CN117241807A - 小体积卒中的细胞疗法和治疗方法 - Google Patents
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Abstract
公开了在受试者罹患小体积缺血性卒中后治疗该受试者的方法，以及治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法。还公开了用于治疗小体积缺血性卒中的组合物。一方面，在小体积缺血性卒中后治疗受试者的方法包括向受试者的围绕小体积缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中细胞来源于经编码Notch细胞内结构域的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月27日提交的第63/194,021号美国临时申请的权益，该申请内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容总体上涉及再生细胞疗法领域，且更具体地，涉及小体积卒中(small-volume stroke)的细胞疗法和治疗方法。
背景
在世界范围内，卒中是第二大死亡原因和第三大失能(disability)原因[1]。缺血性卒中后，急性期一般定义为卒中事件或事故后数小时至数天。急性缺血性卒中的卒中后即时干预集中于通过呼吸和心脏血压控制来维持生命、监测氧饱和度和血糖水平、预防代谢紊乱、维持器官功能以及对升高的颅内压进行管理。
美国仅有的批准用于急性缺血性卒中的疗法之一是溶栓剂，其在卒中发作的3小时内给予患者。一些研究估计，不到5％的急性缺血性卒中受试者实际接受了这种治疗，这可能是由于溶栓干预的严格标准、缺乏足够的设施以及受试者在3小时窗口之外到达[2]。约70％至85％的首次罹患卒中的患者会出现偏瘫或患者身体一侧的至少部分瘫痪。卒中事件或事故后6个月，只有60％出现偏瘫和需要住院康复护理的患者在进行简单日常活动方面实现了功能独立[3]。
一旦卒中患者进入慢性期(一般定义为卒中事件或事故后超过数月)，物理疗法往往是患者仅有的处方康复方案。对于这些慢性卒中患者，没有经证明的生物或药物疗法显示出明显逆转损伤并改善患者的运动功能。虽然已经提出并研究了多种细胞疗法，但迄今为止，这些疗法的临床试验是有限的，这类试验中的患者仅显示出适度改善[4-6]。此外，对于某些疗法是否更有效地治疗特定患者亚群，例如缺血性核心(ischemic core)大小或体积不同的卒中患者，尚未进行研究。
因此，需要用于治疗慢性卒中患者或罹患慢性卒中诱导的运动缺陷的那些患者的安全且有效的疗法。
概述
公开了在受试者罹患小体积缺血性卒中后治疗该受试者的方法，以及治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法。还公开了用于治疗小体积缺血性卒中的组合物。
一方面，在小体积缺血性卒中后治疗受试者的方法包括向受试者的围绕小体积缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。细胞可以来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
细胞可以通过包括以下的方法制备：提供间充质干细胞的培养物，使间充质干细胞的培养物与编码NICD的多核苷酸接触，选择包含多核苷酸的细胞，以及在不对多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。间充质干细胞可以是人骨髓衍生的细胞。此外，编码NICD的多核苷酸不编码全长Notch蛋白。
小体积缺血性核心可以是具有小于50立方厘米(cc)的缺血性核心体积的缺血性核心。例如，小体积缺血性核心可以是具有约2cc与50cc之间的缺血性核心体积的缺血性核心。
在一些情况下，当小体积缺血性核心位于受试者顶区(parietal region)以外的脑区，例如受试者脑的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质或皮质下灰质中时，治疗尤为有效。
在一些情况下，即使在施用细胞前小体积缺血性卒中发生超过6个月，治疗也是有效的。例如，即使在施用细胞前小体积缺血性卒中发生6个月与90个月之间，治疗也可以是有效的。
施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在受试者脑内的沉积位点注射包含细胞的细胞悬浮液。细胞悬浮液可以包含悬浮在无菌等渗晶体溶液中的细胞。
施用治疗有效量的细胞的步骤还可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。例如，施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带近端的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。
施用治疗有效量的细胞的步骤还可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。在一些情况下，施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在缺血性半暗带/慢性缺血性半暗带远端或小体积缺血性核心内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。
施用治疗有效量的细胞的步骤还可以包括通过单钻孔穿颅术(single burr-holecraniostomy)立体定向施用治疗有效量的细胞。
治疗有效量的细胞可以是约250万个细胞(或250万个细胞±10万个细胞)。施用约250万个细胞的步骤可以包括在沿第一沉积轨迹(deposit track)或针轨迹(needletrack)的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点注射包含细胞的细胞悬浮液。每个沉积位点可以注射约20μL细胞悬浮液。细胞悬浮液可具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
治疗有效量的细胞也可以为约500万个细胞(或500万个细胞±10万个细胞)。施用约500万个细胞的步骤可以包括在沿第一沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点注射包含细胞的细胞悬浮液。每个沉积位点可以注射约20μL细胞悬浮液。细胞悬浮液可以具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
方法还可以包括在向受试者施用细胞之前，对配制剂量的细胞进行释放后测试。
方法还可以包括通过确定受试者的mRS分数来确定受试者的失能程度，并且仅当受试者的mRS分数为2至4时，才施用治疗有效量的细胞。
还公开了一种治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法。该方法可以包括确定受试者的缺血性核心的体积，并且仅当缺血性核心的体积被确定为小于50立方厘米(cc)时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。例如，该方法可以包括，仅当缺血性核心的体积在约2cc与50cc之间时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。
卒中诱导的运动缺陷可以是受试者罹患的缺血性卒中的结果。在一些情况下，在施用细胞前缺血性卒中发生超过6个月。例如，在施用细胞前小体积缺血性卒中发生6个月与90个月之间。
在某些情况下，方法包括仅当缺血性卒中发生在超过6个月前(例如6个月至90个月前)时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。
细胞可以来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
细胞可以通过包括以下的方法制备：提供间充质干细胞的培养物，使间充质干细胞的培养物与编码NICD的多核苷酸接触，选择包含多核苷酸的细胞，以及在不对多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。间充质干细胞可以是人骨髓衍生的细胞。此外，编码NICD的多核苷酸不编码全长Notch蛋白。
在某些情况下，方法包括仅当缺血性核心位于受试者的顶区以外的脑区时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。例如，方法可以包括仅当部分缺血性核心位于受试者脑的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质和皮质下灰质的至少一个中时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。
施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在受试者脑中的沉积位点注射包含细胞的细胞悬浮液。细胞悬浮液可以包含悬浮在无菌等渗晶体溶液中的细胞。
施用治疗有效量的细胞的步骤还可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。例如，施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带近端的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。施用治疗有效量的细胞的步骤还可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。在一些情况下，施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在缺血性半暗带/慢性缺血性半暗带远端或小体积缺血性核心内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。
施用治疗有效量的细胞的步骤还可以包括通过单钻孔穿颅术立体定向施用治疗有效量的细胞。
治疗有效量的细胞可以为约250万个细胞(或250万个细胞±10万个细胞)。施用约250万个细胞的步骤可以包括在沿第一沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点注射包含细胞的细胞悬浮液。每个沉积位点可以注射约20μL细胞悬浮液。细胞悬浮液可以具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
治疗有效量的细胞也可以为约500万个细胞(或500万个细胞±10万个细胞)。施用约500万个细胞的步骤可以包括在沿第一沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹或针轨迹的五个沉积位点注射包含细胞的细胞悬浮液。每个沉积位点可以注射约20μL细胞悬浮液。细胞悬浮液可以具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
方法还可以包括在向受试者施用细胞之前，对配制剂量的细胞进行释放后测试。
方法还可以包括通过确定受试者的mRS分数来确定受试者的失能程度，并且仅当受试者的mRS分数为2至4时，才施用治疗有效量的细胞。
还公开了一种组合物，所述组合物用于治疗小体积缺血性卒中。组合物可以包含治疗有效量的细胞和药学上可接受的载体或稀释剂。细胞可以来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
细胞可以通过包括以下的方法制备：提供间充质干细胞的培养物，使间充质干细胞的培养物与编码NICD的多核苷酸接触，选择包含多核苷酸的细胞，以及在不对多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。间充质干细胞可以用包含编码NICD的多核苷酸的质粒瞬时转染。
间充质干细胞可以是人骨髓衍生的细胞。此外，编码NICD的多核苷酸不编码全长Notch蛋白。
药学上可接受的载体或稀释剂可以包括无菌等渗晶体溶液(例如Plasma-LyteA)。在施用前，组合物可以是被包装在密封小瓶中的细胞悬浮液。
治疗有效量的细胞可以为约250万个细胞。当治疗有效量的细胞为约250万个细胞时，组合物可以是约0.3mL的细胞悬浮液，其中细胞浓度为约8.5*106个细胞/mL。
治疗有效量的细胞也可以为约500万个细胞。当治疗有效量的细胞为约250万个细胞时，组合物可以是约0.3mL的细胞悬浮液，其中细胞浓度为约17.0*106个细胞/mL。
在一些情况下，治疗有效量的细胞可以为约200万个细胞至约500万个细胞。
还公开了细胞在制备用于在受试者罹患小体积缺血性卒中后治疗该受试者的药物中的用途，包括：向受试者的围绕小体积缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
还公开了细胞在制备用于治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的药物中的用途，包括：确定受试者的缺血性核心的体积，并且仅当缺血性核心的体积被确定为小于50立方厘米(cc)时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
还公开了来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的细胞，用于在受试者罹患小体积缺血性卒后治疗该受试者的方法中使用，其中，该方法包括向受试者的围绕小体积缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。
还公开了来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的细胞，用于在治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法中使用，其中，该方法包括：确定受试者的缺血性核心的体积；并且仅当缺血性核心的体积被确定为小于50立方厘米(cc)时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中，细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
附图简述
图1示出了治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法。
图2示出了卒中患者的被缺血性半暗带包围的缺血性核心。
图3A示出了各治疗组和对照组的基线FMMS与卒中体积之间的关系。
图3B示出了各治疗组和对照组的基线mRS与基线FMMS之间的关系。
图3C示出了各治疗组和对照组的基线mRS与卒中体积之间的关系。
图4示出了不同剂量组的Δ综合率随卒中体积的变化。
图5示出了脑的不同区域或部位，尤其包括皮质下白质、皮质下灰质、皮质额区、皮质顶区和皮质颞区。
图6是包括关于按群体百分比细分的研究群体的卒中位置、基线特征和Δ响应率的信息的表。
图7是显示图6的Δ综合响应率对群体百分比作图的图。
发明详述
为了本公开内容之目的，如下定义了以下术语。
定义
“血管生成(angiogenesis)”或“血管生成(angiogenic)”是指新的脉管系统(例如血管，例如静脉、动脉、小静脉、小动脉、毛细血管)的形成。血管生成可以通过从现有血管萌发新血管和/或通过内皮细胞原位聚结形成新血管而发生。血管生成还包括基质重塑和细胞募集(例如平滑肌细胞、单核细胞和/或周细胞的募集)的伴随过程。血管生成还包括内皮细胞的增殖和/或迁移。
术语“DNTT-MSC”(“NICD瞬时转染的MSC的后代”)和“SB623细胞”是指在MSC中瞬时表达外源Notch细胞内结构域(NICD)后获得的细胞群体。例如，通过用包含编码NICD(例如来自人Notch 1蛋白)但不编码全长Notch蛋白的序列的载体瞬时转染MSC，然后进行选择(例如用G418)，可以获得DNTT-MSC群体。所选细胞还可以在任选地补充有血清的标准培养基中，在不添加任何生长因子或分化因子(如果培养基中存在血清，则血清中可能存在的生长因子或分化因子除外)的情况下进行培养。通过用NICD(例如人Notch1细胞内结构域(NICD1))瞬时转染人骨髓MSC，然后进行选择和随后的扩增，可以从人骨髓MSC衍生DNTT-MSC。与亲代MSC相比，这一过程产生的细胞群体在体外显示出卓越的血管生成和神经生成特性[7-9]。DNTT-MSC的神经生成作用归因于FGF1、FGF2和BMP的表达增加以及相应的分泌增加[7,9]。
“Fugl-Meyer评估”或“FMA”是用于评估已经患有卒中的个体的感知运动损伤的指数或量表。FMA指数或量表在临床上被用于确定损伤严重性、评估运动恢复和计划治疗。FMA指数或量表由Axel Fugl-Meyer及其同事于1975年首次提出，作为卒中后恢复的标准化评估[10]。评估在五个领域进行，包括：(1)运动功能(上肢和下肢运动功能)；(2)感知功能；(3)平衡；(4)关节活动范围；和(5)关节疼痛。总计评估155个项目，其中所有五个领域的最高分数为226分。
“Fugl-Meyer运动量表或评分”或“FMMS”是用于评估已经患有卒中的个体的运动功能或损伤的分量表，包括上肢和下肢的运动范围。FMMS的范围从0分(偏瘫)到100分(运动功能正常)。在所有五个领域中，FMMS最高分数为100分，占FMA最高总分数(226分)的几乎一半。FMMS最高分数分为上肢66分(基于33个项目的评估)和下肢34分(基于17个项目的评估)。
“FMMS上肢(FMMS Upper Extremity)”或“FMMS UE”是用于评估已经患有卒中的个体的上肢(upper extremity)或上肢(upper limb)运动功能的更具体的分量表。
“FMMS下肢(FMMS Lower Extremity)”或“FMMS LE”是用于评估已经患有卒中的个体的下肢(lower extremity)或下肢(lower limb)运动功能的更具体的分量表。
术语“植入”和“移植”用于表示将外源细胞引入受试者或患者中。外源细胞可以是自体的(即从受试者获得)，或同种异体的(即从除受试者以外的个体获得)。
“间充质细胞”是指间充质组织的细胞(例如成软骨细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、脂肪细胞)及其前体，并且包括例如成纤维细胞(例如人包皮成纤维细胞)、MSC(如本文所定义)和从MSC衍生的细胞，例如如本文所定义的DNTT-MSC。
“最小临床重要差异(Minimally Clinically Important Difference)”或“MCID”是指患者或个体察觉或识别为有意义或重要的治疗结果方面的最小变化。例如，当涉及FMA时，MCID可以是用于评估卒中患者在五个FMA领域的一个或更多个领域中的分数的最小变化。作为更具体的实例，用于评估卒中治疗的MCID阈值可以要求卒中患者的FMMS UE分数表现出从基线测量结果提高至少6分。
“改良Rankin量表(Modified Rankin Scale)”或“mRS”是临床医生报告的序数量表，用于测量已经患有卒中的患者的失能程度或失能等级。该量表的范围为从0(完全没有症状)到6(死亡)的等级或分数。等级或分数为1的患者没有明显失能，并且能够完成所有日常职责和活动。等级或分数为2的患者具有轻微失能，并且不能够执行所有以前的活动，但能够在没有帮助的情况下照料自己的事务。等级或分数为3的患者为中度失能，需要一些帮助，但在没有帮助的情况下能够行走。等级或分数为4的患者表现出中度重度失能且不能行走，并且在没有帮助的情况下无法照顾自己的身体需要。等级或分数为5的患者为重度失能、卧床不起且失禁，并需要持续的护理和照顾。
“MSC”(“间充质干细胞”)是指从骨髓获得的黏附、非造血多能细胞。这些细胞被冠以间充质干细胞、间充质基质细胞、骨髓黏附基质细胞、骨髓黏附干细胞和骨髓基质细胞等不同名称。MSC还可以从例如脐带血、脂肪组织、牙髓、华通氏胶(Wharton's jelly)以及多种类型的结缔组织中获得。MSC可以通过从骨髓中选择(例如通过在培养物中生长)黏附细胞(即黏附在组织培养塑料上的细胞)来获得。为了获得用于治疗的具有足够数量细胞的MSC群体，可以在针对黏附性进行选择后，在培养物中扩增黏附细胞群体。在培养物中的扩增也富集了MSC，因为污染细胞(例如单核细胞)在培养条件下不会增殖。
MSC的示例性公开内容提供于美国专利公开第2003/0003090号、Prockop(1997)Science 276:71-74和Jiang(2002)Nature 418:41-49中。分离和纯化MSC的方法可见于例如美国专利第5,486,359号、Pittenger等人(1999)Science 284:143-147和Dezawa等人(2001)Eur.J.Neurosci.14:1771-1776。人MSC是商购可得的(例如BioWhittaker,Walkersville,Md.)，或可以通过例如骨髓抽吸、然后培养并选择黏附骨髓细胞来从供体获得。参见例如WO 2005/100552。
还可以从脐带血中分离MSC。参见例如Campagnoli等人(2001)Blood98:2396-2402；Erices等人(2000)Br.J.Haematol.109:235-242以及Hou等人(2003)Int.J.Hematol.78:256-261。MSC的另外的来源包括例如脂肪组织、牙髓和华通氏胶。
“神经细胞生成(neuropoiesis)”或“神经细胞生成(neuropoietic)”是指或涉及神经前体细胞(neural precursor cell,NPC)生长和/或分化为神经元和/或神经胶质细胞(例如星形胶质细胞、少突胶质细胞)。神经细胞生成过程的实例包括但不限于NPC增殖、神经发生(例如形成新神经元)和胶质细胞发生(例如形成星形胶质细胞和/或少突胶质细胞)。与神经元发育有关的其他过程包括例如神经突起生长、轴突生长和树突生长。
“Notch蛋白”(例如Notch 1蛋白)是可见于所有后生动物中的跨膜受体，其通过细胞内信号传导影响细胞分化。Notch细胞外结构域(例如Notch 1蛋白的细胞外结构域)与Notch配体(例如δ、Serrate、Jagged)的接触导致Notch蛋白的两次蛋白水解切割，其中第二次由γ分泌酶催化，并将Notch细胞内结构域(NICD)释放到细胞质中。在小鼠Notch蛋白中，这种切割发生在氨基酸gly1743与val1744之间。NICD易位到细胞核，在细胞核中，其充当转录因子，募集另外的转录调节蛋白(例如MAM、组蛋白乙酰化酶)，以缓解多种靶基因(例如Hes 1)的转录抑制。有关Notch信号传导的另外的细节和信息可见于例如Artavanis-Tsakonas等人(1995)Science 268:225-232；Mumm和Kopan(2000)Develop.Biol.228:151-165以及Ehebauer等人(2006)Sci.STKE 2006(364),cm7.[DOI:10.1126/stke.3642006cm7]。
“卒中”是为脑中由血流障碍引起的状况提供的名称。这类脑血管损伤可以由例如颅内出血或由脑中血流减少或阻塞(即脑缺血)引起。缺血性阻塞可以由血栓形成(即在颅血管或供应脑的血管中原位形成凝块)或脑栓塞(即凝块迁移到脑中的某个部位)引起。由缺血性或出血性卒中引起的损害通常导致某些神经功能和生理功能受损。有关不同类型的卒中及其特征的另外的信息可见于共同拥有的美国专利第8,092,792号和第10,245,286号；其公开内容通过引用整体并入本文以用于描述不同类型的卒中及其特征的目的。
治疗
图1示出了治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法100。卒中诱导的运动缺陷可以是受试者罹患的缺血性卒中的结果。方法100也可以被视为是在缺血性卒中后治疗受试者的方法或在小体积缺血性卒中后治疗受试者的方法。
方法100可以包括在操作102中确定患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的缺血性核心的体积。在一些情况下，操作102可以包括接收有关受试者的缺血性核心的体积的数据或信息。
出于本公开内容的目的，缺血性核心或梗死核心可以指已经梗死(即遭受的坏死或组织死亡)或由于受试者罹患的缺血性卒中而不可逆转地注定要梗死的脑组织。
可以利用计算机断层扫描(computed tomography,CT)灌注(computedtomography perfusion,CTP)、扩散加权磁共振成像(diffusion-weighted magneticresonance imaging,DWI)或者在一些情况下利用基线非对比CT(baseline non-contrastCT,NCCT)确定缺血性核心的体积。当利用CTP进行测量时，缺血性核心可以被定义为相对脑血流量(cerebral blood flow,CBF)水平小于正常脑血流量30％的脑组织。当利用DWI进行测量时，缺血性核心可以被定义为表观扩散系数小于620μm2/s的脑组织[11]。
在一些情况下，方法100可以包括仅当缺血性核心被确定为小于50立方厘米(cc)时，才进行细胞疗法或治疗。例如，方法100可以包括仅当缺血性核心被确定为在约2cc与50cc之间时，才进行细胞疗法或治疗。
方法100还可以包括在操作104中通过确定受试者的mRS分数来确定受试者的失能程度。在一些情况下，操作104可以包括接收有关受试者的mRS分数的数据或信息。
尽管图1示出了操作104在操作102之后，但是本领域普通技术人员应当理解，这些操作的顺序可以交换或操作可以同时发生。
在一些情况下，方法100可以包括仅当受试者的mRS分数为2至4时，才进行细胞疗法或治疗。例如，mRS分数小于2的受试者可以视为失能程度不足以需要本文公开的细胞疗法，而mRS分数大于4的受试者可以视为失能对于治疗来说太过严重。
方法100还包括在操作106中向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。在一些情况下，围绕缺血性核心的脑区可以是受试者的缺血性半暗带。方法100可以包括向缺血性半暗带施用治疗有效量的细胞，而不直接注射到缺血性核心。
出于本公开内容的目的，缺血性半暗带可以指灌注不足的脑组织或处于不可逆损伤风险但仍可挽救的脑组织。一些研究已经将缺血性半暗带定义为CBF降低的区域，其中CBF水平降低到约10-15ml/100g/min至约25ml/100g/min[12]。
方法100可以包括在操作106中向受试者的缺血性半暗带施用治疗有效量的细胞。在一些情况下，方法100可以包括仅当缺血性核心的体积被确定为小于50cc时，才向受试者的缺血性半暗带施用治疗有效量的细胞。例如，方法100可以包括仅当缺血性核心的体积被确定为在约2cc与50cc之间时，才向受试者的缺血性半暗带施用治疗有效量的细胞。
在这些和其他情况中，方法100可以包括仅当受试者的mRS分数为2至4时，才向受试者的缺血性半暗带施用治疗有效量的细胞。方法100还可以包括仅当缺血性核心的体积被确定为小于50cc且受试者的mRS分数为2至4时，才向受试者的缺血性半暗带施用治疗有效量的细胞。
如将在以下章节更详细讨论的，申请人发现，在罹患小体积卒中(例如，缺血性核心体积＜50cc)的mRS分数为2至4的受试者中，在治疗组(即施用细胞的受试者)中与假手术组/对照组中的同类受试者相比在运动功能方面表现出临床上重要改善的这类受试者的比例方面观察到统计学显著差异(p值＝0.02)。
在某些情况下，方法100可以视为治疗患有慢性卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法或治疗慢性卒中的方法。例如，方法100可以包括仅当在施用细胞前缺血性卒中发生超过6个月(例如，6个月与90个月之间)时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。
本方法100还可以视为治疗小体积慢性卒中(与急性卒中相对)的方法。例如，方法100可以包括仅当在施用细胞前缺血性卒中发生超过6个月(例如，6个月与90个月之间)时并且仅当缺血性核心的体积被确定为小于50cc时，才向受试者的围绕缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞。
当在治疗(例如施用细胞)前卒中事件发生超过6个月时，受试者的围绕慢性缺血性核心的半暗带可以视为慢性半暗带(与急性半暗带相对)。慢性半暗带所显示的CBF水平甚至可以低于最近罹患卒中的受试者的急性半暗带所显示的CBF水平。在这些情况下，治疗此类患者的方法100可以包括向受试者的围绕慢性缺血性核心的慢性半暗带施用治疗有效量的细胞。在一些情况下，方法100可以包括仅当慢性缺血性核心的体积被确定为小于50cc时，才向受试者的围绕慢性缺血性核心的慢性半暗带施用治疗有效量的细胞。
DNTT-MSC
施用的细胞可以是来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的同种异体细胞。细胞可以通过包括以下的方法制备：提供间充质干细胞的培养物，使间充质干细胞的培养物与编码NICD的多核苷酸接触(其中多核苷酸不编码全长Notch蛋白)，选择包含多核苷酸的细胞，以及在不对多核苷酸进行选择的情况下，进一步培养所选细胞。间充质干细胞可以是人骨髓衍生的细胞。出于本公开内容的目的，施用的细胞可以称为DNTT-MSC。
如前所讨论的，通过在MSC中瞬时表达Notch蛋白的细胞内结构域，可以从骨髓黏附基质细胞(也称为MSC)获得DNTT-MSC。Notch细胞内结构域(例如，来自人Notch 1蛋白的NICD)在MSC中的瞬时表达可以足以将MSC群体转化为DNTT-MSC群体。不需要用生长和/或分化因子进行另外的处理。因此，通过用包含编码NICD(但不编码全长Notch蛋白)的序列的载体瞬时转染MSC，然后选择包含载体的细胞，并在不暴露于另外的生长和/或分化因子的情况下在含血清培养基中进一步培养所选细胞，可以将MSC群体转化为DNTT-MSC群体。参见例如美国专利第7,682,825号(2010年3月23日)；美国专利申请公开第2010/0266554号(2010年10月21日)；以及WO 2009/023251(2009年2月19日)；其公开内容通过引用整体并入本文，用于描述间充质干细胞的分离和间充质干细胞向DNTT-MSC的转化(在这些文件中表示为“神经前体细胞和“神经再生细胞”)的目的。
在这些方法中，可以使用编码Notch细胞内结构域的任何多核苷酸(例如载体)，并且可以使用用于选择和富集转染的细胞的任何方法。例如，可以用载体转染MSC，该载体含有编码Notch细胞内结构域(例如人Notch1细胞内结构域)的序列并且还含有编码选择标记(例如抗药性；例如对G418的抗药性)的序列。在一些情况下，可以使用两种载体转染MSC，一种载体含有编码Notch细胞内结构域的序列且另一种载体含有编码抗药性标记的序列。在这些情况下，在用一种或更多种载体转染细胞培养物后，通过以足以杀伤不包含载体的细胞但保留包含载体的细胞的量向细胞培养物中添加选择剂(例如G418)来实现选择。选择的不存在则需要去除所述选择剂或将其浓度降低到不会杀伤不包含载体的细胞的水平。选择后(例如持续七天)，可去除选择剂，并可以在含血清的培养基中进一步培养细胞(例如两代)。
还可能的是，取决于选择标记的性质和/或所用选择剂的浓度，在选择过程中，并非每个缺乏编码选择标记的载体的细胞都会被杀伤。例如，选择剂可能会抑制不含选择标记的细胞的生长，而在去除选择剂后，该细胞可能会恢复并重新开始生长。
因此，DNTT-MSC的制备涉及在MSC中瞬时表达外源Notch细胞内结构域。为此，可以用包含编码Notch细胞内结构域(例如人Notch 1细胞内结构域)的序列的载体转染MSC，其中所述序列不编码全长Notch蛋白。所有这些序列都是已知的，并且是本领域技术人员容易获得的。例如，Del Amo等人(1993)Genomics 15:259-264提出了小鼠Notch蛋白的完整氨基酸序列；而Mumm和Kopan(2000)Devel.Biol.228:151-165提供了来自小鼠Notch蛋白的围绕所谓的S3切割位点的氨基酸序列，S3切割位点释放细胞内结构域。总之，这些参考文献为本领域技术人员提供了每一种含有Notch细胞内结构域(非全长Notch蛋白)的肽；从而也为本领域技术人员提供了每一种包含编码Notch细胞内结构域的序列的多核苷酸，所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白。前述参考文献(Del Amo以及Mumm)通过引用整体被并入以用于分别公开全长Notch蛋白的氨基酸序列和Notch细胞内结构域的氨基酸序列的目的。
来自另外的物种(包括大鼠、爪蟾(Xenopus)、果蝇(Drosophila)和人)的Notch蛋白和核酸的类似信息是可获得的。参见例如Weinmaster等人(1991)Development 113:199-205；Schroeter等人(1998)Nature 393:382-386；NCBI参考序列号NM_017167(以及其中引用的文献)；SwissProt P46531(以及其中引用的文献)；SwissProt Q01705(以及其中引用的文献)；以及GenBank CAB40733(以及其中引用的文献)。前述参考文献通过引用整体被并入以用于公开许多不同物种的全长Notch蛋白的氨基酸序列和Notch细胞内结构域的氨基酸序列的目的。
在一些情况下，可以通过向MSC中引入包含编码Notch细胞内结构域的序列的核酸，使得MSC不表达外源Notch细胞外结构域，来制备DNTT-MSC。例如，这可以通过用包含编码Notch细胞内结构域的序列的载体转染MSC来实现，其中所述序列不编码全长Notch蛋白。
有关制备DNTT-MSC的另外的细节以及用于制备具有与DNTT-MSC相似的性质的细胞(其可用于本文所公开的方法中)的方法，可见于美国专利第7,682,825号(2010年3月23日)；以及美国专利申请公开第2010/0266554号(2010年10月21日)和第2011/0229442号(2011年9月22日)；其公开内容通过引用整体并入本文以用于描述用于制备DNTT-MSC的可选方法并提供用于制备具有与DNTT-MSC相似的性质的细胞的方法的目的。另见Dezawa等人(2004)J.Clin.Invest.113:1701-1710。
细胞培养
用于细胞培养的标准方法是本领域已知的。参见例如R.I.Freshney“Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique,”Fifth Edition,Wiley,New York,2005。
转染
用于将外源DNA引入细胞(即转染)以及选择经转染的细胞的方法也是本领域已知的。参见例如Sambrook等人“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001；Ausubel等人“Current Protocols inMolecular Biology,”John Wiley&Sons,New York,1987并定期更新。
图2描绘了罹患缺血性卒中的受试者的缺血性核心200。如图2所示，缺血性核心200可被缺血性半暗带202围绕。当在治疗开始前缺血性卒中发生超过6个月时，缺血性核心200可以被视为慢性缺血性核心，并且缺血性半暗带202可以被视为慢性缺血性半暗带。
如前所讨论的，缺血性核心200可以具有核心体积或缺血性核心体积。除了其他成像技术之外，核心体积尤其可以使用计算机断层扫描灌注或扩散加权磁共振成像来确定。当核心体积被确定为小于50cc(例如，在约2cc与50cc之间)时，缺血性卒中可以被视为小体积缺血性卒中。
同样，如前所讨论的，治疗小体积缺血性卒中的方法可以包括向罹患小体积缺血性卒中的受试者的围绕小体积缺血性核心200的缺血性半暗带施用治疗有效量的同种异体细胞。细胞可以来源于经编码NICD的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。为了本公开内容的目的，所述细胞可以称为DNTT-MSC。此外，当在治疗开始前缺血性卒中发生超过6个月时，该方法可以被视为治疗小体积慢性缺血性卒中的方法。
如图2所示，方法可以包括通过在受试者脑内的一个或更多个沉积位点204注射包含细胞的细胞悬浮液来施用治疗有效量的细胞。施用治疗有效量的细胞的步骤还可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点204注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。例如，施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带近端的一个或更多个沉积位点204注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。
施用治疗有效量的细胞的步骤还可以包括在围绕小体积缺血性核心的缺血性半暗带内的一个或更多个沉积位点204注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。在一些情况下，施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带远端的一个或更多个沉积位点204注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。在这些和其他情况下，施用治疗有效量的细胞的步骤可以包括在小体积缺血性核心内的一个或更多个沉积位点204注射至少一部分包含细胞的细胞悬浮液。
细胞悬浮液可以包含悬浮在药学上可接受的载体或稀释剂中的细胞。在一些情况下，药学上可接受的载体或稀释剂可以是无菌等渗晶体溶液。例如，细胞悬浮液可以包含悬浮在Plasma-LyteTM A(Baxter Healthcare Corporation)中的细胞。细胞也可以悬浮在另一种生理相容载体(例如磷酸盐缓冲盐水)中。
可以通过单钻孔穿颅术立体定向施用细胞。关于细胞的立体定向施用的另外的细节可见于美国专利公开第US2019/0290846号(2019年9月26日)，其内容通过引用整体并入本文以用于描述DNTT-MSC的立体定向施用和用于此目的的设备(equipment)的目的。
方法还可以包括在向受试者施用细胞之前，对配制剂量的细胞进行释放后测试。
治疗有效量的细胞(或DNTT-MSC)可以为约250万个细胞(或250万个细胞±10万个细胞)。当施用的细胞量为约250万个细胞时，治疗方法可以包括在沿第一沉积轨迹206A或针轨迹的五个沉积位点204(参见图2)、沿第二沉积轨迹206B或针轨迹的五个沉积位点204以及沿第三沉积轨迹206C或针轨迹的五个沉积位点注射包含细胞的细胞悬浮液。每个沉积位点可以注射约20μL细胞悬浮液。此外，细胞悬浮液可以具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
治疗有效量的细胞(或DNTT-MSC)可以为约500万个细胞(或500万个细胞±10万个细胞)。当施用的细胞量为约500万个细胞时，治疗方法可以包括在沿第一沉积轨迹206A或针轨迹的五个沉积位点204(参见图2)、沿第二沉积轨迹206B或针轨迹的五个沉积位点204以及沿第三沉积轨迹206C或针轨迹的五个沉积位点注射包含细胞的细胞悬浮液。每个沉积位点可以注射约20μL细胞悬浮液。此外，细胞悬浮液可以具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
在一些情况下，治疗有效量的细胞(或DNTT-MSC)可以为约250万个细胞至500万个细胞。例如，治疗有效量的细胞(或DNTT-MSC)可以为约300万个细胞(或300万个细胞±10万个细胞)、约350万个细胞(或350万个细胞±10万个细胞)、约400万个细胞(或400万个细胞±10万个细胞)或约450万个细胞(或450万个细胞±10万个细胞)。
如图2所示，沿每个沉积轨迹或针轨迹的沉积位点204中的至少一些可以位于缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带内。在一些情况下，沿每个沉积轨迹或针轨迹的沉积位点204中的至少一个或更多个可以位于缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带的近端或外周处。在其他情况下，所有沉积轨迹或针轨迹都可以位于缺血性半暗带或慢性缺血性半暗带内。在另外的情况下，沿每个沉积轨迹或针轨迹的沉积位点204中的至少一个或更多个可以位于缺血性核心或慢性缺血性核心内或位于缺血性核心或慢性缺血性核心的外周处。
在某些情况下，当缺血性核心200位于受试者的顶区或顶叶以外的脑区、脑叶或脑部位时，治疗特别有效。例如，治疗小体积缺血性卒中的方法可以包括仅当缺血性核心200的一部分位于受试者脑的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质和皮质下灰质的至少一个中时，才向受试者的围绕缺血性核心200的脑区(例如缺血性半暗带202)施用治疗有效量的细胞(参见例如图5)。在一些情况下，方法可以包括仅当缺血性核心200位于受试者的顶区以外的脑区时，才向受试者的围绕缺血性核心200的脑区(例如缺血性半暗带202)施用治疗有效量的细胞。
组合物、制剂以及试剂盒
还公开了用于治疗小体积缺血性卒中或小体积慢性缺血性卒中的组合物、制剂和试剂盒。组合物可以包含治疗有效量的细胞和药学上可接受的载体或稀释剂。如前所讨论的，细胞(也称为DNTT-MSC)可以来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。细胞(DNTT-MSC)可以通过包括以下的方法制备：提供间充质干细胞(例如人骨髓衍生的细胞)的培养物，并使间充质干细胞的培养物与编码NICD的多核苷酸接触。例如，可以用包含编码NICD的多核苷酸的质粒瞬时转染间充质干细胞。该方法还可以包括选择包含多核苷酸的细胞，并且在不对多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。在某些情况下，多核苷酸不编码全长Notch蛋白。本文公开的组合物尤其可以用于刺激神经前体细胞和/或内皮细胞的增殖和分化。
“治疗有效量”的组合物可以包含适用于尤其通过刺激神经前体细胞和/或内皮细胞的增殖和分化来治疗小体积缺血性卒中或小体积慢性缺血性卒中的量的细胞。在一些情况下，治疗有效量的组合物可以包含约250万个细胞(或250万个细胞±10万个细胞)。治疗有效量的组合物还可以包含约500万个细胞(或500万个细胞±10万个细胞)。治疗有效量的组合物还可以包含约200万个细胞至约500万个细胞。
在其他情况下，组合物的治疗有效量可以根据损伤的性质和严重性、受试者的体重和总体健康状况以及本领域技术人员已知的其他标准而变化。例如，剂量的量可以从约100、约500、约1,000、约2,500、约5,000、约10,000、约20,000、约50,000、约100,000、约500,000、约1,000,000、约2,500,000、约5,000,000到约10,000,000个细胞或更多(或其间的任何整数值)变化；施用频率为例如单剂量、每天一次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次，这取决于体重、施用途径、疾病严重性等。
本文所描述的细胞可以悬浮在药学上可接受的载体或稀释剂中，以形成细胞悬浮液。药学上可接受的载体可以是用于植入的生理上相容的载体。如本文所用的，术语“生理上相容的载体”可以指与制剂的其他成分相容且对其接受者无害的载体。合适的载体或稀释剂的实例包括细胞培养基(例如伊格尔最低必需培养基(Eagle’s minimal essentialmedium))、磷酸盐缓冲盐水、汉克平衡盐溶液+/-葡萄糖(HBSS)和多种电解质溶液(multiple electrolyte solution)。药学上可接受的载体或稀释剂也可以是或包含无菌等渗晶体溶液，例如Plasma-LyteTM A(Baxter Healthcare Corporation)。
各种药物组合物及其制备和使用的技术是本领域技术人员根据本公开内容已知的。有关合适的药物组合物及其施用的技术的详细列表，人们可以参考文字材料诸如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版.1985；Brunton等人,“Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,”McGraw-Hill,2005；University of the Sciences in Philadelphia(eds.)(费城科学大学(编)),“Remington:The Science and Practice of Pharmacy,”Lippincott Williams&Wilkins,2005；以及University of the Sciences in Philadelphia(eds.)(费城科学大学(编)),“Remington:The Principles of Pharmacy Practice,”Lippincott Williams&Wilkins,2008。
组合物可以包含包装在密封小瓶中的细胞悬浮液。在一些情况下，密封的小瓶可以包含0.3mL的细胞悬浮液，所述细胞悬浮液的细胞浓度为约8.5*106个细胞/mL。可选地，密封的小瓶可以包含0.3mL的细胞悬浮液，所述细胞悬浮液的细胞浓度为约17.0*106个细胞/mL。
还公开了可以作为药学上可接受的载体的材料的其他实例，包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状的黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中采用的其他无毒相容物质。湿润剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
示例性的制剂包括但不限于适用于肠胃外施用例如肺内施用、静脉内施用、动脉内施用、眼内施用、颅内施用、脑膜下施用或皮下施用的制剂，包括封装在胶束、脂质体或药物释放胶囊(活性剂掺入被设计用于缓释的生物相容性包衣中)中的制剂；可摄取制剂；用于局部使用的制剂，例如滴眼剂、乳膏、软膏和凝胶；以及其他制剂，例如吸入剂、气雾剂和喷雾剂。本公开内容的组合物的剂量可以根据治疗需求的范围和严重性、所施用的组合物的活性、受试者的总体健康状况以及本领域技术人员熟知的其他考虑因素而变化。
在另外的实施方案中，本文所描述的组合物也可以被局部递送。局部递送允许组合物的非全身递送，从而与全身递送相比减轻身体的组合物负担。这样的局部递送可以例如通过使用多种医疗植入装置(包括但不限于支架和导管)来实现，或者可以通过吸入、注射或手术来实现。用于将所需的剂涂覆、植入、包埋或以其他方式附着至医疗装置诸如支架和导管的方法在本领域中建立，并且在本文中被考虑。
本公开内容的另一方面涉及用于实施向受试者施用细胞的试剂盒。例如，试剂盒可以包含细胞的组合物，所述细胞的组合物视情况被配制(例如配制在药物载体中)成一种或更多种单独的药物制品。
包含DNTT-MSC的组合物可以与包含刺激血管生成的物质(“促血管生成剂”)的其他组合物组合使用。可以以任何顺序依次或同时施用这些组合物。因此，如本文公开的治疗性组合物可以含有DNTT-MSC和促血管生成剂两者。在另外的实施方案中，可以单独地或一起向受试者施用单独的治疗性组合物，其中一种包含DNTT-MSC，且另一种包含促血管生成剂。
在一些情况下，促血管生成剂可以是蛋白(例如成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子α、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、音猬因子(sonichedgehog)、MAGP-2、HIF-1、PR-39、RTEF-1、c-Myc、TFII、Egr-1、ETS-1)或编码此类蛋白的核酸。参见例如Vincent等人(2007)Gene Therapy 14:781-789。在其他情况下，促血管生成剂可以是小RNA分子(例如siRNA、shRNA、微RNA)或靶向编码血管生成抑制剂的核酸的核酶。此外，促血管生成剂可以是三链体形成核酸(a triplex-forming nucleic acid)，所述三链体形成核酸与调节抑制血管生成的蛋白的表达的DNA序列结合，以例如阻断编码该蛋白的基因的转录。
促血管生成剂可以是激活促血管生成分子(例如蛋白)的表达的转录因子。调节促血管生成蛋白的表达的天然存在的转录因子(诸如例如HIF-1α)是已知的。此外，可以通过基因工程构建合成的转录调节蛋白。例如，已经描述了用于设计与感兴趣的序列结合的锌指DNA结合结构域的方法，以及用于将此类锌指DNA结合结构域与转录激活和抑制结构域融合的方法。参见例如美国专利第6,534,261号、第6,607,882号、第6,785,613号、第6,794,136号、第6,824,978号、第6,933,1号、第6,979,539号、第7,013,219号、第7,177,766号、第7,220,719号和第7,788,044号。这些方法可以用于合成激活编码促血管生成蛋白的任何基因的转录的非天然存在的蛋白。此外，已经描述了血管内皮生长因子(VEGF)基因的合成锌指转录激活剂。参见例如美国专利第7,026,462号、第7,067,317号、第7,560,440号、第7,605,140号和第8,071,564号。因此，可以将激活VEGF基因转录的非天然存在的(即合成的)锌指蛋白与SB623细胞组合使用，以在例如治疗卒中中增强血管生成。此外，抑制抗血管生成分子的转录的天然或合成的转录调节蛋白(例如合成的锌指转录调节蛋白)也可以用作促血管生成剂。
临床试验
进行了随机双盲假手术对照临床试验，以评估在由于缺血性卒中而罹患慢性运动缺陷的受试者中立体定向颅内注射DNTT-MSC(也称为SB623细胞)的安全性和疗效。作为临床试验的一部分，受试者按约1:1:1的比例随机接受：(1)约250万个DNTT-MSC；(2)约500万个DNTT-MSC；或(3)假手术(对照组)。对总计158名受试者进行了随机化，其中51名受试者接受假手术，52名受试者接受约250万个DNTT-MSC，且55名受试者接受约500万个DNTT-MSC。
研究群体和施用程序
研究群体包括患有由6个月至90个月(7.5年)前发生的缺血性卒中事件导致的慢性运动缺陷的成年受试者。基于有研究表明超过90％的缺血性卒中受试者在卒中后90天是稳定的，选择卒中后6个月至90个月的区间。所有受试者在筛查时还具有2至4的mRS分数。mRS分数低于2的受试者被视为失能程度不足以证明此类程序的风险是合理的，而MRS分数大于4的受试者则被视为由于失能严重而面临风险增加。
如前所讨论的，作为临床试验的一部分，对总计158名受试者进行随机化，其中51名受试者接受假手术且107名受试者接受治疗(约250万个DNTT-MSC或约500万个DNTT-MSC)。在这158名受试者中，77名受试者罹患小体积缺血性卒中或缺血性核心体积小于50cc的卒中(基于作为受试者病史的一部分而被包括的CT或MRI扫描)。
受试者接受了假手术或约250万个DNTT-MSC或约500万个DNTT-MSC的颅内施用。DNTT-MSC通过单钻孔穿颅术立体定向施用。
在局部麻醉和镇静的情况下形成一个钻孔穿颅术(约1cm至约1.5cm)。打开受试者的硬脑膜，并插入植入套管。将五份20μL体积的包含DNTT-MSC的细胞悬浮液缓慢注射到通过立体定向靶向所选的五个植入位点(因此，沿单个沉积轨迹在五个植入位点注射了总计100μL的细胞悬浮液)。对具有通过相同钻孔穿颅术插入的不同轨迹的另外两个沉积轨迹重复此过程(参见例如图2)。接受约250万个DNTT-MSC的受试者被注射了具有约8.5*106个细胞/mL的靶浓度的细胞悬浮液，而接受约500万个DNTT-MSC的受试者则被注射了具有约17*106个细胞/mL的靶浓度的细胞悬浮液。
假手术组在局部麻醉和镇静的情况下接受假手术，利用相同的立体定向计划程序、部分厚度颅骨外板钻孔和头皮缝合，但不进行硬脑膜穿透或细胞植入。假手术程序被设计为尽可能紧密地模仿治疗组进行的程序。
DNTT-MSC或SB623细胞以含有≥8*106个细胞/mL的1mL单位体积作为无菌细胞悬浮液提供，并低温保存在2mL小瓶中的CryoStoreTM冷冻培养基中。将低温保存的细胞解冻、洗涤、离心并重悬浮在Plasma-Lyte A中，以获得上述靶浓度。施用前，对用于注射的配制剂量进行释放后测试，并且在释放后测试三小时内向受试者施用用于注射的配制剂量。
临床试验结果
在安全性方面，以约250万个细胞或约500万个细胞的剂量向受试者颅内施用的DNTT-MSC在所有患有卒中诱导的慢性运动缺陷的受试者中都被良好地耐受。
在疗效方面，在第24周(约第6个月)，在“合并的治疗组”(施用约250万个细胞或约500万个细胞的受试者)中相对于对照组/假手术组在总FMMS方面表现出至少10分的改善的受试者的比例方面，该研究未满足具有统计学显著差异的主要疗效终点。基于使用广义线性混合模型(generalized linear mixed model,GLMM)分析或逻辑回归分析进行的统计分析，假手术组(约15.6％)和合并的治疗组(约15.0％)的响应率相似，并且合并的治疗组响应率与假手术响应率之间没有统计学显著差异。
临床试验数据的回顾性分析
对从上述临床试验收集的数据进行了回顾性分析。
在疗效方面，申请人从回顾性分析中发现了一个出乎意料的结果，即在罹患小体积卒中(例如，缺血性核心体积小于50cc)的受试者中，在合并的治疗组(即施用约250万个细胞或约500万个细胞的受试者)中与假手术组/对照组相比在运动功能方面表现出临床上重要改善的受试者的比例方面观察到统计学显著差异(p值＝0.02)。鉴于这些出乎意料的发现，DNTT-MSC的施用可以被视为是用于罹患由小体积缺血性卒中引起的慢性运动缺陷的受试者的有效治疗。
此外，申请人发现的另一个出乎意料的结果是在非顶区/顶叶的脑区/脑叶中罹患卒中(即缺血性卒中位于非顶区/顶叶的脑区/脑叶中)的受试者中，在合并的治疗组中与假手术组/对照组相比在运动功能方面表现出临床上重要改善的受试者的比例方面观察到统计学显著差异(p值＝0.05)。
此外，申请人发现的又一个出乎意料的结果是在非顶区/顶叶的脑区中罹患小体积卒中(例如，缺血性核心体积小于50cc)的受试者中，在合并的治疗组中与假手术组/对照组相比在运动功能方面表现出临床上重要改善的受试者的比例方面观察到甚至更大的统计学显著差异(p值<0.01)。
作为回顾性分析的一部分，如果临床试验受试者通过实现下述MCID阈值(“MCID阈值”)中的至少一个而在运动功能方面表现出临床上有意义的改善，则他们被视为“综合响应者(Composite Responder)”：
1.在第24周(“W24”)其总FMMS的基线变化(“CFB”)改善为至少9分(W24 CFB总FMMS改善≥9分)。
2.在第24周其总FMMS UE的CFB改善为至少6分(W24 CFB FMMS UE改善≥6分)。
3.在第24周其总FMMS LE的CFB改善为至少4分(W24 CFB FMMS LE改善≥4分)。
以下表1和表2分别显示了总群体和小体积卒中亚群的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积。
表1：总群体在24周的治疗组和对照组的值
表2：小体积卒中(缺血性核心体积<50cc)群体在24周的治疗组和对照组的值
以下表3显示了总群体和小体积卒中亚群的Δ综合响应率(delta compositeresponse rate)及其随附的p值。就本公开内容的目的而言，“Δ综合响应率”是指治疗组与对照组之间的响应率差异。
表3：总群体和小体积卒中群体在24周的Δ综合响应值和随附的p值
如以上表1-3所示，与对照组(约19％)相比，治疗组中患有小体积卒中的细分群体(population subsegment)(例如罹患缺血性核心体积小于50cc的缺血性卒中的患者)具有显著更高的响应率(约49％)。基于GLMM和逻辑回归分析，该细分群体的约30％的Δ综合响应率被确定为是统计学显著的(p值＝0.02)。与之形成鲜明对比的是，总群体的8％的Δ综合响应率被确定为是统计学不显著的(p值＝0.42)。
回顾性分析还确定，该统计学显著的Δ综合响应率是由受试者的卒中体积而不是受试者的基线mRS驱动的。更具体而言，受试者的卒中体积对受试者的基线mRS没有任何重大影响(并且也没有实质性影响)。
图3A-3C是显示250万(2.5M)剂量组、500万(5.0M)剂量组和对照组的基线FMMS、基线mRS和卒中体积(例如卒中患者的缺血性核心的体积)之间的关系的图。图3A显示2.5M剂量组、5.0M剂量组和对照组的基线FMMS与卒中体积之间的关系。计算这两个因素之间的斯皮尔曼相关性(Spearman correlation)，得出相关性为-0.23，p值为0.002。这表明，受试者的基线FMMS与受试者的卒中体积显著相关，意味着卒中体积较小的受试者通常比卒中体积较大的受试者表现出更强的运动功能。
图3B显示2.5M剂量组、5.0M剂量组和对照组的基线mRS与基线FMMS之间的关系。计算这两个因素之间的斯皮尔曼相关性，得出相关性为-0.34，p值为小于0.001。这表明，受试者的基线mRS与受试者的基线FMMS显著相关，意味着基线运动功能较弱的受试者通常比基线运动功能较强的受试者失能程度更高。
图3C显示2.5M剂量组、5.0M剂量组和对照组的基线mRS与卒中体积之间的关系。计算这两个因素之间的斯皮尔曼相关性，得出相关性为0.06，p值为0.44。这表明，受试者的基线mRS与受试者的卒中体积不显著相关。
剂量比较
以下表4显示按治疗剂量、对照群体和总群体细分的所有受试者的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积。
表4：在24周各群体的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积
以下表5显示按治疗剂量、对照群体和总群体细分的患有小体积卒中的受试者(例如罹患缺血性核心体积小于50cc的缺血性卒中的患者)的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积。
表5：在24周各小体积卒中群体的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积
以下表6显示按治疗剂量、对照群体和总群体细分的卒中体积等于或大于50cc的受试者(例如罹患缺血性核心体积≥50cc的缺血性卒中的患者)的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积。
表6：在24周卒中体积等于或大于50cc的各卒中受试者群体的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积
以下表7显示按治疗剂量、对照群体和总群体细分的卒中体积等于或大于100cc的受试者(例如罹患缺血性核心体积≥100cc的缺血性卒中的患者)的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积。
表7：在24周卒中体积等于或大于100cc的各卒中受试者群体的综合响应率、平均基线分数和平均卒中体积
以上表4-7显示，当治疗群体按剂量(例如2.5M细胞剂量或5.0M细胞剂量)进行细分并与对照群体进行比较时，施用约250万个DNTT-MSC的那些受试者比施用约500万个DNTT-MSC的那些受试者更好地响应。如表5-7所示，这在所有卒中体积亚群中都被保持。
图4显示在几乎所有受试者的卒中体积中，2.5M剂量群体的Δ综合响应率(或治疗组与对照组之间的综合响应率差异)都超过了5.0M剂量群体的Δ综合响应率。从图4可以看出，Δ综合响应率中的差异在患有小体积卒中的受试者(例如，罹患缺血性核心体积小于50cc的缺血性卒中的患者)中尤为明显。这些结果出乎意料，并表明对于慢性缺血性卒中的治疗，250万个DNTT-MSC的剂量可能是比500万个DNTT-MSC的剂量在治疗上甚至更有效的剂量，尽管后者具有更多的细胞。对于患有小体积卒中的受试者(例如罹患缺血性核心体积小于50cc的缺血性卒中的患者)而言，尤其如此。
图4中的图排除了卒中体积低于2cc的受试者(例如，罹患缺血性核心体积小于2cc的缺血性卒中的患者)的结果，因为从相对角度来看，对照组中卒中体积小于2cc的受试者的数目大大超过了5.0M剂量组中此类受试者的数目。
表5-7还显示除了小体积卒中亚群(例如罹患缺血性核心体积小于50cc的缺血性卒中的患者)(参见表5)外，对于卒中体积等于或大于50cc(参见表6)或者等于或大于100cc(参见表7)的那些受试者，对照组的响应实际上优于任一剂量组。这些结果表明，DNTT-MSC对于治疗患有缺血性核心体积大于50cc的慢性卒中患者可能不太有效。
卒中的位置
这项回顾性分析还检查了基于卒中位置的治疗疗效。在受试者群体中，记录了以下脑区/部位中的卒中(或者更恰当地，此类卒中的缺血性核心)：(1)皮质下白质，(2)皮质下灰质，(3)皮质额区，(4)皮质顶区，以及(5)皮质颞区。图5显示了这些脑区/部位以及其他脑区/部位。
如之前所提及的，申请人发现的一个出乎意料的结果是在非皮质顶区/顶叶的脑区罹患卒中的受试者中，在合并的治疗组中与假手术组/对照组相比在运动功能方面表现出临床上重要改善的受试者的比例方面观察到统计学显著差异(p值＝0.05)。
此外，申请人发现的又一个出乎意料的结果是在非皮质顶区/顶叶的脑区罹患小体积卒中(例如缺血性核心体积小于50cc)的受试者中，在合并的治疗组中与假手术组/对照组相比在运动功能方面表现出临床上重要改善的受试者的比例方面观察到甚至更大的统计学显著差异(p值<0.01)。
以下表8显示总群体和在其皮质顶区未罹患卒中的受试者群体的Δ综合响应率及其随附的p值。
表8：在24周总群体和在其皮质顶区未罹患卒中的受试者的Δ综合响应值及随附的p值
以下表9显示在24周小体积卒中群体(缺血性核心体积小于50cc)中皮质顶区罹患或未罹患卒中的那些受试者的各Δ响应率和分数。
表9：在24周按皮质顶区是否存在卒中细分的小体积卒中群体的响应率和分数。
如以上表8所示，与对照组(约19％)相比，在治疗组中，其皮质顶区中未罹患卒中的研究群体中的受试者具有显著更高的响应率(约42％)。基于GLMM或逻辑回归分析，该细分群体的约23％的Δ综合响应率被确定为是统计学显著的(p值＝0.05)。
以上表9表明，在小体积卒中(缺血性核心体积小于50cc)群体的皮质顶区中未罹患卒中的细分群体中观察到最佳Δ综合响应率(45.8％)。
鉴于这些出乎意料的发现，DNTT-MSC的施用可以被视为是用于罹患由缺血性卒中引起的慢性运动缺陷的受试者的有效治疗，其中缺血性核心不位于受试者的皮质顶区。此外，DNTT-MSC的施用可以是用于罹患由小体积缺血性卒中引起的慢性运动缺陷的受试者的更有效的治疗，其中小体积(核心体积<50cc)缺血性核心不位于受试者的皮质顶区。
图6是作为回顾性分析的一部分而生成的参考表，包含有关按群体百分比细分的研究群体的卒中位置、基线特征和Δ响应率的信息。
图7是显示图6的Δ综合响应率对群体百分比作图的图。如图6所示，图中的点P1代表了群体的约9％并且包括具有低卒中体积(缺血性核心体积小于50cc)的受试者并且其中卒中不发生在受试者的皮质下灰质或皮质额区；图中的点P2代表了群体的约11％并且包括具有低卒中体积的受试者并且其中卒中不发生在受试者的皮质顶区；图中的点P3代表了群体的约25％并且包括具有低卒中体积的受试者并且其中卒中不发生在受试者的皮质颞区；图中的点P4代表了群体的约31％并且包括具有低卒中体积的受试者并且其中卒中不发生在皮质顶区或皮质颞区；图中的点P5代表了群体的约47％并且包括具有低卒中体积的所有研究受试者(无论卒中位置如何)；图中的点P6代表了群体的约51％并且包括其中卒中不发生在受试者的皮质顶区的所有研究受试者；图中的点P7代表了群体的约63％并且包括其中卒中至少部分地发生在受试者的皮质下白质中的所有研究受试者；图中的点P8代表了群体的约79％并且包括接受在小于180分钟内(被认为是低细胞处理时间)处理的细胞的所有研究受试者；并且图中的点P9代表了群体的约97％(基本上是整个研究群体)。
图6和图7显示了由点P5(低卒中体积)和P6(皮质顶区无卒中)所代表的细分群体是仅有的这样两个细分群体，即其中响应率(包括Δ综合响应率)经计算接近总研究群体的50％且两个Δ综合响应率均是统计学显著的。
还应注意的是，P5(低卒中体积)和P6(皮质顶区无卒中)群体之间存在明显的重叠，因为皮质顶区无卒中的83名受试者中的55名同时患有低体积卒中。
综合响应者在48周的进展
为了确立作为W24综合响应者的受试者在24周后(即在48周或W48)在其失能分数方面是否也显示出改善，还分析了在W48的临床试验数据，以确定总群体和具有低卒中体积(缺血性核心体积小于50cc)的亚群的mRS CFB。
以下表10和11分别显示了总群体和低卒中体积亚群的W48 mRS变化。重要的是要注意受试者mRS的下降是受试者失能程度或失能等级方面的改善。
表10：总群体中综合响应者和非响应者在48周的mRS变化
表11：低卒中体积亚群中综合响应者和非响应者在48周的mRS变化
如以上表10和表11所示，与总群体相比，低卒中体积(缺血性核心体积<50cc)亚群中的综合响应者在48周表现出更好的ΔmRS CFB。由于受试者运动响应的改善是受试者失能改善的先决条件(这被称为“先导滞后效应”)，因此结果显示，在第48周，总群体和低卒中体积亚群两者中的综合响应者中都存在先导滞后效应，而这种效应在低卒中体积亚群中的综合响应者中更为突出。
已经描述了许多实施方案。然而，本领域技术人员应当理解的是，在不脱离所述实施方案的精神和范围的情况下，可以对本公开内容进行各种改变和修改。通过任何实施方案所示的系统、装置、设备和方法的要素对于具体实施方案而言均是示例性的，并且可以在本公开内容的范围内组合使用或以其他方式在其他实施方案中使用。例如，图中所描绘的或本公开内容中所描述的任何方法的步骤并不要求所示出的或所描述的特定顺序(order)或依次顺序(sequential order)来实现所期望的结果。此外，还可以提供其他步骤操作，或者从所描述的方法或过程中消除或省略步骤或操作，以实现所期望的结果。此外，本公开内容中所描述的或图中所描绘的任何设备或系统的任何组件或部件都可以被移除、消除或省略，以实现所期望的结果。此外，出于简明和清楚，已经省略了本文所示出的或所描述的系统、装置或设备的某些组件或部件。
因此，其他实施方案落入所附权利要求书的范围之内，并且说明书和/或附图可以视为说明性的而非限制性的。
本文所描述的和示出的每一个单独的变化形式或实施方案具有离散的组件和特征，这些组件和特征可以容易地与任何其他变化形式或实施方案的特征分离或组合。可以进行修改，以使特定的情况、材料、物质组成、过程、过程行为或步骤适应本发明的目标、精神或范围。
本文所阐述的方法可以以所阐述事件的任何逻辑上可能的顺序以及所阐述事件的顺序进行。此外，可以提供另外的步骤或操作，或者可以消除步骤或操作以实现所期望的结果。
此外，在提供值的范围的情况下，该范围的上限和下限之间的每一个中间值以及所述及的范围内的任何其他述及的值或中间值都包含在本发明中。此外，所描述的发明的变化形式的任何可选特征可以独立地或与本文所描述的任一个或更多个特征组合提出并请求保护。例如，对范围1至5的描述应视为已公开了诸如1至3、1至4、2至4、2至5、3至5等子范围以及该范围内的个体数字，例如1.5、2.5等，以及其间的任何全增量或偏增量。
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当短语“至少一个”修饰多个项目或组件(或列举的项目或组件列表)时，提到这类短语意指这些项目或组件中的一个或更多个的任意组合。例如，短语“A、B和C中的至少一个”是指：(i)A；(ii)B；(iii)C；(iv)A、B和C；(v)A和B；(vi)B和C；或(vii)A和C。
在理解本公开内容的范围时，本文所用的术语“包含/包括(comprising)”及其派生词旨在作为开放式术语，其指明存在所述及的特征、要素、组件、组、整数和/或步骤，但不排除存在其他未述及的特征、要素、组件、组、整数和/或步骤。上述内容也适用于具有类似含义的词语，例如术语“含有(including)”、“具有(having)”及其派生词。此外，术语“一部分(part)”、“部分(section)”、“部分(portion)”、“成员(member)”、“要素(element)”或“组件(component)”，当以单数使用时，可以具有单个部分或多于一个部分的双重含义。本文所用的以下方向性术语“向前(forward)、向后(rearward)、上方(above)、向下(downward)、竖直(vertical)、水平(horizontal)、下方(below)、横向(transverse)、侧向(laterally)和竖直(vertically)”以及任何其他类似的方向性术语，是指装置或设备的那些位置或者装置或设备平移或移动的那些方向。
最后，本文所用的程度术语诸如“基本上”、“约”和“大约”意指指定值或者指定值以及与从指定值偏离的合理量(例如，偏离多达±0.1％、±1％、±5％或±10％，因为此类变动是适当的)，从而使最终结果不会发生显著或实质性变化。例如，“约1.0cm”可以解释为意指“1.0cm”或介于“0.9cm与1.1cm”之间。当程度术语诸如“约”或“大约”用于指作为某一范围的一部分的数字或值时，该术语可用于修饰最小和最大数字或数值。
本公开内容不旨在局限于所述的具体形式的范围，而是旨在涵盖本文所描述的变化形式或实施方案的替代物、修改形式和等同物。此外，本公开内容的范围完全包括根据本公开内容对本领域技术人员而言可以变得明显的其他变化形式或实施方案。
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Claims (130)
1.一种在受试者罹患小体积缺血性卒中后治疗所述受试者的方法，包括：
向所述受试者的围绕小体积缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中所述细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小体积缺血性核心是具有小于50立方厘米(cc)的缺血性核心体积的缺血性核心。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述小体积缺血性核心是具有在约2cc与50cc之间的缺血性核心体积的缺血性核心。
4.根据权利要求1所述的方法，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带近端或所述慢性半暗带内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
6.根据权利要求1所述的方法，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带远端的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括通过单钻孔穿颅术立体定向施用所述治疗有效量的细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述小体积缺血性核心位于所述受试者的顶区以外的脑区。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述小体积缺血性核心的至少一部分位于所述受试者脑的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质和皮质下灰质的至少一个中。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞通过包括以下的方法制备：
提供间充质干细胞的培养物；
使所述间充质干细胞的培养物与编码NICD的所述多核苷酸接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白，
选择包含所述多核苷酸的细胞；以及
在不对所述多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量的细胞为约250万个细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中施用所述约250万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量的细胞为约500万个细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中施用所述约500万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在施用所述细胞前所述小体积缺血性卒中发生超过6个月。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在施用所述细胞前所述小体积缺血性卒中发生6个月与90个月之间。
17.根据权利要求1所述的方法，还包括通过确定所述受试者的mRS分数来评估所述受试者的失能程度，并且仅当所述受试者的mRS分数为2至4时，才施用所述治疗有效量的细胞。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质干细胞是人骨髓衍生的细胞。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量的细胞悬浮在无菌等渗晶体溶液中。
20.根据权利要求1所述的方法，还包括在向所述受试者施用所述细胞之前，对配制剂量的所述细胞进行释放后测试。
21.一种治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法，包括：
确定所述受试者的缺血性核心的体积；和
仅当所述缺血性核心的体积被确定为小于50立方厘米(cc)时，才向所述受试者的围绕所述缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中所述细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，还包括仅当所述缺血性核心的体积在约2cc与50cc之间时，才向所述受试者的围绕所述缺血性核心的脑区施用所述治疗有效量的细胞。
23.根据权利要求21所述的方法，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
24.根据权利要求21所述的方法，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带近端或所述慢性半暗带内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
25.根据权利要求21所述的方法，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带远端的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
26.根据权利要求21所述的方法，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括通过单钻孔穿颅术立体定向施用所述治疗有效量的细胞。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述缺血性核心位于所述受试者的顶区以外的脑区。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述缺血性核心的至少一部分位于所述受试者的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质和皮质下灰质的至少一个中。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞通过包括以下的方法制备：
提供间充质干细胞的培养物；
使所述间充质干细胞的培养物与编码NICD的所述多核苷酸接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；
选择包含所述多核苷酸的细胞；以及
在不对所述多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。
30.根据权利要求21所述的方法，其中所述治疗有效量的细胞为约250万个细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中施用所述约250万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述治疗有效量的细胞为约500万个细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中施用所述约500万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
34.根据权利要求21所述的方法，其中所述卒中诱导的运动缺陷是所述受试者罹患的缺血性卒中的结果。
35.根据权利要求34所述的方法，其中在施用所述细胞前所述缺血性卒中发生超过6个月。
36.根据权利要求35所述的方法，其中在施用所述细胞前所述缺血性卒中发生6个月与90个月之间。
37.根据权利要求21所述的方法，还包括通过确定所述受试者的mRS分数来评估所述受试者的失能程度，并且仅当所述受试者的mRS分数为2至4时，才施用所述治疗有效量的细胞。
38.根据权利要求21所述的方法，其中所述间充质干细胞是人骨髓衍生的细胞。
39.根据权利要求21所述的方法，其中所述治疗有效量的细胞悬浮在无菌等渗晶体溶液中。
40.根据权利要求21所述的方法，还包括在向所述受试者施用所述细胞之前，对配制剂量的所述细胞进行释放后测试。
41.一种组合物，所述组合物用于治疗小体积缺血性卒中，所述组合物包含：
治疗有效量的细胞，其中所述细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞；和
药学上可接受的载体或稀释剂。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述细胞通过包括以下的方法制备：
提供间充质干细胞的培养物；
使所述间充质干细胞的培养物与编码NICD的所述多核苷酸接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；
选择包含所述多核苷酸的细胞；以及
在不对所述多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。
43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述间充质干细胞是人骨髓衍生的细胞。
44.根据权利要求41所述的组合物，其中所述间充质干细胞是用包含编码NICD的所述多核苷酸的质粒瞬时转染的。
45.根据权利要求41所述的组合物，其中所述治疗有效量的细胞为约250万个细胞。
46.根据权利要求41所述的组合物，其中所述治疗有效量的细胞为约500万个细胞。
47.根据权利要求41所述的组合物，其中所述治疗有效量的细胞为约200万个细胞至约500万个细胞。
48.根据权利要求41所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体或稀释剂包含无菌等渗晶体溶液。
49.根据权利要求45所述的组合物，其中所述组合物是包装在密封小瓶中的细胞悬浮液，其中所述细胞悬浮液的体积为约0.3mL，并具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
50.根据权利要求46所述的组合物，其中所述组合物是包装在密封小瓶中的细胞悬浮液，其中所述细胞悬浮液的体积为约0.3mL，并具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
51.细胞在制备用于在受试者罹患小体积缺血性卒中后治疗所述受试者的药物中的用途，包括：
向所述受试者的围绕小体积缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中所述细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述小体积缺血性核心是具有小于50立方厘米(cc)的缺血性核心体积的缺血性核心。
53.根据权利要求51所述的用途，其中所述小体积缺血性核心是具有在约2cc与50cc之间的缺血性核心体积的缺血性核心。
54.根据权利要求51所述的用途，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
55.根据权利要求51所述的用途，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带近端或所述慢性半暗带内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
56.根据权利要求51所述的用途，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带远端的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
57.根据权利要求51所述的用途，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括通过单钻孔穿颅术立体定向施用所述治疗有效量的细胞。
58.根据权利要求51所述的用途，其中所述小体积缺血性核心位于所述受试者的顶区以外的脑区。
59.根据权利要求51所述的用途，其中所述小体积缺血性核心的至少一部分位于所述受试者脑的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质和皮质下灰质的至少一个中。
60.根据权利要求51所述的用途，其中所述细胞通过包括以下的方法制备：
提供间充质干细胞的培养物；
使所述间充质干细胞的培养物与编码NICD的所述多核苷酸接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；
选择包含所述多核苷酸的细胞；以及
在不对所述多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。
61.根据权利要求51所述的用途，其中所述治疗有效量的细胞为约250万个细胞。
62.根据权利要求61所述的用途，其中施用所述约250万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
63.根据权利要求51所述的用途，其中所述治疗有效量的细胞为约500万个细胞。
64.根据权利要求63所述的用途，其中施用所述约500万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
65.根据权利要求51所述的用途，其中在施用所述细胞前所述小体积缺血性卒中发生超过6个月。
66.根据权利要求51所述的用途，其中在施用所述细胞前所述小体积缺血性卒中发生6个月与90个月之间。
67.根据权利要求51所述的用途，还包括通过确定所述受试者的mRS分数来评估所述受试者的失能程度，并且仅当所述受试者的mRS分数为2至4时，才施用所述治疗有效量的细胞。
68.根据权利要求51所述的用途，其中所述间充质干细胞是人骨髓衍生的细胞。
69.根据权利要求51所述的用途，其中所述治疗有效量的细胞悬浮在无菌等渗晶体溶液中。
70.根据权利要求51所述的用途，还包括在向所述受试者施用所述细胞之前，对配制剂量的所述细胞进行释放后测试。
71.细胞在制备用于治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的药物中的用途，包括：
确定所述受试者的缺血性核心的体积；和
仅当所述缺血性核心的体积被确定为小于50立方厘米(cc)时，才向所述受试者的围绕所述缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中所述细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
72.根据权利要求71所述的用途，还包括仅当所述缺血性核心的体积在约2cc与50cc之间时，才向所述受试者的围绕所述缺血性核心的脑区施用所述治疗有效量的细胞。
73.根据权利要求71所述的用途，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
74.根据权利要求71所述的用途，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带近端或所述慢性半暗带内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
75.根据权利要求71所述的用途，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带远端的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
76.根据权利要求71所述的用途，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括通过单钻孔穿颅术立体定向施用所述治疗有效量的细胞。
77.根据权利要求71所述的用途，其中所述缺血性核心位于所述受试者的顶区以外的脑区。
78.根据权利要求71所述的用途，其中所述缺血性核心的至少一部分位于所述受试者的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质和皮质下灰质的至少一个中。
79.根据权利要求71所述的用途，其中所述细胞通过包括以下的方法制备：
提供间充质干细胞的培养物；
使所述间充质干细胞的培养物与编码NICD的所述多核苷酸接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；
选择包含所述多核苷酸的细胞；以及
在不对所述多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。
80.根据权利要求71所述的用途，其中所述治疗有效量的细胞为约250万个细胞。
81.根据权利要求80所述的用途，其中施用所述约250万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
82.根据权利要求81所述的用途，其中所述治疗有效量的细胞为约500万个细胞。
83.根据权利要求82所述的用途，其中施用所述约500万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
84.根据权利要求71所述的用途，其中所述卒中诱导的运动缺陷是所述受试者罹患的缺血性卒中的结果。
85.根据权利要求84所述的用途，其中在施用所述细胞前所述缺血性卒中发生超过6个月。
86.根据权利要求85所述的用途，其中在施用所述细胞前所述缺血性卒中发生6个月与90个月之间。
87.根据权利要求71所述的用途，还包括通过确定所述受试者的mRS分数来评估所述受试者的失能程度，并且仅当所述受试者的mRS分数为2至4时，才施用所述治疗有效量的细胞。
88.根据权利要求71所述的用途，其中所述间充质干细胞是人骨髓衍生的细胞。
89.根据权利要求71所述的用途，其中所述治疗有效量的细胞悬浮在无菌等渗晶体溶液中。
90.根据权利要求71所述的用途，还包括在向所述受试者施用所述细胞之前，对配制剂量的所述细胞进行释放后测试。
91.细胞，所述细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞，所述细胞用于在受试者罹患小体积缺血性卒中后治疗所述受试者的方法中使用，其中所述方法包括向所述受试者的围绕小体积缺血性核心的脑区施用治疗有效量的所述细胞。
92.根据权利要求91所述的细胞，其中所述小体积缺血性核心是具有小于50立方厘米(cc)的缺血性核心体积的缺血性核心。
93.根据权利要求91所述的细胞，其中所述小体积缺血性核心是具有在约2cc与50cc之间的缺血性核心体积的缺血性核心。
94.根据权利要求91所述的细胞，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
95.根据权利要求91所述的细胞，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带近端或所述慢性半暗带内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
96.根据权利要求91所述的细胞，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述小体积缺血性核心的慢性半暗带远端的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
97.根据权利要求91所述的细胞，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括通过单钻孔穿颅术立体定向施用所述治疗有效量的细胞。
98.根据权利要求91所述的细胞，其中所述小体积缺血性核心位于所述受试者的顶区以外的脑区。
99.根据权利要求91所述的细胞，其中所述小体积缺血性核心的至少一部分位于所述受试者脑的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质和皮质下灰质的至少一个中。
100.根据权利要求91所述的细胞，其中所述细胞通过包括以下的方法制备：
提供间充质干细胞的培养物；
使所述间充质干细胞的培养物与编码NICD的所述多核苷酸接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白，
选择包含所述多核苷酸的细胞；以及
在不对所述多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。
101.根据权利要求91所述的细胞，其中所述治疗有效量的细胞为约250万个细胞。
102.根据权利要求101所述的细胞，其中施用所述约250万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
103.根据权利要求91所述的细胞，其中所述治疗有效量的细胞为约500万个细胞。
104.根据权利要求103所述的细胞，其中施用所述约500万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
105.根据权利要求91所述的细胞，其中在施用所述细胞前所述小体积缺血性卒中发生超过6个月。
106.根据权利要求91所述的细胞，其中在施用所述细胞前所述小体积缺血性卒中发生6个月与90个月之间。
107.根据权利要求91所述的细胞，还包括通过确定所述受试者的mRS分数来评估所述受试者的失能程度，并且仅当所述受试者的mRS分数为2至4时，才施用所述治疗有效量的细胞。
108.根据权利要求91所述的细胞，其中所述间充质干细胞是人骨髓衍生的细胞。
109.根据权利要求91所述的细胞，其中所述治疗有效量的细胞悬浮在无菌等渗晶体溶液中。
110.根据权利要求91所述的细胞，还包括在向所述受试者施用所述细胞之前，对配制剂量的所述细胞进行释放后测试。
111.细胞，所述细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞，所述细胞用于在治疗患有卒中诱导的运动缺陷的受试者的方法中使用，其中所述方法包括：
确定所述受试者的缺血性核心的体积；以及
仅当所述缺血性核心的体积被确定为小于50立方厘米(cc)时，才向所述受试者的围绕所述缺血性核心的脑区施用治疗有效量的细胞，其中所述细胞来源于经编码Notch细胞内结构域(NICD)的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞。
112.根据权利要求111所述的细胞，还包括仅当所述缺血性核心的体积在约2cc与50cc之间时，才向所述受试者的围绕所述缺血性核心的脑区施用所述治疗有效量的细胞。
113.根据权利要求111所述的细胞，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带外周处的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
114.根据权利要求111所述的细胞，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带近端或所述慢性半暗带内的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
115.根据权利要求111所述的细胞，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括在围绕所述缺血性核心的慢性半暗带远端的一个或更多个沉积位点注射至少一部分包含所述细胞的细胞悬浮液。
116.根据权利要求111所述的细胞，其中施用所述治疗有效量的细胞还包括通过单钻孔穿颅术立体定向施用所述治疗有效量的细胞。
117.根据权利要求111所述的细胞，其中所述缺血性核心位于所述受试者的顶区以外的脑区。
118.根据权利要求111所述的细胞，其中所述缺血性核心的至少一部分位于所述受试者的皮质额区、皮质颞区、皮质下白质和皮质下灰质的至少一个中。
119.根据权利要求111所述的细胞，其中所述细胞通过包括以下的方法制备：
提供间充质干细胞的培养物；
使所述间充质干细胞的培养物与编码NICD的所述多核苷酸接触，其中所述多核苷酸不编码全长Notch蛋白；
选择包含所述多核苷酸的细胞；以及
在不对所述多核苷酸进行选择的情况下进一步培养所选细胞。
120.根据权利要求111所述的细胞，其中所述治疗有效量的细胞为约250万个细胞。
121.根据权利要求120所述的细胞，其中施用所述约250万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约8.5*106个细胞/mL的细胞浓度。
122.根据权利要求111所述的细胞，其中所述治疗有效量的细胞为约500万个细胞。
123.根据权利要求122所述的细胞，其中施用所述约500万个细胞包括在沿第一沉积轨迹的五个沉积位点、沿第二沉积轨迹的五个沉积位点以及沿第三沉积轨迹的五个沉积位点注射包含所述细胞的细胞悬浮液，其中每个沉积位点注射约20μL所述细胞悬浮液，并且其中所述细胞悬浮液具有约17.0*106个细胞/mL的细胞浓度。
124.根据权利要求111所述的细胞，其中所述卒中诱导的运动缺陷是所述受试者罹患的缺血性卒中的结果。
125.根据权利要求124所述的细胞，其中在施用所述细胞前所述缺血性卒中发生超过6个月。
126.根据权利要求125所述的细胞，其中在施用所述细胞前所述缺血性卒中发生6个月与90个月之间。
127.根据权利要求111所述的细胞，还包括通过确定所述受试者的mRS分数来评估所述受试者的失能程度，并且仅当所述受试者的mRS分数为2至4时，才施用所述治疗有效量的细胞。
128.根据权利要求111所述的细胞，其中所述间充质干细胞是人骨髓衍生的细胞。
129.根据权利要求111所述的细胞，其中所述治疗有效量的细胞悬浮在无菌等渗晶体溶液中。
130.根据权利要求111所述的细胞，还包括在向所述受试者施用所述细胞之前，对配制剂量的所述细胞进行释放后测试。
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