CN117965693A - 一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂及其应用 - Google Patents

一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂及其应用，涉及生物检测技术领域，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂是由一段双链区和一段单链区构成的环状DNA；所述双链区与所述Cas12a荧光检测系统中的RNP所识别的靶序列完全一致；所述单链区为被Cas12a trans切割的poly T。本发明提供了一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，起到了增强Cas12a荧光检测系统的信号输出放大的效果。同时，本发明首次将Cas12a系统用于牙龈卟啉单胞菌的核酸检测，建立的方法灵敏度高，操作简单，无需复杂的温度循环设备且无需核酸扩增，具有广泛的实际应用价值。

Description

一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂及其应用。
背景技术
牙周炎是由细菌引起的牙周组织的炎症性疾病，在全世界范围内广泛流行。据估计，牙周炎影响了高达90％的世界人口。牙周炎可引起牙齿周围的牙槽骨进行性丢失，进而造成牙齿松动甚至脱落。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)fimAII和IV型菌株是与慢性牙周炎高度相关，可在高达85％的疾病部位检测到，被认为是口腔生物被膜的“基石”。此外，动物实验和人群临床数据调查发现，牙周炎还与糖尿病、心血管疾病、类风湿性关节炎、中风和不良妊娠之间存在关联。因此，可靠的早期牙周病原检测不仅能有效的预防牙周炎，还能为患者的健康带来更多的益处。
目前常用的牙龈卟啉单胞菌检测方法主要包括分离培养、抗体和核酸检测方法。分离培养虽为病原检测的“金标准”，但执行过程费时费力，不能适应现在快节奏的临床诊断；且分离培养需要专门的实验室和设备，无法用于口腔病原的椅边检测。抗体检测方法目前应用最多的为ELISA方法。相比于分离培养，ELISA利用抗原-抗体特异性结合检测病原，更加快捷，且具有一定的特异性，但灵敏度不足。核酸检测方法则比ELISA方法具有更高的灵敏度，以PCR为代表的各类核酸检测方法已广泛地应用于各种病原的检测，且实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)能够对样品中病原靶序列的拷贝数进行定量检测。在Hamlet的研究中，RT-PCR最低可检测到样品中102拷贝牙龈卟啉单胞菌核酸，远灵敏于ELISA的104拷贝。然而，PCR这类检测方法对于设备的需求较高：PCR需要PCR仪以及配套使用的电泳和凝胶成像系统；RT-PCR则需要更为精密的RT-PCR仪。在一些偏远地区或实验设备匮乏的医院无法独立完成病原分子生物学检测。除了上述三类检测方法，基于蛋白酶的特异性也被用于牙龈卟啉单胞菌检测方法的开发，例如Kaman等人，通过构建蛋白酶底物文库，筛选出5种牙龈卟啉单胞菌特有的牙龈蛋白酶特异性底物。通过龈沟液样品能否特异性的分解这5种底物来判断样品中是否含有牙龈卟啉单胞菌。使用该方法检测牙龈卟啉单胞菌较为便捷，但灵敏度同样不高。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspacedpalindromic repeats，CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR associated protein，Cas)构成的CRISPR-Cas系统在原核生物抵御噬菌体攻击的过程中起到至关重要的作用。Cas家族有众多成员，可分为两类：第一类Cas蛋白负责采集入侵者的RNA或DNA，从而产生记忆，当外源序列再次入侵细胞时产生预期精确互补的引导RNA(guide RNA，gRNA)；第二类Cas蛋白则可在gRNA的指导下，特异性地对已产生记忆的RNA或DNA靶片段进行切割，从而沉默外源基因的表达，抵御噬菌体的干扰。由于这种精确靶向功能，CRISPR-Cas不仅被用作靶向基因编辑，也同样在核酸快速检测领域有广泛应用。
近年来，Cas12和Cas13 trans内切酶活性的发现大大推动了CRISPR-Cas系统在生物传感器开发中的应用。在gRNA的介导下，Cas12和Cas13等核酸内切酶在识别并切割DNA或RNA靶序列的同时，其非特异性内切酶活性(称为trans裂解活性)也会被激活，从而对反应体系中ssDNA或ssRNA进行非靶向切割。Cas12/13系统被用于特定靶序列检测时，由于trans裂解活性被靶序列激活后可不断的进行trans切割，因此，当引入供trans切割的报告ssDNA或ssRNA分子时，由报告ssDNA或ssRNA裂解产生的信号会随着时间不断被放大，即使在仅有少量靶序列时也能产生强烈的信号。基于此原理的众多生物传感器，例如SHERLOCK、DETECTER、SHERLOCKv2等，已被广泛用于多种病原的核酸检测。然而现有的基于CRISPR-Cas的生物传感器的高灵敏度都强烈依赖于Cas反应上游的靶序列预扩增。这不仅增加了检测流程的时间和复杂性，预扩增带获得大量靶序列还成为实验室条件下靶序列气溶胶污染的主要来源。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂及其应用。
第一方面，本发明提供了一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂是由一段双链区(14bp)和一段单链区(5nt)构成的环状DNA；
所述双链区与所述Cas12a荧光检测系统中的RNP所识别的靶序列完全一致；
所述单链区为被Cas12a trans切割的poly T。
进一步地，用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的序列包括：15-20bp dsDNA+1～5nt ssDNA，且dsDNA序列与Cas12a RNP gRNA序列互补。
进一步地，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的序列包括chain 1和chainc；其中，所述chain 1由5’到3’依次包括Biontin-TTTTT/Azide-dT/第一序列-CHCH，所述第一序列如SEQ ID NO.1所示；所述chain c如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述chain 1通过点击化学形成环状结构；所述chain c和所述chain 1为互补序列。
进一步地，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的制备方法包括以下步骤：
采用牛血清白蛋白溶液对链霉亲和素修饰磁珠进行封闭，得到封闭后的磁珠；
将封闭后的所述磁珠和chain 1ssDNA寡核苷酸进行第一孵育，然后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗磁珠，得到第一孵育后的磁珠；
将第一孵育后的所述磁珠、二价铜盐、硫醇类还原剂和配体进行第二孵育，使chain 1成环；随后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗并加入核酸外切酶VII，以去除未成环的chain 1ssDNA，得到结合有通过点击化学形成环状结构chain 1的磁珠；
采用磷酸盐缓冲溶液对结合有通过点击化学形成环状结构chain 1的所述磁珠进行清洗并加热，使结合于亲和素的环状DNA释放至上清液，收集上清液并测定环化ssDNA的浓度，然后将等摩尔量的环状ssDNA和chain c混合，制得所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂。
进一步地，所述二价铜盐包括CuSO4；所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦；所述配体包括叔丁基三氯乙酰亚胺酯。
第二方面，本发明提供了第一方面任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的应用，所述应用包括：
(a)制备Cas12a荧光检测系统；
(b)制备生物传感器；
(c)口腔病原菌核酸检测。
第三方面，本发明提供了一种用于口腔病原菌核酸检测的生物传感器，所述生物传感器包括第一方面任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂。
进一步地，所述口腔病原菌包括牙龈卟啉单胞菌、Prevotella melaninogenica(ATCC 33270)、Campylobacter rectus(ATCC 33238)、Streptococcus sanguinis(ATCC10556)、Streptococcus mutans(ATCC 700611)、Peptostreptococcus micros(ATCC33270)、Treponema denticola(ATCC 35405)、Prevotella intermedia(ATCC 25611)、Porphyromonas endodontalis(ATCC 35406)
本发明实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：
1、本发明提供了一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂(简称为NanoCir)，NanoCir是由一段双链区和一段单链区构成的环状DNA。其双链区与系统中的RNP所识别的靶序列完全一致，单链区为易于被Cas12a trans切割的poly T，起到了增强Cas12a荧光检测系统的信号输出放大的效果。具体来说：
如图1所示，NanoCir是由一段双链区和一段单链区构成的环状DNA。其双链区与系统中的RNP所识别的靶序列完全一致，单链区为易于被Cas12a trans切割的poly T。由于拓扑结构的差异，尽管NanoCir具有RNP所识别的靶序列，但环状的NanoCir并不能直接激活RNP。但当反应系统中有少量线性靶序列(牙龈卟啉单胞菌核酸片段)，少量的RNP即可被激活，从而对系统中的reporter和NanoCir同时进行trans切割，产生少量荧光信号和少量线性化的NanoCir(L-NanoCir)。此时，这些L-NanoCir即可被RNP所识别，并进一步激活更多RNP，切割更多reporter和NanoCir，以此产生级联反应，达到信号放大的效果。
2、本发明首次将Cas12a系统用于牙龈卟啉单胞菌的核酸检测，建立的方法的灵敏度高，提取自梯度稀释的牙龈卟啉单胞菌菌液的DNA被用于Cas12a反应及NanoCir增强Cas12a反应。牙龈卟啉单胞菌菌液浓度为3.9×108至0.39CFU。具体来说，具有如下特点：
1)操作简单，无需复杂的温度循环设备(如PCR仪)，仅需要荧光酶标仪即可进行。
2)无需核酸扩增，不会造成气溶胶污染：现有的高灵敏度核酸检测方法均基于核酸扩增原理(如PCR类方法)，对目标序列长期进行大量扩增难免会对实验环境造成目标片段的气溶胶污染，进而在日后的核酸检测中造成假阳性结果。本方法通过在反应体系中预加入被“锁闭”的靶序列的方式，在避免前端预扩增环节的同时，实现了高灵敏度靶序列检测。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的检测原理图。
图2为本发明实施例中线性(Linear-)或环状(Cir-)NanoCir对Cas12a RNP trans活性的激活作用测试结果。
图3为本发明实施例中灵敏度实验测试结果一。
图4为本发明实施例中灵敏度实验测试结果二。
图5为本发明实施例中特异性实验测试结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
第一方面，本发明提供了一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂是由一段双链区和一段单链区构成的环状DNA；
所述双链区与所述Cas12a荧光检测系统中的RNP所识别的靶序列完全一致；
所述单链区为被Cas12a trans切割的poly T。
本发明提供了一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂(简称为NanoCir)，NanoCir由一段双链区和一段单链区构成的环状DNA。其双链区与系统中的RNP所识别的靶序列完全一致，单链区为易于被Cas12a trans切割的poly T，起到了增强Cas12a荧光检测系统的信号输出放大的效果。具体来说，本专利的基本原理包括：
本专利的基本原理：gRNA为根据靶序列特异设计的、能与靶序列靶向互补结合的寡聚RNA链。当gRNA与Cas12a形成RNP复合物，在gRNA引导下，Cas12a可与靶序列特异性结合，同时Cas12a的trans非特异性单链核酸内切酶活性也将被激活，并开始切割反应系统中的reporter。Reporter是同时修饰了荧光基团及淬灭基团的短单链DNA(ssDNA)。当reporter被切割，则荧光基团得以远离淬灭基团，从而释放荧光信号。尽管被激活的Cas12a理论上可以不断地trans切割系统中的reporter，使荧光信号不断累积放大。但实际情况是，当靶序列(牙龈卟啉单胞菌核酸)过少时，被激活的Cas12a量很少，短时间难以产生足以判定为阳性的荧光信号。因此，本专利针对如牙龈卟啉单胞菌等设计了一种Cas12a荧光检测系统的增强剂：NanoCir。本质上，NanoCir由一段双链区和一段单链区构成的环状DNA。其双链区与系统中的RNP所识别的靶序列完全一致，单链区为易于被Cas12a trans切割的poly T。由于拓扑结构的差异，尽管NanoCir具有RNP所识别的靶序列，但环状的NanoCir并不能直接激活RNP。但当反应系统中有少量线性靶序列(牙龈卟啉单胞菌核酸片段)，少量的RNP即可被激活，从而对系统中的reporter和NanoCir同时进行trans切割，产生少量荧光信号和少量线性化的NanoCir(L-Cir)。此时，这些L-Cir即可被RNP所识别，并进一步激活更多RNP，切割更多reporter和NanoCir，以此产生级联反应，达到信号放大的效果。
在一些具体实施例中，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的序列包括如SEQID NO.1所示的chain 1和如SEQ ID NO.2所示chain c。具体地，SEQ ID NO.1所示序列：Biontin-TTTTT/Azide-dT/TTTTCACCGCTGACTTACC-CHCH；SEQ ID NO.2所示序列：GGTAAGTCAGCGGT。
在一些具体实施例中，所述chain 1通过点击化学形成环状结构；所述chain c和所述chain 1为互补序列。
在一些具体实施例中，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的制备方法包括以下步骤：
采用牛血清白蛋白溶液对链霉亲和素修饰磁珠进行封闭，得到封闭后的磁珠；
将封闭后的所述磁珠和chain 1ssDNA寡核苷酸进行第一孵育，然后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗磁珠，得到第一孵育后的磁珠；
将第一孵育后的所述磁珠、二价铜盐、硫醇类还原剂和配体进行第二孵育，使chain 1成环；随后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗并加入核酸外切酶VII，以去除未成环的chain 1ssDNA，得到结合有通过点击化学形成环状结构chain 1的磁珠；
采用磷酸盐缓冲溶液对结合有通过点击化学形成环状结构chain 1的所述磁珠进行清洗并加热，使结合于亲和素的环状DNA释放至上清液，收集上清液并测定环化ssDNA的浓度，然后将等摩尔量的环状ssDNA和chain c混合，制得所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂。
具体地，上述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的制备方法包括：通过点击化学方法成功地实现了chain 1ssDNA的环化。使用1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)溶液，将400μL浓度为2mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠(1μm)(MCE，中国上海)封闭1小时。随后，将磁珠与浓度为0.5μM的chain 1ssDNA寡核苷酸一起孵育1小时。随后，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)清洗珠子，以消除残留的游离线性chain 1ssDNA寡核苷酸。随后，向磁珠中加入含有1mM CuSO4、2mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)和100μM TBTA(叔丁基三氯乙酰亚胺酯)的点击化学反应液体，室温孵育12小时，使chain 1成环。随后再次收集磁珠并用PBS清洗，向其中加入10U的核酸外切酶VII，37℃孵育30分钟，以去除未成环的chain 1ssDNA。反应后，使用PBS清洗磁珠，并加热至95℃，使结合于亲和素的环状DNA释放至上清液，30分钟后收集上清，使用Nanodrop测定环化ssDNA的浓度。然后将等摩尔量的环状ssDNA和chain c混合，形成NanoCir。
在一些具体实施例中，所述二价铜盐包括CuSO4；所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦；所述配体包括叔丁基三氯乙酰亚胺酯。
第二方面，基于同一个发明构思，本发明提供了第一方面任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的应用，所述应用包括：
(a)制备Cas12a荧光检测系统；
(b)制备生物传感器；
(c)口腔病原菌核酸检测。
第三方面，基于同一个发明构思，本发明提供了一种用于口腔病原菌核酸检测的生物传感器，所述生物传感器包括第一方面任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂。
本发明首次将Cas12a系统用于牙龈卟啉单胞菌的核酸检测，建立的方法的灵敏度高，提取自梯度稀释的牙龈卟啉单胞菌菌液的DNA被用于Cas12a反应及NanoCir增强Cas12a反应。牙龈卟啉单胞菌菌液浓度为3.9×108至0.39CFU。具体来说，具有如下特点：
1)操作简单，无需复杂的温度循环设备(如PCR仪)，仅需要荧光酶标仪即可进行。
2)无需核酸扩增，不会造成气溶胶污染：现有的高灵敏度核酸检测方法均基于核酸扩增原理(如PCR类方法)，对目标序列长期进行大量扩增难免会对实验环境造成目标片段的气溶胶污染，进而在日后的核酸检测中造成假阳性结果。本方法通过在反应体系中预加入被“锁闭”的靶序列的方式，在避免前端预扩增环节的同时，实现了高灵敏度靶序列检测。
在一些具体实施例中，所述口腔病原菌包括牙龈卟啉单胞菌、Prevotellamelaninogenica(ATCC 33270)、Campylobacter rectus(ATCC 33238)、Streptococcussanguinis(ATCC 10556)、Streptococcus mutans(ATCC 700611)、Peptostreptococcusmicros(ATCC 33270)、Treponema denticola(ATCC 35405)、Prevotella intermedia(ATCC25611)、Porphyromonas endodontalis(ATCC 35406)。
在一些具体实施例中，NanoCir增强荧光-Cas12a反应：荧光-Cas12a反应体系包括：10μL的10×NEB 2.1缓冲液，6pmol的Cas12a蛋白质，6pmol的gRNA，20pmol的reporter，1μmol DTT，200nM NanoCir以及用Pg.DNA作为靶标的ddH2O补至最终体积100μL。在充分混合后，将反应混合物在室温下孵育0-60分钟。随后，使用EnSight多模板读板仪(PerkinElmer，美国马萨诸塞州)在激发波长570nm和发射波长615nm下读取荧光信号。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
本例提供一种一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，并进一步将其应用于牙龈卟啉单胞菌检测，考察其检测牙龈卟啉单胞菌的特异性和灵敏度。
1、材料方法
核酸序列：本专利所设计的Cas12a检测系统靶向牙龈卟啉单胞菌的16s基因。
gRNA序列：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACCGCUGACUUACCGAACAA；或按照另一序列撰写表达方式规定，将gRNA序列中“U”替换为“T”，gRNA序列具体为：TAATTTCTACTAAGTGTAGATACCGCTGACTTACCGAACAA；记为SEQ ID NO.3。
用于构成NanoCir的序列包括，chain 1和chain c。其中，chain 1通过点击化学形成环状结构，chain c与chain 1互补，形成NanoCir中的双链区域。
chain 1序列：Biontin-TTTTT/Azide-dT/第一序列-CHCH，第一序列：TTTTCACCGCTGACTTACC，记为SEQ ID NO.1；即chain 1序列具体为：Biontin-TTTTT/Azide-dT/TTTTCACCGCTGACTTACC-CHCH。
chain c序列：GGTAAGTCAGCGGT，记为SEQ ID NO.2。
Reporter序列：Texas Red-第二序列-BHQ2，第二序列：CTCTCATTTTTTTTTTAGAGAG，记为SEQ ID NO.4；即Reporter序列具体为：Texas Red-CTCTCATTTTTTTTTTAGAGAG-BHQ2。
2、用于Cas12a荧光检测系统的增强剂(NanoCir)的合成
通过点击化学方法成功地实现了chain 1ssDNA的环化。使用1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)溶液，将400μL浓度为2mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠(1μm)(MCE，中国上海)封闭1小时。随后，将磁珠与浓度为0.5μM的chain 1ssDNA寡核苷酸一起孵育1小时。随后，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)清洗珠子，以消除残留的游离线性chain 1ssDNA寡核苷酸。随后，向磁珠中加入含有1mM CuSO4、2mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)和100μM TBTA(叔丁基三氯乙酰亚胺酯)的点击化学反应液体，室温孵育12小时，使chain 1成环。随后再次收集磁珠并用PBS清洗，向其中加入10U的核酸外切酶VII，37℃孵育30分钟，以去除未成环的chain 1ssDNA。反应后，使用PBS清洗磁珠，并加热至95℃，使结合于亲和素的环状DNA释放至上清液，30分钟后收集上清，使用Nanodrop测定环化ssDNA的浓度。然后将等摩尔量的环状ssDNA和chain c混合，形成NanoCir。
3、NanoCir增强荧光-Cas12a检测反应体系的建立与应用
3.1、荧光-Cas12a反应体系包括：10μL的10×NEB 2.1缓冲液，6pmol的Cas12a蛋白质，6pmol的gRNA，20pmol的reporter，1μmol DTT，200nM NanoCir以及用Pg.DNA作为靶标的ddH2O补至最终体积100μL。在充分混合后，将反应混合物在室温下孵育0-60分钟。随后，使用EnSight多模板读板仪(PerkinElmer，美国马萨诸塞州)在激发波长570nm和发射波长615nm下读取荧光信号。
3.2、考察特异性和灵敏度
为证明此次开发的NanoCir增强Cas12a反应对于牙龈卟啉单胞菌的特异性，其他几种常见的口腔病原菌核酸也被用于NanoCir增强Cas12a，这些菌包括：Prevotellamelaninogenica(ATCC 33270)、Campylobacter rectus(ATCC 33238)、Streptococcussanguinis(ATCC 10556)、Streptococcus mutans(ATCC 700611)、Peptostreptococcusmicros(ATCC 33270)、Treponema denticola(ATCC 35405)、Prevotella intermedia(ATCC25611)、Porphyromonas endodontalis(ATCC 35406)。
测试方法及条件：首先，使用商品化DNA提取试剂盒(天根，DP302)提取上述各细菌DNA。将上述DNA作为靶序列用于NanoCir增强荧光-Cas12a反应，反应体系包括：10μL的10×NEB 2.1缓冲液，6pmol的Cas12a蛋白质，6pmol的gRNA，20pmol的reporter，1μmol DTT，200nM NanoCir以及上述DNA作为靶标的ddH2O补至最终体积100μL。在充分混合后，将反应混合物在室温下孵育30分钟。使用EnSight多模板读板仪(PerkinElmer，美国马萨诸塞州)在激发波长570nm和发射波长615nm下读取荧光信号。
3.3、实验结果
线性(Linear-)或环状(Cir-)amplifier对Cas12a RNP trans活性的激活作用：如图2所示，在25nM线性Linear-amplifier的激活作用，荧光Cas12a反应产生了超过300000的荧光强度，极显著高于阴性对照反应(NC)；而在环状的NanoCir的作用下，仅产生了略高于NC的荧光信号。表明本发明设计的amplifier在线性结构下能够高效启动Cas12a trans反应，而环状结构能够有效“锁闭”这种激活作用。
灵敏度实验：1)如图3所示，本发明首先检验了无预扩增、无NanoCir的普通Cas12a反应的灵敏度。结果显示，普通Cas12a反应最低可检测3.9×105CFU牙龈卟啉单胞菌，3.9×104CFU菌液不能使普通Cas12a反应产生显著高于NC的荧光信号。2)如图4所示，当向普通荧光-Cas12a反应中引入200nM NanoCir，反应20分钟后，即可对3.9×104CFU的牙龈卟啉单胞菌产生显著高于NC的荧光信号，而该浓度是普通荧光-Cas12a的检测极限。反应80分钟后，即使牙龈卟啉单胞菌浓度低至0.39CFU，在NanoCir的增强下，Cas12a反应产生了显著高于NC的荧光信号(p＝0.04)，表明，NanoCir增强Cas12a反应的灵敏度比普通Cas12a灵敏度高1000000倍。而已报道的牙龈卟啉单胞菌荧光定量PCR检测方法的灵敏度为1CFU。需强调的是此次建立方法为非扩增方法，但其灵敏度高于已报到的荧光定量PCR方法。
特异性实验：如图5所示，为验证本次建立的Cas12a方法对于牙龈卟啉单胞菌的特异性，确保不会与其他常见口腔病原菌产生交叉反应而产生假阳性结果，我们选取了数种常见口腔病原菌进行了特异性研究，结果表明，本次建立的荧光-Cas12a反应仅对牙龈卟啉单胞菌核酸产生了阳性反应。
综上所述，本发明提供了一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，起到了增强Cas12a荧光检测系统的信号输出放大的效果。同时，本发明首次将Cas12a系统用于牙龈卟啉单胞菌的核酸检测，建立的方法的灵敏度高，操作简单，无需复杂的温度循环设备且无需核酸扩增，具有广泛的实际应用价值。
本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂是由一段双链区和一段单链区构成的环状DNA；
所述双链区与所述Cas12a荧光检测系统中的RNP所识别的靶序列完全一致；
所述单链区为被Cas12a trans切割的poly T。
2.权利要求1所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的序列包括chain 1和chain c；其中，所述chain 1由5’到3’依次包括Biontin-TTTTT/Azide-dT/第一序列-CHCH，所述第一序列如SEQ ID NO.1所示；所述chain c如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求2所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述chain1通过点击化学形成环状结构；所述chain c和所述chain 1为互补序列。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，其特征在于，所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的制备方法包括以下步骤：
采用牛血清白蛋白溶液对链霉亲和素修饰磁珠进行封闭，得到封闭后的磁珠；
将封闭后的所述磁珠和chain 1ssDNA寡核苷酸进行第一孵育，然后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗磁珠，得到第一孵育后的磁珠；
将第一孵育后的所述磁珠、二价铜盐、硫醇类还原剂和配体进行第二孵育，使chain1成环；随后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗并加入核酸外切酶VII，以去除未成环的chain1ssDNA，得到结合有通过点击化学形成环状结构chain 1的磁珠；
采用磷酸盐缓冲溶液对结合有通过点击化学形成环状结构chain 1的所述磁珠进行清洗并加热，使结合于亲和素的环状DNA释放至上清液，收集上清液并测定环化ssDNA的浓度，然后将等摩尔量的环状ssDNA和chain c混合，制得所述用于Cas12a荧光检测系统的增强剂。
5.根据权利要求4所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂，所述二价铜盐包括CuSO4；所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦；所述配体包括叔丁基三氯乙酰亚胺酯。
6.权利要求1～5任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂的应用，其特征在于，所述应用包括：
(a)制备Cas12a荧光检测系统；
(b)制备生物传感器；
(c)口腔病原菌核酸检测。
7.一种用于口腔病原菌核酸检测的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括权利要求1～5任一项所述的用于Cas12a荧光检测系统的增强剂。
8.根据权利要求7所述的用于口腔病原菌核酸检测的生物传感器，其特征在于，所述口腔病原菌包括牙龈卟啉单胞菌、Prevotella melaninogenica(ATCC 33270)、Campylobacter rectus(ATCC 33238)、Streptococcus sanguinis(ATCC 10556)、Streptococcus mutans(ATCC 700611)、Peptostreptococcus micros(ATCC 33270)、Treponema denticola(ATCC 35405)、Prevotella intermedia(ATCC 25611)、Porphyromonas endodontalis(ATCC 35406)。
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