CN117904251A - 一种实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，涉及脉冲电场杀菌技术领域。可快速测定目标细菌的电穿孔阈值，为脉冲电场杀菌技术应用提供参考标准。该方法包括：S1、将目标细菌配置为标准细菌悬液；S2、将标准细菌悬液通入脉冲电场静态杀菌处理器中；S3、调节外施脉冲电压值，得到不同外施脉冲电压下的细菌存活菌落数；S4、将外施脉冲电压值、细菌存活菌落数、电场静态杀菌处理器电极间距输入分析软件中，生成杀菌动力学曲线；S5、将目标细菌的电学参数和几何结构输入分析软件中，建立目标细菌的仿真模型，得到此时的电场强度值；S6、将电场强度值输入目标细菌的仿真模型中，提取细胞电势分布曲线，得到跨膜电压。
Description
技术领域
本申请涉及脉冲电场杀菌技术领域，尤其涉及一种实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法。
背景技术
高压脉冲电场(Pulsed Electric Field，PEF)杀菌技术是一种新型非热杀菌技术，通过施加几十千伏高电压脉冲实现杀菌。高压脉冲电场杀菌技术应用于液体杀菌时，具有速度快、效率高、能耗低的优点，且营养成分保留程度高，表现出一定钝酶能力，能够有效延长产品货架期，具有良好的市场应用前景。
目前普遍认为其杀菌机理为电穿孔效应，即当高压脉冲电场作用于液体物料时，液体中细菌细胞膜上的跨膜电压会随之发生改变，促使细胞膜蛋白质通道和孔洞打开，磷脂双分子层由疏水性膜孔转化为亲水性膜孔，小分子物质涌入细胞中，使细胞膨胀，产生可逆穿孔。若跨膜电压超过穿孔阈值，可逆穿孔转化为不可逆穿孔，微生物细胞的细胞膜结构被破坏，基本功能丧失，裂解死亡，实现杀菌需要。
快速测定细胞的电穿孔阈值，对脉冲电场杀菌技术的推广应用具有重要意义。在实际生产中，若知悉目标产品中主要的待杀灭细菌的电穿孔阈值，求得跨膜电压的最大公约数，便可合理安排脉冲电源的输出参数，降低研究成本、能源消耗，实现科学化、精准化生产。
在对电穿孔阈值的探究中，由于细胞膜形成的微孔尺寸极小，普通的光学显微镜根本无法观测到，而电子显微镜所需配备的金属物质会对细胞膜结构造成破坏，同样无法观察微孔的形成过程。研究者们试图采用分子动力学仿真对电穿孔过程进行研究，但该研究未有效结合实验数据，无法给出明确阈值。其他如膜穿孔标记法，通过荧光物质标记观察细胞膜的穿孔变化，以碘化丙啶和荧光黄为例，前者在膜穿后进入胞内结合核酸并发出可被流式细胞仪检测到的荧光，可证明穿孔现象，但该法不能区分不可逆性电击穿后的解体细胞；后者细胞悬液必须反复离心，损坏部分可逆穿孔细胞，影响实验结果。
综上，当前细胞电穿孔阈值研究局限于实验室中细胞膜穿孔的观察上，不适合于脉冲电场杀菌技术的大规模杀菌应用，需要开发一种节能、快速、高效的细胞电穿孔阈值测定方法。
发明内容
本申请的实施例提供一种实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，可快速测定目标细菌的电穿孔阈值，为脉冲电场杀菌技术应用提供参考标准，实现精准、快速的杀菌参数设定。
为达到上述目的，本申请的实施例提供了一种实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，包括以下步骤：S1、将目标细菌配置为标准细菌悬液；S2、将标准细菌悬液通入脉冲电场静态杀菌处理器中；S3、调节外施脉冲电压值，得到不同外施脉冲电压下的细菌存活菌落数；S4、将外施脉冲电压值、细菌存活菌落数、电场静态杀菌处理器电极间距输入电穿孔阈值分析软件中，生成不同脉冲电场强度的杀菌动力学曲线；S5、将目标细菌的电学参数和几何结构输入电穿孔阈值分析软件中，建立目标细菌的仿真模型，并确定杀菌动力学曲线杀菌效果从无到有的质变点，得到此时的电场强度值；S6、将所述电场强度值输入目标细菌的仿真模型中，提取细胞电势分布曲线，得到跨膜电压；所述跨膜电压即为目标细菌的电穿孔阈值。
进一步地，所述标准细菌悬液的浓度为105～108CFU/mL；配置溶液为去离子水；溶液的电导率低于100μS/cm。
进一步地，所述电学参数包括细胞外液、细胞膜、细胞质的电导率和相对介电常数；所述几何结构包括形状、长径、短径和细胞膜厚度。
进一步地，所述脉冲电场静态杀菌处理器为平板型电极结构；所述脉冲电场静态杀菌处理器的电极间距设置为3～10mm。
进一步地，所述脉冲电场静态杀菌处理器包括绝缘壳体和设置在所述绝缘壳体内的高压电极和地电极；所述高压电极和地电极平行设置，且两者之间形成处理腔；所述处理腔的侧壁上设有进液口；所述进液口处设有密封装置；所述高压电极和地电极的中部均设有接线棒；所述绝缘壳体上设有通孔；所述接线棒穿过所述通孔后伸出所述绝缘壳体外。
进一步地，所述绝缘壳体采用聚四氟乙烯、有机玻璃或绝缘陶瓷制成；所述高压电极和接地电极均采用食品级金属材料制成。
进一步地，所述高压电极的接线棒和地电极的接线棒上均设有螺纹孔；所述螺纹孔用于连接脉冲电源的高压输出线和接地线。
进一步地，所述处理腔的左右边界均为外凹的椭球形结构。
进一步地，所述脉冲电源的电压、频率和脉冲宽度可调；所述脉冲电源的电压为0～40kV；所述脉冲电源的频率为0～600Hz；所述脉冲电源的脉宽为0～10μs；所述脉冲电源的脉冲波形为矩形脉冲波。
本申请相比现有技术具有以下有益效果：
1、本申请实施例只需要得到目标细菌的杀菌动力学曲线，便可通过细胞的有限元仿真分析得到细胞的穿孔阈值，效果可追踪，相比单纯分子动力学仿真分析或荧光标记等方法，本申请实施例能够快速测定目标细菌的电穿孔阈值，具有成本低廉，操作简单的优点。
2、本申请实施例将宏观的杀菌效果和微观的细胞电穿孔结合起来，把微观问题转化为宏观问题，解决了穿孔阈值微观研究难度过大的问题，为电穿孔机制研究提供了新方法。
3、本申请实施例可以迅速建立起不同细胞的穿孔阈值数据库，生产中只要选取目标产品中典型细菌穿孔阈值的最大公约数，便可实现杀菌目标，节省了试验成本，建立了生产的参考标准，相较于现有技术需要大量的试验才能确定对某一产品中多种细菌的最佳杀灭参数，耗时耗力，研究成本高的特点，本申请实施例有利于脉冲电场杀菌技术的市场推广与应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法的流程图；
图2为本申请实施例实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法中脉冲电场静态杀菌处理器的结构示意图；
图3为本申请实施例实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法建立的球形细胞的模型示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
参照图1至图3，本申请的实施例提供了一种实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，该方法以宏观实验结果为基础，结合耦合有细胞跨膜电压仿真模型的电穿孔阈值分析软件，提供了用于电穿孔阈值测定的脉冲电场静态杀菌处理器，可快速测定目标细菌的电穿孔阈值，为脉冲电场杀菌应用提供参考标准。该方法包括试验测定和软件分析两部分。
具体的，试验测定包括以下步骤：
S1、将目标细菌配置为标准细菌悬液。
目标细菌为任意需要探究电穿孔阈值的细菌，包括杆形、球形、螺旋形等形状细菌。标准细菌悬液的浓度为105～108CFU/mL。配置溶液为去离子水，溶液的电导率低于100μS/cm。由此，可以避免电流热效应导致的液体温升对实验结果的影响。需要说明的是，该方法并不局限于细菌细胞，也可应用于对真菌细胞、动植物细胞的电穿孔阈值分析。
S2、将标准细菌悬液通入脉冲电场静态杀菌处理器中。
参照图2，脉冲电场静态杀菌处理器为平板型电极结构，具体包括绝缘壳体1、高压电极2和地电极3。高压电极2和地电极3均设置在绝缘壳体1内，且两者均沿水平方向平行设置，高压电极2位于地电极3的上方。两者之间形成处理腔4。处理腔4的侧壁上设有进液口5，标准细菌悬液通过进液口5进入处理腔4内。进液口5处设有密封装置(图中未示)，保证标准细菌悬液倒入后处理腔的良好密封性。高压电极2和地电极3的中部均设有接线棒6，绝缘壳体1的顶壁面和底壁面上均设有通孔，接线棒6穿过通孔后伸出绝缘壳体1外。由此，可以实现对标准细菌悬液的脉冲电场处理，得到杀菌动力学曲线。
绝缘壳体1的俯视结构为圆形、方形等任意形状，只要保证高压电极2和接地电极3平行放置即可，保证了装置的多样化应用。为了保证脉冲电场静态杀菌处理器的稳定性，绝缘壳体1采用聚四氟乙烯、有机玻璃或绝缘陶瓷等绝缘性能良好的绝缘介质制成。
为了保证脉冲电场静态杀菌处理器的供电稳定性，高压电极2和接地电极3均采用304不锈钢和316不锈钢等食品级金属材料制成。高压电极2和接地电极3之间的间距为3～10mm，电极的长度可自由设置。需要说明的是，较小的处理间隙可保证杀菌效果，更快地定位出细菌致死的临界电压值。
接线棒6的长度均为1～5cm，其上设有螺纹孔(图中未示)，螺纹孔的孔径为M3～M10，螺纹孔用于稳固连接脉冲电源的高压输出线和接地线。
处理腔4的左右边界均为外凹的椭球形结构7。该结构可以避免传统矩形尖角处电场强度的激增，规避了该处产生火花放电的可能，保障了电场分布的均匀性。
S3、调节外施脉冲电压值，得到不同外施脉冲电压下的细菌存活菌落数。
外施脉冲电压由脉冲电源驱动。脉冲电源的电压、频率和脉冲宽度可调；脉冲电源的电压为0～40kV；脉冲电源的频率为0～600Hz；脉冲电源的脉宽为0～10μs；脉冲电源的脉冲波形为杀菌效果最优的矩形脉冲波。
本申请实施例中，只改变脉冲电源的外施电压参数，其余如脉冲频率、脉冲宽度、处理时间等参数保持不变，控制单一变量，保证检测结果的准确性，以及细胞电穿孔阈值的一般性。
完成上述工作后，即可实现对标准细菌悬液的脉冲电场处理，得到不同外施脉冲电压下的细菌的菌落数。
软件分析包括以下步骤：
S4、将外施脉冲电压值、细菌存活菌落数、电场静态杀菌处理器电极间距输入电穿孔阈值分析软件中，生成不同脉冲电场强度的杀菌动力学曲线。
电穿孔阈值分析软件自动将外施脉冲电压值换算为电场强度值。进而得到杀菌动力学曲线。具体如下，横坐标轴为设置的外施脉冲电场强度梯度，纵坐标轴为细菌致死率，致死率对数值越高，则高压脉冲电场杀菌效果越显著。
另外，由于本申请采用的是平板电极结构，因此，可通过电压值换算得此时处理腔4内的电场强度。换算公式如公式1所示：
其中：E为电场强度(kV/cm)；U为外施电压值(kV)；d为电极间距(mm)。
最后，电穿孔阈值分析软件得到的不同电场强度下细菌的杀菌动力学曲线的方法如下：
横坐标轴为设置的电场强度梯度，纵坐标轴为细菌致死率，可由公式2求得，致死率对数值越高，则高压脉冲电场杀菌效果越显著。
其中：η为细菌致死率；N1为脉冲电场处理前菌落数(CFU/mL)；N2为脉冲电场处理后菌落数(CFU/mL)。
S5、将目标细菌的电学参数和几何结构输入电穿孔阈值分析软件中，建立目标细菌的仿真模型，并确定杀菌动力学曲线杀菌效果从无到有的质变点，得到此时的电场强度值。也就是说，本申请实施例只需找到细菌致死率从0到有所突破的中间值，便找到了细胞发生不可逆电穿孔的临界电压值。
具体的，电学参数主要是细胞膜、细胞质、细胞外液的电导率和相对介电常数。几何结构主要包括形状、半径和细胞膜厚度。这样既可以忽略其他参数，保证计算的简洁性，又可以在具体细胞参数的设定上根据目标细菌确定，保证了方法的通用性。
参照图3，以下以球形细胞为例进行说明。球形细胞中的细胞膜8由两个圆环组成，内部包围的部分为细胞质9，外部为细胞液10。因为细胞膜8的厚度较小，无法清晰在图中显示，故作夸张处理，便于理解。具体的，图中的X、Y为方向坐标轴；E为脉冲电场作用强度，黑色箭头为场强方向；细胞外液、细胞膜、细胞质的电导率分别为σl、σm、σc，相对介电常数分别为εl、εm、εc。
S6、将电场强度值输入目标细菌的仿真模型中，提取细胞电势分布曲线，得到跨膜电压；跨膜电压即为目标细菌的电穿孔阈值。
具体的，电穿孔阈值分析软件能够沿电场强度作用方向提取细胞电势分布曲线，从而计算出细胞的跨膜电压。再将之对比到杀菌动力学曲线中的质变点，相应跨膜电压即为该种细菌的电穿孔阈值。
以上，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将目标细菌配置为标准细菌悬液；
S2、将标准细菌悬液通入脉冲电场静态杀菌处理器中；
S3、调节外施脉冲电压值，得到不同外施脉冲电压下的细菌存活菌落数；
S4、将外施脉冲电压值、细菌存活菌落数、电场静态杀菌处理器电极间距输入电穿孔阈值分析软件中，生成不同脉冲电场强度的杀菌动力学曲线；
S5、将目标细菌的电学参数和几何结构输入电穿孔阈值分析软件中，建立目标细菌的仿真模型，并确定杀菌动力学曲线杀菌效果从无到有的质变点，得到此时的电场强度值；
S6、将所述电场强度值输入目标细菌的仿真模型中，提取细胞电势分布曲线，得到跨膜电压；所述跨膜电压即为目标细菌的电穿孔阈值。
2.根据权利要求1所述的实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，所述标准细菌悬液的浓度为105～108CFU/mL；配置溶液为去离子水；溶液的电导率低于100μS/cm。
3.根据权利要求2所述的实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，所述电学参数包括细胞外液、细胞膜、细胞质的电导率和相对介电常数；所述几何结构包括形状、长径、短径和细胞膜厚度。
4.根据权利要求3所述的实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，所述脉冲电场静态杀菌处理器为平板型电极结构；所述脉冲电场静态杀菌处理器的电极间距设置为3～10mm。
5.根据权利要求4所述的实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，所述脉冲电场静态杀菌处理器包括绝缘壳体和设置在所述绝缘壳体内的高压电极和地电极；所述高压电极和地电极平行设置，且两者之间形成处理腔；所述处理腔的侧壁上设有进液口；所述进液口处设有密封装置；所述高压电极和地电极的中部均设有接线棒；所述绝缘壳体上设有通孔；所述接线棒穿过所述通孔后伸出所述绝缘壳体外。
6.根据权利要求5所述的实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，所述绝缘壳体采用聚四氟乙烯、有机玻璃或绝缘陶瓷制成；所述高压电极和接地电极均采用食品级金属材料制成。
7.根据权利要求6所述的实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，所述高压电极的接线棒和地电极的接线棒上均设有螺纹孔；所述螺纹孔用于连接脉冲电源的高压输出线和接地线。
8.根据权利要求7所述的实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，所述处理腔的左右边界均为外凹的椭球形结构。
9.根据权利要求8所述的实验快速测定细菌电穿孔阈值的方法，其特征在于，所述脉冲电源的电压、频率和脉冲宽度可调；所述脉冲电源的电压为0～40kV；所述脉冲电源的频率为0～600Hz；所述脉冲电源的脉宽为0～10μs；所述脉冲电源的脉冲波形为矩形脉冲波。
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