CN1178537A - 抗－tpo单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种针对人血小板生成素(TPO)的单克隆抗体,一种纯化TPO的方法,该方法包括采用该抗体通过亲和层析从一种含有TPO的物质中分离TPO,以及采用该抗体用于免疫化学定量或检测TPO的方法。通过采用抗－TPO的单克隆抗体可以纯化,检测或定量不同类型的人的TPO分子。

Description

抗-TPO单克隆抗体
                      发明背景发明领域：
本发明涉及一种用于检测，纯化或定量TPO的抗-TPO单克隆抗体。相关领域的公开：
人TPO(血小板生成素)是一种作为细胞因子受体超家族成员之一的Mpl的配体被克隆的蛋白(de sauvage等人，自然(伦敦)，第369期，533-565页(1994)；Bartley，T.D.等人，细胞，第77期，1117-1124页(1994))。这些Mpl配体中的每一种均能在血小板减少动物(人，小鼠，狗)的血清与血浆中检测到，并且已经证实它们涉及巨核细胞与血小板的生成。
为了开发一种用于治疗血小板减少的治疗剂，本发明人通过使用如所表明的一种活性已经从血小板减少的大鼠的血浆中提纯出大鼠TPO，其中该活性刺激了从大鼠骨髓中被高度纯化的巨核细胞前体细胞中巨核细胞的生成，并且已经成功地在其部分氨基酸序列的基础上克隆大鼠TPO cDNA与人TPO cDNA并通过重组DNA技术大量地得到了均一的人TPO(H.Miyazaki等人，Exp.Hematol.，第22期，第838页(1994))。已经发现所得到的人TPO具有与上面所提到的作为人Mpl配体得到的因子同样的氨基酸序列(参见下面显示的序列表中的SEQ IDNO：1)。
在本文中，需要检测、纯化或者定量TPO的高级方法以便于通过重组DNA技术大量生产均一的人TPO，测定所制备的TPO或者开发作为药物的TPO。
                      发明概述
本发明人已经研究了制备用于检测、纯化或定量TPO的抗-TPO单克隆抗体，并且已经发现了杂交瘤生产出可以识别h6T(1-163)的单克隆抗体，该杂交瘤是通过把骨髓瘤细胞与从一种已经用在大肠杆菌中表达的人TPO突变体(称作“h6T(1-163)”)免疫接种的动物中得到的产生抗体的细胞进行融合得到的，一种具有显示在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列并且在CHO细胞(称作“CHO(1-332)”)中进行表达的人TPO蛋白，另一种具有显示在SEQ ID NO：1中位点1至163的氨基酸序列并且在CHO细胞(称作“CHO(1-163)”)中进行表达的人TPO蛋白等等，以及这些单克隆抗体可以用于纯化和定量人TPO蛋白。
h6T(1-163)具有对应于显示在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列位点1至163的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，只是该氨基酸残基Ser1与Ala3分别被Ala与Val所取代而且Met与Lys残基被附加结合的N-末端上。在下面显示的实施例1中将详细地说明生产h6T(1-163)的方法。
因此，本发明提供了一种针对人TPO的单克隆抗体，它也提供了一种用于纯化TPO的方法，该方法包括采用一种抗-人TPO单克隆抗体通过亲和层析从含有TPO的物质中分离TPO。本发明进一步提供了一种用于免疫化学定量或检测TPO的方法，该方法包括使用一种抗-人TPO单克隆抗体。
                   附图简要说明
图1为一幅表明在450/570nm下吸光度随CHO(1-163)或CHO(1-332)的剂量而变化的附图。
图2为一幅表明在450/570nm下吸光度随CHO(1-163)，CHO(1-332)，MKT(L-163)或MKT(1-332)的含量(或浓度)而变化的附图。
图3为一幅表明本发明的单克隆抗体与CHO(1-332)以及重组的人促红细胞生成素的反应活性，它们是通过A450/A570的吸光度的比值进行比较的。
                      发明详述
本发明在下面将进行更为详尽的描述。
本发明的单克隆抗体可以按下面的方式进行生产。(1)制备免疫接种的动物细胞
采用人TPO对小鼠，大鼠或其类似物免疫接种，从中可以制备脾细胞。例如，人TPO可以通过采用重组DNA技术在大肠杆菌中生产(参见实施例1)。免疫接种通常是通过向小鼠，大鼠或兔子经皮下、静脉或腹膜内给药来实现的，给药量为结合了一种合适辅剂的5至100微克的人TPO/动物，或者按一种爪垫给药的方式来实现。免疫接种可以每隔合适的时间，优选每隔1至2周的时间(在爪垫给药的情况下为2至3天)进行一次或多次。
测定在免疫接种动物的血清中抗体对抗原的滴度并且在此基础上把显示有足够高的抗体滴度的动物用作产生抗体细胞的来源。优选为在最后的免疫接种后3-4天所得到的产生抗体的细胞。
许多已知的技术，诸如放射免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)及其类似的测定可以用作测定一种抗体滴度的方法，并且在本发明中通常采用ELISA。(2)制备骨髓瘤细胞
作为骨髓瘤细胞，通常希望使用从小鼠中得到的已建立的细胞，例如象P3-X63-Ag8-U1(P3-U1)[微生物学与免疫学中的流行课题，81，1-7(1978)]，P3-NSI/I-Ag4.1(NS-1)[欧洲免疫学杂志，6，511-519(1976)]，SP2/O-Ag14(SP-2)[自然，276，269-270(1978)]，P3-X63-Ag8.653(653)[免疫学杂志，123，1548-1550(1979)]，P3-X63-Ag8(X63)[自然，256，495-497(1975)]及其类似物的具有8-氮鸟嘌呤-抗性小鼠(BALB/c来源)的骨髓瘤细胞系。这些细胞系继代培养在一种合适的培养基之内或之上，这些培养基诸如8-氮鸟嘌呤培养基[8-氮鸟嘌呤加上常规培养基，即补充有谷氨酰胺(1.5mM)，2-巯基乙醇(5×10-5M)，庆大霉素(10微克/毫升)与胎牛血清(FCS；10％)的RPMI1640培养基]；IMDM(Iscove改良的Dulbecco’s培养基)；或Dulbecco’sMEN，并且在进行细胞融合之前它们最后在常规培养基之内或之上继代培养3至4天以便于在融合时可以得到2×107或更多的融合细胞。(3)细胞融合
在小鼠的情况下，例如将5至10微克的人TPO/动物向已经按步骤(1)的方式进行免疫接种的小鼠经腹膜内或皮下给药，并且在3-4天后切去小鼠的脾脏以获得脾细胞。象在步骤(2)中所制备的骨髓瘤细胞一样，把如此得到的脾细胞也用培养基或PBS充分地洗涤，在将这两种细胞以脾细胞比骨髓瘤细胞大约为5-10∶1的比例进行混合后，然后使之离心。弃去所得到的上清液，而且充分地分散沉淀的细胞，并且当向该悬浮液中加入溶于类似DMEM的培养基的聚乙二醇(PEG：分子量为1,000至4,000)溶液的同时于37℃下搅拌该细胞1至2分钟直至脾细胞的数量变为每0.1-1.0毫升悬浮液有108个细胞为止，另外再持续搅拌1至2分钟。在搅拌后，将1至3毫升的培养基加入到悬浮液中，与此同时搅拌1至3分钟并且随后缓慢地加入7至10毫升同样的培养基。在37℃下保留该悬浮液5至10分钟，然后离心。弃去所得到的上清液，并且将残留的细胞再悬浮于FCS-补充培养基中并进行离心。重复该步骤二或三次。将该细胞慢慢地悬浮在50至200毫升FCS-补充培养基中，并且以孔体积一半的量向一块培养平板的孔中分配该悬浮液，采用一个3-7％的二氧化碳温育箱在35至38℃下培养该悬浮液10至18小时。向该培养平板的孔中以孔体积一半的量分配HAT培养基(在常规培养基中含有次黄嘌呤(10-6至10-3M)，氨基蝶呤(10-8至10-7M)与胸苷(10-6至10-4M))，并且持续该培养10至30小时。此后，在1到4天的时间里每隔10至30小时除去一半体积的培养上清液的液体并且代之以同样体积的新鲜HAT培养基，采用一个3-7％的二氧化碳温育箱在35至38℃下培养该细胞10至14天。
当在孔中观察到呈一个集落形式生长的杂交瘤时，除去在孔中一半体积的上清液液体并且代之以同样体积的HT培养基(不含氨基蝶呤的HAT培养基)，并且随后在1到3天的时间里每隔10至30小时进行HT培养基对上清液液体的替换。在HT培养基中培养3至4天后，从该培养物中取出一部分培养上清液并且通过酶免疫测定方法来测定该上清液的抗-TPO抗体的滴度。
将由上面的抗体滴度测定来确定其特异抗体产率的杂交瘤转移到另一块平板上进行克隆。可以通过一种经有限稀释来稀释该杂交瘤从而在一个孔中含有一个单一的杂交瘤细胞的方法，一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法，一种采用显微操作器挑取单一的杂交瘤细胞的方法，或者一种采用细胞分选仪分离单一的杂交瘤细胞的“分选仪克隆”方法，并且优选为简单或易于操作的有限稀释方法来进行这种克隆。对于确定抗体滴度所在的孔而言，例如通过有限稀释方法重复该克隆2至4次，并且筛选表明具有一个稳定的抗体滴度的克隆作为产生抗-TPO抗体的杂交瘤细胞系。(4)制备单克隆抗体
以常规培养基代替HT培养基来培养在上面步骤(3)中得到的杂交瘤。采用旋动或滚瓶实现大规模培养。例如通过把从大规模培养中得到的上清液液体进行凝胶过滤以收集并纯化IgG组分便可以得到抗-人TPO单克隆抗体。
在另一方面，当免疫接种的动物为小鼠时，可以在属于同品系(例如Balb/c或Nu/NU)的其它小鼠的腹腔内培育该杂交瘤。在这种情况下，当把在上面的步骤(3)中得到的产生抗-TPO单克隆抗体的杂交瘤通过腹膜内注射以4×104-107细胞/动物的剂量向经降植烷-处理的雌性小鼠(4至8周龄)给药时，在给药后2至3周该杂交瘤引起腹水肿瘤。当从每只小鼠中收集该腹水液体并通过离心除去任意一种固体成分时，它便可以用作检测或定量和纯化人TPO的一种单克隆抗体。如果需要进一步的纯化，可以使用DEAE-Sepharose柱，蛋白A-Sepharose柱或者类似柱从离心过的上清液中收集IgG组分。
通过Ouchterlony方法(免疫学实验介绍，生物学实验方法15，由Gakkai Shuppan中心出版，东京，日本，第74页，1981)或EIA进行该抗体的同种型或亚类的鉴定。
通过Folin-Lowry方法并且通过在280nm下的吸光度[1.4(OD280)＝免疫球蛋白1毫克/毫升]来计算蛋白质的含量。
制备本发明的单克隆抗体的方法将在下面的实施例中进行描述，其中发现从杂交瘤细胞系L3-1与L4-1所得到的单克隆抗体(命名为L3-1与L4-1)分别属于IgG2a和IgG2b亚类。
在下面的实施例中描述了所得到的单克隆抗体L3-1与L4-1的抗原特异性。
本发明的单克隆抗体可以在亲和色谱中用作分离和纯化人TPO的配体。根据采用象CNBr-活化的Sepharose 4B(pharmacia精细化学品厂)的凝胶载体或膜载体的多种蛋白质固定化技术可以制备在亲和色谱中有用的固定化单克隆抗体。为了采用固定化的单克隆抗体纯化人TPO，在一个柱中装填该抗体并且将含有人TPO的溶液加入柱中。此后，未结合的物质被洗出并且将结合到该柱上的TPO进行洗脱，例如采用可以含有氯化钠，丙酸，二氧杂环己烷，乙二醇，离液盐，gluanidine的盐酸化物，尿素或类似物的甘氨酸-盐酸缓冲溶液(pH2.5)洗脱。
本发明的单克隆抗体可以用于检测人TPO，例如通过象固相夹心方法的酶免疫测定方法来测定。
根据本发明的一个具体的实施方案，本发明的检测或定量方法包括将抗-TPO单克隆抗体与含有TPO的样品接触以检测或定量所形成的免疫复合物。
固相夹心方法是通过下面的步骤进行的。
固相夹心方法是一种非竞争性固相酶免疫测定方法，其中一个抗原采用两种不同的可以识别同一抗原不同表位的抗体来检测或定量。即，在第一步把识别TPO的抗体固定化在固相上，之后在第二步通过形成一种TPO与固定化在固相上的抗体的免疫复合物而将TPO吸附在该固相上。在第三步，通过TPO与一个被标记的抗体或抗体片段的反应来检测或定量TPO，其中该抗体或抗体片段可以识别一个TPO表位而不是识别由在第一步中采用的抗体可识别的表位。被标记的抗体或其片段可以通过采用诸如辣根过氧化物酶的一种酶直接以马来酰亚胺-铰链(hinge)方法或类似方法，或者间接以亲和素-生物素方法或类似方法标记该抗体或其片段来制备。
                      实施例
现给出下面的实施例以便于更为详细地说明本发明。实施例1制备抗原蛋白h6T(1-163)
将显示在序列表(SEQ ID NO：3)中编码h6T(1-163)的DNA进行化学合成并且克隆到已经用XbaI和Hind III消化的pCFM536(ATCCNo.39934；JP-A-60-501988)中[采用事先以pMW1(ATCC No.39933)转化的大肠杆菌JM109作为宿主]。把如此得到的克隆命名为pCFM536/h6T(1-163)，并且采用含有这一表达载体的大肠杆菌菌株作为用于h6T(1-163)表达的转化体。
表达质粒pCFM536的表达受一个λPL启动子的控制，其中该启动子在一个cI857阻抑基因的控制之下。将上述转化体于30℃下在60毫升补充有50微克/毫升α-氨基苄青霉素与12.5微克/毫升四环素的LB培养基中摇振培养过夜，并且将25毫升该培养物加入到1,000毫升补充有50微克/毫升α-氨基苄青霉素的LB培养基中并在30℃下摇振培养直至在A600下的OD达到1.0至1.2为止。接下来，加入大约330毫升预热至65℃的LB培养基以便于最终的温度变为42℃，并且于42℃下持续该摇振培养3小时以诱导h6T(1-163)的表达。
将0.6克产生h6T(1-163)的转化体的冷冻细胞悬浮在3毫升水中并且采用一台高压粉碎器粉碎该细胞。通过离心回收被沉淀的组分，借此除去大部分受污染的蛋白质，细胞组分及其类似物。将如此回收的含有h6T(1-163)的沉淀组分悬浮在2毫升水中，并与0.5毫升的1M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)和10毫升的10M尿素混合，然后在室温下搅拌5分钟。向4毫升所得到的悬浮液中加入28毫升的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)与8毫升含有1M尿素的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，接下来在4℃下轻度搅拌过夜。通过离心回收被沉淀的组分，并且在室温下通过加入200微升含有8M胍，5％乙氰和0.3％EDTA的0.5MTris-HCl缓冲液(pH8.5)使得如此回收的含有h6T(1-163)的沉淀组分进行增溶溶解，然后在加入20毫克DTT之后使该组分在60℃下经过1小时的还原处理。接下来采用一种洗脱溶剂A(0.1％TFA)和一种洗脱溶剂B(含有0.05％TFA的n-PrOH)，将一份100微升的该组分加入到一个已用25％B平衡的Capcell Pak C1 300A(由Sheseido生产，目录(Ca.)号.C1类型：SG300A，φ4.6×150毫米)柱中，然后采用从25％B至40％B的50分钟的线性梯度在0.4毫升/分钟的流速下进行展开以回收在从大约28％至大约30％n-PrOH的范围内洗脱的h6T(1-163)的峰组分。在向该组分加入100毫升50％的甘油后，通过离心-蒸发除去TFA和n-PrOH以制备用作抗原的h6T(1-163)。实施例2  制备产生抗-人TPO单克隆抗体的杂交瘤(1)免疫接种小鼠
将在实施例1中得到的500微克h6T(1-163)与1,000微升的RIVIADJUVANT(由免疫化学研究所生产，目录号：52017700)充分混合以形成一种乳状液。接下来，在用醚麻醉下向每只Balb/c雌性小鼠(4周龄)的爪垫注射5微克抗原/只小鼠。每隔3天按如上同样的方式重复加强免疫共8次。在最后一次加强免疫时，通过皮下注射以5微克/只小鼠的剂量注射人IL-6。在最后一次加强免疫3天后，采用血细胞比容毛细管从轨道中收集血液，并且从中分离出血清以便通过酶免疫测定方法来测定血液的抗体滴度及其与h6T(1-163)的反应性。在接下来的细胞融合中采用表明具有1∶1000或者更高的抗体滴度以及TPO反应性的小鼠的脾细胞。(2)制备骨髓瘤细胞系
将骨髓瘤细胞(P3X63-Ag.8-653)解冻，悬浮在添加了10％FCS(由Hyclone生产，目录号.A-1115-L)的DMEM培养基中，然后在300×g下离心5分钟。弃去上清液，并且将残留的细胞重新悬浮在10％FCS/DMEM中，并于37℃下在5％的二氧化碳温育箱中进行培养。(3)细胞融合
按常规的方式进行细胞融合。简而言之，无菌除去用h6T(1-163)免疫接种的小鼠的局部(即腹股沟，肠系膜)淋巴结和脾脏，并且将该淋巴结细胞和脾细胞分别悬浮在10％FCS/DMEM中以制备产生抗体的细胞。接下来，将处在对数生长期的1份骨髓瘤细胞与5份淋巴结细胞或脾细胞混合，用DMEM洗涤以除去血清，然后采用聚乙二醇(PEG1500，由Boehringer Mannheim生产，目录号：783641)使之进行细胞融合。在细胞融合完成后，用含有10％FCS和10纳克/毫升的人IL-6的DMEM调节所得到的细胞至1×106细胞/毫升，并且将其以一份100微升分配至一块96-孔微量滴定板(Nunc-Immuno P1ate MaxiSorpTM，由InterMed生产，目录号：4-42404)的孔中。在18小时后，将含有2×HAT(由SIGMA生产，目录号：H0262)的10％FCS/10纳克/毫升-人IL-6/DMEM以100微升/孔的量加入孔中，并且于37℃下在一个5％的二氧化碳温育箱中在大约10至大约14天的期间内培养该细胞。(4)筛选生产抗-人TPO单克隆抗体的杂交瘤
产生抗-人TPO单克隆抗体的杂交瘤是通过一种酶免疫测定方法进行筛选的。用PBS调节h6T(1-163)或CHO(1-332)至20微克/毫升，并且将其以一份50微升分配至一块96-孔微量滴定板(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorpTM，由InterMed生产，目录号：4-42404)的孔中。当采用一个微量板混合器(微量板混合器MPM-1，由Iwaki Glass生产)振荡该平板时，抗原在每个孔的底部充分分散。用平板密封(由SUMILON生产，目录号：MS-30020)密封该平板，并用在37℃下保留该平板2小时或者在4℃下保留过夜以便吸附抗原至该平板上。接下来，在用20mM Tris-HCl/0.5M氯化钠/0.1％Tween 20的洗涤缓冲液(pH7.5)洗涤后，向每个孔中加入300微升稀释了4倍的Block Ace(由Dainippon制药厂生产，目录号：UK-B25)，并且用平板密封密封该平板，并在37℃下保留该平板1小时或者在4℃下保留过夜。在用洗涤缓冲液洗涤4次之后，向每个孔中加入50微升杂交瘤克隆的培养上清液液体，并且采用一个微量板混合器振荡该平板并用平板密封进行密封，然后使该平板在37℃下反应小时。在该反应以及随后用洗涤缓冲液洗涤4次完成后，向每个孔中加入50微升在稀释了10倍的Block Ace中已按1∶500稀释的碱性磷酸酶-标记的蛋白A(PIERCE，目录号：32300)，并且在一个微量板混合器上振荡该平板，用平板密封进行密封，然后使该平板在37℃下反应1小时，在反应后，用洗涤缓冲液洗涤孔4次，向每个孔中加入100微升用于碱性磷酸酶的颜色展开试剂盒(Kirkegaard & Perry实验室，目录号：50-80-00)的颜色形成物，并且在一个微量板混合器上振荡该平板，用平板密封进行密封，然后使该平板在室温下反应。在大约30分钟后，采用一个平板读数器(Wellreader SK601，由SeikagakuKogyo生产)测定在405nm处的吸光度，从孔中筛选对h6T(1-163)和CHO(1-332)均呈阳性的克隆。将如此筛选的克隆扩增并冷冻直至使用。与此同时，通过有限稀释方法进行克隆。采用含有1×HT(由SIGMA生产，目录号：H0137)的10％FCS/10纳克/毫升-人IL-6/DMEM培养基进行有限稀释，第二次筛选是通过酶免疫测定方法按照与上面相同的方式来进行的。当该克隆被稳定时，在10％FCS/DMEM中继代培养该克隆，扩增该克隆，然后冷冻它们直至使用。(5)识别-人TPO单克隆抗体的位点
通过以上的方法总共得到了63个抗-人TPO单克隆抗体的克隆。从这些克隆中筛选出了13个具有高反应性的克隆，并且通过与在上面的步骤(4)中采用的同样的酶免疫测定方法、采用在显示于SEQ ID NO：1中的人TPO氨基酸序列的基础上所合成的多种抗原的肽(HT-1，2，3，4，5和6)(参见表1)测定了它们与TPO蛋白反应的区域。结果得到了一个与HT-1反应的抗体(抗体L3-1)，一个与HT-2反应的抗体(抗体L4-1)，10个与HT-3反应的抗体(抗体L1-10，S6-27，S3-13，S2-2，L3-15，L2-43，L3-4，L4-13，S4-12和S3-52)。
                  表1 人TPO(氨基酸位点8至28)肽HT-1区域DLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQ人TPO(氨基酸位点47至62)肽HT-2区域SLGEWKTQMEETKAQD人TPO(氨基酸位点108至126)肽HT-3区域LGTQLPPQGRTTAHKDPNA人TPO(氨基酸位点172至190)肽HT-4区域NELPNRTSGLLETNFTASA人TPO(氨基酸位点262至284)肽HT-5区域SLPPNLQPGYSPSPTHPPTGQYT人TPO(氨基酸位点306至332)肽HT-6区域PSAPTPTPTSPLLNTSYTHSQNLSQEG保藏机构：国家生物科学与人体技术研究院，工业科学与技术机构地址：    1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本保藏机构：中国典型培养物保藏中心地址：    珞珈山，武汉430072，中国
就此而论，杂交瘤L4-1的亚克隆(L4-1-31)与杂交瘤L3-1的亚克隆(L3-1-54)已于1994年12月27日保藏在日本国际贸易与工业部工业科学与技术机构的国家生物科学与人体技术研究院，保藏号分别为FERM BP-4956与FERM BP-4955，这些亚克隆也被中国保藏机构(CCTCC)所保藏，保藏号分别为CCTCC-C95003与CCTCC-C95002，该亚克隆分别命名为小鼠-小鼠杂交瘤L4-1-31和小鼠-小鼠杂交瘤L3-1-54。(6)抗-人TPO单克隆抗体的亚类
通过EIA方法(INNOGENETICS)测定在上面步骤(5)中得到的抗-人TPO单克隆抗体L3-1，L4-1，L1-10，S6-27以及S3-13的亚类。将每种培养物的上清液与一种固定化的大鼠抗-小鼠(亚类特异的)单克隆抗体进行反应，随后使之与一种碱性磷酸酶-标记的大鼠抗-小鼠(κ/轻链特异的)单克隆抗体进行反应。在反应完成后，通过加入BCIP底物进行颜色展开以测定亚类。结果，发现抗-人TPO单克隆抗体L3-1，L4-1，L1-10，S6-27以及S3-13的亚类分别为IgG2a，IgG2b，IgG3，IgG3和IgG3。(7)纯化抗-人TPO单克隆抗体
将产生抗-人TPO单克隆抗体的杂交瘤在1升补充有10毫克牛胰岛素，10毫克人运铁蛋白，20mM单乙醇胺和5×10-5M亚硒酸钠的不含血清的eRDF培养基中采用滚瓶(Falco，目录号：3000)大规模培养。当杂交瘤的存活率达到90％或以下时，进行离心以回收培养上清液，随后该上清液通过0.22微米的膜过滤器过滤。将所得到的培养上清液在100毫升/分钟的流速下加到一个已用0.15M磷酸缓冲液(PBS)平衡的蛋白A柱(由Fuji过滤器工业K.K.生产，日本)中。在培养上清液中的抗体吸附到蛋白A上之后，通过在100毫升/分钟的流速下使PBS穿过该柱洗去未被吸附的物质直至在280nm下的吸附值达到基线为止。在洗去未被吸附的物质之后，采用0.1M的甘氨酸洗脱液(pH2.5)洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0.1M Tris进行中和，通过超滤将其调节到一个合适的浓度，灭菌，然后在-20℃下储存。实施例3  采用抗-人TPO单克隆抗体的ELISA
用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.2)调节作为固相抗体识别HT-1区域的抗-人TPO单克隆抗体(L3-1的L3-1-54亚类)至20微克/毫升，并且将其以一份50微升分配至一块96-孔微量滴定板(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorpTM，由InterMed生产，目录号：4-42404)的孔中。通过采用一个微量板混合器(微量板混合器MPM-1，由Iwaki Glass生产)振荡该平板，固相抗体在每个孔的底部充分分散。用平板密封(由SUMILON生产，目录号：MS-30020)密封该平板，并且在37℃下保留该平板2小时或者在4℃下保留过夜以便吸附该固相抗体至该平板上。在用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl/0.5 M氯化钠/0.1％ Tween 20(pH7.5)洗涤后，向每个孔中加入300微升稀释了4倍的Block Ace(由Dainippon制药厂生产，目录号：UK-B25)，并且用平板密封密封该平板，并在37℃下保留该平板1小时或者在4℃下保留过夜。在用洗涤缓冲液洗涤4次之后，向每个孔中加入一个50微升待检测的样品或者在稀释了10倍的Block Ace中作为标准稀释的已知浓度的TPO，并且在微量板混合器上振荡该平板，用平板密封进行密封，然后在37℃下保留该平板2小时或者在4℃下保留过夜。在反应后，用洗涤缓冲液洗涤孔4次，稀释了10倍的Block Ace将识别HT-2区域的生物素-标记的抗-人TPO单克隆抗体(L4-1的L4-1-31亚类；第一抗体)稀释到500钠克/毫升，并且将其以一份50微升分配至孔中，在一个微量板混合器上振荡该平板，用平板密封进行密封，然后在37℃下保留该平板2小时或者在4℃下保留过夜。在反应后，用洗涤缓冲液洗涤孔4次，在稀释了10倍的Block Ace中按1∶2,000稀释过氧化物酶-标记的亲和素(UltraAvidinTM-辣根过氧化物酶，由Leinco Technologies生产，目录号：A106)，将其以一份50微升分配至孔中，并且在一个微量板混合器上振荡该平板，用平板密封进行密封，然后使该平板在37℃下反应1小时。在该反应完成并且随后用洗涤缓冲液洗涤(×4)后，向每个孔中加入100微升的颜色形成物，其中该颜色形成物是通过将一种底物溶液以1/100的体积比加入到用于过氧化物酶的颜色展开试剂盒(SUMILON，目录号：ML-1120T)的TMBZ颜色形成物中制得的，并且在一个微量板混合器上振荡该平板，用平板密封进行密封，然后使该平板在室温下反应。在大约20分钟后，向每个孔中加入100微升反应终止溶液，在一个微量板混合器上振荡该平板以终止染色反应。采用一个ELISA平板读数器(Wellreader SK601，由Seikagaku Kogyo生产)测量在450nm/570nm波长处的吸光度。在通过已知浓度的CHO(1-163)或CHO(1-332)得到的吸收值的基础上绘制标准曲线(参见图1)。除了CHO(1-163)和CHO(1-332)以外，也绘制在大肠杆菌中生产的人TPO突变体(例如“MKT(1-332)”和“MKT(1-163)”)的另一标准曲线(参见图2)。因此，可以定量测定不同种类的TPO分子。
MKT(1-332)具有一个向显示在SEQ ID NO：1中的人TPO氨基酸序列的N-末端加入一个Met残基(在位点-2)与一个Lys残基(在位点-1)的氨基酸序列。MKT(1-163)具有一个向显示在SEQ ID NO：1中的1-163氨基酸序列的N-末端加入一个Met残基(在位点-2)与一个Lys残基(在位点-1)的氨基酸序列
此外，采用表明与在SEQ ID NO：1中显示的人TPO的N-末端氨基酸序列具有高同源性的人促红细胞生成素(hEPO)检测抗原的特异性。结果发现这一系统能够特异地检测TPO(参见图3)。
当采用L3-1与S3-13，S3-13与L3-1，或者S3-13与L4-1的组合作为一种固相抗体与一种生物素-标记的第一抗体的组合进行夹心测定时，也可以在类似于L3-1-54与L4-1-31组合的情况下进行TPO的检测与定量。
正如在上面具体的实施例中说明的，通过使用本发明的单克隆抗体可以检测或定量不同种类的人TPO分子。
                             序列表SEQ ID NO：1信息序列特征：
长度：332个氨基酸
类型：氨基酸最初来源：
人类序列描述：SEQ ID NO：1Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1                5                   10                  15Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val
         20                  25                  30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
     35                  40                  45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu
 50                  55                  60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65                   70                  75                  80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln
             85                  90                  95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu
        100                 105                 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe
    115                 120                 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130                 135                 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145                 150                 155                 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn
            165                 170                 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr
        180                 185                 190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile
    195                 200                 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly
210                 2l5                 220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225                 230                 235                 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly
            245                 250                 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser
        260                 265                 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu
    275                 280                 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro
290                 295                 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305                 310                 315                 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly
            325                 330SEQ ID NO：2信息序列特征：
长度：165个氨基酸
类型：氨基酸最初来源：
人类序列描述：SEQ ID NO：2Met Lys Ala Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys-2  -1    1               5                  10Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro15                   20                  25                  30Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe
             35                  40                  45Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp
         50                  55                  60Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg
     65                  70                  75Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser
 80                  85                  90Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr95                 100                 105                 110Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala
            115                 120                 125Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu
        130                 135                 140Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr
    145                 150                     155Thr Ala Val pro Ser
160         163SEQ ID NO：3信息序列特征：
长度：535个核苷酸
类型：核酸
链：  双链
拓扑结构：线性分子类型：合成DNA最初来源：
人类序列描述：SEQ ID NO：3CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA                                       28ATG AAA GCA CCT GTA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA      76Met Lys Ala Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys
     +1               5                  10CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG     124Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro15                  20                  25                  30GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT GTC GAC TTC     172Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe
             35                  40                  45TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA GCT CAG GAC     220Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp
         50                  55                  60ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG GCT GCA CGT     268Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg
     65                  70                  75GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC CAG CTG TCT     316Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser
 80                  85                  90GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG CTT GGC ACC     364Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr95                 100                 105                 110CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT CCG AAC GCT     412Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala
            115                 120                 125ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC AAA GTT CGT TTC CTG      460Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu
        130                 135                 140ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT CGG GCG CCG CCA ACC      508Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr
    145                 150                 155ACT GCT GTT CCG TCT TAATGAAAGC TT                                    535Thr Ala Val Pro Ser
160

Claims (4)

1.一种针对人TPO的单克隆抗体。
2.一种纯化TPO的方法，该方法包括采用一种针对人TPO的单克隆抗体通过亲和层析从一种含有TPO的物质中分离TPO。
3.一种用免疫化学方法定量或检测TPO的方法，其特征在于使用了针对人TPO的单克隆抗体。
4.根据权利要求3的方法，该方法包括将该单克隆抗体与一种含有TPO的样品接触以定量或检测所形成的免疫复合物。
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