CN117679355A - 达原饮在制备抑制emt的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中医药技术领域，公开了达原饮在制备抑制EMT的药物中的应用。本发明首次公开了达原饮在制备抑制EMT的药物中的应用，通过实验证明，达原饮可有效促进发生EMT的上皮细胞中CDH1基因和E‑cad蛋白的表达，抑制发生EMT的上皮细胞中N‑cad、Vimentin、α‑SMA蛋白的表达。抑制肿瘤细胞发生EMT，降低肿瘤细胞迁移率；抑制肺纤维化过程中EMT的发生，抑制胶原蛋白的合成，即达原饮可通过抑制EMT用于预防和/或治疗EMT相关疾病，为EMT相关疾病的预防和治疗提供新的可能。

Description

达原饮在制备抑制EMT的药物中的应用
技术领域
本发明属于中医药技术领域，具体涉及达原饮在制备抑制EMT的药物中的应用。
背景技术
上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞下调其上皮特征，获得间充质细胞表型的动态转化过程。肿瘤细胞通过EMT丢失某些上皮细胞特征来获得更强的侵袭和迁移能力，促进肿瘤的发生、侵袭和转移，增强其耐药性。同样各种亚临床迁延性损伤因素首先累及肺泡上皮，诱导肺泡上皮细胞发生EMT，发生EMT的肺上皮细胞参与肺组织过度修复，促进肺纤维化进展。
旁分泌信号分子TGF-β1等下调上皮细胞E-钙粘蛋白(E-cadherin，E-cad)的表达，破坏细胞连接是EMT发生的关键。EMT发生的组织学鉴定标准为：丢失E-cad蛋白等上皮细胞黏附分子，增加N-cad、Vimentin、α-SMA蛋白等间充质细胞的标志蛋白的表达。
达原饮是“开达膜原”的经典方剂，已用于治疗SARS的“邪伏膜原”证和COVID-19的“湿邪郁肺”证。除治疗肺系疫病外，达原饮还可用于治疗无名发热等，但通过抑制EMT预防和/或治疗疾病的研究与应用至今未见报道。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于依据中医理论，提供达原饮在制备抑制EMT的药物中的应用。
本发明第二发明的目的，在于提供达原饮在制备CDH1基因、E-cad蛋白促进剂中的应用。
本发明第三发明的目的，在于提供达原饮在制备N-cad或Vimentin抑制剂中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供达原饮在制备胶原蛋白合成抑制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，在于提供达原饮在制备抑制EMT的药物中的应用，所述达原饮由包括以下组分的原料制成：槟榔、厚朴、草果仁、知母、白芍、黄芩、甘草片。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～18份、厚朴3～9份、草果仁1～5份、知母3～9份、白芍3～9份、黄芩3～9份、甘草1～5份。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～10份、厚朴3～7份、草果仁1～4份、知母3～6份、白芍3～6份、黄芩3～6份、甘草1～4份。
在本发明一些实施方式中，所述药物促进发生EMT的上皮细胞中E-cad蛋白的表达，和/或抑制发生EMT的上皮细胞中N-cad、Vimentin、α-SMA蛋白的表达。
在本发明一些实施方式中，所述药物抑制发生EMT的肿瘤细胞迁移，降低细胞迁移，和/或抑制肺纤维化过程中EMT的发生，降低肺组织中的羟脯氨酸含量。
在本发明一些实施方式中，所述药物由包括所述的达原饮和药学上可接受的辅料制备而成。
在本发明一些实施方式中，所述药物可按本领域常规方法制备。本发明所述药物是各原料药粉碎后混合而成的组合物；或者各原料药混合后提取得到的提取物，或者各原料药单独提取后混合得到的提取物。任选的，提取物进一步精制纯化。其中，所述提取的方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等：所述纯化的方法包括水提醇沉、碱溶酸沉以及各种柱色谱纯化方法，如大孔树脂柱、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等。
在本发明一些实施方式中，所述药物的剂型为汤剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、散剂和膏剂中的一种。
在本发明一些实施方式中，上述达原饮加入适宜的药学上可接受的辅料，按所需剂型的常规制备工艺即可，以制成相应的汤剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、散剂和膏剂。
在本发明一些实施方式中，所述药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂或防腐剂中的至少一种。
在本发明一些实施方式中，所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、水、糊精、明胶、羟丙基纤维素、甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮等；所述稀释剂选自乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙和结晶纤维素中的至少一种；所述崩解剂选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙和藻酸中的至少一种；所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、微粉硅胶、滑石粉、无水硅胶和硬脂酸镁中的至少一种：所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、羧甲基纤维素钠和固态聚乙二醇中的至少一种：所述润湿剂选自甘油、吐温-80、氧基氢化蓖麻油、十二烷基硫酸钠和卵磷脂中的至少一种：所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇和植物油中的至少一种，所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等：所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦和聚山梨(吐温)中的至少一种：所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、甜菊素、安赛蜜、柠檬酸和糖精钠中的至少一种；所述防腐剂选自对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯中的至少一种。
本发明第二个方面，在于提供达原饮在制备CDH1基因、E-cad蛋白促进剂中的应用。
在本发明一些实施方式中，所述CDH1基因、E-cad蛋白促进剂为促进CDH1基因或E-cad蛋白表达的促进剂。
在本发明一些实施方式中，所述CDH1基因、E-cad蛋白促进剂用于促进细胞内CDH1基因或E-cad蛋白的表达。
在本发明一些实施方式中，所述细胞包括肺癌细胞和肺泡上皮细胞。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下组分的原料制成：槟榔、厚朴、草果仁、知母、白芍、黄芩、甘草片。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～18份、厚朴3～9份、草果仁1～5份、知母3～9份、白芍3～9份、黄芩3～9份、甘草1～5份。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～10份、厚朴3～7份、草果仁1～4份、知母3～6份、白芍3～6份、黄芩3～6份、甘草1～4份。
在本发明一些实施方式中，所述促进剂由包括所述的达原饮和药学上可接受的辅料制备而成。
在本发明一些实施方式中，所述促进剂可按本领域常规方法制备。本发明所述促进剂是各原料药粉碎后混合而成的组合物；或者各原料药混合后提取得到的提取物，或者各原料药单独提取后混合得到的提取物。任选的，提取物进一步精制纯化。其中，所述提取的方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等：所述纯化的方法包括水提醇沉、碱溶酸沉以及各种柱色谱纯化方法，如大孔树脂柱、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等。
在本发明一些实施方式中，所述药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂或防腐剂中的至少一种。
本发明第三个方面，在于提供达原饮在制备N-cad或Vimentin的抑制剂中的应用。
在于提供达原饮在抑制N-cad或Vimentin的表达中的应用。
在本发明一些实施方式中，所述N-cad或Vimentin抑制剂为抑制N-cad或Vimentin基因或蛋白表达的抑制剂。
在本发明一些实施方式中，所述N-cad或Vimentin抑制剂用于抑制细胞内N-cad或Vimentin基因或蛋白表达。
在本发明一些实施方式中，所述细胞包括肺癌细胞和肺泡上皮细胞。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下组分的原料制成：槟榔、厚朴、草果仁、知母、白芍、黄芩、甘草片。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～18份、厚朴3～9份、草果仁1～5份、知母3～9份、白芍3～9份、黄芩3～9份、甘草1～5份。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～10份、厚朴3～7份、草果仁1～4份、知母3～6份、白芍3～6份、黄芩3～6份、甘草1～4份。
在本发明一些实施方式中，所述抑制剂由包括所述的达原饮和药学上可接受的辅料制备而成。
在本发明一些实施方式中，所述抑制剂可按本领域常规方法制备。本发明所述抑制剂是各原料药粉碎后混合而成的组合物；或者各原料药混合后提取得到的提取物，或者各原料药单独提取后混合得到的提取物。任选的，提取物进一步精制纯化。其中，所述提取的方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等：所述纯化的方法包括水提醇沉、碱溶酸沉以及各种柱色谱纯化方法，如大孔树脂柱、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等。
在本发明一些实施方式中，所述药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂或防腐剂中的至少一种。
本发明第四个方面，在于提供达原饮在制备胶原蛋白合成抑制剂中的应用。
在于提供达原饮在体外抑制胶原蛋白合成中的应用。
在本发明一些实施方式中，所述胶原蛋白合成抑制剂为抑制纤维化过程中胶原的过度合成。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下组分的原料制成：槟榔、厚朴、草果仁、知母、白芍、黄芩、甘草片。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～18份、厚朴3～9份、草果仁1～5份、知母3～9份、白芍3～9份、黄芩3～9份、甘草1～5份。
在本发明一些实施方式中，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～10份、厚朴3～7份、草果仁1～4份、知母3～6份、白芍3～6份、黄芩3～6份、甘草1～4份。
在本发明一些实施方式中，所述抑制剂由包括所述的达原饮和药学上可接受的辅料制备而成。
在本发明一些实施方式中，所述抑制剂可按本领域常规方法制备。本发明所述抑制剂是各原料药粉碎后混合而成的组合物；或者各原料药混合后提取得到的提取物，或者各原料药单独提取后混合得到的提取物。任选的，提取物进一步精制纯化。其中，所述提取的方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等：所述纯化的方法包括水提醇沉、碱溶酸沉以及各种柱色谱纯化方法，如大孔树脂柱、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等。
在本发明一些实施方式中，所述药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂或防腐剂中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了达原饮在制备抑制EMT的药物中的应用。通过实验证明，达原饮可有效促进发生EMT的上皮细胞中CDH1基因和E-cad蛋白的表达，抑制发生EMT的上皮细胞中N-cad、Vimentin、α-SMA蛋白的表达。抑制发生EMT的肿瘤细胞迁移，降低肿瘤细胞迁移率。抑制肺纤维化过程中EMT的发生，降低肺组织中的羟脯氨酸含量，抑制纤维化过程中胶原蛋白的过度合成。即达原饮可通过抑制EMT用于预防和/或治疗EMT相关的疾病，为EMT相关疾病的预防和治疗提供新的可能。本发明所用的达原饮的质量可控、便于标准化生产，且安全可靠、对人体无毒副作用。
附图说明
图1为达原饮质谱图。
图2为达原饮混标质谱图。
图3为达原饮药理血清对TGF-β1诱导的A549细胞中EMT相关蛋白的影响；其中，A为Western blot显示目标蛋白的表达情况；B、C、D、E分别为ImageJ分析目标蛋白的相对表达量；图中，达原饮+为低剂量药理血清，达原饮++为中剂量药理血清，达原饮+++为高剂量药理血清，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图4为达原饮药理血清干预TGF-β1诱导的A549细胞迁移的结果；其中，A为不同诱导时间细胞迁移的情况；B为12h的细胞迁移率，C为18h的细胞迁移率；图中，达原饮+为低剂量药理血清，达原饮++为中剂量药理血清，达原饮+++为高剂量药理血清，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图5为达原饮对博来霉素造模至第14天的小鼠体重、肺脏质量和肺脏系数的影响；其中，A为小鼠体重，B为肺脏质量，C为肺脏系数；图中，达原饮+为低剂量组，达原饮++为中剂量组，达原饮+++为高剂量组，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图6为达原饮干预博来霉素造模至第14天小鼠肺组织中CDH1基因表达的结果，图中，达原饮+为低剂量组，达原饮++为中剂量组，达原饮+++为高剂量组，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图7为达原饮干预博来霉素造模至第14天小鼠肺组织中E-cad蛋白表达的结果；其中，A为Western blot显示E-cad蛋白的表达情况，B为ImageJ分析目标蛋白的相对表达量；图中，达原饮+为低剂量组，达原饮++为中剂量组，达原饮+++为高剂量组，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图8为达原饮干预博来霉素造模第14天小鼠肺组织中E-cad蛋白免疫荧光染色的结果(标尺为50μm)，图中，A为正常组，B为模型组，C为达原饮低剂量组，D为达原饮中剂量组，E为达原饮高剂量组，F为地塞米松组。
图9为达原饮干预博来霉素造模第14天小鼠肺组织中α-SMA蛋白免疫组织化学染色的结果(标尺为100μm)，图中，A为正常组，B为模型组，C为达原饮低剂量组，D为达原饮中剂量组，E为达原饮高剂量组，F为地塞米松组。
图10为博来霉素造模至第21天的小鼠肺组织的HE染色结果(标尺为60μm)，图中，A为正常组，B为模型组，C为高剂量达原饮组，D为地塞米松组。
图11为博来霉素造模至第21天的小鼠肺组织的Masson染色结果(标尺为60μm)，图中，A为正常组，B为模型组，C为高剂量达原饮组，D为地塞米松组。
图12为博来霉素造模至第21天的小鼠右肺组织的羟脯氨酸含量的检测结果，图中，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1
根据《经典名方开发指引》中达原饮组方剂量槟榔(7.46g)、生厚朴(3.73g)、炒草果仁(1.87g)、知母(3.73g)、白芍(3.73g)、黄芩(3.73g)、生甘草(1g)共七味，购于北京燕京饮片厂。称取5倍量的全方药材，10倍量去离子水煎煮两次，每次1h，合并水煎液，减压浓缩，定容至500mL。分别取三份20ml提取液，冷冻干燥(-60℃，真空度<50pa)，计算提取率，结果见表1，冻干粉制备工艺稳定，平均提取率为23.7±0.13％。剩余提取液进行冷冻干燥(-60℃，真空度<50pa)，得到达原饮冻干粉。
表1达原饮冻干粉提取率
取冻干粉10mg，溶于1mL去离子水中，制备成10mg/mL样品。标准品：厚朴酚、和厚朴酚、芒果苷、知母皂苷BⅡ、芍药苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、黄芩素、甘草苷、甘草酸，分别配置成40μg/mL液体，各取100μL混匀，制备混标。对冻干粉样品以及混标进行质谱分析，并与数据库对比。
结果如图1和图2显示：质谱得到172种化合物，经过筛选得到106种化合物，其中包括混标中的11种标准品。
实施例2
选取8周龄的SD大鼠，适应性喂养1周后，随机分为4组，分别为对照组、达原饮低剂量组、达原饮中剂量组和达原饮高剂量组，每组3只。按分组给予达原饮冻干粉水溶液(低剂量组0.43g/mL、中剂量组0.86g/mL、高剂量组1.72g/mL)灌胃(1.35mL/天)，每日1次，连续给药3天，对照组灌胃等体积饮用水，于末次灌胃1.5h后取血，制备得到达原饮药理血清。
TGF-β1(10ng/mL)诱导的A549细胞(即EMT细胞模型)给予含有10％对照血清或不同浓度的达原饮药理血清处理，48h后提取各组A549细胞的蛋白，进行Western blot检测。Western blot结果如图3显示：与模型组相比，达原饮高剂量组的大鼠药理血清能促进发生EMT的模型细胞中E-cad蛋白的表达(P＜0.01)，降低N-cad(P＜0.01)、Vimentin(P＜0.05)和α-SMA蛋白的表达量(P＜0.05)。
实施例3
人肺癌细胞(A549细胞)在TGF-β1的诱导下，失去上皮细胞特征向间充质细胞转化，使癌细胞具备迁移能力。用含有10％FBS的DMEM培养基正常培养A549细胞至对数生长期，以106个/孔接种至6孔板。待细胞贴壁后划痕，PBS清洗细胞三次，加入含有2.5％对照血清或不同浓度的达原饮药理血清(实施例2制得)的DMEM培养基处理，同时添加TGF-β1(10ug/mL)。37℃、5％的CO2培养0h、12h、18h拍摄记录细胞位置。用Image J统计细胞迁移率。
结果如图4所示：达原饮中、高剂量组的药理血清能够显著降低12h和18h模型细胞的迁移率(P＜0.01)。
实施例4
购置8周龄SPF级C57BL/6N雄性小鼠，适应饲养1周后，气管内滴注博来霉素(1.5mg/kg)进行造模。造模1天后，将小鼠随机分为模型组、达原饮低剂量组、达原饮中剂量组、达原饮高剂量组和阳性对照组。给药组按0.3mL/只/天灌胃达原饮冻干粉水溶液(达原饮低剂量组0.43g/mL、达原饮中剂量组0.86g/mL、达原饮高剂量组1.72g/mL)，阳性对照组腹腔注射地塞米松(2mg/kg)，模型组灌胃等体积饮用水，正常组常规饲养。连续给药13天后停止给药，分别于造模后第14天取材观察达原饮对肺纤维化小鼠EMT的影响，于造模后第21天取材观察达原饮对肺组织中羟脯氨酸含量的影响。
1.采用称重法测量肺脏质量和肺系数
于给药处理至造模后第14天，称量各组小鼠体重，腹腔注射戊巴比妥钠(55mg/kg)进行麻醉，腹主动脉取/放血后，取全肺称量肺湿重，计算肺脏系数＝肺湿重(g)/体重(g)*100％。结果如图5所示：造模后第14天，与模型组相比，达原饮高剂量组能下调肺纤维化小鼠肺脏质量(P＜0.05)和肺脏系数(P＜0.05)。
2.采用qPCR分析各组小鼠肺组织中CDH1基因的表达情况
给药处理至造模后第14天，取各组小鼠右肺组织一叶，用RNA提取试剂盒(中国Accurate公司，批号：A4A2039)提取总RNA，用RNA反转录试剂盒(中国Accurate公司，批号：A4A1006)反转录为cDNA，使用Premix Ex TaqTM试剂盒(中国Accurate公司，批号：A4A1954)进行PCR扩增，以上实验均按照说明书操作。引物由生工生物工程公司(中国Sangon Biotech公司)合成，序列如下：
CDH1上游引物：5’-CAGTTCCGAGGTCTACACCTT-3’(SEQ ID NO:1)。
CDH1下游引物：5’-TGAATCGGGAGTCTTCCGAAAA-3’(SEQ ID NO:2)。
GAPDH上游引物；5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’(SEQ ID NO:3)。
GAPDH下游引物；5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’(SEQ ID NO:4)。
PCR扩增反应条件为：预变性(95℃，30s)，PCR扩增40个循环(95℃、5s，60℃、30s)。实验结果采用mRNA相对表达量＝2-ΔΔCT计算。
qPCR分析结果如图6所示：给药至造模第14天，与模型组相比，达原饮高剂量组促进肺纤维化小鼠肺的组织中CDH1基因的表达(P＜0.01)。
3.采用Western blot和免疫荧光染色分析各组小鼠肺组织中E-Cad蛋白的表达情况
给药处理至造模后第14天，取各组小鼠右肺组织一叶，经组织匀浆仪裂解后，4℃、13000rpm离心5min。取裂解液上清，经BCA试剂盒测定(中国Biorigin，批号：20230104)蛋白含量，加入5×SDS上样缓冲液，95℃金属浴加热5min，制备Western blot样品。Westernblot结果如图7所示：与模型组相比，达原饮高剂量能够促进肺纤维化小鼠肺组织中E-cad蛋白的表达(P＜0.01)。
取各组小鼠左肺叶灌注固定液(0.1mL/叶)。固定后的肺组织行石蜡包埋，按3μm厚度制备肺组织切片。对各组肺组织切片进行常规免疫荧光染色，FV3000激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司)扫描图像。结果如图8所示：给药至造模第14天，对照组的E-cad蛋白广泛表达于正常肺泡隔的上皮细胞；与对照组相比，模型组的肺泡上皮细胞大量丢失E-Cad蛋白；与模型组相比，随着给药剂量增加达原饮能够促进肺纤维化小鼠肺泡上皮细胞中E-Cad蛋白的表达。
4.采用免疫组织化学染色法观察α-SMA蛋白在肺组织中的表达情况
给药处理至造模后第14天，取各组小鼠的左肺组织切片，进行常规免疫组织化学染色，DM6000B显微镜(德国Leica公司)扫描病理结果，观察肺组织中α-SMA蛋白的表达情况。结果如图9所示：模型组实变区中α-SMA蛋白呈强阳性表达，随着达原饮给药剂量增加α-SMA蛋白的阳性水平降低。
5.采用HE染色和Masson染色观察病理进展情况
第14天停止灌胃高剂量达原饮后，至造模第21天取各组小鼠的左肺组织切片，进行常规HE染色和Masson染色，DM6000B显微镜(德国Leica公司)扫描病理结果，观察肺纤维化进展。HE染色结果如图10所示：至造模第21天，正常组小鼠肺泡结构完整，肺间隔中有丰富的气-血屏障；模型组实变区内可见大量间质细胞增生，肺泡间隔增厚。高剂量达原饮能够缓解肺间质增生。Masson染色结果如图11所示：至造模第21天，正常组小鼠肺泡隔中较少观察到胶原纤维(蓝色)；模型组小鼠的实变区内胶原纤维持续沉积，造成实变区大面积蓝染，高剂量达原饮能够减少实变区内胶原纤维的沉积。
6.采用羟脯氨酸检测法分析肺组织中的胶原含量
羟脯氨酸为胶原纤维所特有，测定肺组织中的羟脯氨酸含量，可以评估肺纤维化的程度。第14天停止灌胃高剂量达原饮后，至造模第21天取各组小鼠两叶右肺组织加入500μL组织裂解液，匀浆后取50μL，加12mol/mL盐酸50μL，121℃加热2h，冷却后用10mol/mL氢氧化钠调节pH至6～8范围。按试剂盒(中国solarbio，批号：20230404)说明操作加入检测试剂，60℃水浴15min，冷却，3500rpm离心10min，取上清用800TS酶标仪(美国BioTek公司)检测560nm的吸光度，并根据标准曲线计算样品中的羟脯氨酸含量。
结果如图12所示：与模型组相比，高剂量达原饮能降低肺纤维化小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量(P＜0.01)，抑制纤维化过程中胶原蛋白的合成。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.达原饮在制备抑制EMT的药物中的应用，所述达原饮由包括以下组分的原料制成：槟榔、厚朴、草果仁、知母、白芍、黄芩、甘草片。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述达原饮由包括以下重量份的组分的原料制成：槟榔6～18份、厚朴3～9份、草果仁1～5份、知母3～9份、白芍3～9份、黄芩3～9份、甘草1～5份。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物促进发生EMT的上皮细胞中CDH1基因和E-cad蛋白的表达，和/或抑制发生EMT的上皮细胞中N-cad、Vimentin、α-SMA蛋白的表达，和/或抑制发生EMT的肿瘤细胞迁移，降低细胞迁移，和/或抑制肺纤维化过程中EMT的发生，抑制胶原的合成。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物由包括权利要求1～3中任一项所述的达原饮和药学上可接受的辅料制备而成。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂或防腐剂中的至少一种。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物是各原料药粉碎后混合而成的组合物；或者各原料药混合后提取得到的提取物，或者各原料药单独提取后混合得到的提取物。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为汤剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、散剂和膏剂中的一种。
8.达原饮在(1)或(2)中的应用：
(1)制备CDH1基因和E-cad蛋白促进剂；
(2)促进CDH1基因和E-cad蛋白的表达。
9.达原饮在(3)或(4)中的应用：
(3)制备N-cad抑制剂或Vimentin抑制剂；
(4)抑制N-cad或Vimentin的表达。
10.达原饮在(5)或(6)中的应用：
(5)制备胶原蛋白合成抑制剂；
(6)抑制胶原蛋白的合成。
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