CN117286095A - 无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法 - Google Patents

无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117286095A
CN117286095A CN202311236865.3A CN202311236865A CN117286095A CN 117286095 A CN117286095 A CN 117286095A CN 202311236865 A CN202311236865 A CN 202311236865A CN 117286095 A CN117286095 A CN 117286095A
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
cells
final concentration
medium
free medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311236865.3A
Other languages
English (en)
Inventor
郑辉
孟斐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regenerative Medicine And Health Innovation Center Hong Kong Institute Of Innovation Chinese Academy Of Sciences Ltd
Original Assignee
Regenerative Medicine And Health Innovation Center Hong Kong Institute Of Innovation Chinese Academy Of Sciences Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regenerative Medicine And Health Innovation Center Hong Kong Institute Of Innovation Chinese Academy Of Sciences Ltd filed Critical Regenerative Medicine And Health Innovation Center Hong Kong Institute Of Innovation Chinese Academy Of Sciences Ltd
Priority to CN202311236865.3A priority Critical patent/CN117286095A/zh
Publication of CN117286095A publication Critical patent/CN117286095A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及在使用病毒感染体细胞的基础上利用无血清培养基对胚胎成纤维细胞进行培养进而获得更多数目的心肌细胞的方法，主要涉及向细胞的基础培养基中添加少量蛋白添加剂以及小分子化合物，获得一种新型无血清培养基，以及在病毒感染胚胎成纤维细胞后使用该新型无血清培养基培养2天‑3天可以将胚胎成纤维细胞直接转分化成为心肌细胞并且显著提高转分化效率。利用本发明制得的无血清培养基可以在使用病毒将外源性转录因子(Gata4，Mef2c，Tbx5)过表达的条件下，显著提高胚胎成纤维细胞直接转分化为心肌细胞的转分化效率，为今后心肌细胞在临床疾病治疗中应用提供技术支撑。

Description

无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及细胞转分化技术，具体地，本发明主要涉及一种利用无血清培养基提高从成纤维细胞中获得心肌细胞效率的方法。
背景技术
近几十年来，随着小分子药物的快速发展，其在临床上的应用越来越广泛，这使得许多严重危害人类健康的疾病能够得到更为有效的治疗，提高人均寿命的同时也增强了人们的身体素质。但是，仍有部分严重危害人类健康的疾病，心血管疾病便是其中一类。虽然人们对于以心肌细胞损伤和心脏功能受损为特点的心血管疾病的认识和治疗方式已经有了极大的进步，这使得心血管疾病死亡率整体呈现出了下降的趋势，但是由于人类成年后的心肌细胞在受损后几乎丧失其增殖能力，并且传统的治疗手段主要聚焦如何限制疤痕的形成，因此心血管类疾病仍然是世界范围内致死率最高的疾病之一。包括心肌梗死在内的各种导致心肌损伤的因素都会使得心肌细胞数目减少，通常伴随着残余的心肌细胞功能衰退等现象，最终引发心力衰竭。因此，如何促进心肌再生，如何恢复心肌组织中仍具备功能的心肌细胞数目，是改善心肌功能、治疗心肌梗死的重要研究方向。
成体心肌细胞通常被认为是终末分化细胞，一般不具备增殖能力，但近年来有研究表明，人类和小鼠的成体心肌细胞每年会以极为缓慢的速度进行更新，这表明成体心肌细胞可能存在一定的增殖潜能。随着相关研究的不断深入，研究人员对于如何增加心肌细胞数目这一问题，存在三种主要思路；第一，刺激心肌细胞增殖，使得心肌细胞重新进入细胞周期，从而进行有丝分裂；第二，将体细胞(例如成纤维细胞)进行重编程使其直接转分化形成心肌细胞；第三，诱导各种干细胞像心肌细胞进行定向分化。但是，由于心肌细胞增殖能力非常弱，直接刺激心肌细胞增殖的效果并不能满足于临床治疗的需求，因此许多研究也在逐步尝试及探索其他可以增加心肌细胞数目的方法。
当心脏发生心肌梗死后将导致心肌细胞严重缺失，心肌梗死发生后，若不进行及时救治，则会造成心肌细胞的永久性死亡，引发心脏衰竭，严重影响心脏的功能及患者的生活质量。虽然目前传统的治疗措施可以在一定程度上缓解病情进展，但并不能使患者恢复如初；患者出现心脏衰竭后，常伴随心肌细胞缺血坏死、纤维化瘢痕形成等症状，使得治疗更加困难并且易导致不良预后。
干细胞领域的发展为人类治疗疾病提供了一条新的途径：首先将特定的细胞从人体内进行分离，随后在体外的适宜条件下将分离出的细胞进行扩增并转换为目的细胞，将其移植回体内后完成对受损的组织和器官的替换或者修复，从而达到疾病治疗的目的(Li等，How far are induced pluripotent stem cells from the clinic？Ageing researchreviews(2010)9(3):257-64；Grabel,Prospects for pluripotent stem celltherapies:into the clinic and back to the bench.J Cell Biochem(2012)113(2):381-7)。研究者曾经计划使用胚胎干细胞(ESCs)体外分化获得心肌细胞，但是由于胚胎干细胞来源不足、面临伦理争议、免疫排斥以及成瘤风险等问题，这一计划离实际应用有一段很大的距离。2006年建立的诱导多能干细胞技术(iPS技术)，使胚胎干细胞来源不足、伦理争议以及受体免疫排斥等问题在很大程度上都得以解决(Takahashi等，Induction ofpluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures bydefined factors.Cell(2006)126(4):663-76)。而2010年心肌转分化技术的建立则可以有效规避胚胎干细胞的成瘤性风险(Ieda等，Direct reprogramming of fibroblasts intofunctional cardiomyocytes by defined factors.Cell.2010；142(3):375-386)。这样，以干细胞为基础的再生医学有望成为治疗心血管疾病的重要手段。
体外获得心肌细胞主要有两种途径：1)利用iPS技术将体细胞变为多能干细胞，再通过定向分化获得心肌细胞；2)直接利用转分化技术从体细胞出发获得心肌细胞。早在1973年，Eguchi和Okada就提出了转分化(transdifferentiation)的概念，其是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为其他类型细胞的现象。此后，不同的细胞类型转换被科学家发现或者实现：胚胎成纤维细胞转换成具有收缩特性的肌细胞，在成年蝾螈四肢再生过程中，皮肤、肌肉和软骨细胞先转换为祖细胞，B淋巴细胞转换为巨噬细胞，耳蜗细胞转换成功能性的听觉细胞(Izumikawa等Auditory hair cell replacement and hearingimprovement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.Nat Med.2005；11(3):271-276.)。1996年，Naldini L等人发现逆转录病毒载体可以整合到基因组中，且允许基因进行长期的表达，因此开发了一种基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的逆转录病毒载体系统(Naldini L,U,Gallay P,et al.In vivo gene delivery and stabletransduction of nondividing cells by a lentiviral vector.Science.1996；272(5259):263-267.)。随后，Morita S等人发现了一种命名为PlatE的细胞系，这种细胞系可以高效且稳定的进行逆转录病毒的包装，可以长期且稳定地产生逆转录病毒(Morita S等，Plat-E:an efficient and stable system for transient packaging ofretroviruses.Gene Ther.2000；7(12):1063-1066.)，因此以该细胞系为基础的逆转录病毒包装体系广泛应用于宿主细胞的感染。
在心肌转分化方面，国内外也已经取得了一定的研究进展：2010年，科学家成功将小鼠成纤维细胞诱导成为功能性心肌细胞，同时发现了心肌转分化过程中发挥重要作用的三个转录因子(GMT)：Gata4，Mef2c，Tbx5(Ieda等，Direct reprogramming of fibroblastsinto functional cardiomyocytes by defined factors.Cell.2010；142(3):375-386)。
与采用ES/iPS细胞体外分化来获得心肌细胞的方法相比，体细胞转分化技术一定程度上能够规避成瘤风险，并且在获得目标细胞的周期会更短，也为潜在的心血管治疗提供了新思路。但是，目前大部分针对人类体细胞的转分化方法获得的心肌细胞比例非常低，且体外转分化获取到的心肌细胞与体内的心肌细胞相比，仍有一定的差异。
近年来研究者通过过表达转录因子、microRNA(miRNA)或者添加化学小分子的方式诱导成纤维细胞向心肌细胞以及心脏祖细胞进行转分化，相关成果不断涌现，为细胞疗法在心血管疾病中的应用提供了重要的理论依据。2011年，科学家发现，转录因子(OKSM)与化学小分子的共同作用可以直接将小鼠成纤维细胞转分化为具有功能的心肌细胞(Efe等，Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a directreprogramming strategy.Nature cell biology,13(3),215-222.)。2012年，Jayawardena等人研究发现外源性表达4种miRNA组合可以替代GMT等转录因子，完成由小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞的转分化过程(Jayawardena等，MicroRNA-mediated in vitro and invivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.CircRes.2012；110(11):1465-1473.)。
尽管当前存在多种方法获得心肌细胞，然而，目前转分化获得的心肌细胞仍面临着两大问题：其一，转分化效率较低。其二，所需的周期还是较长。另外，从安全性上考虑，通过干细胞的移植来治疗心血管系统疾病是否具有致瘤性还并没有被完全确定。
本发明的申请人曾经通过研发无血清培养基，用于提高胚胎成纤维细胞向神经细胞的转分化效率，说明该研究方向是可行的且具有较大的应用价值，但由于转分化过程的复杂性以及不同目标细胞的对培养物质的需求不同以及不可意料性，对于无血清培养基能否提高心肌细胞的转分化效率依然需要进一步研究。
发明内容
本发明提供一种无血清培养基，以及利用该无血清培养基在借助病毒使外源性转录因子过表达的条件下将胚胎成纤维细胞转分化为心肌细胞的方法。
本发明的第一目的是提供一种无血清培养基，该无血清培养基由基础培养基、蛋白添加剂以及小分子化合物和细胞培养辅助成分组成，能够提高胚胎成纤维细胞向心肌细胞的转分化效率。
一种无血清培养基，其由基础培养基、蛋白添加剂以及小分子化合物和细胞培养辅助成分组成；
所述蛋白添加剂为转铁蛋白，胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子中至少一种，其中，所述转铁蛋白的浓度为5.0ng/ml-50ng/ml，所述胰岛素的浓度为5ng/ml-30ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml-40ng/ml；所述小分子化合物为寡霉素，所述寡霉素的终浓度为10μg/ml-50μg/ml。
在其中一些实施例中，所述蛋白添加剂中转铁蛋白的浓度为5.0ng/ml-20ng/ml，优选为5.5±0.1ng/ml；所述蛋白添加剂中胰岛素的浓度为优选为5ng/ml-20ng/ml，优选为10±1ng/ml；所述蛋白添加剂中碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml-25ng/ml，优选为20±1ng/ml。
在其中一些实施例中，所述小分子化合物为寡霉素，所述寡霉素的终浓度为50±1μg/ml。
在其中一些实施例中，所述细胞培养辅助成分为NEAA、GlutaMAX、丙酮酸钠和2-巯基乙醇中的至少一种；
在其中一些实施例中，所述细胞培养辅助成分为为非必需氨基酸和GlutaMax。
作为优选的，所述细胞培养辅助成分为非必需氨基酸NEAA(体积终浓度1％)，GlutaMax(体积终浓度1％)。
在其中一些实施例中，其中所述基础培养基为其中所述基础培养基为Dulbecco’sModified Eagle’s Medium(DMEM),Minimal Essential Medium(MEM),Basal MediumEagle(BME),F-10,F-12,RPMI 1640,Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM),αMinimal Essential Medium(αMEM),Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium中的一种或两种以上的混合物。
在其中一些实施例中，所述基础培养基为DMEM和F12的混合物，作为优选的，所述基础培养基为DMEM和F12体积比为1：1的混合物。
在其中一些实施例中，所述无血清培养基由以下组成构成：以体积比1：1的DMEM和F12混合培养基为基础培养基，添加终浓度为5.5±0.1ng/ml的转铁蛋白，终浓度为10±0.5ng/ml的胰岛素，终浓度为20±1ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，终浓度为50±1μg/ml的寡霉素，以及细胞培养辅助成分：体积终浓度为1％的NEAA和体积终浓度为1％的GlutaMax。
本发明的第二目的是提供一种胚胎成纤维细胞转分化为心肌细胞的方法，该方法能够提高心肌细胞转分化效率。
一种将胚胎成纤维细胞转分化成为心肌细胞的方法，包括如下步骤：
(a)准备胚胎成纤维细胞；
(b)使用platE细胞包装能够过表达外源性转录因子Gata4，Mef2c，Tbx5的逆转录病毒。
(c)向(a)的细胞中加入上述逆转录病毒进行感染，使得外源性转录因子Gata4，Mef2c，Tbx5能够在胚胎成纤维细胞中进行过表达；
(d)随后使用任一项上述的无血清培养基，在适合于细胞生长的条件下，培养步骤(b)中的细胞1-3天，然后更换为心肌培养基继续培养，以获得心肌细胞。
本发明的第三目的是提供任一项上述的无血清培养基提高胚胎成纤维细胞转分化成为心肌细胞的效率中的应用。
在本发明提供了提高胚胎成纤维细胞直接转分化成为心肌细胞效率的技术手段，该技术手段涉及一种无血清培养基，当先使用该无血清培养基处理成纤维细胞48小时后再使用病毒感染成纤维细胞使得外源性转录因子(Gata4，Mef2c，Tbx5)过表达后，更换为心肌培养基继续培养成纤维细胞，显微镜明场视野下的细胞数目未发生明显变化；而当病毒感染成纤维细胞使得外源性转录因子(Gata4，Mef2c，Tbx5)过表达后，再使用所述无血清培养基处理成纤维细胞48小时，显微镜明场视野下细胞数目明显增多。在使用病毒过表达Gata4，Mef2和Tbx5的条件下，使用该无血清培养基对成纤维细胞进行处理后，通过免疫荧光实验对心肌细胞的标志性基因(cTNT)的表达情况进行检测，结果显示，心肌细胞的标志性基因(cTNT)存在表达，并且cTNT阳性细胞的比例有所增加，这表明上述处理过程可显著提高成纤维细胞直接转分化为心肌细胞的转分化效率。
本发明中，将外源转录因子表达与添加化学小分子这两种方式相结合，即在使用病毒过表达外源转录因子(Gata4，Mef2c，Tbx5)的基础上，向基础的细胞培养基中添加少量蛋白添加剂以及小分子化合物，我们实现了小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞的转分化，得到的心肌细胞可以表达心肌特异性标记蛋白cTNT。该方法将外源转录因子与化学小分子相结合，其中化学小分子具有易于合成、便于保存及定量等优势；同时可以通过设置浓度，通过培养基的组合和最合适的浓度，以及控制作用时间对化学小分子的功能发挥进行精确的控制，实现了可显著提高成纤维细胞直接转分化为心肌细胞的转分化效率的方法，该方法也在一定程度上规避了成瘤风险。
本发明所述无血清培养基和胚胎成纤维细胞转分化为心肌细胞的方法能够在体外更加安全快速的获得心肌细胞，为今后心血管疾病的临床治疗提供技术支撑。
附图说明
图1：优化的无血清培养基可以诱导小鼠胚胎成纤维细胞表达心肌细胞标志物(cTNT)的结果示意图。
图2：优化的无血清培养基培养与病毒处理的先后顺序影响小鼠胚胎成纤维细胞数目的结果示意图。
图3：优化的无血清培养基的连续培养对诱导小鼠胚胎成纤维细胞表达心肌细胞标志物(cTNT)的免疫荧光实验结果示意图。
图4：优化的无血清培养基的连续培养对诱导小鼠胚胎成纤维细胞表达心肌细胞标志物(cTNT)的流式分选结果示意图。
图5：非优化的无血清培养基对诱导小鼠胚胎成纤维细胞表达心肌细胞标志物(cTNT)的流式分选结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
“基础培养基”是指任何能够支持细胞生长的培养基。基础培养基提供了标准的无机盐例如锌、铁、镁、钙和钾，以及维生素、葡萄糖、缓冲系统以及关键的氨基酸。可以用于本发明的基础培养基包括但不限于Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、MinimalEssential Medium(MEM)、Basal Medium Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、αMinimalEssential Medium(αMEM)、Glasgow’s Minimal Essential Medium(G-MEM)、以及Iscove’sModified Dulbecco’s Medium。本领域的技术人员已知如何选择适用于所培养的细胞的基础培养基。在优选的实施方案中，基础培养基是DMEM与F12的混合物。在更优选的实施方案中，基础培养基是DMEM与F12体积比1:1的混合物。
“蛋白添加剂”是指在细胞培养中，用于加入到基础培养基中，支持细胞生存生长作用的添加剂，这些因子一般并不包含于基础培养基中，而是由通常培养细胞使用的血清所提供。蛋白添加剂包含支持细胞生长的至少一种或多种以下组分：一个或多个胰岛素及胰岛素替代物、一个或多个转金属蛋白及转金属蛋白替代物、一个或多个氨基酸、一个或多个激素及类激素化合物、血清白蛋白或血清白蛋白替代物。已知多种商业化的蛋白添加剂，例如KonckOut Serum Replacement(KOSR)，N2，B27，Insulin-Transferrin-SeleniumSupplement(ITS)，G5，bFGF等，这是本领域技术人员容易获得的。优选地，本文中所用的蛋白添加剂由转铁蛋白、胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子按一定比例混合得到的混合添加剂，更优选地，最终培养基中转铁蛋白的浓度为5.5ng/ml-50ng/ml，胰岛素的浓度为10ng/ml-30ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子的浓度在10ng/ml-40ng/ml之间；更优选的，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml-20ng/ml；最优选的方案是在最终培养基中转铁蛋白的浓度为5.5±0.1ng/ml，胰岛素的浓度为10±0.5mg/l，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为20±1ng/ml。
本发明所用的小分子化合物是指寡霉素。在本发明的培养基中，优选培养基中添加的寡霉素的浓度可以在10μg/ml-50μg/ml之间，更优选在大约50±1μg/ml。
本发明的无血清培养基是通过本领域技术人员已知的常规技术制备的，如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)中所述的混合配制血清的技术和条件。
本发明所用的病毒是通过本领域技术人员已知的常规技术制备的，参见例如Morita S等，Plat-E:an efficient and stable system for transient packaging ofretroviruses.Gene Ther.2000；7(12):1063-1066。
本发明中所述“体细胞”是相对于“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期(在小鼠中具体为受精后3.5天)之后的胎鼠或成年小鼠进行取材，取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源(如精原干细胞、生殖嵴干细胞等)。本文中所用的体细胞优选来源于人、大鼠或小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞。
本发明中所述“转分化”是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为其他类型细胞的现象，且这一转变不经过多能干细胞的中间过程。在本发明中，“转分化”指将不同来源的体细胞或成体干细胞转变为心肌细胞的过程。优选为将成纤维细胞转变为心肌细胞，最优选为胚胎成纤维细胞转变为心肌细胞。
本发明中所述的“适宜细胞生长的条件”是本领域的常规干细胞培养条件，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。
本发明中所述的检测心肌细胞的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Ieda等，Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes bydefined factors.Cell.2010；142(3):375-386)等。所述方法包括免疫荧光染色、流式细胞染色等。
除了特别说明,本文中提及的各种试剂均来自英杰生命科学公司(Invitrogen)、西格玛公司(Sigma)或者默克化工技术(上海)有限公司(Merck)。
实施例1：利用本发明所述无血清培养基提高小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞的转分化的效率。
一、按照现有的常规方法，获得小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞，包括以下两步。
1.小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养
取孕龄13-14天的小鼠，颈椎脱臼处死，浸泡在0.5％新洁尔灭中30s，取出后，将其固定在无菌的铺有吸水纸的解剖盘上，腹面向上。用75％的乙醇清洁孕鼠腹部，防止腹毛黏附在子宫及其他腹腔脏器上，造成污染。用无菌手术器械剖开孕鼠腹部皮肤层，肌肉层，暴露小鼠腹腔。用新的无菌手术器械去除黏连到子宫上的脂肪和结缔组织，迅速将小鼠子宫取出。将其放入预装有含双抗的PBS的10cm培养皿中。在超净工作台内，用含双抗的PBS洗涤小鼠子宫3次。用无菌眼科剪剪开包膜，将小鼠胚胎与胚外组织分离，将胚胎放置于新的预装有含双抗PBS的10cm培养皿中。用弯头眼科剪将小鼠胚胎剪至1-3mm3大小。向培养皿中加入适量0.25％和0.05％混合的胰蛋白酶，37℃条件下，消化10分钟，至溶液变浑浊，加入等体积MEF细胞培养基，终止消化。轻轻吹打混匀5-10次，静置。将细胞悬液转移至50ml离心管中，200g，离心5分钟。弃上清，向沉淀中加入MEF细胞培养基，轻轻吹打重悬，将细胞分种到15cm培养皿中，补充适量培养基，混匀，于37℃，5％CO2条件下培养。于第二天，观察细胞状态，更换新鲜培养基，标记细胞代数为P0。MEF细胞培养基(500ml)包含：高糖DMEM培养基430ml，FBS 60ml，GlutaMax和NEAA各5ml。
2.MEF细胞冻存
吸弃培养基，用DPBS洗涤细胞一次，加入适量0.25％胰蛋白酶，37℃条件下消化1-2分钟，加入等量MEF细胞培养基，终止消化。用巴氏吸管吹散细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管中，200g离心5分钟。弃上清，用MEF细胞培养基重悬细胞，吸取少量细胞进行计数，其余细胞重新离心。配置冻存液，冻存液成分为，10％DMSO+90％FBS。用冻存液重悬细胞，调整细胞浓度至3×106个/ml，每只冻存管加入0.5ml细胞悬液，标记冻存细胞名称，代数及冻存时间。将冻存管放入程序降温盒中，放于-80℃冰箱中进行过夜冻存。于第二天将冻存管取出，放入液氮中进行长期低温保存。
二、逆转录病毒包装
按照常规方法进行：复苏并扩增plat-E细胞，在细胞长至80％左右即可进行转染。Plat-E是非常重要的逆转录病毒包装细胞系，在加入特定的质粒后能够快速、短暂地产生高滴度逆转录病毒(Plat-E:an efficient and stable system for transientpackaging of retroviruses.S Morita 1,T Kojima,T Kitamura)。
转染前1小时将plat-E细胞培养基更换为新鲜培养基。在1ml Opti-MEM中加入10μg目的质粒(pMMLV-Hnf4α，pMMLV-Foxa3，pMMLV-Kmd2b)(对应一个10cm盘)，剧烈震荡后室温静置5分钟。每毫升Opti-MEM加入40μL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)，剧烈震荡后室温静置15分钟。将质粒混合液加入至plat-E细胞盘内，轻轻摇动混匀，置于37℃培养箱培养，于12h后更换新鲜培养基。在加入质粒混合液后第36h及60h时进行病毒收集。在进行第一次病毒收集时，将含有病毒的培养基吸至针筒内，用0.45μm的滤器过滤至离心管中，在合适的温度下保存，并加入一定体积的培养基继续培养。
三、MEF细胞转分化
从液氮罐中取出MEF细胞的冻存管，于37℃水浴快速振荡解冻，解冻后，用吸水纸擦去水滴。用75％酒精对冻存管外壁进行消毒后放入生物安全柜，于生物安全柜内吸取细胞悬液加入到15ml离心管中。逐滴加入MEF细胞培养液6ml，边加边振荡，200g，离心5分钟。弃上清，加入MEF培养基重悬，并将细胞转移到培养皿中，摇动铺匀后，与37℃，5％CO2条件下培养，待细胞长满10cm培养皿80％时传代培养。
移除培养基，用DPBS洗涤细胞一次，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，37℃条件下消化3分钟，加入2ml MEF细胞培养基，终止消化。用巴氏吸管吹散细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管中，200g离心5分钟。弃上清，用MEF细胞培养基重悬细胞，细胞计数，并调整细胞浓度。对于24孔板，每孔种MEF细胞1×104个，6孔板每孔种细胞5×104至8×104个，待细胞贴壁完全后(12-24小时)，添加可将外源转录因子(Gata4，Mef2c，Tbx5)过表达的病毒进行感染，全程需要对MEF细胞进行两次病毒感染，每次感染时间为12小时，随后更换新鲜的MEF培养基继续培养12h后，再次添加病毒进行感染，感染结束后更换本发明所述无血清培养基进行培养，此时标记天数为D0。
所述无血清培养基的组成为：以体积比1：1的DMEM和F12混合培养基为基础培养基，添加终浓度为5.5±0.1ng/ml的转铁蛋白，终浓度为10±0.5ng/ml的胰岛素，终浓度为20±1ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，终浓度为50±1μg/ml的寡霉素，以及细胞培养辅助成分：体积终浓度为1％的NEAA和体积终浓度为1％的GlutaMax。以下称上述无血清培养基为最优化的无血清培养基。
将上述配置培养基所需的蛋白添加剂、小分子化合物以及适于细胞生长的NEAA和GlutaMAX分别加入基础培养基中，颠倒混合均匀，同时避免产生大量泡沫(对于不同组分的加入顺序等没有要求，只是简单的混合)，配置好的培养基于4℃保存，可稳定保存2周。
其中蛋白添加剂在配置培养基之前应保存在-20℃，具体保存方式参见产品说明书。其中小分子化合物应先将粉末配置为高浓度储存液分装保存于-20℃，并避免反复冻融。
利用无血清培养基培养细胞0-3天后更换为心肌培养基(主要组成为DMEM，M199，FBS(体积终浓度10％)，NEAA(体积终浓度1％)Sodium Pyruvate(体积终浓度1％)，GlutaMAX(体积终浓度1％)，Penicillin-Streptomycin(体积终浓度1％)。
每天观察细胞状态，拍摄明场照片，记录细胞形变情况。每24h更换一次新鲜的无血清培养基，更换培养基前需提前将培养基置于室温进行预热。记录培养天数，逆转录病毒感染结束后培养第一天为D0，培养天数为D0至D16。
四、免疫荧光染色鉴定心肌细胞
将处理过的盖玻片在超净工作台内取出，用酒精灯点燃盖玻片上的残余无水乙醇，进行灼烧灭菌。将盖玻片放置在24孔板中，随后添加Matrigel没过盖玻片37℃放置过夜，随后将MEF细胞接种于盖玻片上。按照上述方法进行接种和培养，于D17取出24孔板。用PBS洗涤细胞一次，移除PBS，加入4％多聚甲醛进行固定，室温固定30分钟。完成固定后，用PBS洗涤3次，每次5分钟。随后利用0.3％ Triton-X100(PBS配置)进行通透，室温通透20分钟后，加入3％ BSA(PBS配置)溶液室温封闭2小时，PBS洗涤3次，每次5分钟。封闭结束后。向盖玻片中滴加一抗(稀释比例按照抗体说明书所提供，PBS+1％BSA稀释)200μl，4℃孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次5分钟，洗去残余一抗。加入二抗(Invitrogen 1：400稀释，PBS稀释)200μl，避光，室温孵育1h。用PBS洗涤三次，每次5分钟，洗去残余二抗。加入DAPI(终浓度为1μg/ml，PBS稀释)染液，对细胞核进行染色，避光，室温5分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟。洗去残余DAPI后，用封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察，拍照记录。
按照上述方法，在使用逆转录病毒对小鼠成纤维细胞将外源转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5过表达后，利用最优化的无血清培养基培养小鼠胚胎成纤维细胞2天，后更换心肌培养基继续培养至D16，之后利用免疫荧光的方法检测获得的心肌细胞标志物阳性的细胞比例。
如图1所示，在利用病毒进行外源转录因子过表达的基础上，再利用无血清培养基培养小鼠胚胎成纤维细胞后所获得细胞可以表达心肌细胞标志物的cTNT，而Phalloidin则用于标记丝状肌动蛋白，图中显示经过上述培养过程获得的肌肉细胞中存在部分cTNT阳性的细胞，这说明上述培养过程可以诱导产生心肌细胞。
实施例2：利用最优化的无血清培养基连续培养来提高小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞转分化的效率。
在使用逆转录病毒过表达外源转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5后，利用实施例1所述最优化的无血清培养基继续培养小鼠胚胎成纤维细胞0，1，2或3天后更换心肌培养基至D16(16天)，随后利用免疫荧光和流式分选的方法可以获得表达心肌细胞标志物的心肌细胞。
如图2所示，当先使用最优化的无血清培养基处理成纤维细胞48小时后，再使用病毒感染成纤维细胞24小时或48小时将外源性转录因子(Gata4，Mef2c，Tbx5)进行过表达后，更换为心肌培养基继续培养成纤维细胞，显微镜明场视野下的细胞数目未发生明显变化；而当先使用病毒感染成纤维细胞24小时或48小时将外源性转录因子(Gata4，Mef2c，Tbx5)进行过表达后，再使用最优化的无血清培养基处理成纤维细胞48小时，显微镜明场视野下细胞数目明显增多。当在病毒将外源性转录因子(Gata4，Mef2c，Tbx5)过表达的条件下，使用最优化的无血清培养基对成纤维细胞进行处理后，通过免疫荧光实验对心肌细胞的标志性基因(cTNT)的表达情况进行检测，结果显示，心肌细胞的标志性基因(cTNT)存在表达，并且cTNT阳性细胞的比例有所增加，这表明上述处理过程可显著提高成纤维细胞直接转分化为心肌细胞的效率。
如图3所示，在使用病毒过表达外源转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5后，利用最优化的无血清培养基连续培养小鼠胚胎成纤维细胞1-3天后，使用4％多聚甲醛将细胞进行固定，使用免疫荧光的方法对所获得细胞中心肌细胞标志物cTNT的表达情况进行检测，检测结果显示所获得细胞可以表达心肌细胞标志物cTNT，与使用病毒过表达外源转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5，但未添加最优化无血清培养基的对照组(WT，直接用心肌培养基培养16天)相比，利用最优化的无血清培养基对细胞进行连续培养，尤其是培养至D3时，绿色荧光标记的cTNT阳性细胞数目显著增加，这表明使用病毒过表达外源转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5后添加最优化的无血清培养基进行连续培养2天-3天可以显著提高小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞转分化的效率。
如图4所示，利用最优化的无血清培养基连续培养小鼠胚胎成纤维细胞1-3天后，将细胞使用4％多聚甲醛固定，使用流式分选的方法对所获得细胞中心肌细胞标志物cTNT的表达情况进行检测，检测结果显示所获得的细胞可以表达心肌细胞标志物cTNT，并且与使用病毒过表达外源转录因子，但未添加最优化无血清培养基的对照组(WT)以及完全不表达cTNT的阴性对照组(Nag CT)的细胞相比，利用最优化的无血清培养基对细胞进行连续培养，尤其是培养至D3时，cTNT阳性细胞数目显著增加，这进一步表明使用病毒过表达外源转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5后再使用最优化的无血清培养基进行连续培养可以显著提高小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞转分化的效率。
实施例3：利用非最优化的无血清培养基实现小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞的转分化
在使用病毒进行外源转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5的过表达后，利用非最优化的无血清培养基(包括以体积比1：1的DMEM和F12混合培养基为基础，添加不同浓度及不同组合的转铁蛋白、胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子的培养基，所述细胞培养辅助成分为非必需氨基酸NEAA(体积终浓度1％)，GlutaMax(体积终浓度1％))。按照实施例1中的培养方法，利用无血清培养基首先培养小鼠胚胎成纤维细胞2天，随后更换心肌培养基继续培养至D16后，利用免疫荧光的方法确定细胞中表达心肌细胞标志物(cTNT)的比例。
其中，非最优化的无血清培养基组成如下表所示：
转铁蛋白 胰岛素 碱性成纤维细胞生长因子 寡霉素
最优化 5.5ng/ml 10ng/ml 20ng/ml 50μg/ml
1 5.5ng/ml 10ng/ml 10ng/ml 10μg/ml
2 5.5ng/ml 10ng/ml 10ng/ml 10μg/ml
3 5.5ng/ml 10ng/ml 20ng/ml 10μg/ml
4 5.5ng/ml 30ng/ml 20ng/ml 10μg/ml
5 5.5ng/ml 30ng/ml 0ng/ml 10μg/ml
6 5.5ng/ml 30ng/ml 20ng/ml 50μg/ml
7 5.5ng/ml 30ng/ml 40ng/ml 10μg/ml
8 50ng/ml 0ng/ml 20ng/ml 10μg/ml
9 100ng/ml 50ng/ml 20ng/ml 0μg/ml
如图5所示，在使用病毒将外源转录因子进行过表达后，与只添加心肌培养基的对照组(iCM)相比，最优化的无血清培养基处理组中获得心肌细胞标志物(cTNT)阳性细胞的比例最高，但是非最优化的无血清培养基也可以获得表达心肌细胞标志物(cTNT)的细胞，这表明非最优化培养基在一定程度上也可以实现小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞的转分化，但最优化的无血清培养基对小鼠胚胎成纤维细胞向心肌细胞转分化的作用最为显著。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种无血清培养基，其特征在于：其由基础培养基、蛋白添加剂、小分子化合物组成和细胞培养辅助成分组成；
所述蛋白添加剂包括转铁蛋白，胰岛素，碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种，所述转铁蛋白的终浓度为5.0ng/ml-50ng/ml，所述胰岛素的终浓度为5ng/ml-30ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml-40ng/ml；所述小分子化合物为寡霉素，所述寡霉素的终浓度为10μg/ml-50μg/ml。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述蛋白添加剂为转铁蛋白，胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子，其中，所述转铁蛋白的终浓度为5.0ng/ml-20ng/ml，所述胰岛素的终浓度为5ng/ml-20ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml-25ng/ml。
3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述转铁蛋白的终浓度为5.5±0.1ng/ml，所述胰岛素的终浓度为10±0.5ng/ml，和所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为20±1ng/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的无血清培养基，其特征在于：所述寡霉素的终浓度为50±1μg/ml。
5.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述细胞培养辅助成分为非必需氨基酸，GlutaMax，丙酮酸钠，2-巯基乙醇中的至少一种；优选的，所述细胞培养辅助成分为为非必需氨基酸和GlutaMax；
更优选地，所述非必需氨基酸的体积终浓度为1％，所述GlutaMax的体积终浓度为1％。
6.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：其中所述基础培养基为DMEM、MEM、BME、F-10、F-12、RPMI 1640、GMEM、αMEM、
IMDM中的一种或两种以上的混合物；优选的，所述基础培养基为DMEM和F12的混合物。
7.根据权利要求6所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM和F12体积比为1：1的混合物。
8.根据权利要求7所述的无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基由以下组成构成：以体积比1：1的DMEM和F12混合培养基为基础培养基，
添加终浓度为5.5±0.1ng/ml的转铁蛋白，终浓度为10±0.5ng/ml的胰岛素，终浓度为20±1ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，终浓度为50±1μg/ml的寡霉素，以及细胞培养辅助成分：体积终浓度为1％的NEAA和体积终浓度为1％的GlutaMax。
9.权利要求1-8任一项所述的无血清培养基在胚胎成纤维细胞直接转分化成为心肌细胞中的应用。
10.一种将胚胎成纤维细胞转分化成为心肌细胞的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(a)准备胚胎成纤维细胞；
(b)获得platE细胞包装的能够过表达外源性转录因子Gata4，Mef2c，Tbx5的三种逆转录病毒；
(c)向(a)的细胞中加入所述三种逆转录病毒进行感染，使得外源性转录因子Gata4，Mef2c，Tbx5能够在胚胎成纤维细胞中进行过表达；
(d)随后使用权利要求1-8任一项所述的无血清培养基，在适合于细胞生长的条件下，培养步骤(c)中的细胞2-3天，然后更换为心肌培养基继续培养，以获得心肌细胞。
CN202311236865.3A 2023-09-22 2023-09-22 无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法 Pending CN117286095A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311236865.3A CN117286095A (zh) 2023-09-22 2023-09-22 无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311236865.3A CN117286095A (zh) 2023-09-22 2023-09-22 无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117286095A true CN117286095A (zh) 2023-12-26

Family

ID=89240283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311236865.3A Pending CN117286095A (zh) 2023-09-22 2023-09-22 无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117286095A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2017018137A (ja) ヒト多能性細胞培養のための簡易基本培地
CN104726406B (zh) 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法
CN104560869B (zh) 一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法
CN105683359B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为肝细胞的方法
CN109749997B (zh) 一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法
JP6711759B2 (ja) 間葉系幹細胞から誘導された万能幹細胞を利用して神経細胞に分化させる方法
WO2021018296A1 (zh) 一种通过体细胞重编程制备诱导多能干细胞的方法
CA3095490A1 (en) A method of inducing or improving wound healing properties of mesenchymal stem cells
CN102144027A (zh) 生产多能干细胞的方法
CN106282113B (zh) 一种利用无血清培养基通过转分化获得神经细胞的方法
JP6711756B2 (ja) 間葉系幹細胞から誘導された万能幹細胞を利用して脂肪細胞に分化させる方法
Tao et al. Noggin induces human bone marrow-derived mesenchymal stem cells to differentiate into neural and photoreceptor cells
AU2014396937A1 (en) Method for manufacturing induced pluripotent stem cells from adipose-derived mesenchymal stem cells and induced pluripotent stem cells manufactured by same method
CN117286095A (zh) 无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法
CN105705631B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为造骨细胞的方法
CN112608904B (zh) 一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用
CN102994447B (zh) 一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法
CN111718898B (zh) 提高滑膜间充质干细胞逆境耐受性的方法及其试剂
Yu et al. Differentiation of human embryonic germ cells and transplantation in rats with acute myocardial infarction
US20200325443A1 (en) Method of inducing or improving wound healing properties of mesenchymal stem cells
CN117264872A (zh) 无血清培养基及其在提高转分化肝脏细胞的效率中的应用
KR101982835B1 (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 췌장의 베타세포로 분화시키는 방법
CN118240883B (zh) 一种炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法
CN117210392B (zh) 一种LncRNA在制备防治心梗的药物中的应用
CN114231567B (zh) 一种人肺特络细胞系构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Country or region after: Hong-Kong

Address after: 5th floor, 1 Central Leisure Plaza, Hong Kong, China

Applicant after: Regenerative Medicine and Health Innovation Center, Hong Kong Institute of Innovation, Chinese Academy of Sciences

Address before: 5th floor, 1 Central Leisure Plaza, Hong Kong, China

Applicant before: Regenerative medicine and health innovation center, Hong Kong Institute of innovation, Chinese Academy of Sciences, Ltd.

Country or region before: Hong-Kong