CN117903321A - 一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117903321A
CN117903321A CN202410072805.0A CN202410072805A CN117903321A CN 117903321 A CN117903321 A CN 117903321A CN 202410072805 A CN202410072805 A CN 202410072805A CN 117903321 A CN117903321 A CN 117903321A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tuberculosis
virus
particle
yidc
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410072805.0A
Other languages
English (en)
Inventor
周方斌
张冬梅
张逸龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Military Medical University SMMU
Original Assignee
Second Military Medical University SMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Military Medical University SMMU filed Critical Second Military Medical University SMMU
Priority to CN202410072805.0A priority Critical patent/CN117903321A/zh
Publication of CN117903321A publication Critical patent/CN117903321A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用。本发明提供了一种结核病毒样颗粒，所述结核病毒样颗粒的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；本发明还提供了所述的结核病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：将结核分枝杆菌的膜外片段与人乳头瘤病毒衣壳蛋白融合；本发明的结核HPV‑16L1/YidC病毒样颗粒由结核分枝杆菌蛋白YidC嵌合在改造的人乳头瘤病毒蛋白HPV16L1上组装而成，与单分子相比，具有较强的免疫原性。

Description

一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,MTB)感染引起的、以呼吸系统感染为主的传染性疾病。接种疫苗是预防结核病最经济有效的手段，卡介苗(BCG)是目前唯一批准上市的结核疫苗，但其保护效果存在局限性。全球有17种结核候选疫苗进入临床研究阶段，根据其设计策略可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗以及mRNA疫苗。以上几种疫苗各有优缺点。减毒活疫苗通常产生持久免疫力，不需要佐剂。但其生产成本高、制造困难、且具有在感染HIV或其他免疫缺陷的个体中引起自身免疫反应、过敏反应或疾病的风险；灭活疫苗的生产工艺成熟、简单，但其存在潜在的安全问题；重组亚单位疫苗可能面临免疫原性方面的限制，因为它们通常由几种结核分枝杆菌免疫原组成；病毒载体疫苗具有以下优点：可以携带编码大抗原片段的基因，可以诱导高水平的体液和细胞免疫反应，不需要佐剂来增强免疫应答，但其缺点也显而易见；预先存在的针对病毒载体的中和抗体可能限制加强疫苗接种策略，某些病毒载体可能不适合用于免疫功能低下的个体；mRNA的优点在于它可以被广泛地改造以增强体内稳定性和抗原的产生，没有宿主基因组整合的风险，并且与活病毒和DNA疫苗相比，它可以刺激更好的免疫反应。然而，目前mRNA疫苗需要冷链运送，而且生产成本昂贵，尽管生产成本肯定会随着需求而下降。
病毒样颗粒(Virus like particle，VLP)不含有病毒核酸，安全性好，其构象表位与天然病毒相似，可以显著地提高免疫应答水平，是理想的候选疫苗。自上世纪80年代发现在多瘤病毒的荚膜蛋白能够自行组装成VLP后，VLP类疫苗的研究得到迅速发展。人用VLP疫苗如乙肝疫苗(HBV)、戊肝疫苗(HEV)和人乳头瘤病毒(HPV)疫苗目前已批准上市，包括最新的RTS，S/AS01疟疾疫苗，在研的人用VLP疫苗包括流感病毒疫苗、艾滋病病毒疫苗和埃博拉病毒疫苗等。
因此，倘若能够提供一种结核VLP，具有良好的免疫原性和免疫保护作用，则具有重要的理论意义和社会意义。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较强的免疫原性的结核病毒样颗粒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种结核病毒样颗粒，所述结核病毒样颗粒的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；
编码氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了所述的结核病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：将结核分枝杆菌的膜外片段与人乳头瘤病毒衣壳蛋白融合；
所述结核分枝杆菌的膜外片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
作为优选，所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白为去除铰链区的人乳头瘤病毒衣壳蛋白。
本发明还提供了所述的结核病毒样颗粒在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
本发明还提供了所述的结核病毒样颗粒在制备结核疫苗中的应用。
本发明还提供了一种重组质粒，包括结核病毒样颗粒和空载载体；
所述结核病毒样颗粒为所述的结核病毒样颗粒；
所述空载载体为pPIC3.5K。
本发明还提供了所述的重组质粒在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
本发明还提供了一种重组菌株，包括质粒和宿主菌；
所述质粒为所述的重组质粒；
所述宿主菌为GS115酵母菌。
本发明还提供了所述的重组菌株在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
本发明还提供了一种结核疫苗，包括结核病毒样颗粒、重组质粒或重组菌株；
所述结核病毒样颗粒为所述的结核病毒样颗粒；
所述重组质粒为所述的重组质粒。
所述重组菌株为所述的重组菌株。
本发明的有益效果：
1、本发明的结核病毒样颗粒由结核结核分枝杆菌的膜外片段YidC与人乳头瘤病毒衣壳蛋白HPV-16L1连接得到的，与单分子YidC相比，具有较强的免疫原性；
本发明将结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒皮下注射免疫小鼠可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答，与单分子YidC相比，结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒的免疫原性得到显著提高。
2、目前国内外利用酵母表达系统制备结核病毒样颗粒鲜有报道，本发明建立了酵母细胞制备病毒样颗粒方法，对分离表达条件进行探索和优化，确定最佳实验条件，获得结核病毒样颗粒。具体的，本发明通过蜗牛酶消化结合超声破碎酵母细胞，并采用密度梯度离心法纯化得到大量的结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒分子。
附图说明
图1为人乳头瘤病毒衣壳蛋白的制备过程；
图2为重组质粒的构建流程；
图3为PCR扩增优化后的YidC基因；
图4为重组质粒pBlu-HPV-16L1/YidC双酶切验证结果；
图5为阳性克隆酵母菌基因组PCR鉴定结果；
图6为实施例5中SDS-PAGE检测结果；
图7为实施例6中SDS-PAGE和Western Blot检测结果，其中左图为SDS-PAGE检测结果，右图为WesternBlot检测结果；
图8为结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒的TEM分析结果，其中上图为HPV-16L1/YidC病毒样颗粒，下图为HPV-16L1病毒样颗粒；
图9为结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒疫苗的免疫过程；
图10为结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒免疫小鼠血清特异性抗体亚型水平，其中上图从左至右依次为结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒免疫小鼠血清特异性抗体亚型YidC-IgG水平、结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒免疫小鼠血清特异性抗体亚型YidC-IgG1水平，下图是结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒免疫小鼠血清特异性抗体亚型YidC-IgG2a水平；
图11为免疫小鼠脾细胞经结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒刺激分泌的IFN-γ、IL-4、IL-10和TNF-α水平，其中上图从左至右依次为小鼠脾细胞经结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒刺激分泌的IFN-γ水平、小鼠脾细胞经结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒刺激分泌的IL-4水平，下图从左至右依次为小鼠脾细胞经结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒刺激分泌的IL-10水平、小鼠脾细胞经结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒刺激分泌的TNF-α水平。
具体实施方式
本发明提供了一种结核病毒样颗粒，所述结核病毒样颗粒的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；
编码氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了所述的结核病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：将结核分枝杆菌的膜外片段与人乳头瘤病毒衣壳蛋白融合；
所述结核分枝杆菌的膜外片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
在本发明中，所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白为去除铰链区的人乳头瘤病毒衣壳蛋白。
在本发明中，所述膜外片段是结核分枝杆菌蛋白YidC的膜外片段，所述YidC是一种定位于细胞膜的转座酶，在结核分杆菌中，YidC可调节关键呼吸蛋白在结核分枝杆菌中向细胞膜的转运，它的缺失对缺氧基因、ATP合成酶和许多中心代谢和呼吸通路蛋白表达造成剧烈影响。对于分枝杆菌在体外以及巨噬细胞中的增殖都是必不可少的。过表达YidC将导致结核菌的体外生长改变及细菌细胞包膜的完整性受损，提示其可作为潜在的结核疫苗和抗结核药物靶标。
在本发明中，所述去除的铰链区为FG铰链区；
所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白为16型人乳头瘤病毒L1蛋白，16型人乳头瘤病毒L1蛋白能够自我组装成病毒样颗粒，其主要特征是在β折叠之间有三个背向病毒的铰链区：DE、FG和HI，在不破坏16型人乳头瘤病毒L1蛋白自我组装能力的前提下，去除其FG铰链区，可将其改造为病毒样颗粒疫苗的载体。
在本发明中，所述的结核病毒样颗粒在表达时结构稳定，制备效率高，制备的病毒样颗粒具有较高的免疫原性。
在本发明中，人乳头瘤病毒衣壳蛋白去除铰链区的方法包括如下步骤：
(1)按毕赤酵母密码子偏好性优化16型人乳头瘤病毒L1蛋白基因，合成16型人乳头瘤病毒L1蛋白基因后连接至质粒pUC57上，得到重组质粒pUC57-HPV16L1；
(2)以重组质粒pUC57-HPV16L1为模板，在16型人乳头瘤病毒L1蛋白基因的N端和FG序列的左侧设计引物，所述N端的引物序列如SEQ ID NO：5所示：GGGGATCCAAAAAAATGTCCTTGTGGTTGCCATC，FG序列的左侧的引物序列如SEQ ID NO：6所示：CCCCATGGAGATGCATTCTCTGTTATCAACACC，分别带有BamHI和NcoI酶切位点，扩增FG左侧序列；
(3)在16型人乳头瘤病毒L1蛋白基因的C端和FG序列的右侧设计引物，所述C端的引物序列如SEQ ID NO：7所示：GGGAATTC TTACAACTTTCTCTTCTTCCTCTTAGC，FG序列的右侧的引物序列如SEQ ID NO：8所示：CCCCATGGACTACAAGCAGACCCAGTTGTGT，分别带有EcoRI和NcoI酶切位点，扩增FG右侧序列；
(4)先将(2)中的左侧序列通过BamHI和NcoI克隆到pBluescript II SK+(pBlu)载体上，得到重组pBlu载体，得到再将(3)中的右侧序列通过NcoI和EcoRI克隆到携带了左侧序列的重组pBlu载体上，从而获得了不含有FG铰链区的、引入了NcoI酶切位点的16型人乳头瘤病毒L1蛋白基因。
本发明还提供了所述的结核病毒样颗粒在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
本发明还提供了所述的结核病毒样颗粒在制备结核疫苗中的应用。
本发明还提供了一种重组质粒，包括结核病毒样颗粒和空载载体；
所述结核病毒样颗粒为所述的结核病毒样颗粒；
所述空载载体为pPIC3.5K。
本发明还提供了所述的重组质粒在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
本发明还提供了一种重组菌株，包括质粒和宿主菌；
所述质粒为所述的重组质粒；
所述宿主菌为GS115酵母菌。
本发明还提供了所述的重组菌株在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
本发明还提供了一种结核疫苗，包括结核病毒样颗粒、重组质粒或重组菌株；
所述结核病毒样颗粒为所述的结核病毒样颗粒；
所述重组质粒为所述的重组质粒；
所述重组菌株为所述的重组菌株。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人乳头瘤病毒衣壳蛋白的制备，制备过程如图1所示，具体步骤如下：
(1)按毕赤酵母密码子偏好性优化16型人乳头瘤病毒L1蛋白基因，合成HPV16L1基因后连接至质粒pUC57上，得到重组质粒pUC57-HPV16L1；
(2)以重组质粒pUC57-HPV16L1为模板，在HPV16L1基因的N端和FG序列的左侧设计引物，所述N端的引物序列如SEQ ID NO：5所示：GGGGATCCAAAAAAATGTCCTTGTGGTTGCCATC，FG序列的左侧的引物序列如SEQ ID NO：6所示：CCCCATGG AGATGCATTCTCTGTTATCAACACC，分别带有BamHI和NcoI酶切位点，扩增FG左侧序列；
(3)在HPV16L1基因的C端和FG序列的右侧设计引物，所述C端的引物序列如SEQ IDNO：7所示：GGGAATTC TTACAACTTTCTCTTCTTCCTCTTAGC，FG序列的右侧的引物序列如SEQ IDNO：8所示：CCCCATGGACTACAAGCAGACCCAGTTGTGT，分别带有EcoRI和NcoI酶切位点，扩增FG右侧序列；
(4)先将(2)中的左侧序列通过BamHI和NcoI克隆到pBluescript II SK+(pBlu)载体上，得到重组pBlu载体，再将(3)中的右侧序列通过NcoI和EcoRI克隆到携带了左侧序列的重组pBlu载体上，从而获得了不含有FG铰链区的、引入了NcoI酶切位点的人乳头瘤病毒衣壳蛋白HPV16L1基因，即改造后的HPV-16L1 pBlu质粒。
实施例2重组质粒的构建
重组质粒的构建流程如图2所示，具体步骤如下：
(1)按毕赤酵母密码子偏好性优化结核分枝杆菌YidC基因序列，合成YidC基因后连接至pUC57，得到重组质粒pUC57-YidC；
(2)以重组质粒pUC57-YidC为模板，PCR扩增YidC基因序列(如图3所示)，扩增的引物如SEQ ID NO：9～10所示：CCCCATGGTACTGGTTTTCTAACAACATTTGGAC；CCCCATGGTCTCTTTCTCTTCTTTGGTCTAACAC。得到PCR产物，在PCR产物两端引入NcoI酶切位点。
其中PCR反应体系如表1所示，反应程序如下：
混匀，置于PCR仪上按照以下程序进行扩增：预变性94℃、5min，在经94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min。
表1PCR反应体系
(3)用NcoI酶切实施例1所述的改造后的HPV-16L1 pBlu质粒和PCR产物，分别得到载体以及酶切后的PCR产物，为了防止载体自连，需将载体进行去磷酸化酶处理，得到处理后的载体；
(4)将酶切后的PCR产物连接到处理后的载体上，得到pBlu-HPV-16L1/YidC载体；由于单酶切具有不能定向克隆的缺点，因此在用PCR筛选阳性克隆时，采用的引物是HPV-16L1 N端引物(SEQ ID NO：5)和YidC基因的C端引物(SEQ ID NO：10)；
(5)阳性克隆结果测序，进一步证明其序列正确：构建好的pBlu-HPV-16L1/YidC载体抽提质粒后用BamHI和EcoRI内切酶将HPV-16L1/YidC序列片段酶切下来，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切下来的HPV-16L1/YidC序列片段，检测结果如图4所示。结果表明重组质粒pBlu-HPV-16L1/YidC经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后分为2个片段，分别为载体片段(大小8000bp)和HPV-16L1/YidC片段(大小2000bp)；
将酶切下来的HPV-16L1/YidC序列片段再克隆到毕氏酵母表达载体pPIC3.5K，从而得到重组质粒pPIC3.5K-HPV-16L1/YidC。
实施例3重组菌株的制备
(1)使用Sal I内切酶线性化实施例2所述的重组质粒pPIC3.5K-HPV16L1/YidC；使用酚氯仿抽提质粒：步骤(1)中酶切后的体系为100μl，补至400μl；加入等体积的酚氯仿(酚氯仿取下层)，混匀，4℃静置10min；取上层水样，加入500μl预冷无水乙醇，置于-20℃，1h，4℃离心12000rpm，20min，弃上清；加入250μl 70％乙醇，4℃，离心12000rpm，20min，弃上清；吹干，加入20μl ddH2O溶解，得到线性化重组质粒；
(3)酵母感受态细胞的制备：将GS115毕赤酵母细胞划线于YPD平板上，于30℃培养48h；挑取酵母单菌落并接种于YPD液体培养基中，30℃，220rpm摇床震荡过夜培养；接种100μl的过夜培养物于100μlYPD培养基中，30℃振荡培养10h至OD600＝1.4；于4500rpm，25℃离心5min，无菌条件下收集细胞，用25mL预冷的灭菌水洗涤菌体沉淀，于4500rpm，25℃离心5min，无菌条件下收集细胞，加入10mL预冷的1mol/l无菌山梨醇，打散菌体使之重悬于溶液中；7000rpm离心5min，无菌条件下弃上清，加入0.5mL预冷的1mol/l无菌山梨醇，打散菌体，得到酵母感受态细胞；
(4)电击转化：调整好BIO-RADE电打孔仪参数(电压：1500V，电阻：200Ω，电容：25μF，脉冲时间：10mS，一次电击)，将步骤(2)中的线性化重组质粒加入100μl步骤(3)所述的酵母感受态细胞中，混匀，冰上预冷5min，转入0.2cm电打孔杯(预先放冰上预冷)中，置于冰上10min，放入电打孔仪，电击后取出，迅速放回冰上并加入1mL预冷1mol/l山梨醇中，混匀，置于30℃摇床震摇40min，吸取300μl涂布于MD平板上，30℃，3～7天后观察，得到重组菌株。
实施例4阳性克隆筛选
(1)将实施例3所述的MD平板上长出的重组菌株，用3mLYPD培养液冲洗后，用涂棒涂匀，得到菌苔液，吸取菌苔液于1.5mL EP管中，测定OD600值为3.7，1OD600的细胞浓度为5×107cells/mL，3.7OD600的细胞浓度为1.85×108cells/mL，涂布浓度为105cells/200μl，因此稀释100倍；取200μl涂布于不同浓度梯度的YPD-G418平板上(浓度依次为：0.25，0.5，2.0，4.0mg/mL)，30℃培养2d；
(2)mut+基因型的筛选：将在2.0，4.0mg/mL长出的高拷贝克隆，先点在MM平板上，再点在MD平板上培养，观察两个平板上的生长情况，挑选阳性克隆；
(3)抽取阳性克隆酵母基因组，采用YidC基因的引物进行PCR验证，结果如图5所示。
结果显示酵母基因组中含有目的基因，说明目标基因已经成功插入到GS115酵母的基因组中。
实施例5结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒的表达与发酵
(1)从实施例4所述的MD平板上挑取10个阳性克隆，接种到3mL MGY培养基中，30℃，250rpm摇床培养至OD600＝4，得到菌体；同时挑2个pPIC3.5k转化酵母作为空载体对照，分别取500μl菌体抽取基因组进行目的基因PCR，剩余菌体继续诱导表达；
(2)将剩余菌体在2000rpm，25℃，离心5min，弃上清；加入3mLBMMY(含5‰甲醇)重新悬浮酵母菌，30℃，250rmp培养，开始诱导表达；
(3)每隔24h补加甲醇(5‰)，并取样；96h后收集各个时间点的样品10000rpm离心10min去上清，-80℃冻融两次，用1mL蜗牛酶反应液重悬，然后加入20μl蜗牛酶溶液，30℃，2h。10000rmp离心，收集酵母的原生质体，然后用1mL的反应液(不含巯基乙醇)洗涤3次，然后超声破碎(超声条件为600W，10s间隔，超声10s，总超声时间为10min)，超声后12000rmp离心10min，收集上清液；将上清液和步骤(1)中诱导前的菌体、空载体对照进行SDS-PAGE和WesternBlot分析，观察在相应位置上有无蛋白条带，结果如图6所示。结果显示，在96h后HPV16L1/YidC大量表达。
(4)目的蛋白发酵：根据SDS-PAGE检测结果选取在试管中表达水平相对较高的菌株，划YPD平板，并冷冻保种(等量30％甘油与菌液混合后，投入液氮速冻，然后置于-80℃)；
从平板上接种，然后在5L摇瓶中培养1L菌液，进行诱导表达，分析表达菌体；在初步扩大培养后，如仍然表达目的蛋白，则将此菌株在15L发酵罐进行表达，30℃，96h后得到转化HPV-16L1/YidC的重组菌。
实施例6结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒的纯化与组装
(1)将实施例5所述的转化HPV-16L1/YidC的重组菌破碎，10000rmp离心10min，取上清液，-80℃保存，采用密度梯度离心法纯化，具体步骤如下：Optiprep Gradients的准备，事先配置好磷酸盐缓冲液0.8mol/l、27％Optiprep、33％Optiprep、39％Optiprep、46％Optiprep，准备超速离心管并编号，在每个超速离心管中自下而上依次加入27％Optiprep、33％Optiprep、39％Optiprep，和46％Optiprep各1mL，注意加入的速度缓慢，然后35℃下静置4h；将蛋白混合样品从-80℃冰箱取出后放冰上融化，12000rmp离心，取上清，缓慢加入1.5mL至对应梯度离心柱液面上；238000rpm，16℃，4h，对应转子为335650SW 60TiSwinging Bucket RotorPackage水平转头；离心后使用移液器自上而下吸取400μl/tube，-80℃保存；密度梯度离心后样品SDS-PAGE和Western Blot检测，检测结果如图7所示；根据SDS-PAGE和Western Blot检测结果将对应目的样品混合后浓缩至0.2mg/mL，采用BCA试剂盒检测浓度，然后-80℃保存，得到结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒；
(2)透射电子显微镜(TEM)分析：取Optiprep密度梯度离心样品做TEM分析，具体步骤如下：将样品使用1×PBS(0.5M NaCl)稀释，以HPV 16L1作为对照组分析；各取1滴样品滴在透射电镜的铜网的网格上；待样品干燥后取1滴2％的醋酸双氧铀自然滴于铜网上至铜网自然干燥；用TEM观察图像在不同放大倍率下的照片，寻找目标视野后拍照，结果如图8所示。
实施例7结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒的免疫原性
(1)小鼠免疫。采用小鼠BCG初免-蛋白加强免疫策略，步骤如图9所示，具体步骤如下：
首先对7周龄C57BL/6小鼠(购自上海吉辉实验动物饲养有限公司)进行尾静脉取血100μl，静置2h后3800rmp离心30min后取血清于-20℃保存，然后对小鼠进行卡介苗(BGG)初免(100μl BGG(0.5mg/mL)/只)；7周后尾静脉取血，方法同上；8周后，各小鼠尾静脉注射100μl蛋白液(含20μg抗原：实施例6所述的结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒，50μl不完全弗氏佐剂，PBS补足)；蛋白免疫1周后尾静脉取血，方法同上；蛋白免疫2周后，蛋白免疫加强一次，方法同上；两次蛋白加强免疫后，眼球取血法处死小鼠，收集小鼠血清，然后分离小鼠脾细胞；
(2)脾细胞刺激与培养：无菌条件下取小鼠脾细胞，使用400目筛网磨碎后，洗涤重悬脾细胞稀释至终浓度为1×106个/mL，分别用PPD和结核分枝杆菌蛋白YidC的膜外片段(2μg/mL)刺激脾细胞，2个复孔，每孔加入500μl稀释好的脾细胞悬液和500μl刺激物；37℃，5％CO2浓度，培养48h后，收集脾细胞上清，-80℃冻存；
(3)血清特异性抗体检测：使用间接ELISA法检测小鼠免疫前以及免疫后各时期血清中抗体IgG、IgG1、IgG2a，具体步骤如下：按2μg/mL包被抗原(抗原分别为PBS缓冲液、人乳头瘤病毒衣壳蛋白、结核分枝杆菌蛋白YidC的膜外片段、结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒)，100μl每孔，4℃孵育过夜；PBST洗涤后，每孔加入200μl封闭液，37℃封闭1h；加入各组小鼠不同时间采集的血清样本，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液按1:200稀释，100μl/孔，37℃孵育1h；加入稀释5000倍的HRP标记的抗鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体，37℃孵育1h；加入TMB显色液，避光反应10min后加入50μl 2N H2SO4终止反应；酶标仪读取数据，以630nm为参考波长读取OD450nm数值，结果如图10所示，图中PBS为PBS缓冲液，HPV16L1为人乳头瘤病毒衣壳蛋白，YidC为核分枝杆菌蛋白YidC的膜外片段，HPV-16L1/YidC为结核HPV-16L1/YidC病毒样颗粒。
从图10中可以看出，接种卡介苗7周后，各组IgG抗体均未明显升高；然而加强免疫后，与PBS和HPV16L1组相比，YidC和HPV16L1/YidC VLP组中YidC特异性IgG的含量有统计学意义；且与YidC组相比，HPV16L1/YidC VLP组在第12周(p＝0.001)诱导出更高的YidC特异性IgG抗体滴度。此外，我们发现YidC和HPV16L1/YidC VLPs都主要增强了抗YidC的IgG2a滴度，而不是IgG1滴度，这导致抗YidC的IgG2a/IgG1比例显著增加，这表明这些蛋白在小鼠体内诱导的免疫反应偏向Th1型。上述结果支持HPV16L1/YidC VLP作为免疫原的高效力，可引发针对表面显示的疫苗抗原YidC的强效体液免疫反应。
(4)脾细胞上清细胞因子检测：脾细胞均经GST(一种不相关的日本血吸虫重组蛋白，作为阴性对照)、LEDF-CD3ε抗体(阳性对照)、PPD和YidC刺激，48h后收集上清液。分别使用细胞因子ELISA检测试剂盒(购自ebioscience)用于定量IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-10。具体操作如下：使用包被液1：500比例稀释小鼠一抗(ELISA检测试剂盒内置)，使其终浓度为1μg/mL；每孔包被50μl稀释后一抗，每个脾细胞上清样品3个复孔，4℃孵育过夜；每孔加入200μl封闭液，室温封闭1h；清洗后每孔加入50μl对应的细胞因子标准品以及脾细胞上清样品，37℃孵育1h；清洗后加入50μl 1：500比例稀释生物素标记小鼠二抗(ELISA检测试剂盒内置)，室温孵育2h；加入50μl 1:1000比例稀释亲和素标记的HRP，室温孵育30min；加入TMB显色液，避光反应10min后，加入25μl 2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪读取数据，数据结果如图11所示。
结果如图11所示，脾细胞经GST刺激后，所有组中几乎检测不到IFN-γ的分泌；相反，当用LEAF-CD3ε抗体刺激时，所有组中都观察到高水平的IFN-γ。
脾细胞经PPD刺激后，HPV16L1组与PBS组间IFN-γ分泌无差异。然而，与HPV16L1相比，YidC诱导的IFN-γ分泌水平更高；与YidC相比，HPV16L1/YidC病毒样颗粒在IFN-γ分泌方面没有显著差异(p＞0.999)。
关于Ag85B特异性T细胞反应，与接受PBS、HPV16L1或YidC免疫的小鼠相比，在结核HPV16L1/YidC病毒样颗粒免疫的小鼠中观察到更高浓度的IFN-γ分泌。与接种HPV16L1的小鼠相比，接种YidC的小鼠的IFN-γ分泌明显增加；此外，与YidC相比，结核HPV16L1/YidC病毒样颗粒诱导更高的抗YidC IFN-γ水平(p＝0.0002)。对各组间IL-2、TNF-α、IL-10进行定量分析；然而，无论是PPD还是YidC刺激脾细胞，两者之间均没有显著差异。
由以上实施例可知，本发明提供了一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用，本发明提供的结核HPV16L1/YidC病毒样颗粒，由结核分枝杆菌蛋白YidC嵌合在改造的人乳头瘤病毒HPV16L1上组装而成，兼具体液免疫和细胞免疫特征，具有较高的免疫原性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种结核病毒样颗粒，其特征在于，所述结核病毒样颗粒的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；
编码氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的结核病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将结核分枝杆菌的膜外片段与人乳头瘤病毒衣壳蛋白融合；
所述结核分枝杆菌的膜外片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述人乳头瘤病毒衣壳蛋白为去除铰链区的人乳头瘤病毒衣壳蛋白。
4.权利要求1所述的结核病毒样颗粒在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
5.权利要求1所述的结核病毒样颗粒在制备结核疫苗中的应用。
6.一种重组质粒，其特征在于，包括结核病毒样颗粒和空载载体；
所述结核病毒样颗粒为权利要求1所述的结核病毒样颗粒；
所述空载载体为pPIC3.5K。
7.权利要求6所述的重组质粒在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
8.一种重组菌株，其特征在于，包括质粒和宿主菌；
所述质粒为权利要求5所述的重组质粒；
所述宿主菌为GS115酵母菌。
9.权利要求8所述的重组菌株在制备预防和/或治疗结核病的药物中的应用。
10.一种结核疫苗，其特征在于，包括结核病毒样颗粒、重组质粒或重组菌株；
所述结核病毒样颗粒为权利要求1所述的结核病毒样颗粒；
所述重组质粒为权利要求6所述的重组质粒；
所述重组菌株为权利要求8所述的重组菌株。
CN202410072805.0A 2024-01-18 2024-01-18 一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用 Pending CN117903321A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410072805.0A CN117903321A (zh) 2024-01-18 2024-01-18 一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410072805.0A CN117903321A (zh) 2024-01-18 2024-01-18 一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117903321A true CN117903321A (zh) 2024-04-19

Family

ID=90685238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410072805.0A Pending CN117903321A (zh) 2024-01-18 2024-01-18 一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117903321A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9782471B2 (en) EV71 virus-like particles and preparation method and application thereof
CN102154325B (zh) 针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途
CN110156896B (zh) 重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用
CN106318955B (zh) 表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒、由其制备的疫苗和应用
EP1790332B1 (en) Human papilloma virus vaccine for oral administration
WO2017162091A1 (zh) 基于表达HBsAg的失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗
CN113293144B (zh) 一种重组f基因型腮腺炎病毒活载体麻疹疫苗
CN106905434B (zh) 一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN103667319B (zh) 抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途
CN117903321A (zh) 一种结核病毒样颗粒及其制备方法与应用
WO2023142647A1 (zh) 一种新型hpv治疗性核酸疫苗
CN116514999A (zh) 一种嵌合表达口蹄疫病毒抗原表位融合蛋白、自组装纳米颗粒制备及其应用
CN115340609B (zh) 一种口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法
CN114681602B (zh) 一种双价人乳头瘤病毒疫苗
CN1324661A (zh) 一种人乙型肝炎核酸疫苗
CN107648602B (zh) 二价乙肝疫苗及其制备方法
CN106986942B (zh) 一种包含蝙蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN106986943B (zh) 一种包含北极地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN101049508A (zh) 携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗
CN117187262A (zh) 重组人乳头瘤病毒蛋白表达
RU2362586C2 (ru) Фармацевтические композиции для терапевтического применения
CN104745605B (zh) 重组人乳头瘤病毒6和11亚型蛋白毕赤酵母表达
CN105385698B (zh) 重组聚核苷酸与带有相同重组聚核苷酸的转基因金针菇
RU2469741C1 (ru) Полиэпитопная вакцина 4-го поколения против гепатита в и способ ее получения
WO2023165435A1 (zh) 重组刺突蛋白及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination