CN117603893A - 一种重组bcg菌株及其制备方法与应用 - Google Patents

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刘海灿
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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种重组BCG菌株及其制备方法与应用。本发明的重组BCG菌株，相比出发菌株，过表达ESAT‑6、CFP‑10、nPPE18和nPstS1蛋白，ESAT‑6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，CFP‑10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，nPPE18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，nPstS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明的重组BCG菌株增强了BCG的免疫保护效能，可作为新型TB预防性疫苗。

Description

一种重组BCG菌株及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种重组BCG菌株及其制备方法与应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)主要是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染引起的慢性传染性疾病，发病率高，对人类健康造成巨大威胁。疫苗是有效预防传染病流行和传播、降低传染病的发病率与病死率的重要手段之一。
接种疫苗是控制传染病最经济最有效的策略，目前唯一被批准应用的TB预防性疫苗卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)可降低婴儿和儿童患结核病的风险，但预防成年人结核病的效果差异较大，且不被推荐用于免疫缺陷人群，在不同人群中的保护作用有限，难以有效控制结核病的流行。截至目前，共有16种抗结核病候选疫苗正在进行临床试验，根据研发技术可分为重组卡介苗、蛋白/佐剂疫苗、病毒载体疫苗和分枝杆菌灭活疫苗。
蛋白/佐剂和病毒载体疫苗的抗原数量是有限的，而Mtb蛋白成分和感染人体后的状态较为复杂，使其难以达到较优的保护效果。灭活疫苗由于在体内不能复制，免疫原性较低，需要反复接种，其成本较高。BCG作为一种减毒活疫苗，其免疫效果主要依靠有效的免疫成分以及其在体内的复制能力和持久性。但BCG的保护效果从青少年时期开始减弱，对成人结核病几乎无保护预防作用，并且成年人再接种BCG是否有效存在一定的争议性。BCG对成年人保护效果降低的主要原因可能包括：1)在长期传代过程中，BCG丢失一些重要的免疫优势抗原基因，和Mtb相比，这些缺失基因区域被称为差异区域(Region of Differences,RD)，如esxB,esxA等；2)非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria，NTM)感染，预先在人体内致敏，和卡介苗存在交叉免疫，抑制BCG在人体内的复制，导致定植能力下降，致使其抗Mtb感染免疫保护效能降低。
在BCG的基础上，构建重组BCG以弥补BCG免疫保护效果不佳和持续时效较短等缺点，是重组BCG作为结核新疫苗研发的重要方向。重组BCG采用分子克隆技术，将BCG缺失的有效免疫优势抗原基因或者低表达免疫优势抗原基因重组进入BCG，达到高效表达，进一步增强BCG的免疫保护作用，同时弥补其免疫效果时长不足的缺点，以进一步提高BCG在儿童人群的免疫保护作用，并延长其对成年人群的保护效果。
因此构建含有多个组分抗原的重组BCG成为近年来的研发趋势。王等人构建的包含融合抗原的rBCG::AB在动物模型中显示出比包含单抗原的rBCG::Ag85A和rBCG::Ag85B更好的免疫效果；同样，袁等人构建的共表达Ag85B和HspX的rBCG::XB在小鼠中显示出比表达单抗原的rBCG::85B和rBCG::X提供较优的免疫原性和保护效果。另外，删除BCG的脲酶C基因，并转入李斯特菌Hly基因构建的VPM1002疫苗，降低了吞噬溶酶体的pH值，增加了抗原提呈细胞吞噬和交叉提呈的能力，诱导了更强的免疫应答和保护作用，目前正在处于临床Ⅲ期，有望成为BCG的替代疫苗。rBCG30是第一个进入临床试验的重组BCG疫苗，其表达并分泌大量的30kD蛋白Ag85B，在动物模型中显示出比BCG更优的保护效果。临床Ⅰ期试验结果显示，rBCG30诱导Ag85B特异性CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ，并产生TEM和TCM细胞。但rBCG30临床Ⅰ期试验结束后，自2008年长时间未见在预防TB方向的研究进展，可能由于导入单一抗原的重组BCG，难以达到理想的增强BCG的保护效果。此外，在BCG中导入免疫原性较优的抗原，也并不一定能提高BCG的效果，有时甚至还会降低原始BCG的效果，如可参见Marques-Neto LM,Piwowarska Z,Kanno AI,Moraes L,Trentini MM,Rodriguez D,et al.Thirtyyears of recombinant BCG:new trends for a centenary vaccine.Expert RevVaccines.2021；20:1001-11和张灵霞,吴雪琼,董恩军.Ag85a-卡介苗重组疫苗对结核病预防及治疗作用的研究.中国现代医学杂志.2009；19:1948-51。
因此，有必要对重组BCG进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的可提高保护效果的重组BCG菌株及其应用。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种重组BCG菌株，相比出发菌株，所述重组BCG菌株过表达ESAT-6、CFP-10、nPPE18和nPstS1蛋白，ESAT-6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，CFP-10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，nPPE18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，nPstS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选，本发明的所述重组BCG菌株中过表达融合蛋白EPCP009，所述融合蛋白EPCP009的氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示。
本发明优选分别将ESAT-6、nPPE18、CFP-10和nPstS1四种抗原组分通过柔性连接臂顺次连接形成一个融合抗原使用。
本发明的重组BCG菌株，其基因组中包含esxA、esxB、nPPE18和nPstS1基因，esxA基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示、esxB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示、nPPE18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示、nPstS1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
优选，所述重组BCG菌株的基因组中包含融合蛋白EPCP009的编码基因，所述融合蛋白EPCP009的编码基因如SEQ ID No.10所示。
本发明中esxA、nPPE18、esxB和nPstS1四种结核分枝杆菌基因序列间通过特定linker连接，组成融合蛋白EPCP009的编码基因。
本发明发现在BCG菌株上导入esxA、nPPE18、esxB和nPstS1基因(使其表达ESAT-6、nPPE18、CFP-10和nPstS1四个抗原)构建的新型重组卡介苗rBCG-EPCP009显著提高了BCG的免疫原性和体外保护效果，具有发展为新型TB预防性疫苗的潜力，也为以BCG为基础，采用重组卡介苗研发结核新疫苗提供了新的思路。
具体地，ESAT6和CFP10属于RD1区抗原，属于早期分泌抗原，存在于Mtb的培养上清液中，可被T细胞识别，刺激产生保护性细胞因子IFN-γ，被广泛应用于TB疫苗的前期研发。Rv1196基因编码的PPE18蛋白，体外实验证明能刺激人类T细胞的快速增殖，可作为潜在的抗TB疫苗成分。Rv0934基因编码磷酸盐特异性运输底物结合蛋白-1(PstS1)，可诱导小鼠CD8+T细胞的激活以及产生Th1和Th17免疫保护反应。然而，PPE18和PstS1蛋白均为BCG中低表达蛋白。为获得比BCG更有效的TB新疫苗，本发明将表达ESAT-6、nPPE18、CFP-10和nPstS1免疫优势抗原的esxA、nPPE18、esxB和nPstS1四个基因通过基因工程技术，使用pMV361质粒将其导入BCG构建重组卡介苗，即rBCG-EPCP009。通过免疫BALB/c小鼠，分析母本BCG和重组卡介苗rBCG-EPCP009在免疫8周和12周时的免疫应答水平，体外分枝杆菌生长抑制能力，以及通过病理切片和定植能力分析疫苗的安全性。
优选，所述出发菌株为BCG-China。
本发明还提供一种构建上述重组BCG菌株的方法，包括在出发菌株中转入含有esxA、esxB、nPPE18和nPstS1基因的质粒的步骤。优选，包括在出发菌株中转入含有融合蛋白EPCP009的编码基因的质粒的步骤。
本发明方法中，在转入质粒后，还包括在含有卡那霉素抗性的7H10平板上筛选阳性克隆，通过PCR验证鉴定，获得重组的阳性BCG菌株的步骤。
本发明优选，所述质粒构建时采用pMV361穿梭载体。
本发明的重组BCG菌株的构建方法具体包括重组整合质粒的构建、BCG感受态细胞的转化和筛选。
本发明重组BCG菌株效果的评价可通过检测其细胞因子、抗体效价、组织病理、体内定植能力和体外保护性来实现。
本发明再提供上述重组BCG菌株或上述方法构建获得的重组BCG菌株在制备预防结核分枝杆菌感染的疫苗或治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物中的应用。
本发明另提供一种预防结核病的疫苗，其包括上述重组BCG菌株或上述方法构建获得的重组BCG菌株。
本发明的疫苗，还包括佐剂。
本发明的有益效果至少在于：
本发明构建的过表达ESAT-6、CFP-10、nPPE18和nPstS1的重组卡介苗rBCG-EP009诱导小鼠产生高水平的PPD和EPCP009抗原特异性的偏向Th1型和Th17型细胞免疫应答，增强了BCG的免疫保护效能，具有发展为新型TB预防性疫苗的潜力。具体表现为产生高水平且持久的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-17和GM-CSF细胞因子，和显著升高的IFN-γ、IL-2和TNF-α的CD4T+细胞百分比；rBCG-EP009在脾脏内的定植能力优于BCG组，未发现在肝脏内定植，且其在免疫小鼠之后，脾脏、肝脏和肺脏均未发现明显的病变，说明其安全性和BCG组相当；MGIA试验表明，rBCG-EP009免疫小鼠的脾细胞在体外能够明显抑制Mtb的生长，其短期的抑菌能力优于BCG组。
优选，本发明利用BCG-China株作为制备基因重组卡介苗rBCG-EP009的母株，有利于rBCG-rBCG-EP009疫苗候选后期开展临床试验和推广。
附图说明
图1为本发明实施例1中T细胞表位预测结果。图中A为nPPE18蛋白的T细胞表位分布图；B为nPstS1蛋白的T细胞表位分布图。
图2为本发明实施例2中卡介苗rBCG-EP009的构建和表达验证结果以及实施例4中的EPCP009蛋白检测结果。图中A为pMV361-EPCP009重组质粒示意图。B为rBCG-EP009基因的验证。泳道M：DNA标准分子量；泳道1：BCG的基因组PCR产物；泳道2：rBCG-EP009的基因组PCR产物。C为通过qRT-PCR检测rBCG-EP009中esxA、esxB、nPPE18、nPstS1的mRNA水平。D为EPCP009蛋白检测电泳结果，泳道M：预染的蛋白标准分子量；泳道1：EPCP009蛋白。
图3为本发明实施例3中的重组卡介苗rBCG-EP009的免疫方案和检测指标示意图。图中A为检测方法；B为检测指标。
图4为本发明实施例4中rBCG-EP009免疫BALB/c小鼠8周和12周时的抗体水平。图中的A为BCG和rBCG-EP009免疫8周后的IgG、IgG1、IgG2a抗体滴度和IgG2a/IgG1比值；B为BCG和rBCG-EP009免疫12周后的IgG、IgG1、IgG2a抗体滴度和IgG2a/IgG1比值；图中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns代表差异不显著。
图5为本发明实施例4中rBCG-EP009诱导小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的斑点数。图中A、C分别为各组免疫8周时，小鼠脾淋巴细胞经免疫PPD或EPCP009抗原刺激后分泌IFN-γ的细胞数差异；图中B、D分别为各组免疫8周时，小鼠脾淋巴细胞经免疫PPD或EPCP009抗原刺激后分泌IL-4的细胞数差异；图中E、G分别为各组免疫12周时，小鼠脾淋巴细胞经免疫PPD或EPCP009抗原刺激后分泌IFN-γ的细胞数差异；图中F、H分别为各组免疫12周时，小鼠脾淋巴细胞经免疫PPD或EPCP009抗原刺激后分泌IL-4的细胞数差异；图中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns代表差异不显著。
图6为本发明实施例4中rBCG-EP009诱导小鼠脾淋巴细胞分泌的PPD特异性细胞因子检测结果。图中的A-I依次为BCG和rBCG-EP009免疫BALB/c小鼠8周和12周时脾淋巴细胞经PPD刺激分泌的细胞因子水平IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-12(IL-12p70)、GM-CSF、IL-17、IL-4、IL-6、IL-10；图中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns代表差异不显著。
图7为本发明实施例4中rBCG-EP009诱导小鼠脾淋巴细胞分泌的EPCP009特异性细胞因子检测结果。图中的A-I依次为BCG和rBCG-EP009免疫BALB/c小鼠8周和12周时脾淋巴细胞经EPCP009抗原刺激分泌的细胞因子水平IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-12(IL-12p70)、GM-CSF、IL-17、IL-4、IL-6、IL-10；图中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns代表差异不显著。
图8为本发明实施例4中rBCG-EP009诱导小鼠脾淋巴细胞分泌不同细胞因子的CD4T+细胞比例检测结果。图中的A-C依次为BCG和rBCG-EP009免疫BALB/c小鼠8周后脾淋巴细胞经PPD或EPCP009抗原刺激分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的CD4T+细胞占总CD4T+细胞的比例；D-F依次为BCG和rBCG-EP009免疫BALB/c小鼠12周时脾淋巴细胞经PPD或EPCP009抗原刺激分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的CD4T+细胞占总CD4T+细胞的比例。图中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns代表差异不显著。
图9为本发明实施例5中BCG和rBCG-EP009免疫小鼠8周和12周时在脾脏和肺脏内的定植情况。图中的A-B依次为BCG和rBCG-EP009免疫BALB/c小鼠8周和12周后，脾脏和肺脏经研磨涂板之后，计算BCG和rBCG-EP009在小鼠脾脏(A)和肺脏(B)内的活菌数量；图中**P<0.01，***P<0.001，ns代表差异不显著。
图10为本发明实施例6中BCG和rBCG-EP009免疫小鼠8周时肝、脾、肺脏器病理切片和肺脏的病理评分。图中A-C依次为肝、脾、肺脏器病理切片结果，D为肺脏组织病理评分；图中ns代表差异不显著。
图11为本发明实施例7中各免疫组小鼠脾细胞体外抑制结核分枝杆菌生长的差异结果；图中，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，ns代表差异不显著。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
本发明具体实施方式部分用于改造的出发菌株为BCG中国株(BCG-China)，购自中国食品药品检定研究院。
实施例1T细胞表位预测及分析
在美国国家生物技术信息中心NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的数据库中，检索并下载结核分枝杆菌的esxA，esxB，PPE18和PstS1基因序列。使用TEpredict(http://tepredict.sourceforge.net/)和IEDB(http://tools.iedb.org/mhci/)等生物信息学软件预测和筛选各个基因中能与人HLA-A02型等位基因(包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206基序)或HLA-DRB1型等位基因结合的免疫优势抗原Th和CTL细胞表位，对所有表位肽通过干扰素γ释放试验实验(IGRA)和动物免疫进行了免疫原性验证。将T细胞表位聚集区域的基因进行连接，构建可高效表达T细胞集中区抗原的基因片段，结果如图1所示。在PPE18基因中，富含T细胞表位集中区的位置于氨基酸第201-300位，形成新的亚单位蛋白，命名为nPPE18；在PstS1基因中，富含T细胞表位集中区的位置于氨基酸第57-135位和268-373位两个区域，形成新的亚单位蛋白，命名为nPstS1。
实施例2重组卡介苗的构建和表达验证
1、BCG感受态的制备
从-80℃冰箱中取出冻存的BCG中国株，于无菌条件下取200μL菌液接种于200mL的7H9液体培养基中(含有0.2％甘油，0.05％吐温80，10％的OADC)置于37℃培养箱中静置培养；培养3周左右，待菌液生长至对数期(菌液吸光度OD600约为0.6～0.8之间)，收集菌体。首先，将培养之后的菌液放置冰上冰浴1h，然后于4000rpm、4℃条件下离心15min，弃去上清。加入40mL高压灭菌之后预冷的10％(v/v)的甘油重悬菌体，4000rpm、4℃离心15min，弃去上清，收集菌体，以上步骤重复3次。最后加入5mL高压灭菌的10％(v/v)的甘油重悬菌体，使菌体重新悬浮，即为BCG感受态细胞。
2、重组卡介苗rBCG-EP009的构建
(1)含有EPCP009融合抗原基因的质粒pUC57-EPCP009由北京擎科生物技术有限公司构建，具体在载体pUC57的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点处连接EPCP009基因(SEQ ID No.10)。
(2)对含有EPCP009融合抗原基因的质粒pUC57-EPCP009，使用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，同时利用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶对pMV361空载体(购于上海晶诺生物科技有限公司)进行双酶切。酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收后利用T4 DNA连接酶连接，连接条件为25℃、30min，获得pMV361-EPCP009质粒，重组质粒示意图见图2中的A。对pMV361-EPCP009质粒进行酶切验证。将pMV361-EPCP009质粒转化入DH5α中扩增，对质粒进行提取纯化。从冰箱取出制备好的BCG感受态，冰上融化；将10μL带有EPCP009目的基因的pMV361穿梭质粒，加入200μL的BCG感受态中，冰上静置10min后，将全部液体转移至电转杯中；电转条件为：25kv，25μF，1000Ω，电击转化；将电转之后的菌液转移至1.5mL无菌EP管，加入800μL的7H9液体培养基，37℃、180rpm摇床中复苏培养24h；将复苏之后的菌液室温4000rpm离心10min，弃去400μL液体，吸取200μL菌液涂布于含有25μg/mL卡那抗性的7H10平板上进行培养，筛选阳性克隆，获得重组卡介苗rBCG-EP009。根据整合位点分别在BCG和pMV361上设计上游和下游引物，通过基础PCR扩增验证目的基因的整合，整合引物见表1中的SEQ ID No.11-12，扩增产物验证电泳结果见图2中的B。
3、重组BCG总RNA的提取
分别收集37℃培养3～4周之后的BCG和rBCG-EP009菌液2mL，4000rpm离心10min，弃上清，用50μL的PBS重悬菌体，并转移至含有玻璃珠的灭菌离心管中。于离心管中加入200μL的TE，接着加入100μL的溶菌酶；用漩涡振荡器振荡5min,冰上静置5min,重复3次；在离心管中加入1mL的Trizol，振荡5min,冰上静置5min，接着加入300μL的氯仿；漩涡振荡器振荡1min，冰上静置5min，然后在4℃、12000rpm条件下低温离心15min；吸取上层水相转移至新的1.5mL的EP管中，并加入等体积的异丙醇，-80℃过夜；取出样品于冰上融化，然后于4℃、12000rpm条件下离心15min，弃去上清，加入1mL预冷的75％的乙醇，颠倒混匀离心管6～8次；4℃，12000rpm离心15min，尽量弃去离心管中的液体，然后室温放置，待离心管中的乙醇挥发完之后，加入30μL的无RNase水溶解洗脱RNA，测定RNA的OD260和OD280，若OD260/OD280的比值应在1.7～2.0之间，初步判断提取的RNA为纯净样品，并冻存于-80℃冰箱备用。同时，将提取的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后若在凝胶上观察到三条明显的条带，分别为原核生物核糖体所含的5S、16S及23SrRNA，则说明提取的RNA完整性较好。
4、引物的设计和合成
根据H37Rv标准株(H37Rv，ATCC27294)的esxA、esxB、nPPE18、nPstS1和16s基因序列，使用PRIMER 5设计qRT-PCR的引物，引物序列见表1。引物序列由北京擎科生物技术有限公司合成。将其稀释成100μM的储存液于-20℃保存备用，使用工作液浓度为10μM。
表1重组BCG验证的引物序列(依次为SEQ ID No.11-22)
5、逆转录
根据北京全式金生物公司逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录成cDNA。逆转录的反应体系如下表2。
表2
反应条件：25℃孵育10min后，42℃孵育15min。逆转录产物用于接下来的qPCR。
6、qRT-PCR反应
使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的荧光定量SYBR Green qPCR反应试剂盒进行PCR反应，检测esxA、esxB、nPPE18、nPstS1的mRNA水平。反应体系如下表3。
表3
qPCR反应条件：94℃10min；94℃5s,55℃15s,72℃10s,40循环；72℃10min；4℃终止。
7、结果处理
归一化处理：ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因；矫正表达：ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt对照组；基因相对表达量＝2-ΔΔCt。
通过qRT-PCR检测的rBCG-EP009中esxA、esxB、nPPE18、nPstS1的mRNA水平结果见图2中的C，以16s为内参对照，使用2-ΔΔCT方法计算基因表达的增加倍数。
实施例3重组卡介苗rBCG-EP009的动物免疫
1、菌液的制备
在P2实验室于无菌条件下，用接种环刮取罗氏培养基上生长良好的BCG和rBCG-EP009新鲜菌落于超声分散管中，向管中加入1mL的PBS，使用超声分散仪分散菌体，静置10min，取上面均匀分散的菌液测其OD600，并调整其OD600的值为1。将菌液按照100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释，每个稀释度取50μL均匀涂布于7H10平板上，每个梯度设置两个重复。两周后对其菌落进行计数，并计算OD600＝1的菌液对应的菌落个数。依据计算，1OD＝5×106/mL。
2、实验动物的免疫
选取6～8周龄SPF级别的雌性BALB/c小鼠为动物实验模型，共72只。如图3所示，根据实验设计小鼠随机分为三组：PBS阴性对照组、BCG阳性对照组、rBCG-EP009免疫组，每组24只，在8周和12周两个时间点进行检测，其中每个时间点取6只用于免疫学指标评价，6只用于安全性评价。采用皮内多点的免疫方式进行免疫(1×106CFU/200μL,200μL/只)，阴性对照组采用皮内多点的方式免疫200μL的PBS。于免疫8周和12周后，分别进行眼眶取血，并麻醉处死小鼠，6只小鼠分离脾脏用于免疫学评价，6只小鼠分离肝脏、脾脏和肺脏用于病理分析和菌落定植分析。
重组卡介苗rBCG-EP009的免疫方案和检测指标见图3。
实施例4重组卡介苗rBCG-EP009的免疫原性评价
1、ELISA检测小鼠血清特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体
将收集的血液室温条件下静置2h，待血液凝固后于4℃，4000rpm条件下离心10min收集血清，分装后冻存于-20℃冰箱。ELISA检测血清中抗原特异性的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度，具体步骤如下：
1)将PPD和EPCP009蛋白(核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，使用大肠杆菌BL21(DE3)外源性表达EPCP009蛋白用于重组rBCG-EP009的EPCP009特异性效应指标检测，表达后其电泳验证结果见图2中的D)分别用碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)稀释至2μg/mL；
2)稀释后的蛋白包被96孔酶标板，每孔100μL，包被抗原量为200ng，置于4℃孵育过夜；
3)次日，用PBS-T洗板5次，每孔加入100μL 3％的BSA于37℃条件封闭2h；
4)每孔加200μL的PBS-T，洗涤5次，每次静置2min，甩去液体，用吸水纸拍干水分；
5)使用PBS(10mmol/L,pH 7.4)将各组血清按2倍梯度倍比稀释，每孔中加入100μL稀释后的血清，每个样本做三个复孔，37℃孵育1h；
6)每孔加200μL的PBS-T，洗涤5次，每次静置2min，甩去液体，用吸水纸拍干水分；
7)每孔加入100μL的1：5000倍稀释的HRP标记的IgG、IgG1、IgG2a抗体，37℃孵育1h；
8)每孔加200μL的PBS-T，洗涤5次，每次静置2min，甩去液体，用吸水纸拍干水分；
9)加入TMB底物显色液，置于37℃温箱中避光反应15min；
10)每孔加入100μL终止液(2M的H2SO4)，终止显色；
11)使用酶标仪，检测波长450nm的吸光度值；
12)以PBS组为对照组，OD≥2.1×OD(对照组)判读为阳性；
13)抗体滴度以最高稀释度的倒数表示，结果以log2(抗体滴度)显示。
rBCG-EP009免疫BALB/c小鼠8周和12周时的抗体水平检测结果分别见图4中的A(8周)和B(12周)。无论是免疫8周时，还是12周时，rBCG-EP009组均产生高水平的PPD和EPCP009特异性的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度，显著高于BCG组(P<0.05)。另外，在免疫8周和12周时，rBCG-EP009组的IgG2a/IgG1比值均大于1，说明rBCG-EP009组诱导偏向Th1型的免疫应答；且在免疫8周时的PPD和EPCP009特异性的IgG2a/IgG1稍高于BCG组，说明免疫8周时，rBCG-EP009诱导比BCG更高水平的Th1型免疫应答。
2、脾脏单个淋巴细胞的分离和制备
1)麻醉小鼠，无菌操作摘取小鼠脾脏组织，去除脂肪组织，浸泡于完全培养基中；
2)提前将小鼠淋巴细胞分离液(购自深圳市达科为生物工程有限公司)取出平衡至室温，在35mm细胞培养皿中放入4mL小鼠淋巴细胞分离液；
3)将70μm细胞筛网放在培养皿中，把脾脏组织剪碎并研磨，将悬有脾细胞的分离液转移至15mL离心管中，并在其液面以上覆盖500μL RPMI1640培养基，保持液面分界明显；
4)将离心管转移至水平转子离心机，设置较慢的加速和减速档，配平后室温800g离心30min；
5)将离心后试管中部形成的白膜层单个淋巴细胞小心吸出，并加入10mLRPMI1640培养基，来回颠倒混匀，置于水平转子离心机300g离心5min，弃上清；
6)加入完全培养基调节淋巴细胞浓度至2×107个/mL备用。
3、流式细胞术结合胞内细胞因子染色检测分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ的CD4T+淋巴细胞
3.1抗原刺激
1)根据样本数量配制刺激剂及阻断剂混合液：100μL/孔，含PPD或EPCP009抗原20μg/mL,CD28抗体2μg/mL,CD49d抗体2μg/mL,BFA阻断剂0.2μL；
2)取100μL细胞悬液2×106个细胞接种于96孔培养板，加入配制好的刺激混合液100μL，终浓度：PPD或EPCP009抗原10μg/mL,CD28抗体1μg/mL,CD49 d抗体1μg/mL，BFA阻断剂1000倍稀释，混匀后37℃、5％CO2培养箱中刺激培养细胞8h；
3)同时设置两孔阳性对照孔，加入100μL非特异性刺激剂Cell Stimula-tionCocktail(with BFA)500×加入孔中与其他样本同时刺激培养；
4)收集细胞转移至5mL流式管中进行染色操作。
3.2流式染色步骤
1)收集培养孔中淋巴细胞至5mL 12×75mm流式管，加入2mL PBS，混匀后300g离心5min弃上清；
2)加入稀释配制好的Ghost DyeTMViolet 510细胞死活染液1mL，混匀后室温避光孵育15min；
3)加入2mL流式染色洗液，混匀后300g离心5min弃上清；
4)重悬细胞至100uL流式染色洗液中，加入细胞表面抗原的荧光标记抗体(CD3、CD4)，混匀后室温避光孵育20min；
5)加入2mL流式染色洗液，混匀后300g离心5min弃上清；
6)每管加入0.5mL细胞固定液，混匀后室温避光孵育20min；
7)300g离心5min弃上清；
8)将10×胞浆破膜洗液用去离子水稀释为1×工作液，每管加入2mL 1×胞浆破膜洗液，混匀后300g离心5min弃上清；
9)每管再次加入2mL 1×胞浆破膜洗液，混匀后300g离心5min弃上清；
10)加入胞浆抗原的荧光标记抗体(IL-2、TNF-α、IFN-γ)，混匀后室温避光孵育30min；
11)每管加入2mL 1×胞浆破膜洗液，混匀后350g离心5min弃上清；
12)每管加入2mL流式染色洗液，混匀后300g离心5min弃上清
13)加入0.5mL细胞染色洗液重悬细胞待上流式细胞仪获取分析；
14)数据采用FACSDiva8.0软件获取及分析。
rBCG-EP009诱导小鼠脾淋巴细胞分泌不同细胞因子的CD4T+细胞比例检测结果见图8。免疫8周时，无论是PPD刺激，还是EPCP009刺激，rBCG-EP009组分泌总IFN-γ、IL-2或TNF-α的CD4T+细胞占总的CD4T+细胞显著高于PBS组和BCG组(P<0.05)。随着时间的延长，在免疫12周时，rBCG-EP009组产生的PPD特异性的总IFN-γ、IL-2或TNF-α的CD4T+细胞显著高于PBS组和BCG组(P<0.05)；产生的EPCP009特异性IFN-γ和TNF-α的CD4T+细胞显著高于PBS组和BCG组(P<0.05)；rBCG-EP009组诱导产生和BCG组相当的EPCP009特异性IL-2的CD4T+细胞。
4、ELISPOT检测小鼠脾细胞中PPD和EPCP009特异性的IFN-γ和IL-4
将PPD和EPCP009抗原分别稀释至20ng/μL，参照ELISPOT试剂盒说明书进行抗原特异性IFN-γ和IL-4的检测。每只小鼠设置三个检测孔：两个抗原检测孔为技术重复和一个阳性对照孔。抗原检测孔中加入10μL的刺激物，阳性对照孔中加入10μL的20ng/μL的刀豆蛋白。
rBCG-EP009诱导小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的斑点数检测结果分别见图5中的A-D(8周)和E-H(12周)。免疫8周时：和BCG组相比，rBCG-EP009组的PPD特异性INF-γ和IL-4水平均高于BCG组，差异均有统计学意义(P均<0.01)。和PBS组相比，BCG组未产生EPCP009抗原特异性IFN-γ；rBCG-EP009组产生显著高于PBS组和BCG组的EPCP009抗原特异性IFN-γ(P均<0.05)。免疫12周时：和PBS组相比，BCG组和rBCG-EP009组的PPD特异性INF-γ和IL-4水平均显著增高，差异有统计学意义(P均<0.01)。和PBS组相比，BCG组未产生EPCP009特异性的INF-γ和IL-4；rBCG-EP009组产生显著升高的EPCP009特异性的INF-γ和IL-4，差异有统计学意义(P均<0.05)。和BCG相比，rBCG-EP009组产生显著升高的PPD和EPCP009特异性的INF-γ；rBCG-EP009产生的PPD特异性的IL-4低于BCG组(P<0.05)，产生的EPCP009特异性的IL-4和BCG组相当。rBCG-EP009组产生的PPD特异性IFN-γ的SFC大于600，而产生IL-4的SFC小于100，说明rBCG-EP009组产生持久性偏向Th1型的免疫应答。
5、Luminex检测小鼠脾细胞上清中的抗原特异性细胞因子
每孔加入100μL脾细胞，以1×105cells/well铺于96孔细胞培养板中，每孔分别加入50μL的10μgPPD或EPCP009蛋白，将脾细胞与相应的刺激物在37℃，5％的CO2培养箱中孵育24h，4℃条件下，1000g离心15min，收集细胞上清，并根据制造商的说明，使用定制的Luminex试剂盒检测IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12、GM-CSF、IL-17、IL-4、IL-6和IL-10九种细胞因子的表达水平。简述如下：
1)将标准品混匀，按照1:4梯度稀释，每个标准品设置7个梯度和1个空白，同时设置两个复孔。
2)在每孔中加入50μL标准品或样品后，加入50μL稀释的微球混合物；
3)室温条件下，800rpm摇床上混匀震荡2h。
4)将微孔板放置磁力架上，吸出孔内的液体。
5)加入100μL洗涤液，重复清洗三次。
6)加入50μL稀释的生物素抗体，室温条件下，放入摇床上800rpm混匀振荡1h。
7)加入100μL洗涤液，重复清洗三次。
8)加入稀释的PE标记的链霉亲和素，室温条件下，800rpm摇床上混匀振荡30min。
9)最后，每个孔中加入100μL的洗涤液，室温条件下，800rpm摇床上混匀振荡30min，重悬磁珠，并在90min内上机检测并分析。
rBCG-EP009诱导小鼠脾淋巴细胞分泌的PPD特异性细胞因子检测结果见图6。rBCG-EP009诱导小鼠脾淋巴细胞分泌的EPCP009特异性细胞因子见图7。在免疫后第8周，rBCG-EP009刺激产生较高水平的PPD特异性IL-2、IFN-γ和TNF-α等Th1型细胞因子，其中IFN-γ、IL-12、GM-CSF和IL-6的分泌量显著高于BCG组(P<0.05)，而IL-4和IL-10等Th2型细胞因子分泌量极低，均低于40pg/mL，说明rBCG-EP009诱导偏向Th1型的免疫应答，且相较于BCG，提高了Th1型的免疫应答水平。随着免疫时间的延长，在第12周，rBCG-EP009刺激产生的PPD特异性IL-2、IFN-γ和TNF-α等Th1型细胞因子仍显著高于BCG组(P<0.05)。无论在第8周还是第12周，PBS组和BCG组均产生较低水平的EPCP009抗原特异性细胞因子，而rBCG-EP009组产生较高水平的EPCP009抗原特异性的IL-2、IFN-γ和TNF-α等Th1型细胞因子和Th17型细胞因子IL-17等，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12、GM-CSF、IL-17和IL-6的分泌量显著高于BCG组(P<0.05)和PBS组(P<0.05)，而EPCP009抗原特异性的IL-4和IL-10等Th2型细胞因子在8周时分泌量极低。随着时间的延长，在12周时，rBCG-EP009组分泌的EPCP009f抗原特异性IL-2、GM-CSF和IL-17水平有增加的趋势。
实施例5rBCG-EP009在器官内的定植能力
小鼠在免疫后的第8周和12周，采用颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下获取肝脏、脾脏和肺脏分别置于1640培养基中，并对脏器称重。将脏器置于4％的NaOH溶液中浸泡处理1min，之后转移至含有7H9液体培养基中，使用组织匀浆器充分研磨上述脏器，充分混匀，吸取100μL匀浆液接种于7H10固体培养基上(每只小鼠每个脏器重复接种3个平板)，使用涂布棒均匀涂开，置于5％CO2，37℃培养箱中，培养3～4周，可见清晰的BCG或rBCG-EP009的菌落数，然后计算菌落数。脏器贺菌量以每只小鼠每克组织CFU的log10的均值表示。
计算公式：
CFU/克＝A×10×(B+C)/C
A：三个固体培养基上生长的菌落数均值；
B：为加入的培养基体积(mL)；
C：脏器组织的重量(g)。
BCG和rBCG-EP009免疫小鼠8周和12周时在脾脏和肺脏内的定植情况检测结果见图9。经涂板计数分析，BCG和rBCG-EP009未发现在小鼠肝脏体内定植。在免疫8周时，rBCG-EP009在小鼠脾脏和肺脏的定植能力均高于BCG组，差异有统计学意义(P均<0.05)。随着免疫时间的延长，在免疫12周时，BCG和rBCG-EP009菌株在脾脏和肺脏的定植数量均呈下降趋势。在免疫12周后，rBCG-EP009在小鼠脾脏内的定植数量依然显著高于BCG组(P<0.05)；在小鼠肺脏内的定植数量和BCG组相当，差异无统计学意义。
实施例6组织病理学检测
免疫8周时，颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，无菌操作剪取小鼠脾脏、肝脏和肺脏组织(剪取的组织不宜过大)，置于4％免疫组化固定液中固定，进行常规石蜡切片、染色，观察其组织形态学变化，以评价重组卡介苗rBCG-EP009的安全性。每组取3只小鼠做病理分析，具体实验步骤简述如下：
1)脱蜡至水：材料依次经过二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III各5min；材料依次经过无水乙醇I、无水乙醇II、95％乙醇I、95％乙醇II、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇和自来水洗数遍，控干水分；
2)经Harris苏木素染色5min后用自来水洗数遍；
3)经盐酸酒精分化；
4)放入氨水中返蓝后经室温蒸馏水清洗数遍，控干；
5)放入醇溶性伊红染液中、水洗；
6)梯度酒精脱水透明：材料依次经过50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇二次、二甲苯三次；
7)中性树胶封片；
8)镜下观察染色情况。
9)同时，对于肺脏组织按照肺泡壁增厚程度(肺泡壁增厚程度为增厚面积、厚度的综合评判)、间质性肺炎、肺泡炎和细支气管炎的情况进行评价，对试验样品各项炎细胞统计评分，分值判定为：
——0-1个/20X视野评分为0
——2≤/20X视野＜5评分为1
——5≤/20X视野＜10个评分为2
——10≤/20X视野＜20个评分为3
——/20X视野≥20个评分为4。
BCG和rBCG-EP009免疫小鼠8周时肝、脾、肺脏器病理切片和肺脏的病理评分见图10。和PBS组相比，BCG和rBCG-EP009组小鼠脾脏稍微增生，但未见明显的增生、萎缩和水肿等病理改变。通过HE染色观察所见，肝组织：各组肝脏基本结构存在，大部分肝细胞呈空泡样变，胞核呈颗粒样变，胞浆溶解，部分区域肝细胞溶解消失，呈片状坏死。肝窦闭锁，其间可见散在巨噬细胞，肝板排列紊乱(黑色箭头指示炎症和坏死)，但各组相比无差异。脾组织：各组脾脏基本结构存在，白髓区可见动脉周围淋巴鞘、淋巴小结轻度增生，边缘区未见明显异常；红髓区未见明显异常，各组相比无差异。肺组织：各组肺脏支气管及肺泡结构未见异常，可见少量炎性细胞浸润，但各组间相比无明显差异。所有脏器结构均在正常形态学范围内，未见细胞水肿、坏死等明显病理性病变。各组间的肺脏组织病理评分结果之间无明细差异。
实施例7体外分枝杆菌生长抑制实验
1)使用含1×非必需氨基酸(购自北京索莱宝科技有限公司，产品牌号N1250)，10mM Hepes，1mM丙酮酸钠，5×10-5M 2-巯基乙醇的1640完全细胞培养基调整细胞数至2×106cells/mL(培养基中不加入青霉素和链霉素双抗，否则影响结核分枝杆菌生长)。
2)从罗氏培养基上刮取新鲜的H37Rv，使用PBS洗涤，并调整菌液浓度OD600值为1，并通过涂板计算1OD对应的菌落数。
3)将菌液梯度稀释，取50CFU的结核分枝杆菌，涂布于无抗7H10平板上，作为空白对照。
4)取500μL的H37Rv(50CFU)，加入500μL的脾细胞(2×106cells)中；
5)将脾细胞-H37Rv混合物在24孔细胞板中于37℃、5％CO2条件下共培养4天。
6)4天后，收集脾细胞-H37Rv的混合物，然后转移到1.5mL离心管中。
7)室温条件下，4000rpm离心10min，弃上清液。
8)每孔加入500μL无菌水，室温孵育5min，裂解细胞使其释放出胞内菌。
9)混合后取50μL涂布于含10％OADC的7H10培养基上，每组样品设置六个重复。
10)37℃条件下培养两周左右，对细菌数量进行计数，数据以每个样品总数量的lgCFU表示。
为避免BCG或rBCG-EP009免疫后在脾脏中定植的菌落数和H37Rv菌落的计数混淆，将收集的脾细胞-H37Rv的混合物涂布于含5μg/mL噻吩-2-羧酸肼(TCH)和10％OADC的7H10固体培养基上，每组样品设置六个重复(经预实验结果显示，5μg/mL的TCH可以抑制BCG和rBCG-EP009的生长，同时不影响H37Rv的生长)。
PBS、BCG和rBCG-EP009免疫BALB/c小鼠8周和12周时，脾淋巴细胞和H37Rv共培养之后，接种于7H10平板上培养后的菌落计数结果见图11。无论是免疫8周还是12周时，与PBS组相比，BCG和rBCG-EP009组均对Mtb生长产生了明显的抑制作用(P均<0.01)。在免疫8周时，和BCG组相比，rBCG-EP009组对Mtb生长产生了明显的抑制作用(P<0.05)；但在免疫12周时，rBCG-EP009组对Mtb生长抑制能力和BCG组相当，差异无统计意义。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种重组BCG菌株，其特征在于，相比出发菌株，所述重组BCG菌株过表达ESAT-6、CFP-10、nPPE18和nPstS1蛋白，ESAT-6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，CFP-10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，nPPE18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，nPstS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的重组BCG菌株，其特征在于，所述重组BCG菌株中过表达融合蛋白EPCP009，所述融合蛋白EPCP009的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
3.根据权利要求1所述的重组BCG菌株，其特征在于，所述重组BCG菌株的基因组中包含esxA、esxB、nPPE18和nPstS1基因，esxA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示、esxB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示、nPPE18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示、nPstS1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
4.根据权利要求1所述的重组BCG菌株，其特征在于，所述重组BCG菌株的基因组中包含融合蛋白EPCP009的编码基因，所述融合蛋白EPCP009的编码基因如SEQ ID No.10所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的重组BCG菌株，其特征在于，所述出发菌株为BCG-China。
6.一种构建权利要求1-5任一项所述的重组BCG菌株的方法，其特征在于，包括在出发菌株中转入含有esxA、esxB、nPPE18和nPstS1基因的质粒的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括在出发菌株中转入含有融合蛋白EPCP009的编码基因的质粒的步骤。
8.权利要求1-5任一项所述的重组BCG菌株或权利要求6或7所述的方法构建获得的重组BCG菌株在制备预防结核分枝杆菌感染的疫苗或制备治疗结核分枝杆菌感染引起疾病的药物中的应用。
9.一种预防结核病的疫苗，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的重组BCG菌株或权利要求6或7所述的方法构建获得的重组BCG菌株。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，还包括佐剂。
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