CN117403005A - 一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，该方法包括：对HPV核酸样本进行LAMP等温扩增反应，获得阳性核酸扩增产物；制备胶体金侧向层析试条，胶体金侧向层析试条的检测线T1处包被有抗异硫氰酸抗体，检测线T2处包被有抗地高辛抗体，标记垫层胶体金胶微球上标记有抗生物素抗体；将阳性核酸扩增产物滴加到胶体金侧向层析试条上，生物素与抗生物素抗体结合，形成FITC‑DNA‑生物素‑生物素抗体‑胶体金复合物或DIGoxin‑DNA‑生物素‑生物素抗体‑胶体金复合物；将阳性核酸扩增产物流滴入胶体金侧向层析试条，检测是否为HPV16型阳性或HPV18型阳性。本申请突破设备束缚，诊断结果可视化，能够实现居家自测，提升检测的便携性。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法。
背景技术
环介导等温扩增技术是一种在恒温条件下进行的DNA扩增方法，其原理是利用环介导DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的特殊性质，实现DNA的快速扩增。该技术具有操作简便、扩增效率高、无需高精度温控设备等优点，因此在基因检测领域得到了广泛的应用。
横向流动试纸条是一种基于毛细管作用和反应物在纸张上的扩散效应的分析方法。通过在试纸条上固定检测目标的特异性探针和信号产生反应物，结合上样样品后，样品中的目标分子与探针发生特异性的反应，形成可视化的颜色信号，从而实现目标分子的快速检测。
超过90％的女性一生中至少有一次感染HPV，即宫颈癌患病潜在人群大，产品需求市场大。及早进行宫颈癌早筛，发现宫颈癌前病变并治疗是降低宫颈癌发病率和死亡率的关键。且HPV检测初筛为后续进一步诊断治疗起到决定性作用，进行准确高效的宫颈癌筛查分流可避免不必要的阴道镜转诊，有效减少医疗资源的浪费。
然而，宫颈癌筛查覆盖率低、现有宫颈癌检测方法灵敏度低、检测核酸扩增耗时长、检测成本高昂，且假阳性率高是亟待解决的问题。
鉴于此，本申请提出了一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其所制作的横向试纸条能够应用于宫颈癌的早期筛查。
发明内容
为了克服现有宫颈癌筛查覆盖率低、现有宫颈癌检测方法灵敏度低且假阳性率高等问题，本发明的目的在于提出一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法以解决上述技术问题。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，该方法包括以下步骤：
S1、对HPV核酸样本进行LAMP等温扩增反应，获得阳性核酸扩增产物，其中阳性核酸扩增产物为同时带有生物素和异硫氰酸荧光素或同时带有生物素和地高辛的双标记产物；
S2、制备胶体金侧向层析试条，胶体金侧向层析试条的检测线T1处包被有抗异硫氰酸抗体，检测线T2处包被有抗地高辛抗体，标记垫层胶体金胶微球上标记有抗生物素抗体；
S3、将阳性核酸扩增产物滴加到胶体金侧向层析试条上，生物素与抗生物素抗体结合，形成FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物；
S4、当阳性核酸扩增产物流至检测线T1处时，FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物以其异硫氰酸荧光素被检测线T1处上的抗异硫氰酸抗体捕获显示红色线，检测结果为HPV16型阳性；
当阳性核酸扩增产物流至检测线T2处时，DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物以其地高辛被检测线T2处上的地高辛抗体捕获显示红色线，检测结果为HPV18型阳性。
通过上述技术方案，本申请通过环介导等温扩增技术实现在恒温条件下HPV基因指数级扩增，并结合胶体金免疫层析技术，将引物FITC(异硫氰酸)/Digoxin(地高辛)和Biotin(生物素)偶联实现了层析试纸对目标核酸的捕获，能够弥补现有宫颈癌检测不足，突破设备束缚，提高检测结果准确性，诊断结果可视化，实现居家自测，提升检测的便携性，大幅度降低宫颈癌筛查的成本以提高宫颈癌筛查覆盖率。
在一个优选的实施例中，该方法还包括：FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物流至胶体金侧向层析试条的质控线C处时，剩余的生物素抗体-胶体金复合物与质控线C处包被的羊抗鼠抗体结合显示红色线，指示检测结果有效可控。
通过上述技术方案，方便测试人员知晓所测得的结果是否有效可控。
在一个优选的实施例中，步骤S1具体包括以下子步骤：
S11、通过NCBI网站查找并下载全部HPV高危病毒亚型的基因序列和全部的HPV高危亚型变异株病毒的基因序列；
S12、通过MEGA序列比对软件将HPV高危病毒亚型的基因序列与HPV高危亚型变异株病毒的基因序列一一进行对比，找出1000bp的保守碱基序列作为靶序列；
S13、利用LAMP引物设计软件对保守碱基序列的6个不同的区域设计出4-6条特异性引物，特异性引物包括HPV16的LAMP引物和HPV18的LAMP引物。
通过上述技术方案，由于是针对靶序列6个区域设计的4-6种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。
环介导等温扩增技术依靠4-6条特异性引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)，在等温条件(60-65℃)下扩增靶序列，避免传统的PCR需要变温扩增而对精密仪器的依赖性，同时具有快速、高效、特异性强的特点。但是影响的因素很多，如反应温度，引物浓度，酶Mg2+等因素。因此，本申请进行实验设计时综合运用单因素试验与响应面分析法,首先确定了各因素的有效范围,再对三因素三水平进行组合优化，获得最佳反应体系。具体如下：
单因素试验：不同酶的应用、聚合酶最佳的反应温度、最佳反应时间等不同因素。分别进行对照实验探究不同条件对于DNA扩增速率的影响。
响应面分析法：响应面分析法(也称响应曲面法)是一种简便的优化方法，将体系的响应作为一个或多个因素的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来。由单因素试验确定水平→根据实验对比数据设计实验，获取实验数据→利用实验数据获取回归方程即响应面方程→利用响应面进行分析。验设计与优化方法，找出最优值，判别优化区域。
组合优化：经过单因素实验和响应面分析法得到判别优化区域，再进行具体对应实验绘制出直观的图形，观察其最优化点，找出最优值。
经过三因素三水平组合优化，最终确定HPV16的LAMP引物为：
其中，F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，LoopF和LoopB为环引物。
经过三因素三水平组合优化，最终确定HPV18的LAMP引物为：
其中，F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，LoopF和LoopB为环引物。
在一个优选的实施例中，LAMP等温扩增反应体系包括以下检测组分：
| 试剂 | 用量/μL | 浓度 |
| 聚合酶反应缓冲液 | 2.5 | 10X |
| LAMP引物混合物 | 2.5 | 10X |
| dNTP混合液 | 1 | 1.6mmol/L |
| 甜菜碱 | 1 | 1mol/L |
| BstDNA聚合酶 | 1 | 8000U/mL |
| DNA模板 | 1 | ≥100拷贝数/μL |
| syto9荧光染料 | 0.1 | 1μmol/L |
| 双重去离子水 | 15.9 | |
| 总共 | 25 |
其中，LAMP引物混合物中包括1.6μMFIP和BIP，0.2μMF3和B3，0.4μMLoopF和LoopB，DNA模板使用DEPC水溶解。
上述技术方案中，环介导等温扩增技术LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification)是在恒温条件下进行，呈指数级别放大核酸分子，30分钟内能够将DNA放大109～1010倍。
在一个优选的实施例中，LAMP等温扩增反应的反应条件为：65摄氏度恒温加热，孵育30min。
通过上述技术方案，在等温条件(65℃)下扩增靶序列，避免传统PCR需要变温扩增而对精密仪器的依赖性，同时具有快速、高效、特异性强的特点。
在一个优选的实施例中，在步骤S2中，制备胶体金侧向层析试条包括：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和衬底五部分首尾相连组成胶体金侧向层析试条。
在一个优选的实施例中，该方法还包括：对HPV核酸样本进行LAMP等温扩增反应，若无扩增产物，则FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物不被检测线T1处上的抗异硫氰酸抗体捕获，也不被检测线T2处上的地高辛抗体捕获，在质控线C处被生物素捕捉显示红色线。
通过上述技术方案，本申请能够对无扩展产物的待测样品进行检测，显示出并未感染HPV的结果。
在一个优选的实施例中，该方法还包括：待阳性核酸扩增产物进入胶体金侧向层析试条的样品孔后，将胶体金侧向层析试条垂直放置在含有缓冲液的浸泡盒中，使缓冲液与胶体金侧向层析试条充分接触，通过毛细作用，阳性核酸扩增产物会沿着胶体金侧向层析试条上升，阳性核酸扩增产物与胶体金侧向层析试条上特定的探针结合。
本发明提供的基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，具有如下有益效果：
(1)环介导等温扩增联合横向流动试纸条具有高度的敏感性和特异性，通过合理设计的引物和探针，可以实现对目标基因的特异性扩增和检测，避免了假阳性结果的出现。
(2)导等温扩增反应在恒温条件下进行，无需复杂的温控设备，可以在简单的仪器设备上进行。结合横向流动试纸条的特性，样品加入后，反应结果可以在几十分钟内得出，可以达到快速检测和实时监测的效果。
(3)将环介导等温扩增技术运用于HPV核酸检测领域，研制出HPV核酸检测试纸条，可以降低HPV检测成本，最终实现HPV居家检测。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是根据本发明基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法的流程图；
图2是根据本发明的Lamp等温扩增反应示意图；
图3是根据本发明的胶体金侧向层析试条模型结构示意图；
图4是根据本发明的层析试纸条上复合物的产生示意图；
图5是根据本发明的检测线捕获胶体金复合物示意图；
图6根据本发明的Lamp反应无扩增产物示意图；
图7是根据本发明层析试纸条结果判读示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与有关发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
本申请以HPV样本或者质粒DNA为材料，利用环介导等温扩增技术(LAMP)进行核酸扩增，借助横向流动试纸条完成产物检测，建立一种可用于HPV疾病快速检测的方法。图1示出了根据本发明一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，图2示出了根据本发明的Lamp等温扩增反应示意图，结合参考图1和图2，该方法包括以下步骤：
S1、对HPV核酸样本进行LAMP等温扩增反应，获得阳性核酸扩增产物，其中阳性核酸扩增产物为同时带有生物素和异硫氰酸荧光素或同时带有生物素和地高辛的双标记产物。
在本实施例中，步骤S1具体包括以下子步骤：
S11、通过NCBI网站查找并下载全部HPV高危病毒亚型的基因序列和全部的HPV高危亚型变异株病毒的基因序列；
S12、通过MEGA序列比对软件将HPV高危病毒亚型的基因序列与HPV高危亚型变异株病毒的基因序列一一进行对比，找出1000bp的保守碱基序列作为靶序列；
S13、利用LAMP引物设计软件对保守碱基序列的6个不同的区域设计出4-6条特异性引物，特异性引物包括HPV16的LAMP引物和HPV18的LAMP引物。
其中，本申请设计出的HPV16的LAMP引物为：
设计出的HPV18的LAMP引物为：
其中，F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，LoopF和LoopB为环引物。
在本实施例中，LAMP等温扩增反应体系以质粒DNA作为模板，反应体系为25μL，LAMP等温扩增反应的反应条件为：65摄氏度恒温加热，孵育30min。具体包括以下检测组分：
其中，LAMP引物混合物中包括1.6μMFIP和BIP，0.2μMF3和B3，0.4μMLoopF和LoopB，DNA模板使用DEPC水溶解。
需将DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和dNTPs等反应组分混合均匀，确保反应体系中包含足够的环介导聚合酶(例如Bst DNA聚合酶)，以实现等温扩增反应。
环介导等温扩增技术LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification)在恒温条件下进行，呈指数级别放大核酸分子，30分钟内能够将DNA放大109～1010倍。
图3示出了胶体金侧向层析试条模型结构示意图，如图3所示，本申请提供的基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法还包括以下步骤：
S2、制备胶体金侧向层析试条，胶体金侧向层析试条的检测线T1处包被有抗异硫氰酸抗体，检测线T2处包被有抗地高辛抗体，标记垫层胶体金胶微球上标记有抗生物素抗体，质控线C处包被有羊抗鼠抗体。
在本实施例中，通过将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和衬底五部分首尾相连组成胶体金侧向层析试条。待阳性核酸扩增产物进入胶体金侧向层析试条的样品孔后，将胶体金侧向层析试条垂直放置在含有缓冲液的浸泡盒中，使缓冲液与胶体金侧向层析试条充分接触，通过毛细作用，阳性核酸扩增产物会沿着胶体金侧向层析试条上升，阳性核酸扩增产物与胶体金侧向层析试条上特定的探针结合。根据特定探针的颜色变化，可以判断目标DNA序列是否存在。通常，阳性结果会显示为2条带状线(检测线T+质检线C)，而阴性结果则显示1线条(质检线C)。结果可通过肉眼观察或使用相应的检测设备来读取。
图4示出了层析试纸条上复合物的产生示意图，如图4所示：
S3、将阳性核酸扩增产物滴加到胶体金侧向层析试条上，生物素与抗生物素抗体结合，具体为双标记产物以其生物素胶体金侧向层析试纸条上金标记链霉亲和素结合，形成FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物。
图5示出了检测线捕获胶体金复合物示意图，图6示出了Lamp反应无扩增产物示意图，图7是示出了层析试纸条结果判读示意图，结合参考图5-图7，本申请提供的基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法包括：S4、当阳性核酸扩增产物流至检测线T1处时，FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物以其异硫氰酸荧光素被检测线T1处上的抗异硫氰酸抗体捕获显示红色线，检测结果为HPV16型阳性；
当阳性核酸扩增产物流至检测线T2处时，DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物以其地高辛被检测线T2处上的地高辛抗体捕获显示红色线，检测结果为HPV18型阳性；
FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物流至胶体金侧向层析试条的质控线C处时，剩余的生物素抗体-胶体金复合物与质控线C处包被的羊抗鼠抗体结合显示红色线，即剩余的金标记链霉亲和素与质控C处包被的生物素化白蛋白结合显示红色线，指示检测结果有效可控；应当理解的是，检测线T1、检测线T2以及质控线C处均未显示红色线，则检测结果无效。以及，检测线T1和检测线T2显示红色线但质控线C处均未显示红色线，也视为检测结果无效。
对HPV核酸样本进行LAMP等温扩增反应，若无扩增产物，则亲和素结合的显色颗粒(即FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物)不被检测线T1处上的抗异硫氰酸抗体捕获(T1区无颜色)，也不被检测线T2处上的地高辛抗体捕获(T2区无颜色)，在质控线C处被生物素捕捉显示红色线，检测结果为阴性。
通过上述技术方案，本申请在设计HPV16型的引物上添加了生物素(Biotin)和异硫氰酸荧光素(FITC)；在设计HPV18型的引物上添加了生物素(Biotin)和地高辛(Digoxin)；所以假如样本中有HPV16型核酸，那么可以在检测线T1显色。
通过环介导等温扩增技术实现在恒温条件下HPV基因指数级扩增，并结合胶体金免疫层析技术，将引物FITC(异硫氰酸)/Digoxin(地高辛)和Biotin(生物素)偶联实现了层析试纸对目标核酸的捕获，能够弥补现有宫颈癌检测不足，突破设备束缚，提高检测结果准确性，诊断结果可视化，实现居家自测，提升检测的便携性，大幅度降低宫颈癌筛查的成本以提高宫颈癌筛查覆盖率。
本申请能够将便携式LAMP仪应用于HPV基因扩增，操作简单。LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要金属浴即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行，不需要特殊的试剂及仪器。
而且本申请不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增能够在lh内均可完成，添加环状引物后时间可以节省50％多数情况在20-30min均可检测到扩增产物。对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。且产物可以扩增至109倍，应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测，可以达到快速高效的效果。而且由于是针对靶序列6个区域设计的特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离上述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
Claims (10)
1.一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、对HPV核酸样本进行LAMP等温扩增反应，获得阳性核酸扩增产物，其中所述阳性核酸扩增产物为同时带有生物素和异硫氰酸荧光素或同时带有生物素和地高辛的双标记产物；
S2、制备胶体金侧向层析试条，所述胶体金侧向层析试条的检测线T1处包被有抗异硫氰酸抗体，检测线T2处包被有抗地高辛抗体，标记垫层胶体金胶微球上标记有抗生物素抗体；
S3、将所述阳性核酸扩增产物滴加到所述胶体金侧向层析试条上，所述生物素与所述抗生物素抗体结合，形成FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物；
S4、当所述阳性核酸扩增产物流至所述检测线T1处时，所述FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物以其异硫氰酸荧光素被所述检测线T1处上的抗异硫氰酸抗体捕获显示红色线，检测结果为HPV16型阳性；
当所述阳性核酸扩增产物流至所述检测线T2处时，所述DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物以其地高辛被所述检测线T2处上的地高辛抗体捕获显示红色线，检测结果为HPV18型阳性。
2.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，还包括：所述FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物流至所述胶体金侧向层析试条的质控线C处时，剩余的生物素抗体-胶体金复合物与质控线C处包被的羊抗鼠抗体结合显示红色线，指示检测结果有效可控。
3.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，步骤S1具体包括以下子步骤：
S11、通过NCBI网站查找并下载全部HPV高危病毒亚型的基因序列和全部的HPV高危亚型变异株病毒的基因序列；
S12、通过MEGA序列比对软件将所述HPV高危病毒亚型的基因序列与所述HPV高危亚型变异株病毒的基因序列一一进行对比，找出1000bp的保守碱基序列作为靶序列；
S13、利用LAMP引物设计软件对所述保守碱基序列的6个不同的区域设计出4-6条特异性引物，所述特异性引物包括HPV16的LAMP引物和HPV18的LAMP引物。
4.根据权利要求3所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，所述HPV16的LAMP引物为：
其中，F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，LoopF和LoopB为环引物。
5.根据权利要求3所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，所述HPV18的LAMP引物为：
其中，F3和B3为外引物，FIP和BIP为内引物，LoopF和LoopB为环引物。
6.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，LAMP等温扩增反应体系包括以下检测组分：
其中，所述LAMP引物混合物中包括1.6μMFIP和BIP，0.2μMF3和B3，0.4μMLoopF和LoopB，所述DNA模板使用DEPC水溶解。
7.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，所述LAMP等温扩增反应的反应条件为：65摄氏度恒温加热，孵育30min。
8.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，在步骤S2中，制备胶体金侧向层析试条包括：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和衬底五部分首尾相连组成所述胶体金侧向层析试条。
9.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，还包括：对HPV核酸样本进行LAMP等温扩增反应，若无扩增产物，则FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物不被所述检测线T1处上的抗异硫氰酸抗体捕获，也不被所述检测线T2处上的地高辛抗体捕获，在质控线C处被生物素捕捉显示红色线。
10.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，还包括：待所述阳性核酸扩增产物进入所述胶体金侧向层析试条的样品孔后，将所述胶体金侧向层析试条垂直放置在含有缓冲液的浸泡盒中，使缓冲液与所述胶体金侧向层析试条充分接触，通过毛细作用，所述阳性核酸扩增产物会沿着所述胶体金侧向层析试条上升，所述阳性核酸扩增产物与所述胶体金侧向层析试条上特定的探针结合。
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