CN117957248A - 抗periostin人源化单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

抗periostin人源化单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了抗periostin人源化单克隆抗体及其制备方法与应用，所述抗periostin人源化单克隆抗体的表达量较高，与抗原结合的特异性和亲和性较好。

Description

抗periostin人源化单克隆抗体及其制备方法与应用
本申请要求于2021年09月13日提交中国专利局、申请号为202111068177.1、发明名称为“抗periostin人源化单克隆抗体及其制备方法与应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及抗periostin人源化单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
增生型糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)等玻璃体视网膜疾病是现阶段导致相应人群视力下降和丧失的主要原因，也是世界性医学难题。因此，寻玻璃体视网膜疾病的新的生物学标记物和治疗靶点对疾病的早期发现、早期诊断及早期治疗至关重要。
骨膜蛋白(periostin)是于1993年发现于小鼠胚胎成骨细胞前体细胞中的细胞黏附蛋白，命名为成骨细胞特异性因子-2(OSF-2)，因其在成年小鼠牙周膜和骨膜可以特异性表达，故更名为骨膜蛋白。骨膜蛋白(periostin)是一种独特的细胞外基质蛋白，参与人体各组织器官的相应免疫炎症反应，如心肌梗死后重塑、骨髓纤维化、牙周组织再生修复、皮肤伤口愈合、肿瘤细胞转移、肾脏损伤、以及可诱导慢性过敏性疾病等。近年以periostin为靶点的药物研究与生产成为热点，大量上市药物在肿瘤治疗过程中取得了令人瞩目的成绩。
骨膜蛋白在眼部的主要作用包括促进细胞增殖、分化、迁移和粘附，诱导纤维形成以及促进新生血管等。越来越多的国内外研究证明，骨膜蛋白是各玻璃体视网膜疾病中的关键因子，骨膜蛋白有望成为玻璃体视网膜疾病的新的生物学标志物，以此提供新的治疗策略。例如，有报道称：Periostin抗体已被证实对眼科诸多领域对年龄相关性黄斑变以及糖尿病视网膜病变所引发的眼内部的新生血管性增生、黄斑水肿等治疗起到关键作用。
但此前的Periostin抗体皆为鼠源单抗，鼠源性抗体作为异源蛋白应用于人体会引起针对异源蛋白的免疫排斥反应，诱发产生人抗鼠抗体，缩短抗体在体内的半衰期影响抗体的治疗效果。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上对Periostin抗体进行人源化改造，能够减少异源抗体的免疫原性，提高与抗原结合的特异性和亲和性，从而起到更好的治疗作用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗periostin人源化单克隆抗体及其制备方法与应用。
本发明提供的抗periostin人源化单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明提供的抗periostin人源化单克隆抗体，其重链的恒定区为人IgG1；其轻链的恒定区为人κ型。
一些具体实施例中，所述人源化抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示， 其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明利用periostin鼠源单抗，对其进行人源化改造，成功构建真核表达质粒，转染哺乳动物细胞CHO进行分泌表达，通过SDS-PAGE、ELISA、WB等在体外进行了亲和力、结合活性等生物学功能评价，为CHO细胞大规模表达抗periostin人源化单克隆抗体研究提供了理论基础。
本发明提供的抗periostin人源化单克隆抗体以上述重链及轻链组成，经人源化后，比现有技术中的嵌合抗体或其他鼠源periostin单克隆抗体更加安全可靠的、功能更显著。经检测，该人源化抗体对人periostin具有良好的特异性。鉴于Periostin抗体已被证实对眼科诸多领域对年龄相关性黄斑变以及糖尿病视网膜病变所引发的眼内部的新生血管性增生、黄斑水肿等治疗起到关键作用。因此，本发明提供的抗体具有潜在的治疗组织纤维化病变的作用。
本发明还提供了编码所述的单克隆抗体的核酸。具体的，本发明提供了编码所述单克隆抗体重链的核酸、编码所述单克隆抗体轻链的核酸、编码所述单克隆抗体重链可变区的核酸和/或编码所述单克隆抗体轻链可变区的核酸。一些实施例中，编码所述抗体重链的核酸具有如SEQ ID NO：5所示的核酸序列。编码所述抗体轻链的核酸具有如SEQ ID NO：6所示的核酸序列。为了方面蛋白的表达，本发明提供的编码核酸的5’端还包括接头序列。因此，一些具体实施例中，编码所述抗periostin人源化单克隆抗体重链的核酸具有如SEQ ID NO：7所示的核酸序列；编码抗periostin人源化单克隆抗体的轻链核酸具有如SEQ ID NO：8所示的核酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，包括编码所述的单克隆抗体的核酸。本发明中，所述表达载体中还包括骨架载体；一些实施例中，所述骨架载体为pCDNA3.4。
本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。本发明中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，一些具体实施例中，所述宿主细胞为CHO-K1细胞。
本发明所述抗periostin人源化单克隆抗体的制备方法包括：培养本发明宿主细胞、诱导抗periostin人源化单克隆抗体的表达。
本发明还提供了抗periostin人源化单克隆抗体在制备药物或检测试剂中的应用，所述药物为治疗组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的药物。所述试剂为诊断组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的试剂。一些实施例中，所述组织纤维化病变为视网膜纤维化。
本发明提供了一种药物，其包括本发明所述的抗periostin人源化单克隆抗体。
本发明还提供了一种试剂盒，其含有抗periostin人源化单克隆抗体，或包括将该抗体与化学标记或生物标记形成的结合物，或包括所述抗periostin人源化单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。
本发明中所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、PAP、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。所述偶联物中的固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。该试剂盒能够用于组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的诊断。所述诊断的方法采用免疫学检测方法，例如ELISA、western blot、免疫荧光技术、免疫组化检测等。
本发明还提供了一种治疗组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的方法，其为给予本发明所述的药物。
本发明还提供了一种诊断组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的方法，其为以本 发明所述的诊断试剂进行诊断
本发明提供提供了抗periostin人源化单克隆抗体，该抗体仅保留鼠源性McAb可变区中与抗原结合的互补决定区，制备CDR移植抗体。与嵌合抗体相比，其免疫原性更低。相对于实验中的其他抗体，本发明筛选获得的抗体表达量更高，与抗原结合的特异性和亲和性更好，能更好地参与人体免疫反应。
附图说明
图1示鼠杂交瘤细胞(45-2-G3-1-G7-B7)VH和VL PCR扩增结果；
图2示克隆后PCR结果；
图3-1和图3-2示重链和轻链的质粒图谱；
图4示纯化效果；
图5示18个人源化抗体的ELISA结果；
图6示表达载体电泳检测结果；
图7示线性化表达载体电泳检测结果；
图8示加压筛选后蛋白表达纯化结果；
图9示筛选获得细胞表达蛋白纯化结果；
图10示人源化抗periostin抗体5-G4、5-G6、5-G9鉴定；
图11示微管抑制实验结果，其中，Periostin抗体为人源化单抗，对照Periostin为小鼠单抗；
图12示细胞迁移实验结果；
图13示相对于空白对照组的细胞迁移率；
图14示细胞侵袭实验结果；
图15示相对于空白对照组的细胞侵袭率；
图16示细胞划痕实验结果；
图17示细胞相对迁移距离(％)；
图18示不同组别RPE细胞中VEGFA、α-SMA、Col I、Col III、Fibronectin蛋白的表达WB检测图；
图19示不同组别RPE细胞中VEGFA、α-SMA、Col I、Col III、Fibronectin蛋白的表达水平；
图20示各组血管内皮细胞膜上的αvβ3、αvβ5整合素，VEGFR-2、FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的mRNA表达量；
图21示不同组别HUVEC细胞中各个蛋白的Western blot检测图；
图22示不同组别HUVEC细胞中各个蛋白的表达水平；
图23示IF检测HUVEC细胞中FAK蛋白的表达；
图24示IF检测HUVEC细胞中VEGFR2蛋白的表达；
图25示IF检测HUVEC细胞中αvβ3蛋白的表达；
图26示IF检测HUVEC细胞中αvβ5蛋白的表达。
具体实施方式
本发明提供了抗periostin人源化单克隆抗体及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的 方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。所述“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。
抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。
“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。本发明提供的为periostin的人源化单克隆抗体。从培养的杂交瘤细胞45-2-G3-1-G7-B7中提取总RNA，用寡核苷酸引物反转录合成cDNA，用IgG简并引物和kappa特异性引物分别扩增VH和VL片段，用凝胶电泳观察到结果(图1)。然后将PCR产物亚克隆到标准载体中，进行克隆采摘和PCR验证(图2)，最后对阳性克隆进行测序。采用基因合成法，将抗Periostin鼠单克隆抗体的可变区基因的框架区替换为人抗体的框架区，人源化抗体可变区基因片段，重组入含有调控序列和人抗体恒定区基因的载体中，构建抗Periostin人源化单克隆抗体的完整基因及包含所述基因的真核表达载体，再转染CHO-K1细胞。经GS系统加压筛选，获得持续稳定分泌人源化抗体的CHO-K1细胞。
本发明所述抗periostin人源化单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为：
本发明所述抗periostin人源化单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为：
本发明所述抗periostin人源化单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列为：
本发明所述抗periostin人源化单克隆抗体的轻链恒定区的氨基酸序列为：
本发明所述抗periostin人源化单克隆抗体的重链的氨基酸序列为：
本发明所述抗periostin人源化单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为：
为了方便抗体的表达和纯化，在载体构建和蛋白表达的过程中，分别在重链片段和轻链片段的N端添加接头片段。该片段在后续纯化过程中被去掉。一些实施例中，所述抗periostin人源化单克隆抗体的重链的N端添加的接头的氨基酸序列为MKHLWFFLLLVAAPRWVLS，所述抗periostin人源化单克隆抗体的轻链的N端添加的接头的氨基酸序列为MVLQTQVFISLLLWISGAYG。
抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。
本发明所述药物中含有至少一种功能成分，还包括可药用的载体。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、抗体人源化设计
(1)、CDR区序列鉴定
由鼠杂交瘤细胞(45-2-G3-1-G7-B7，构建方法参见《抗人periostin单克隆嵌合 抗体及应用》，申请号：202010788885.1，来自沈阳何氏眼产业集团有限公司或沈阳眼产业技术研究院有限公司)分离出全部mRNA，以此作为合成cDNA的模板，从cDNA中分离重链可变区DNA片段及轻链可变区DNA片段，再将这些得到的DNA片段克隆进载体并测序得到序列结果如下：
氨基酸序列：
>45-2-G3-1-G7-B7-VL1
>45-2-G3-1-G7-B7-VL2 and VL3
>45-2-G3-1-G7-B7-VH
轻链可变区中的3个CDR区的氨基酸序列依次为：SSASY、DTS、QQWSSNPPT。
重链可变区中的3个CDR区的氨基酸序列依次为：GYSFTDYF、INPYSGDT、GRSGVSGLDY。
(2)序列比对及鼠源抗体CDR移植
使用NCBI开发的Igblast(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)搜索IMGT小鼠和人类V基因数据库，输入小鼠抗体可变区序列，序列比对后确定同源性最高的人抗体可变区，然后将小鼠抗体CDR区域移植到的人类框架受体区域，以此完成CDR移植。
2、18个人源化抗体载体构建及表达
(1)基因合成
将可变区序列与人恒定区DNA序列链接，插人pcDNA3.4表达载体，得到质粒图谱(图3-1和图3-2)，periostin抗体的重链和轻链核酸序列、氨基酸序列如下所示。
(2)亚克隆到表达载体
基因合成后对CHO系统密码子优化，并亚克隆到表达载体PATX1。
核酸序列信息包括：
DNA序列
>12-VHA-1423bp
>12-VHB-1423bp
>459-VHA-1423bp
>459-VHB-1423bp
>459-VHC-1423bp
>551-VHB-1423bp
>621-VLA-725bp
>311-VLA-725bp
>139-VLA-725bp
>12-VHA
>12-VHB
>459-VHA
>459-VHB
>459-VHC
>551-VHB
>621-VLA
>311-VLA
>139-VLA
(3)瞬转
无内毒素质粒DNA提取，将构建的载体共转染CHO-K1细胞，培养至存活率下降到50％以下。取部分细胞收集培养上清，用protein G纯化后跑SDS-PAGE胶，用抗原蛋白进行ELISA检测抗体的活性。
转染方法：
①转染前一天，接种27×10 6个细胞到完全培养基中培养(不含抗生素及抗聚集试剂)，使细胞在转染当天处于对数生长期。
②转染复合物的准备
a稀释DNA至完全培养基中，轻柔混匀。
b稀释PEI转染试剂至完全培养基中，轻柔混匀，室温孵育5min。
c加稀释的PEI到稀释的DNA中，转染混合物总体积为3ml，轻柔混匀，室温孵育20-30min。
③转染：加入3ml转染混合物到27ml细胞悬液中，轻柔混匀，在37℃，5％CO 2，130rpm条件下培养至细胞活率降到50％以下收样。
转染信息：
(4)纯化
离心收集上清，装填18个1ml蛋白A纯化柱，填料用PBS pH 7.5平衡，最后将蛋白A树脂与培养上清混匀孵育过夜，孵育结束后纯化。用PBS，pH 7.5的缓冲液清洗，用20mM柠檬酸pH 2.7缓冲液洗脱，中和缓冲液为1M Tris HCl，pH 9.0中和至6.0。纯化完成后取IN、FT、洗涤和洗脱的样各20ul跑SDS-PAGE，根据SDS-PAGE收集样品透析过夜，然后将样品汇集并进行缓冲液交换和浓缩，最终结果如图4所示。
样品信息
序号 Antibody Concentration Quantity Number Yield
1 12-VHA/621-VLA 1.05mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
2 12-VHA/311-VLA 1.16mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
3 12-VHA/139-VLA 1.31mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
4 12-VHB/621-VLA 1.01mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
5 12-VHB/311-VLA 1.00mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
6 12-VHB/139-VLA 1.13mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
7 459-VHA/621-VLA 0.96mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
8 459-VHA/311-VLA 1.02mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
9 459-VHA/139-VLA 1.07mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
10 459-VHB/621-VLA 0.80mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
11 459-VHB/311-VLA 1.13mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
12 459-VHB/139-VLA 1.25mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
13 459-VHC/621-VLA 0.69mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
14 459-VHC/311-VLA 1.00mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
15 459-VHC/139-VLA 1.16mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
16 551-VHB/621-VLA 1.78mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
17 551-VHB/311-VLA 1.71mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
18 551-VHB/139-VLA 1.80mg/ml 0.50mg/vial 1vial 0.50mg
Western Blot验证特异性结合，其中1-18为18个人源化单抗，19009414P 11(human IgG1)为periostin嵌合抗体，45-2-G3-1-G7-B7为periostin鼠单抗，结果如下表和图5所示。
人源化抗体ELISA的排板情况
ELISA检测结果
1 2 3 4 5 6 7 8
2.2676 2.1962 2.1325 1.0578 1.0122 1.0485 2.0413 1.7380
2.3149 2.2910 2.1548 1.9094 1.9964 1.9358 1.9902 1.6759
1.8726 1.9203 1.8613 2.0560 1.8604 1.8602 1.9714 1.6779
2.1021 1.9955 1.9839 0.4797 0.4511 0.4934 1.7166 0.7665
2.1828 2.1139 2.0769 1.1582 1.0934 1.0282 1.7625 0.7699
2.0264 2.1278 2.1131 0.6429 0.5133 0.5998 1.7652 0.6939
1.8504 1.9261 1.9378 0.0641 0.0639 0.0626 0.0619 0.0555
2.0901 2.2168 2.1762 2.0171 2.1129 2.0738 0.0554 0.0567
3、人源化抗体稳转株构建及表达
(1)载体构建
由上一步瞬转测试结果可得，18号抗体551-VHB/139-VLA的表达量最高，且结合能力能够满足要求，因此，综合考虑表达量和抗体结合能力后，以551-VHB和139-VLA作为periostin人源化抗体的重链和轻链，亚克隆到表达载体pATX-GS2中，后共同转染CHO细胞表达抗体蛋白。琼脂糖凝胶电泳跑胶结果如图6。
(2)periostin人源化抗体表达
将目的片段经双酶切(EcoR I/Not I)、连接后亚克隆到表达载体pATX-GS2中，然后稳定转染CHO细胞，经MSX加压筛选、ELISA有限稀释得到稳定的细胞株。在37℃、5％二氧化碳的摇床中培养7d后收集上清液，用琼脂糖凝胶ProteinA层析填料纯化上清液中的人源化抗体。
①质粒线性化
将提取好的质粒PATX-GS2-139-VLA-551-VHB提前取出10ul备份(用于验证线性化是否成功)，将酶，buffer依次加入质粒，并混匀；EP管插入浮漂，放入37度水浴锅中酶切大概1-2h。酶切成功后需进行回收：根据质粒体积加入0.75倍的异丙醇，混匀；4度离心30min后弃上清；加入1ml 70％乙醇4度离心5min，跑胶测浓度(图7)。
酶切体系：
试剂名称 体积(ul)
酶切buffer 10
质粒 全部
酶 6-10
②转染
为了获得稳定的表达重组抗体的转染细胞池，用PVUI线性化的质粒pATX-GS2-139-VLA-551-VHB转染CHO-K1细胞，化学方法进行转染(FectoCHO TM表达系统转染试剂盒)。
(3)加压筛选
转染48小时后，对转染后的宿主细胞施加相应的选择压力筛选，本发明选用GS筛选系统(glutamine synthetase Gene Expression System)。对细胞进行加压处理，并用30um浓度的MSX处理细胞：采用6孔平板标准分批培养法分别测定CHO-K1细胞株对MSX的自然抗性，测定MSX对未转染细胞株CHO-K1的最低杀灭浓度为20uM。加入30um浓度的MSX，每3～4天更换新的筛选培养基，直至有抗性的稳定细胞出现，MSX筛选2～3周后，产生3个稳定池。
在125ml摇瓶中，细胞培养在30ml选择性培养基中，标准条件下培养(37℃、5％CO 2、130rpm)。当细胞在摇瓶中处于良好状态时，进行30ml补料分批表达试验，在D3、D5、D7和D9上添加进料培养基并全程监测血糖。连续培养3代，直到细胞 活力下降到50％以下结束培养，收集培养液上清，进行纯化分析。纯化结果如图8所示，其中reduced示还原SDS-PAGE电泳结果，non-reduced示非还原SDS-PAGE电泳结果。
样品信息：
Antibody Concentration Specification Quantity Yield
18-stable 1 0.86mg/ml 1.75ml/vial 4vials 6.02mg/30ml
18-stable 2 0.94mg/ml 1.80ml/vial 4vials 6.76mg/30ml
18-stable 3 1.62mg/ml 1.80ml/vial 4vials 11.66mg/30ml
(4)有限稀释法分离单克隆抗体：挑选Stable pool 3多克隆细胞株进行有限稀释单克隆加压铺板，将获得的稳定转染池的细胞悬液稀释到很低的密度，使每个孔平均接种1个细胞。用ELISA法筛选出表达量较高的5-G4、5-E6、5-G6、5-D7、5-G9、2-H3、2-C7共7株单克隆细胞株进行后续的扩大培养。以1∶3倍稀释梯度，抗体浓度依次为1、0.33、0.11、0.037、0.012、0.004、0.0014ug/ml，以及空白对照共8个梯度。显微镜下观察单克隆，ELSIA法检测阳性单克隆，结果见下表。
抗体ELISA结果：
将克隆5-G4、2-C7、5-E6、5-G9、2-H3、5-D7、5-G6的细胞培养于125ml摇瓶中的30ml选择性培养基中，并在标准条件下培养(37℃，5％二氧化碳，130转/分)3代。当细胞在摇瓶中处于良好状态时，进行30ml补料分批表达试验。在D3、D5、D7和D9上添加进料培养基。全程监测血糖。收集培养基，直到细胞活力下降到50％以下。纯化结果如图9：
样品信息：
Antibody Concentration Volume Quantity Yield Yield
5-E6 4.49mg/ml 1.63ml/vial 7vials 51.23mg/30ml 1.70g/L
5-G4 7.13mg/ml 1.64ml/vial 7vials 81.86mg/30ml 2.72g/L
2-H3 3.91mg/ml 1.67ml/vial 7vials 45.71mg/30ml 1.52g/L
5-D7 4.63mg/ml 1.55ml/vial 6vials 43.06mg/30ml 1.44g/L
2-C7 3.64mg/ml 1.63ml/vial 7vials 41.53mg/30ml 1.38g/L
5-G6 5.07mg/m 1.65ml/vial 7vials 58.56mg/30ml 1.95g/L
5-G9 6.14mg/m 1.61ml/vial 7vials 69.20mg/30ml 2.31g/L
(5)、人源化抗periostin抗体鉴定
从表达量和ELISA筛选结果，选三株稳转株5-G4、5-G6、5-G9进行WB检测，验证结合特异性。
实验条件：抗原1ug，一抗1∶1000稀释，孵育1h，二抗1∶10000稀释，孵育 45min。结果如图10。
由图10可见，5-G4、5-G6、5-G9三株稳转株均与periostin抗原蛋白特异性结合。
4、抗periostin人源化抗体抗纤维化作用研究
4.1研究方法
将5-G6稳转株的抗体在体内外分别进行成纤维细胞的跨孔迁移试验、迁移细胞数量研究，免疫组化分析小鼠的成纤维细胞的迁移；以及HE和Masson染色观察小鼠组织病理变化，研究纤维化面积比率；荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法分别检测小鼠纤维化模型中I型胶原蛋白(Col1a1和Col1a2)和III型胶原蛋白(Col3a1)mRNA的表达情况；实验以含periostin+对照IgG的条件培养基为对照IgG组，将含periostin+人源化periostin抗体的条件培养基受试组记做Postn nAb组。
Wilcoxon秩和检验比较纤维化面积比率、阳性浸润成纤维细胞数量及成纤维细胞比率和迁移成纤维细胞数量的中值。
最后统计学方法：采用SPSS统计软件进行实验数据处理，采用方差对组间分析，在所有统计分析中，显著性定义为p＜0.05。
4.2研究结果
4.2.1、跨孔迁移实验中，空白对照组中的成纤维细胞数量远远大于Postn nAb组，即Postn nAb组能够有效抑制成纤维细胞的迁移，这一结果证明了Postn nAb在体外的有效性。
4.2.2、与空白对照组相比，在14dpi时，免疫组织学分析显示Postn nAb减少浸润成纤维细胞的数量。
4.2.3、纤维化面积比率28dpi，与空白对照组小鼠相比，Postn nAb组小鼠中纤维化面积显著减少。
4.2.4、Postn nAb组小鼠中I型胶原蛋白和III型胶原蛋白mRNA表达量与空白对照组小鼠明显降低(P＜0.05)。
研究结论：本研究成功制备了抗periostin人源化单克隆抗体，且制备的抗periostin人源化单克隆抗体能够特异性结合体内periostin蛋白，从而有效的抑制体内纤维化作用，因此抗periostin人源化单克隆抗体有望成为治疗视网膜纤维化的新型药物。
5、Periostin人源化单抗体外活性实验
5.1微管抑制实验
体外培养HUVEC细胞，分别以50000个/孔(24h)进行12孔板铺板，5％CO2，37℃过夜培养后进行加药处理16h，进行血管形成实验，观察并在适当时间点拍照记录，并统计实验结果得下表和图11。
HUVEC Number of tubes HUVEC Number of tubes
分组(μg/mL) 16h 分组(μg/mL) 16h
对照periostin 0 121 periostin抗体1 162
对照periostin 1 108 periostin抗体10 57
对照periostin 10 91 periostin抗体100 41
对照periostin 100 26 periostin抗体1000 2
由表可知，随着抗体浓度增高，微管数量减少，且在相同浓度下人源化单抗的抑制微管率大于鼠单抗，可以证实上述periostin人源化单抗可抑制periostin对人血管内皮细胞微管形成作用。
5.2体外培养RPE细胞并分组，分别进行细胞迁移、细胞侵袭以及细胞划痕实验
a空白对照组(Control)：不含重组periostin蛋白或抗体
b periostin组：只含periostin
c对照IgG组：含periostin+对照IgG
d periostin抗体组：含periostin+Postn nAb
Postn nAb：本发明制备的periostin人源化抗体
5.2.1细胞迁移实验
Transwell检测
(1)细胞离心完成之后弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用无血清DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1×10 5个/ml；
(2)取细胞悬液200μl加入Transwell小室，24孔板下室加入600μl含10％FBS的培养基，37℃培养16-24h；
(3)取出transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗2次；
(4)4％PFA固定，10min，PBS洗2次；
(5)结晶紫染色10min，PBS洗2次；
(6)显微镜下观察迁移的细胞(图12)，随机选取3个视野进行拍照，并用image J软件进行计数，作图(图13)。
实验结果
实验结果显示，与空白对照组(Control)相比，periostin处理组细胞迁移率和迁移细胞数显著增大(P＜0.001)，而periostin+Postn nAb处理组显著低于空白对照组(P＜0.001)，periostin+IgG处理组比periostin处理组细胞迁移程度略小，说明periostin人源化单抗可抑制periostin引起的RPE细胞的迁移。
5.2.2细胞侵袭实验
Transwell小室预先涂好Matrigel基质胶，加入一定浓度的细胞悬液，并于下室中加入含FBS的培养基，37℃、5％CO 2培养箱中培养48h后观察、拍照(图14)，统计迁移细胞数(图15)。
结果显示，与空白对照组相比，periostin处理组细胞迁移率和侵袭细胞数显著增高(P＜0.01)，而periostin+Postn nAb处理组显著降低(P＜0.01)，同时periostin+IgG处理组比periostin处理组RPE细胞迁移程度略小，结果表明periostin人源化单抗有抑制periostin的作用。
5.2.3划痕实验
(1)细胞经上述分组处理后用10μl枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致；
(2)吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片，加入 相应无血清培养基；
(3)将培养板放入培养箱培养0、6h、24h、48h分别取出拍照；
根据收集图片数据分析实验结果(图16～17)。实验结果与分析：细胞经上述分组处理后用10μl枪头垂直于孔板制造细胞划痕，将培养板放入培养箱培养0、6h、24h、48h分别取出拍照。
实验结果显示，培养48h时与空白对照组相比，periostin处理组细胞相对迁移距离显著增高(P＜0.01)，而periostin+Postn nAb处理组显著低于空白对照组(P＜0.001)，同时periostin+IgG处理组比periostin处理组RPE细胞迁移程度略小，结果表明periostin人源化单抗可抑制periostin诱导的RPE细胞的作用。
5.3 Western Blot检测结果
检测不同组别RPE细胞中VEGFA、α-SMA、Col I、Col III、Fibronectin蛋白的表达。
VEGFA(血管内皮生长因子)A：VEGFA诱导血管生成反应，促进血管再生。
α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)：存在于血管壁、肠粘膜肌层和固有肌层以及各种组织间质中，在肌成纤维细胞和肌上皮细胞中高表达，有研究表明在器官纤维化的研究中随纤维化程度加重而增加。
ColI、Col III(I型胶原和III型胶原蛋白)：与皮肤损伤修复过程和修复质量紧密相关。促使真皮层成纤维母细胞增生，主要存在皮肤、肌腱、韧带、血管等结缔组织，构成细胞外基质网状结构，起到支撑器官、保护机体的作用，还与细胞附着、细胞迁移有关。
Fibronectin纤维粘连素：促进细胞的黏连生长，影响细胞的黏附、迁移或肿瘤转移、胚胎发育、生长和分化等。
实验结果显示(图18～19)，与空白对照组(Control)相比，periostin处理组、periostin+IgG处理组、periostin+Postn nAb处理组蛋白表达差异均有统计学意义，(P＜0.001)，与空白对照组(Control)相比，periostin处理组蛋白表达量均显著增高(P＜0.001)，而periostin+Postn nAb处理组的VEGFA、α-SMA、Col I、Col III、Fibronectin蛋白表达量均显著降低(P＜0.001)，由此可说明periostin单抗可抑制VEGFA、α-SMA、Col I、Col III、Fibronectin蛋白的表达。
6 HUVEC细胞体外荧光定量PCR、WB、IF检测
periostin可通过整合素(Integrin)-局部黏着斑激酶(FAK)-磷酸肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT/PKB)信号通路促进视网膜血管的形成和纤维化，通过荧光定量PCR技术，免疫荧光和蛋白质印记法测定人血管内皮细胞膜上的整合素(αvβ3、αvβ5)，内皮生长因子受体-2(VEGFR-2，vascular endothelial growth factor receptor-2)、FAK、PI3K、AKT的mRNA表达量及蛋白表达水平的差异变化，从而证实periostin人源化单抗对玻璃体视网膜纤维化性病变具有治疗作用。
体外培养人HUVEC细胞并分组：
a空白对照组(Control)：不含重组periostin蛋白或抗体
b periostin组：只含periostin
c对照IgG组：含periostin+对照IgG
d periostin抗体组：含periostin+Postn nAb
Postn nAb：本发明制备的periostin人源化抗体
人periostin蛋白以及抗体先孵育1h后，再加入到细胞里再次处理24h后进行下述检测，对照IgG的工作浓度同抗periostin人源化单抗的浓度。
6.1荧光定量PCR测定
检测血管内皮细胞膜上的αvβ3、αvβ5整合素，VEGFR-2、FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的mRNA表达量
由图20可知，与空白对照组相比，periostin处理组αvβ3、αvβ5、VEGFR-2、FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT基因表达增多，periostin+Postn nAb处理组的基因表达量均降低，尤其VEGFR-2的mRNA表达量显著低于空白对照组(P＜0.001)，由此可说明periostin人源化单抗可抑制VEGFR-2、FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的mRNA基因的表达。
6.2 Western blot检测HUVEC细胞中αvβ3、αvβ5、VEGFR-2、FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表达
取正常培养的HUVEC细胞，以10 6个/皿(6cm皿)进行铺板，5％CO 2，37℃过夜培养。细胞过夜贴壁后，按照分组进行处理；BCA试剂盒检测总蛋白含量，SDS-PAGE电泳后转膜，封闭液封闭，洗涤后一抗4℃冰箱过夜，洗膜，二抗室温摇床孵育1h，显色。计算各组灰度值与同条件下内参灰度值之比作为各种蛋白的相对表达量。
不同组别HUVEC细胞中各个蛋白的表达及灰度分析见图21～22，实验结果显示，与空白对照组相比，periostin处理组αvβ3、αvβ5、VEGFR-2、FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表达增多，而periostin+Postn nAb处理组的蛋白表达量降低，且均低于periostin处理组，由此可说明periostin人源化单抗可抑制periostin的作用。
6.3 IF检测HUVEC细胞中αvβ3、αvβ5、VEGFR-2、FAK蛋白的表达
在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗，4％的多聚甲醛固定爬片，0.5％TritonX-100室温通透20min，加一抗放入湿盒4℃孵育过夜，加荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，滴加DAPI核复染，封片并置于荧光显微镜下观察(图23～26)。
荧光显微镜下可见，periostin蛋白在HUVEC细胞胞浆表达，αvβ3、αvβ5、VEGFR-2、FAK蛋白的空白对照组细胞胞浆呈现弱荧光；periostin处理组细胞胞浆显示强荧光；periostin+Postn nAb处理组细胞荧光信号较periostin处理组明显减弱，且与空白对照组相比无明显差异，由此可以说明periostin人源化单抗可通过阻断Integrin-FAK-PI3K-AKT/PKB信号通路进而阻断periostin的作用，从而抑制视网膜纤维化。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (14)

  1. 抗periostin人源化单克隆抗体，其特征在于，
    其重链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
    其轻链可变区具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，
    其重链的恒定区为人IgG1；
    其轻链的恒定区为人κ型。
  3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
  4. 编码权利要求1～3任一项所述的单克隆抗体的核酸。
  5. 根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，
    编码其重链的核酸具有如SEQ ID NO：5所示的核酸序列；
    编码其轻链的核酸具有如SEQ ID NO：6所示的核酸序列。
  6. 根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，
    编码其重链的核酸具有如SEQ ID NO：7所示的核酸序列；
    编码其轻链的核酸具有如SEQ ID NO：8所示的核酸序列。
  7. 包括权利要求4～6任一项所述的核酸的表达载体。
  8. 根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，其骨架载体为PATX-GS2。
  9. 转化或转染权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。
  10. 权利要求1～3任一项所述的抗periostin人源化单克隆抗体的制备方法，包括：培养权利要求9所述的宿主细胞、诱导抗periostin人源化单克隆抗体的表达。
  11. 权利要求1～3任一项所述抗periostin人源化单克隆抗体在制备药物或检测试剂中的应用，所述药物为治疗组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的药物，所述试剂为诊断组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的试剂。
  12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述组织纤维化病变为视网膜纤维化。
  13. 一种治疗组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述抗periostin人源化单克隆抗体。
  14. 一种诊断组织纤维纤维化病变和/或恶性肿瘤的试剂盒，其特征在于，
    包括：权利要求1～3任一项所述的抗periostin人源化单克隆抗体，
    或包括将权利要求1～3任一项所述的抗periostin人源化单克隆抗体与化学标记或生物标记形成的结合物；
    或包括权利要求1～3任一项所述的抗periostin人源化单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。
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