CN117512043A - 一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肽提取技术领域，具体涉及一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，MRM分子共振木瓜蛋白酶酶解，超滤膜分级，以及后续胃蛋白酶、酰基转移酶I的分级酶解。本发明设计负离子的发生量为2000个e‑/cm3～2500个e‑/cm3的MRM分子共振技术贯穿蛋白源制备过程以及木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶解过程，促进提高蛋白质提取率，以及促进酶解提升菊芋肽提取率，还配合超滤膜分级，进行分离酶解，改变小于3kDa的产物的酶解顺序，获得了较高的菊芋肽提取率。
Description
技术领域
本发明属于肽提取技术领域，具体涉及一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法。
背景技术
菊芋又称洋生姜、洋姜和鬼子姜，是一种多年宿根性草本植物，生有块状的地下块茎及纤维状根。菊芋的地上茎叶和地下块茎都是良好的饲料，地下块茎也能够作为蔬菜食用，地下块茎具有通便利胆、消肿去湿和中益胃的功效。另外，菊芋还具有良好的药用价值，把菊芋中的菊糖提取出来，能够用来治疗糖尿病；菊芋的根茎捣烂之后能够外敷治疗无名肿毒和腮腺炎，因此，菊芋具有良好的生物学特性的药用价值。
目前，菊芋的利用方式主要是食疗和中药方式用药，比较粗放，没有进行成分精炼，效用没有良好的针对性。其中，一项公开号为CN116813711A的发明专利公开了一种降血糖抗氧化的菊芋肽、其制备方法及其应用，酶解提取肽成分，实现降血糖的药用价值，但仍存在肽类成分吸收率低的问题，原材料不能得到充分的利用。
发明内容
针对现有菊芋药用成分提取药用成分利用率低，酶解肽吸收率低的问题。本发明提供一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，设计负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振技术贯穿蛋白源制备过程以及木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶解过程，促进提高蛋白质提取率，以及促进酶解提升菊芋肽提取率，还配合超滤膜分级，进行分离酶解，改变小于3kDa的产物的酶解顺序，获得了较高的菊芋肽提取率。其具体技术方案如下：
一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：将菊芋新鲜叶片进行水洗、烘干，然后粉碎成粉体，按粉体：NaCl溶液=1：（15～20）的质量比，将粉体加入至NaCl溶液中，MRM分子共振浸泡3h～4h；之后离心分离，收集上清液；向上清液中添加硫酸铵溶液，持续搅动，直到蛋白质完全析出；之后离心分离，收集沉淀，向沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到蛋白质；
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为2%(w/v)～3%(w/v)，加入质量体积比为4%～6%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的Amicon Ultra-15 离心超滤管，进行离心分离上清液，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；
S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)～3%(w/v)，加入质量体积比为3%～5%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；
S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)～3%(w/v)，加入质量体积比为6%～8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；
S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)～3%(w/v)，加入质量体积比为6%～8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；
S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽。
上述方法的S1中，烘干为40℃～45℃真空烘干。
上述方法的S1中，NaCl溶液的浓度为0.15mol/L。
上述方法的S1中，硫酸铵溶液的浓度为4.0mol/L。
上述方法的S1中，MRM分子共振浸泡的方法为：将粉体加入NaCl溶液中，然后将MRM分子共振板静置于NaCl溶液中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3，保持浸泡3h～4h。
上述方法的S1中，分子共振水的制备方法为：将MRM分子共振板静置于水中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的分子共振水。
上述方法的S2中，上清液离心分离的转速为8000rpm～8500rpm，时间为20min～25min。
上述方法的S6中，复合菊芋肽中包含5种菊芋肽，分别为Pep1、Pep2、Pep3、Pep4和Pep5；
Pep1的氨基酸序列SEQ ID NO:1为ILLLRMGQRNLVVVS；
Pep2的氨基酸序列SEQ ID NO:2为VVQQYRYGWEAEAAAVV；
Pep3的氨基酸序列SEQ ID NO:3为VKKNPAAATEGIVI；
Pep4的氨基酸序列SEQ ID NO:4为GKGGQLARAAGAV；
Pep5的氨基酸序列SEQ ID NO:5为VVVVGLYYGFL。
Pep1的提取率为3.6%以上，Pep2的提取率为4.8%以上，Pep3的提取率为3.4%以上，Pep4的提取率为4.6%以上，Pep5的提取率为3.2%以上。
上述技术方中，S5在S2之后进行，S5与S3不分先后顺序。
本发明的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，与现有技术相比，有益效果为：
一、本发明设计特殊的蛋白质提取步骤参数，能够提升蛋白质提取收率，其中，MRM分子共振浸泡3h～4h，设计负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3，MRM分子共振对水分子进行物理位移和排序，共振作用的同时令水分子激活，由大分子团跃进到小分子团，促进实现植物蛋白源的高效浸出，提高蛋白质提取收率。
二、设计向蛋白质沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到净化后的蛋白质，防止蛋白质中残留化学成分，保证蛋白质的纯度，为后续酶解提供条件，防止化学成分影响酶解。
三、本发明设计木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶解反应在负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行，且将木瓜蛋白酶的酶解产物进行超滤膜分级，并进行后续分级酶解，意外地发现，能够大幅提高Pep3、Pep4、Pep5的收率，发明人猜测，该有益效果是由于MRM分子共振能够促进酶解，提高收率，且结合分离分级酶解，能够改变肽链酶解顺序，木瓜蛋白酶酶解后的小于3kDa的产物直接由酰基转移酶I酶解产生的作用。
四、本发明设计采用5kDa和3kDa超滤膜分级分离，利用5kDa过渡，能够提高小于3kDa产物的分离精度。
综上，本发明设计负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振技术贯穿蛋白源制备过程以及木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶解过程，促进提高蛋白质提取率，以及促进酶解提升菊芋肽提取率，还配合超滤膜分级，进行分离酶解，改变小于3kDa的产物的酶解顺序，获得了较高的菊芋肽提取率，其中，Pep1的提取率为3.6%以上，Pep2的提取率为4.8%以上，Pep3的提取率为3.4%以上，Pep4的提取率为4.6%以上，Pep5的提取率为3.2%以上；具有良好的经济实用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：称取500g菊芋新鲜叶片，将菊芋新鲜叶片进行水洗、40℃真空烘干，然后粉碎成粉体，按粉体：NaCl溶液=1：15的质量比，将粉体加入至0.15mol/L的NaCl溶液中，MRM分子共振浸泡3h；之后离心分离，收集上清液；向上清液中添加4.0mol/L的硫酸铵溶液，持续搅动，直到蛋白质完全析出；之后离心分离，收集沉淀，向沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到蛋白质213.2g；
MRM分子共振浸泡的方法为：将粉体加入NaCl溶液中，然后将MRM分子共振板静置于NaCl溶液中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-/cm3，保持浸泡3h。
分子共振水的制备方法为：将MRM分子共振板静置于水中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-/cm3的分子共振水。
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为4%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的Amicon Ultra-15 离心超滤管，进行离心分离上清液，8000rpm离心20min，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；
S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为3%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；
S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；
S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；
S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽。
实施例2
一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：称取500g菊芋新鲜叶片，将菊芋新鲜叶片进行水洗、45℃真空烘干，然后粉碎成粉体，按粉体：NaCl溶液=1：20的质量比，将粉体加入至0.15mol/L的NaCl溶液中，MRM分子共振浸泡4h；之后离心分离，收集上清液；向上清液中添加4.0mol/L的硫酸铵溶液，持续搅动，直到蛋白质完全析出；之后离心分离，收集沉淀，向沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到蛋白质212.6g；
MRM分子共振浸泡的方法为：将粉体加入NaCl溶液中，然后将MRM分子共振板静置于NaCl溶液中进行反应，形成负离子发生量为2500个e-/cm3，保持浸泡4h。
分子共振水的制备方法为：将MRM分子共振板静置于水中进行反应，形成负离子发生量为2500个e-/cm3的分子共振水。
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为3%(w/v)，加入质量体积比为6%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的Amicon Ultra-15 离心超滤管，进行离心分离上清液，8500rpm离心25min，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；
S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，终浓度为3%(w/v)，加入质量体积比为5%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；
S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为3%(w/v)，加入质量体积比为8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；
S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为3%(w/v)，加入质量体积比为8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；
S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽。
实施例3
一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：称取500g菊芋新鲜叶片，将菊芋新鲜叶片进行水洗、42℃真空烘干，然后粉碎成粉体，按粉体：NaCl溶液=1：18的质量比，将粉体加入至0.15mol/L的NaCl溶液中，MRM分子共振浸泡3.5h；之后离心分离，收集上清液；向上清液中添加4.0mol/L的硫酸铵溶液，持续搅动，直到蛋白质完全析出；之后离心分离，收集沉淀，向沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到蛋白质213.1g；
MRM分子共振浸泡的方法为：将粉体加入NaCl溶液中，然后将MRM分子共振板静置于NaCl溶液中进行反应，形成负离子发生量为2200个e-/cm3，保持浸泡3.5h。
分子共振水的制备方法为：将MRM分子共振板静置于水中进行反应，形成负离子发生量为2200个e-/cm3的分子共振水。
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为2.5%(w/v)，加入质量体积比为5%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2200个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1.2h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的Amicon Ultra-15 离心超滤管，进行离心分离上清液，8200rpm离心22min，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；
S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，终浓度为2.5%(w/v)，加入质量体积比为4%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2200个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1.2h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；
S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2.5%(w/v)，加入质量体积比为7%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.2h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；
S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2.5%(w/v)，加入质量体积比为7%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.2h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；
S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽。
实施例4
一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：称取500g菊芋新鲜叶片，将菊芋新鲜叶片进行水洗、40℃真空烘干，然后粉碎成粉体，按粉体：NaCl溶液=1：20的质量比，将粉体加入至0.15mol/L的NaCl溶液中，MRM分子共振浸泡3h；之后离心分离，收集上清液；向上清液中添加4.0mol/L的硫酸铵溶液，持续搅动，直到蛋白质完全析出；之后离心分离，收集沉淀，向沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到蛋白质214.2g；
MRM分子共振浸泡的方法为：将粉体加入NaCl溶液中，然后将MRM分子共振板静置于NaCl溶液中进行反应，形成负离子发生量为2500个e-/cm3，保持浸泡3h。
分子共振水的制备方法为：将MRM分子共振板静置于水中进行反应，形成负离子发生量为2500个e-/cm3的分子共振水。
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为6%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的Amicon Ultra-15 离心超滤管，进行离心分离上清液，8000rpm离心25min，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；
S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为5%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；
S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；
S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为3%(w/v)，加入质量体积比为6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；
S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽。
实施例5
一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：称取500g菊芋新鲜叶片，将菊芋新鲜叶片进行水洗、45℃真空烘干，然后粉碎成粉体，按粉体：NaCl溶液=1：15的质量比，将粉体加入至0.15mol/L的NaCl溶液中，MRM分子共振浸泡4h；之后离心分离，收集上清液；向上清液中添加4.0mol/L的硫酸铵溶液，持续搅动，直到蛋白质完全析出；之后离心分离，收集沉淀，向沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到蛋白质213.8g；
MRM分子共振浸泡的方法为：将粉体加入NaCl溶液中，然后将MRM分子共振板静置于NaCl溶液中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-/cm3，保持浸泡4h。
分子共振水的制备方法为：将MRM分子共振板静置于水中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-/cm3的分子共振水。
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为3%(w/v)，加入质量体积比为4%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的Amicon Ultra-15 离心超滤管，进行离心分离上清液，8500rpm离心20min，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；
S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，终浓度为3%(w/v)，加入质量体积比为3%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；
S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为3%(w/v)，加入质量体积比为6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；
S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；
S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽。
制备对比例1的菊芋肽
S1：称取500g菊芋新鲜叶片，剪切至1cm～2cm小段，加入至2500mL的1M氢氧化钠溶液提取剂中，充分混匀后，加入至榨汁机榨汁2min，200mm滤布过滤得到墨绿色提取液。用1M盐酸调pH至6.5，恒温水浴中絮凝20min。冷水冷却至室温，10000rpm离心5min，得到蛋白沉淀，60℃烘箱中烘干，得到蛋白质198.4g；
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为4%的木瓜蛋白酶；水浴65℃反应1h后，在沸水中加热10min，停止反应。冷却、离心，收集上清液，冷冻干燥，得到冻干品；
S3：将S2得到的冻干品悬浮于pH1.5、50mMKCl-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为3%的胃蛋白酶；水浴37℃反应1h后，在沸水中加热10min，停止反应。冷却\离心，收集上清液，冷冻干燥，得到冻干品；
S4：将S3冻干品悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h后，在沸水中加热10min，停止反应。冷却、离心，收集上清液，冷冻干燥，得到冻干品，即复合菊芋肽。
制备对比例2的菊芋肽
S1：称取500g菊芋新鲜叶片，剪切至1cm～2cm小段，加入至2500mL的1M氢氧化钠溶液提取剂中，充分混匀后，加入至榨汁机榨汁2min，200mm滤布过滤得到墨绿色提取液。用1M盐酸调pH至6.5，恒温水浴中絮凝20min。冷水冷却至室温，10000rpm离心5min，得到蛋白沉淀，60℃烘箱中烘干，得到蛋白质196.2g；
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为4%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的Amicon Ultra-15 离心超滤管，进行离心分离上清液，8000rpm离心20min，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；
S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为3%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；
S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；
S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)，加入质量体积比为6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；
S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽。
测定实施例1至实施例5、对比例1、对比例2制备得到复合菊芋肽中均包含Pep1、Pep2、Pep3、Pep4和Pep5。
Pep1的氨基酸序列SEQ ID NO:1为ILLLRMGQRNLVVVS；
Pep2的氨基酸序列SEQ ID NO:2为VVQQYRYGWEAEAAAVV；
Pep3的氨基酸序列SEQ ID NO:3为VKKNPAAATEGIVI；
Pep4的氨基酸序列SEQ ID NO:4为GKGGQLARAAGAV；
Pep5的氨基酸序列SEQ ID NO:5为VVVVGLYYGFL。
Pep1、Pep2、Pep3、Pep4和Pep5的性能和药用价值，请参见CN116813711A一种降血糖抗氧化的菊芋肽、其制备方法及其应用，所测定的结果。
测定实施例1至实施例5、对比例1、对比例2制备得到复合菊芋肽中各类肽的提取率，提取率=肽质量/蛋白质质量，如下表1所示。
表1 提取率结果%
| 试样 | Pep1 | Pep2 | Pep3 | Pep4 | Pep5 |
| 实施例1 | 3.62 | 4.83 | 3.48 | 4.62 | 3.24 |
| 实施例2 | 3.63 | 4.83 | 3.43 | 4.61 | 3.24 |
| 实施例3 | 3.62 | 4.81 | 3.45 | 4.61 | 3.25 |
| 实施例4 | 3.61 | 4.85 | 3.46 | 4.62 | 3.25 |
| 实施例5 | 3.64 | 4.82 | 3.48 | 4.63 | 3.23 |
| 对比例1 | 3.28 | 4.56 | 2.35 | 2.45 | 1.98 |
| 对比例2 | 3.54 | 4.78 | 3.18 | 4.36 | 3.03 |
由上述结果可知，实施例1至实施例5的酶解方法，能够改变蛋白质水解顺序，对Pep3、Pep4、Pep5具有较高的提取率。另外，由实施例1至实施例5、对比例1、对比例2的蛋白质提取量可知，实施例1至实施例5的蛋白质提取量相对提升。
Claims (10)
1.一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将菊芋新鲜叶片进行水洗、烘干，然后粉碎成粉体，按粉体：NaCl溶液=1：（15～20）的质量比，将粉体加入至NaCl溶液中，MRM分子共振浸泡3h～4h；之后离心分离，收集上清液；向上清液中添加硫酸铵溶液，持续搅动，直到蛋白质完全析出；之后离心分离，收集沉淀，向沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到蛋白质；
S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为2%(w/v)～3%(w/v)，加入质量体积比为4%～6%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的Amicon Ultra-15 离心超滤管，进行离心分离上清液，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；
S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)～3%(w/v)，加入质量体积比为3%～5%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；
S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)～3%(w/v)，加入质量体积比为6%～8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；
S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%(w/v)～3%(w/v)，加入质量体积比为6%～8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；
S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽。
2.根据权利要求1所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，S1中，所述烘干为40℃～45℃真空烘干。
3.根据权利要求1所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，S1中，所述NaCl溶液的浓度为0.15mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，S1中，所述硫酸铵溶液的浓度为4.0mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，S1中，所述MRM分子共振浸泡的方法为：将粉体加入NaCl溶液中，然后将MRM分子共振板静置于NaCl溶液中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3，保持浸泡3h～4h。
6.根据权利要求1所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，S1中，所述分子共振水的制备方法为：将MRM分子共振板静置于水中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的分子共振水。
7.根据权利要求1所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述上清液离心分离的转速为8000rpm～8500rpm，时间为20min～25min。
8.根据权利要求1所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，S6中，所述复合菊芋肽中包含5种菊芋肽，分别为Pep1、Pep2、Pep3、Pep4和Pep5；
所述Pep1的氨基酸序列SEQ ID NO:1为ILLLRMGQRNLVVVS；
所述Pep2的氨基酸序列SEQ ID NO:2为VVQQYRYGWEAEAAAVV；
所述Pep3的氨基酸序列SEQ ID NO:3为VKKNPAAATEGIVI；
所述Pep4的氨基酸序列SEQ ID NO:4为GKGGQLARAAGAV；
所述Pep5的氨基酸序列SEQ ID NO:5为VVVVGLYYGFL。
9.根据权利要求8所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，所述Pep1的提取率为3.6%以上，Pep2的提取率为4.8%以上，Pep3的提取率为3.4%以上，Pep4的提取率为4.6%以上，Pep5的提取率为3.2%以上。
10.根据权利要求1所述的一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，S5在S2之后进行，S5与S3不分先后顺序。
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