CN117269497A - 甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的组合物、应用和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甲状腺乳头状癌的诊断和风险评估技术领域,尤其涉及一种用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的组合物、应用和系统。一种用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的组合物,该组合物包括用于测量CLDN16蛋白表达水平,和/或编码CLDN16蛋白的基因的mRNA表达水平的试剂。通过该组合物可以术前检测甲状腺组织中的CLDN16的mRNA表达水平,用于对甲状腺乳头状癌的原发灶和转移灶进行精准的诊断,同时对甲状腺乳头状癌的疾病风险进行精准预测,指导临床决策。
Description
技术领域
本发明涉及甲状腺乳头状癌的诊断和风险评估技术领域,尤其涉及一种用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的组合物、应用和系统。
背景技术
甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,全球发病率以每年3.6%的增幅上升,成为增长速度最快的恶性肿瘤之一。2020年全球癌症统计数据显示,甲状腺癌新增病例高达58.6万,在全球癌症发病率中排名第9位,其中女性甲状腺癌发病率10.1/10万,为全球女性第5大高发癌症,占全部恶性肿瘤新发人数的3.8%。2018年全国肿瘤登记年报显示,我国甲状腺癌发病率为13.17/10万,女性发病率为20.28/10万,在恶性肿瘤和女性恶性肿瘤中分别是第7位和第4位,是增长速度最快的恶性肿瘤之一。因此,甲状腺癌逐渐成为我国公共卫生健康方面的一个亟需解决的问题。
甲状腺癌常见的病理类型有甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma, FTC)、甲状腺髓样癌(medullarythyroid carcinoma, MTC)和甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma, ATC)。其中PTC占所有甲状腺癌的90%以上。在甲状腺乳头状癌中,最常见的临床表现为甲状腺结节,超声引导下细针穿刺细胞学检查(Fine Needle Aspiration Biopsy,FNAB)对甲状腺结节的诊断尤为重要,其虽然大大提高了甲状腺癌的检出率和诊断准确率,但仍有25%~30%的FNA样本诊断不明确,这一部分为“不确定细胞学”,即意义不明的非典型或滤泡状病变(FNAⅢ类)和滤泡状肿瘤或可疑滤泡状肿瘤(FNA Ⅳ类),以上均有不能忽略的恶性风险(10%~30%和25%~40%)。根究一项研究统计,考虑到小结节直径和病理学家的诊断经验,据报告,大约17%(10%-26%)的FNAB不确定,6%(1%-11%)无法诊断[9, 10]。这些结果不确定或无法诊断的患者大多接受重复的FNAB或不必要的诊断手术,使他们遭受甲状腺激素的终身替代治疗和相应的手术并发症。因此,对甲状腺结节进行精确的良恶性诊断至关重要,这不仅可以使甲状腺癌的病人得到及时有效的治疗,提高患者的生存率,还可以使甲状腺良性的病人避免过度治疗。同时,PTC是一种侵袭性相对较低、预后良好的肿瘤,五年生存率可达90%以上,因此已有一些研究认为,部分低危的PTC,尤其是甲状腺乳头状微小癌,可以通过密切的随访来替代手术治疗。然而在临床中,仍有高达10%的PTC患者,易出现转移,肿瘤的复发率和死亡率高。针对该部分患者缺乏有效的术前预测模型,如果仅凭借医生的临床经验对甲状腺癌病人进行随访或手术治疗,往往导致低危病人的过度治疗,而部分高危病人延误手术治疗时机,从而造成手术范围和难度的扩大。因此,鉴于甲状腺癌的预后差异性,迫切需要建立一套术前风险评估体系来精准区分不同危险分层的甲状腺癌,指导临床手术决策和术后随访计划。
申请人申请的中国发明专利申请(公开号:CN114606315A,公开日:2022-06-10)公开了一种甲状腺乳头状癌的生物标记物及PIM1基因抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制剂中的应用,所述生物标记物为受BRAF V600E突变调控的PIM1蛋白。该发明研究PIM1基因及BRAF V600E突变在PTC病理发展过程中的作用,发现PIM1在PTC的发生发展中可能起着重要的致癌作用,并且,PIM1在PTC中的作用是受到了上游BRAF V600E突变和NOX4的调控,即BRAF V600E突变调控NOX4,然后NOX4再调控PIM1。
申请人申请的中国发明专利申请(公开号:CN112852960A,公开日:2021-05-28)公开了一种甲状腺乳头状癌的生物标记物及PIM1基因抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制剂中的应用,所述生物标记物为PIM1基因及其表达产物。本发明研究PIM1基因在PTC病理发展过程中的作用,发现PIM1在PTC的发生发展中可能起着重要的致癌作用,并且PIM1与NOX4的表达显著相关,即PIM1在PTC中受NOX4的调控,从而发挥其在氧化损伤中的作用。可见,该发明对PTC的发病机制的理论研究具有重要的意义和价值,并且,该发明中的生物标记物能作为PTC诊断的标记物,从而提高PTC诊断的准确性,为PTC诊断产品的研究提供理论基础。
中国发明专利申请(公开号CN111808950A,公开日: 2020-10-23)公开了一种与甲状腺乳头癌相关的miRNA标志物,所述标志物为miRNA-503-5p;同时,提供了所述miRNA标志物在制备预判甲状腺癌风险或诊断甲状腺乳头癌的工具中的应用。本发明通过GEO和TCGA数据库中甲状腺乳头状癌miRNA数据进行分析,筛选出与甲状腺乳头状癌有关的miRNA,用荧光定量PCR验证其在临床样本中的表达,为甲状腺乳头状癌的诊断及治疗提供依据。经检验证明,miRNA-503-5p能有效的区分甲状腺乳头状癌标本和正常标本。
Claudin家族由20多种跨膜蛋白组成,它们是紧密连接的主要组成部分。它们作为物理屏障,阻止分子自由通过上皮或内皮细胞片之间的细胞旁空间,并在维持细胞极性和信号转导方面发挥关键作用。Claudin-16是claudins家族的一员,是一种紧密连接蛋白,在维持各种上皮的细胞极性、细胞排列、粘附、细胞旁运输和离子通透性中发挥重要作用,但其缺乏在甲状腺乳头状癌中的诊断及风险评估等临床应用。
发明内容
为了解决上述的技术问题,本发明的目的是提供一种用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的组合物,通过该组合物可以术前检测甲状腺组织中的CLAUDIN-16的mRNA表达水平,用于对甲状腺乳头状癌的原发灶和转移灶进行精准的诊断,同时对甲状腺乳头状癌的疾病风险进行精准预测,指导临床决策。
为了实现上述的目的,本发明采用了以下的技术方案:
一种用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的组合物,该组合物包括用于测量CLAUDIN-16(NCBI Gene: 10686)蛋白表达水平,和/或编码CLAUDIN-16蛋白的基因的mRNA表达水平的试剂。
作为优选,该组合物还包括用于测量BRAF V600E突变蛋白表达水平,和/或编码BRAF V600E突变蛋白的基因的mRNA表达水平的试剂。
作为优选,所述用于测量蛋白表达水平的试剂包含抗体、寡肽、配体、PNA或适体,所述试剂可特异性结合至所述蛋白。
作为优选,所述用于测量mRNA表达水平的试剂包含引物、探针或反义核苷酸,所述试剂可特异性结合至编码所述标记物蛋白的基因的mRNA;测试方法包括PCR、基因芯片、二代高通量测序中的任意一种或至少两种的组合。
进一步,本发明还公开了所述的组合物在制备用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的试剂中的应用。
进一步,本发明还公开了所述的组合物在制备用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的系统中的应用。
进一步,本发明还公开了一种用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的系统,该系统包括:
1)所述的组合物或所述的试剂盒;
2)采用所述的组合物进行蛋白表达水平和/或编码蛋白的基因的mRNA表达水平测试的设备;
3)计算机设备,所述计算机设备包括存储器和处理器,存储器存储甲状腺乳头状癌的术前诊断模型和/或风险评估模型;处理器执行通过所述的术前诊断模型和/或风险评估模型对甲状腺乳头状癌的原发灶和转移灶进行精准的诊断,和/或对甲状腺乳头状癌的疾病风险进行精准预测。
作为优选,受试者样品是血液、血清或血浆。
作为优选,蛋白表达水平的测量使用可分别特异性结合至相应蛋白的抗体、寡肽、配体或适体。
作为优选,蛋白表达水平的测量或比较通过使用选自以下的至少一种来进行:蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测定、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、补体结合试验、2-D电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)。
作为优选,其中mRNA表达水平的测量通过使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核糖核酸酶保护测定、RNA印迹法、DNA芯片或二代高通量测序方法来进行。
作为优选,编码CLAUDIN-16蛋白的基因的mRNA表达水平的测量方法包括以下的步骤:
1)将mRNA打断成200nt至700nt的短片段后以mRNA为模板,用六碱基随机引物合成第一条eDNA链;
2)加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成第二条eDNA链;
3)在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复,加polyA并连接测序接头,然后采用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,最后进行PCR扩增建立测序文库;
4)构建转录组文库,凝胶电泳进行质检后上机,进行测序得到测序序列;
5)在测序后过滤掉原始数据中不合格的序列,得到有效数据用于后续分析。
作为优选,针对测序前的RawData以及过滤后的CleanData进行基于FastQC的数据质量控制,从GC比,序列长度,碱基序列质量等的角度对于过滤前后的数据质量进行评估;采用HISAT2进行参考基因组比对,将RNA-Seq的信息比对到人类基因组上,获得详细的基因表达信息;同时根据Hisat2的比对结果,根据MappedReads采用HTSeq进行表达量统计,得到每一个样本的每一个基因Counts数;优选,基于每一个基因的Counts数,使用FPKM值作为基因表达量的衡量指标,统计得到每一个样本每一个基因的表达情况。
作为优选,CLAUDIN-16蛋白的检测方法如下:使用CLAUDIN-16的抗体,通过S-P免疫组化染色法,采用综合积分法对IHC染色进行判定:
1)、阳性细胞数计分:无阳性细胞为0分、1-10%为1分、11-50%为2分、51-80%为3分、81-100%为4分;
2)、染色强度计分:无染色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分;
3)、两项乘积即为总分,0分为阴性(-)、1-4分为弱阳性(+)、5-8分为阳性(++)、9-12分为强阳性(+++)。
作为优选,甲状腺乳头状癌的术前诊断模型的构建方法如下:通过ROC曲线确定CLAUDIN-16 mRNA表达阳性和阴性的最佳截止点FPKM=1.25,对样本的CLAUDIN-16的mRNA的表达水平进行检测,当FPKM≥1.25时,记1分,同时对样本的BRAFV600E进行检测,当BRAFV600E突变时,记1分,当分数≥1分时,判断为恶性,<1分时,判断为良性,用于甲状腺乳头状癌的术前诊断。
作为优选,甲状腺乳头状癌的术前风险评估模型的构建方法如下:预测模型由Libsvm 3.20使用 MATLAB 2022a的建模平台建立;使用 C-SVC、RBF 核函数和网格搜索法调试模型;网格 c 边界、网格 c 步长、网格 g 边界和网格 g 步长分别为 -8 至 8、0.5、-8 至 8 和 0.5;正值表示高风险PTC,负值表示非高风险PTC;模公式如下:Plabel = sgn(Σni = 0 wi exp(−gamma|(xi-x)|2+b))。
再优选,所述风险评估预测模型中纳入CLAUDIN-16的表达水平和BRAF V600E的突变状态,患者年龄、性别,进行建模,构在建模过程中,模型优化方面,对非线性SVM模型使用网格搜索法选取参数,对所构建模型进行指标筛选时,分别先后使用阈值法、枚举法、向后法、向前法算法建模,并根据这些常用算法的特性来对指标筛选算法进行必要的改善;在对模型的效果评估中,使用准确率、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、AUC指标,并以准确性为最主要的标准。
本发明由于采用了上述的技术方案,通过术前检测甲状腺组织中的CLAUDIN-16的mRNA表达水平,集合BRAF V600E突变,用于对甲状腺乳头状癌的原发灶和转移灶进行精准的诊断,同时对甲状腺乳头状癌的疾病风险进行精准预测,指导临床决策。
附图说明
图1为CLAUDIN-16基因在甲状腺乳头状癌中细胞中的表达情况及分子功能。
图2为CLAUDIN-16基因在甲状腺乳头状癌中的病例表达情况。
图3为CLAUDIN-16、BRAF V600E突变及联合在甲状腺乳头状癌良恶性鉴别中的ROC曲线。
图4为CLAUDIN-16结合BRAF V600E突变在甲状腺乳头状癌中的分子分型。
具体实施方式
下面结合本发明实施例,将实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护范围。
一、实验方法:
1.甲状腺癌细胞系的获得和培养
8505C甲状腺癌细胞系从德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)获得, Nthy、KHM-5M、KMH2,C643、CAL62、BCPAP、TPC1、KTC1从中国细胞系资源库(中国上海)购买。所有的细胞系均在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养,在37%,含5%CO2的培养箱中培养。
2.甲状腺乳头状癌细胞系的迁移、侵袭能力的检测:
利用 RNA干扰序列,构建CLAUDIN-16敲降的PTC细胞模型,通过transwell小室迁移、侵袭等实验,考察细胞的迁移、侵袭能力;同时通过蛋白印迹实验,考察上皮间质化(EMT)通路相关蛋白N-Cadherin和E-Cadherin的表达水平。
3.CLAUDIN-16 mRNA的检测技术:
使用Epicentre® Ribo-zero rRNA Removal Kit (Human) 试剂盒移除rRNA进行全转录组测序。加入fragmentationbuffer将mRNA打断成200nt至700nt的短片段后以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条eDNA链;加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I合成第二条eDNA链;在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复,加poly A并连接测序接头,然后采用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,最后进行PCR扩增建立测序文库。使用NEBNext®Ultra™ 构建转录组文库,凝胶电泳进行质检后上机,采用Illumina Novo-Seq 6000进行测序得到测序序列。在测序后使用Cutadapt过滤掉原始数据中不合格的序列(测序接头、低质量序列等)得到有效数据(CleanData)用于后续分析。本研究的过滤标准如下:1. 过滤掉污染序列。2. 过滤大量测序判定失败序列(包含大量N的序列)3.过滤掉测序质量过低的序列(一条序列20%的序列低于Q值20,即单碱基错误大于1%)4. 长度过短的序列(50bp)。针对测序前的Raw Data以及过滤后的Clean Data进行基于Fast QC的数据质量控制,从GC比,序列长度,碱基序列质量等的角度对于过滤前后的数据质量进行评估。采用HISAT2 进行参考基因组比对,将RNA-Seq的信息比对到人类基因组上,获得详细的基因表达信息;同时根据Hisat2的比对结果,根据Mapped Reads采用HTSeq进行表达量统计,得到每一个样本的每一个基因Counts数。而为了更为准确的获得基因的详细表达情况,我们基于每一个基因的Counts数,使用FPKM值(Fragments PerKilobase Million,基于基因的原始reads count标准化而来)作为基因表达量的衡量指标,统计得到了每一个样本每一个基因的表达情况。
4.CLAUDIN-16 蛋白的检测技术:
使用CLAUDIN-16的抗体,通过S-P免疫组化染色法,采用综合积分法对IHC染色进行判定:1)、阳性细胞数计分:无阳性细胞为0分、1-10%为1分、11-50%为2分、51-80%为3分、81-100%为4分;2)、染色强度计分:无染色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分;3)、两项乘积即为总分,0分为阴性(-)、1-4分为弱阳性(+)、5-8分为阳性(++)、9-12分为强阳性(+++)。
5.构建甲状腺乳头状癌的术前诊断模型
通过ROC曲线确定CLAUDIN-16 mRNA表达阳性和阴性的最佳截止点:FPKM=1.25,对样本的CLAUDIN-16的mRNA的表达水平进行检测,当FPKM≥1.25时,记1分,同时对样本的BRAF V600E进行检测,当BRAF V600E突变时,记1分;当分数≥1分时,判断为恶性,<1分时,判断为良性,用于甲状腺乳头状癌的术前诊断。
6.构建甲状腺乳头状癌的术前风险评估模型
支持向量机(SVM)用于建立PTC 风险评估预测模型。预测模型由 Libsvm 3.20(https://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm/) 使用MATLAB 2022a (MathWorks,USA) 的建模平台建立。使用 C-SVC、RBF 核函数和网格搜索法调试模型。网格 c 边界、网格 c 步长、网格 g 边界和网格 g 步长分别为 -8 至 8、0.5、-8 至 8 和 0.5。由于我们将患者分为两组,正值表示高风险PTC,负值表示非高风险PTC。
建模公式:Plabel = sgn(Σni = 0 wi exp(−gamma|(xi-x)|2+b))
该风险评估预测模型,纳入CLAUDIN-16的表达水平(联系变量)和BRAF V600E的突变状态(突变/未突变),患者年龄(连续变量)、性别(男性/女性),进行建模,构在建模过程中,模型优化方面,对非线性SVM模型使用网格搜索法选取参数,对所构建模型进行指标筛选时,分别先后使用阈值法、枚举法、向后法、向前法等算法建模,并根据这些常用算法的特性来对指标筛选算法进行必要的改善。在对模型的效果评估中,我们主要使用准确率、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、AUC等指标,并以准确性为最主要的标准。
甲状腺乳头状癌风险评估SVM模型的相关参数:
Parameters: [5×1 double]
nr_class: 2
totalSV: 289
rho: -0.6861
Label: [2×1 double]
ProbA: []
ProbB: []
nSV: [2×1 double]
sv_coef: [289×1 double]
SVs: [289×4 double]
7.BRAF V600E突变的检测方法
BRAF V600E突变的检测采用现有的技术,参见《临床医学进展, 2022, 12(9),8499-8507》公开的BRAF V600E在甲状腺乳头状癌临床应用性中的研究进展;也可以采用申请人申请的中国发明专利申请(公开号:CN114606315A,公开日:2022-06-10)。
二、实验结果:
1.CLAUDIN-16基因在甲状腺乳头状癌中细胞中的表达情况及分子功能
图1 显示了CLAUDIN-16基因在甲状腺乳头状癌中细胞中的表达情况及分子功能;其中:图1A示例显示CLAUDIN-16蛋白在甲状腺乳头状癌细胞中(BCPAP,TPC1,KTC1)中呈现高表达,表达水平显著高于其他甲状腺癌细胞系;图1B示例显示CLAUDIN-16 mRNA在甲状腺乳头状癌细胞系中(BCPAP,TPC1,KTC1)表达水平显著高于甲状腺正常细胞系(Nthy);图1C,1D示例显示CLAUDIN-16基因敲除后,显著抑制甲状腺乳头状癌细胞的迁移和侵袭能力;图1E,1F示例显示CLAUDIN-16基因敲除后,其N-Cadherin表达显著降低,E-Cadherin表达显著升高,表面其抑制甲状腺乳头状癌细胞的EMT功能。
2.CLAUDIN-16基因在甲状腺乳头状癌中的病例表达情况
图2显示了CLAUDIN-16基因在甲状腺乳头状癌中的病例表达情况,其中:图2A-C示例显示在TCGA数据库,GSE27155数据库和中国的临床数据中,CLAUDIN-16 mRNA在甲状腺乳头状癌病例中中呈现高表达,表达水平显著高于甲状腺正常组织和甲状腺良性肿瘤;图2D-F示例显示在GSE33630,GSE29265和GSE27155数据库中,CLAUDIN-16 mRNA在甲状腺乳头状癌病理中表达水平显著高于甲状腺其他类型肿瘤(甲状腺未分化癌,甲状腺髓样癌,甲状腺滤泡状癌);图2G示例显示在中国的临床数据中,CLAUDIN-16 蛋白在甲状腺乳头状癌中表达显著高于甲状腺其他类型肿瘤(甲状腺未分化癌,甲状腺滤泡状癌)。
3.CLAUDIN-16结合BRAF V600E突变在甲状腺乳头状癌中的术前诊断价值
表1
表1示例显示确定RPKM=1.25作为CLAUDIN-16 mRNA的截止点,结合BRAF V600E突变组成分子组合 ,诊断甲状腺乳头状癌的良恶性的诊断价值:在TCGA样本中诊断准确率达为89.4%,中国临床数据中诊断准确率为96.6%,在BRAF V600E野生型临床样本中诊断准确率为93.9,在甲状腺穿刺样本中诊断准确率为97.7%,显著高于现有国外主流甲状腺癌诊断模型的准确率。
4.CLAUDIN-16、BRAF V600E突变及联合在甲状腺乳头状癌良恶性鉴别中的ROC曲线
如图3所示,图3A示例显示在TCGA数据库中,CLAUDIN-16联合BRAF V600E用于鉴别甲状腺良恶性结节的诊断效率(ROC=0.925)显著高于CLAUDIN-16(ROC=0.922)或BRAFV600E (ROC=0.742)单独应用;图3B示例显示在我们中心样本中,同样提示CLAUDIN-16联合BRAFV600E用于鉴别甲状腺良恶性结节的诊断效率(ROC=0.976)显著高于CLAUDIN-16(ROC=0.937)或BRAF V600E (ROC=0.870)单独应用。
5.CLAUDIN-16结合BRAF V600E突变在甲状腺乳头状癌中的分子分型
如图4所示,图4A示例显示CLAUDIN-16基因结合BRAF V600E突变可以对甲状腺乳头状癌进行分子分型,可以分成4种亚型,这4种亚型可以反应甲状腺乳头状癌的不同临床特征,用于区分甲状腺乳头状癌的风险程度;图4B示例显示4种甲状腺乳头状癌的分子分型的甲状腺乳头状癌的分化程度,该4种分型,可以很好的区分甲状腺癌的临床风险。
6.CLAUDIN-16在甲状腺乳头状癌中的术前风险评估的预测价值
表2
表2示例说明甲状腺乳头状癌的术前风险评估模型,其在174例训练集中预测准确率达92.0%,126例验证集中,预测准确率达100%。
以上为对本发明实施例的描述,通过对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列,而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的组合物,其特征在于,该组合物包括用于测量CLAUDIN-16蛋白(NCBI Gene: 10686)表达水平,和/或编码CLAUDIN-16蛋白的基因的mRNA表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,该组合物还包括用于测量BRAF 基因V600E位点的突变的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,所述用于测量蛋白表达水平的试剂包含抗体、寡肽、配体、PNA或适体,所述试剂可特异性结合至所述蛋白;
和/或,所述用于测量mRNA表达水平的试剂包含引物、探针或反义核苷酸,所述试剂可特异性结合至编码所述标记物蛋白的基因的mRNA;测试方法包括PCR、基因芯片、二代高通量测序中的任意一种或至少两种的组合。
4.权利要求1-3中任意一项权利要求所述的组合物在制备用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的试剂中的应用。
5.一种用于甲状腺乳头状癌的术前诊断和/或风险评估的系统,该系统包括:
1)权利要求1-3中任意一项权利要求所述的组合物;
2)采用所述的组合物进行蛋白表达水平和/或编码蛋白的基因的mRNA表达水平测试的设备;
3)计算机设备,所述计算机设备包括存储器和处理器,存储器存储甲状腺乳头状癌的术前诊断模型和/或风险评估模型;处理器执行通过所述的术前诊断模型和/或风险评估模型对甲状腺乳头状癌的原发灶和转移灶进行精准的诊断,和/或对甲状腺乳头状癌的疾病风险进行精准预测。
6.根据权利要求5所述的系统,其特征在于,受试者样品是血液、血清或血浆。
7.根据权利要求5所述的系统,其特征在于,蛋白表达水平的测量或比较通过使用选自以下的至少一种来进行:蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测定、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、补体结合试验、2-D电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS);
和/或,mRNA表达水平的测量通过使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核糖核酸酶保护测定、RNA印迹法、DNA芯片或二代高通量测序方法来进行;
作为优选,编码CLAUDIN-16蛋白的基因的mRNA表达水平的测量采用二代高通量测序方法,包括以下的步骤:
1)将mRNA打断成200nt至700nt的短片段后以mRNA为模板,用六碱基随机引物合成第一条eDNA链;
2)加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成第二条eDNA链;
3)在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复,加polyA并连接测序接头,然后采用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,最后进行PCR扩增建立测序文库;
4)构建转录组文库,凝胶电泳进行质检后上机,进行测序得到测序序列;
5)在测序后过滤掉原始数据中不合格的序列,得到有效数据用于后续分析。
8.根据权利要求7所述的系统,其特征在于,针对测序前的RawData以及过滤后的CleanData进行基于FastQC的数据质量控制,从GC比,序列长度,碱基序列质量等的角度对于过滤前后的数据质量进行评估;采用HISAT2进行参考基因组比对,将RNA-Seq的信息比对到人类基因组上,获得详细的基因表达信息;同时根据Hisat2的比对结果,根据MappedReads采用HTSeq进行表达量统计,得到每一个样本的每一个基因Counts数;优选,基于每一个基因的Counts数,使用FPKM值作为基因表达量的衡量指标,统计得到每一个样本每一个基因的表达情况。
9.根据权利要求5所述的系统,其特征在于,CLAUDIN-16蛋白的检测方法如下:使用CLAUDIN-16的抗体,通过S-P免疫组化染色法,采用综合积分法对IHC染色进行判定:
1)、阳性细胞数计分:无阳性细胞为0分、1-10%为1分、11-50%为2分、51-80%为3分、81-100%为4分;
2)、染色强度计分:无染色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分;
3)、两项乘积即为总分,0分为阴性(-)、1-4分为弱阳性(+)、5-8分为阳性(++)、9-12分为强阳性(+++)。
10.根据权利要求7或8所述的系统,其特征在于,甲状腺乳头状癌的术前诊断模型的构建方法如下:通过ROC曲线确定CLAUDIN-16mRNA表达阳性和阴性的最佳截止点FPKM=1.25,对样本的CLAUDIN-16的mRNA的表达水平进行检测,当FPKM≥1.25时,记1分,同时对样本的BRAFV600E进行检测,当BRAFV600E突变时,记1分;当分数≥1分时,判断为恶性,<1分时,判断为良性,用于甲状腺乳头状癌的术前诊断;
和/或,甲状腺乳头状癌的术前风险评估模型的构建方法如下:预测模型由 Libsvm3.20使用 MATLAB 2022a的建模平台建立;使用 C-SVC、RBF 核函数和网格搜索法调试模型;网格 c 边界、网格 c 步长、网格 g 边界和网格 g 步长分别为 -8 至 8、0.5、-8 至 8和 0.5;正值表示高风险PTC,负值表示非高风险PTC;模公式如下:Plabel = sgn(Σni = 0wi exp(−gamma|(xi-x)|2+b));
作为优选,风险评估预测模型中纳入CLDN16的表达水平和BRAF V600E的突变状态,患者年龄、性别,进行建模,构在建模过程中,模型优化方面,对非线性SVM模型使用网格搜索法选取参数,对所构建模型进行指标筛选时,分别先后使用阈值法、枚举法、向后法、向前法算法建模,并根据这些常用算法的特性来对指标筛选算法进行必要的改善;在对模型的效果评估中,使用准确率、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、AUC指标,并以准确性为最主要的标准。
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