产生作用，也可以与胰岛素受体形成杂交受体[3]。IGF(胰岛素样生长因子)正常情况下由肝脏分泌(受脑垂体前叶分泌的生长激素调控)，激活的IGFR信号通路下游主要为PI3K-AKT和Ras-MAPK等。IGF1R主要的生理功能为促进骨骼和组织生长发育，同时也是肿瘤发生发展中的重要信号通路[4,5]。在胰腺癌中，IGF主要来源可能为基质细胞，激活的IGF1R信号通路在胰腺癌中维持肿瘤细胞的基础生长速率。有文献表面，IGF1R可以诱导胰腺癌的吉西他滨及其他化疗常规化疗药物耐药，并促进胰腺癌的转移[6-8]。核酸适体
核酸适体(Aptamer)是从人工合成的DNA/RNA文库中通过SELEX技术筛选得到的能够高度特异性、高亲和性结合靶标分子的单链寡核苷酸。其折叠成二级和三级结构，借助静电引力、疏水作用力、范得华力等分子间的作用力，通过空间结构与靶分子构象的匹配，从而特异地识别靶分子。核酸适体具有与抗体相似的分子识别功能，但与抗体相比具有更多的应用优势，例如可不依赖生物体在体外筛选，靶分子范围广(金属离子、毒素、病毒、细菌、细胞、组织等)，分子量小，低免疫原性、易固相合成与标记，化学稳定性好、可常温保存等。核酸适体在疾病标志物的发现、分子诊断、靶向分子医药、分子病理等领域显示出巨大的临床应用前景[9-12]。
因此，急需设计发明一种可以特异性识别IGF1R蛋白的核酸适体，用于IGF1R阳性肿瘤的诊断及靶向治疗。
现有文献支持：
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发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，提供一种靶向IGF1R的aptamer的制备方法及应用。
本发明通过下述方案实现：
一种靶向IGF1R的aptamer，所述aptamer具有如SEQ1、2、3所示的序列或与其同源性80％以上的核苷酸序列。
所述aptamer经过修饰，所述修饰为碱基或磷酸骨架的修饰。
所述碱基修饰为F取代、MOE修饰、OME修饰。
所述骨架修饰为部分硫代或全硫代。
所述aptamer经过末端偶连，所述偶连物包括荧光基团、药物、碱基类似物、糖修饰、肽、放射性物质、生物素以及量子点。
所述aptamer部分或全部转换为肽核酸或左旋核苷酸。
一种靶向IGF1R的aptamer的制备方法，所述aptamer的制备方法包括以下步骤：
通过多轮蛋白筛选的方式获得靶向IGF1R的aptamer文库；
在aptamer文库中选出多条丰度最高的aptamer；
挑选进化较好的aptamer进行结合验证，得到亲和力较高的aptamer。
一种靶向IGF1R的aptamer在制备靶向治疗试剂及试剂盒中的应用，所述试剂中包含所述靶向IGF1R的aptamer，用于细胞、血清、组织样品、分泌物以及活体中IGFIR的识别。
所述试剂中包含权利要求1-7所述aptamer及其衍生物，用于特定组织或细胞中IGFIR的识别，以降解靶蛋白或杀死细胞。
基于靶向IGF1R的aptamer达到肿瘤诊断或治疗的效果，所述肿瘤包含IGFIR阳性的肿瘤。
本发明的有益效果为：
1.本发明的aptamer针对IGF1R蛋白，可以保证结合亲和力高，特异性好，易于修饰和人工合成，稳定性好，使用便利。
2.本申请通过蛋白筛选技术获得一种可以识别IGF1R蛋白的核酸适体，可以用于胰腺肿瘤的诊断及靶向治疗。
附图说明
图1为经过5轮蛋白筛选所获得的靶向IGF1R蛋白的序列库。
图2为通过SPR验证选出的96条富集程度较高的序列与IGF1R的亲和力差异。
图3为SPR测定4条较好的核酸适体序列的亲和力。
图4为通过流式实验检测对于IGF1R阳性的人源或鼠源胰腺癌细胞系的靶向性。
图5为通过流式实验检测所挑选的两条序列对于IGF1R阳性细胞系的KD值。
图6为小鼠体内实验检测核酸适体对KPC的靶向性。
图7为构建ApDC的示意图。
图8为通过长期克隆形成实验验证ApDC对胰腺癌细胞的杀伤作用结果。
图9为小鼠体内实验验证ApDC具有很好的肿瘤靶向治疗效果。
图10为本申请aptamer的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面对本发明优选的实施例进一步说明：
一种靶向IGF1R的aptamer，所述aptamer具有如SEQ1、2、3所示的序列或与其同源性80％以上的核苷酸序列。
SEQ1：
ACACGCATAACGGGGGGGGAGGAGGGTGGGAGGTAATTGGGTGTTGTGGAGTTATGCGTG
SEQ2:
CACACGCATAACTCCCTGAGGTGGTGTTGGGGGCGGGTGGGTGCGTGTGAGTTATGCGTG
SEQ3:
CACACGCATAACTCCCTGAGGTGGTTTTGGGGGCGGGTGGGTACGTGTGAGTTATGCGTG
所述aptamer经过修饰，所述修饰为碱基或磷酸骨架的修饰。
所述碱基修饰为F取代、MOE修饰、OME修饰。
所述骨架修饰为部分硫代或全硫代。
所述aptamer经过末端偶连，所述偶连物包括荧光基团、药物、碱基类似物、糖修饰、肽、放射性物质、生物素以及量子点。
所述aptamer部分或全部转换为肽核酸或左旋核苷酸。
一种靶向IGF1R的aptamer的制备方法，所述aptamer的制备方法包括以下步骤：
通过多轮蛋白筛选的方式获得靶向IGF1R的aptamer文库；
在aptamer文库中选出多条丰度最高的aptamer；
挑选进化较好的aptamer进行结合验证，得到亲和力较高的aptamer。
一种靶向IGF1R的aptamer在制备靶向治疗试剂及试剂盒中的应用，所述试剂中包含所述靶向IGF1R的aptamer，用于细胞、血清、组织样品、分泌物以及活体中IGFIR的识别。
所述试剂中包含权利要求1-7所述aptamer及其衍生物，用于特定组织或细胞中IGFIR的识别，以降解靶蛋白或杀死细胞。
基于靶向IGF1R的aptamer达到肿瘤诊断或治疗的效果，所述肿瘤包含IGFIR阳性的肿瘤。
本申请为IGF1R蛋白的靶向提供新的工具，为IGF1R的蛋白降解提供新的方法，为基于IGF1R的靶向治疗提供新的思路，为基于IGF1R的分子分型提供新的工具。
下面结合具体实施例对本申请做进一步阐述
靶向IGF1R的aptamer筛选
本实施例通过5轮蛋白Aptamer筛选，获得了有富集的文库，如图1所示。图1为经过5轮筛选之后，每轮筛选保留率情况，其中Elution-为负筛组洗脱后保留的核酸适体，Elution+为正筛组洗脱后保留的核酸适体。如图1所示，每轮筛选均保留有较多的核酸适体，且随着筛选压力的增加以及筛选轮数的增加，Elution阴性组的保留率逐步下降，而Elution阳性组的保留率逐步增高，第4、5轮可以看出阳性组的保留率远高于阴性组。
通过测序分析，选出96条富集程度较高的序列。通过SPR验证其与IGF1R的结合(图2)。图2为SPR法检测IGF1R蛋白与96条富集程度较高的核酸适体序列的结合曲线，结果显示大部分序列与IGF1R蛋白有良好的亲和性，其中有4条序列较为突出。
通过亲和力实验发现4条较好的序列(图3)。图3为SPR检测经过挑选的4条核酸适体序列与IGF1R蛋白的结合情况。
通过流式实验，证实挑选序列对于IGF1R阳性的人源或鼠源胰腺癌细胞系的靶向性(图4)。图4为通过流式细胞术检测对于IGF1R蛋白高表达的人源胰腺癌细胞系(PANC-1)或鼠源胰腺癌细胞系(KPC)的靶向性。具体步骤如下：消化并收集细胞，将其与Cy5标记的Aptamer在4度共孵育1小时，通过流式细胞术检测细胞表面荧光，并通过FlowJo软件对结果进行处理分析。如图4所示，所筛选的4条核酸适体序列中的IGF1R-85、IGF1R-86和IGF1R-90都显示出相比于随机文库序列更为明显的荧光波峰的偏移，提示均与PANC-1和KPC细胞有较强结合能力，具有较好的靶向性。而IGF1R-06核酸适体序列在细胞水平结合的能力不如其他3条序列，提示其靶向性较弱。
通过流式实验，证实挑选序列对于IGF1R阳性细胞系的KD值(图5)。图5为通过流式细胞术检测并计算IGF1R-06与IGF1R-85对于IGF1R阳性细胞系PANC-1的KD值。具体步骤为：通过将Cy5标记的核酸适体，分别以逐渐递增的浓度与细胞共孵育1小时，通过流式细胞术检测不同浓度下的细胞表面荧光强度，随着核酸适体浓度的增加，荧光强度应该趋于饱和，可以计算出其在细胞水平的KD值。通过实验发现，IGF1R-85的KD值为75.10nM，IGF1R-06的KD值为207.8nM，提示IGF1R-85在细胞水平相较于IGF1R-06更好的亲和力。
靶向IGF1R的aptamer用于肿瘤诊断
通过小鼠离体荧光成像实验，证实aptamer对KPC的靶向性(图6)。图6为小鼠体内实验检测核酸适体对KPC的靶向性。将IGF1R蛋白高表达的小鼠胰腺癌细胞系种植于C57BL/6小鼠的皮下，成瘤后通过尾静脉注射Cy5标记的核酸适体。注射后4小时，对小鼠进行解剖，通过小动物成像仪检测皮下瘤组织的荧光强度。如图6所示，相较于随机文库序列，IGF1R-85在肿瘤组织中荧光强度更高，提示IGF1R-85核酸适体在肿瘤组织中有明显富集，说明在小鼠体内对胰腺癌皮下瘤有较好的靶向性。
基于IGF1R的肿瘤治疗
将IGF1R与siRNA或药物连接，构建ApDC(图7)。图7为核酸适体搭载药物的方式示意图，包括药物末端连接，碱基取代，互补配对，核酸序列连接，药物嵌入等方式。
细胞水平通过长期克隆形成实验，验证ApDC对胰腺癌细胞的杀伤作用(图8)。图8为通过长期克隆实验检测核酸适体偶联药物ApDC对于鼠源胰腺癌细胞系KPC的杀伤作用。具体步骤为：将KPC细胞按照1万/孔的浓度种植于12孔板中，分别将含有不同浓度的IGF1R-85、VC-MMAE以及IGF1R-85与VC-MMAE的偶联物IGF1R-85-M即ApDC的培养基与细胞共孵育，至第4天时进行一次换液，将每个孔中的培养基全部换为不含有药物的培养基。第14天时，将每个孔的培养基吸净并使用PBS进行润洗后，使用4％的多聚甲醛对细胞进行固定，使用结晶紫对孔板进行染色，以观察细胞的生长情况。如图8所示，相较于VC-MMAE，IGF1R-85-M对于细胞的杀伤作用和生长抑制作用更为明显，提示其较强的靶向治疗效果。
通过小鼠体内实验发现在肿瘤模型中ApDC具有很好的肿瘤靶向治疗效果(图9)。图9为小鼠体内实验验证ApDC具有良好的肿瘤靶向治疗效果。具体步骤如下：利用KPC细胞接种至C57BL/6小鼠的皮下，至第7天时尾静脉注射给药，每3天一次，共计给药4次，后续观察两周，并检测肿瘤大小。其中NC为对照组，IGF1R-85组为单独核酸适体给药组，VC-MMAE组为单独药物给药组，IGF1R-85-M为核酸适体-药物偶联物给药组。如图9所示，相比于单独核酸适体或单独化疗药物组，核酸适体-药物偶联物组对肿瘤有更明显的抑制作用。
本发明的aptamer针对IGF1R蛋白，可以保证结合亲和力高，特异性好，易于修饰和人工合成，稳定性好，使用便利。
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种靶向IGF1R的aptamer，其特征在于：所述aptamer具有如SEQ1、2、3所示的序列或与其同源性80％以上的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的靶向IGF1R的aptamer，其特征在于：所述aptamer经过修饰，所述修饰为碱基或磷酸骨架的修饰。
3.根据权利要求2所述的靶向IGF1R的修饰aptamer，其特征在于：所述碱基修饰为F取代、MOE修饰、OME修饰。
4.根据权利要求2所述的靶向IGF1R的修饰aptamer，其特征在于：所述骨架修饰为部分硫代或全硫代。
5.根据权利要求1所述的靶向IGF1R的aptamer，其特征在于：所述aptamer经过末端偶连，所述偶连物包括荧光基团、药物、碱基类似物、糖修饰、肽、放射性物质、生物素以及量子点。
6.根据权利要求1所述的靶向IGF1R的aptamer，其特征在于：所述aptamer部分或全部转换为肽核酸或左旋核苷酸。
7.一种制备如权利要求1-6任一权利项所述靶向IGF1R的aptamer的方法，其特征在于，所述aptamer的制备方法包括以下步骤：
通过多轮蛋白筛选的方式获得靶向IGF1R的aptamer文库；
在aptamer文库中选出多条丰度最高的aptamer；
挑选进化较好的aptamer进行结合验证，得到亲和力较高的aptamer。
8.一种如权利要求1-6任一权利项所述靶向IGF1R的aptamer在制备检测试剂及试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂中包含所述靶向IGF1R的aptamer，用于细胞、血清、组织样品、分泌物以及活体中IGFIR的识别。
9.根据权利要求8所述靶向IGF1R的aptamer在制备靶向治疗试剂及试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂中包含权利要求1-7所述aptamer及其衍生物，用于特定组织或细胞中IGFIR的识别，以降解靶蛋白或杀死细胞。
10.根据权利要求9所述的靶向IGF1R的aptamer在肿瘤诊断和治疗中的应用，其特征在于：基于靶向IGF1R的aptamer达到肿瘤诊断或治疗的效果，所述肿瘤包含IGFIR阳性的肿瘤。
Priority Applications (1)
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| CN202410060603.4A CN118064438A (zh) | 2024-01-16 | 2024-01-16 | 一种靶向IGF1R的aptamer的制备方法及应用 |
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