CN117106978A - 一种基于转座酶的gi\gii组诺如病毒靶向建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于测序文库构建技术领域，具体涉及一种基于转座酶的GI\GII组诺如病毒靶向建库方法。本发明提供了诺如病毒特异性反转录引物，可以针对诺如病毒针对性的反转录。本发明建立了基于TRACE‑seq理论构建的基于转座酶的诺如病毒文库制备方法，并最终应用于诺如病毒的全基因组测序。本发明还构建了与上述制备方法对应的文库构建试剂盒，采用转座酶法打断，在片段打断过程自动添加通用片段，只需一步就可以完成index的添加；采用本发明所述试剂盒完成建库只需要上机测序较少的数据量就可以得到更多的基因片段，降低测序成本。
Description
技术领域
本发明属于测序文库构建技术领域，具体涉及一种基于转座酶的GI\GII组诺如病毒靶向建库方法。
背景技术
病毒基因组的成功获取需要从背景序列中有效筛选极少量的病毒序列，在病毒测序过程中，如何去除背景序列是非常关键的，背景序列中影响最大的是核糖体RNA。目前在转录组测序技术，去除核糖体RNA有两种方式：第一种是利用病毒自带的poly-A尾，通过修饰oligo-T的磁珠特异性富集mRNA；第二种是使用背景生物的随机核糖体RNA的特异性探针，捕获宿主及背景序列中的核糖体RNA并进一步去除。尽管这些方法可以实现对部分背景序列的去除，但是在针对病毒序列的测序中，宿主及背景的核酸读段仍然可以占到99％以上。背景序列的存在增加了测序需要的原始数据量和成本，也提高了后续生物信息学分析的难度、分析时间和储存消耗。由于诺如病毒序列的多样性和极不保守性，很难设计出对诺如病毒分段PCR或者全局式多重PCR的特异性引物，从而进行针对诺如病毒的特异性NGS建库分析。因此与其他种类病毒相比，获取NoV的全基因组序列更加困难。根据VP1氨基酸序列的聚类分析，诺如病毒可分为10个基因组(Genogroup，GI-GX)，其中GI和GII组毒株最为常见。自上世纪90年代以来，GII.4型NoV是全球最主要的流行基因型，引起了50-70％的疫情，因此本发明以GI和GII组诺如病毒为对象研发了基于转座酶的靶向建库方法。
转座酶(Transposase)存在于原核生物和真核生物中，并以“剪切和粘贴”机制催化确定的DNA元件(转座子)移动到基因组的另一部分。利用这种催化活性，DNA片段化的同时将DNA末端连接上特定的接头。基于Tn5转座酶的DNA建库方法解决了传统方法建库时对物理超声打断的设备依赖，并且对样本的DNA起始投入量要求更低。Tn5已被广泛应用于高通量测序，生物信息学分析和酶结构学研究表明，它属于反转录病毒整合酶家族，不仅可以作用于DNA，也具有对RNA-cDNA杂交链的体外标记活性，实现了体外特异性识别并同步打断RNA-cDNA双链的功能，称为Transposase-assisted RNA-DNA hybrids Co-tagmEntation(TRACE-seq)。与传统RNA-seq相比，TRACE-seq具有更简单的操作步骤和更稳定的序列产出，但目前仍停留在理论层面，实际应用很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于转座酶的GI\GII组诺如病毒靶向建库方法，基于TRACE-seq理论构建基于转座酶的诺如病毒文库，并最终应用于诺如的全基因组测序。
本发明提供了一种诺如病毒特异性反转录引物组，包括独立包装的A组引物和B组引物；
所述A组引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.13所示；
所述B组引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14～SEQ ID No.25所示。
本发明提供了一种诺如病毒特异性反转录方法，包括提取诺如病毒RNA后依次进行预变性和DNA去除，得模板液；
将所述模板液分别与上述诺如病毒特异性反转录引物组中的A组引物和B组引物构建反转录体系，进行反转录反应，得A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链；
所述反转录体系以10μL计，包括：7.5μL模板液、10×RTMix 1.0μL、HiScript IIIEnzyme Mix 1.0μL和A组引物/B组引物0.5μL。
优选的，所述预变性包括将提取得到的诺如病毒RNA于65℃加热5min，然后在0～4℃环境中静置2min。
优选的，所述反转录反应的程序，包括：105℃热盖；25℃5min；37℃30min；85℃5s。
本发明还提供了一种诺如病毒的文库构建试剂盒，包括上述诺如病毒特异性反转录引物组和反转录病毒整合酶。
优选的，所述反转录病毒整合酶包括Tn5转座酶。
本发明还提供了一种诺如病毒的文库构建方法，包括以下步骤：(1)提取诺如病毒RNA后依次进行预变性和DNA去除，得模板液；
(2)将所述模板液分别与上述诺如病毒特异性反转录引物组中的A组引物和B组引物构建反转录体系，进行反转录反应，得RNA-cDNA双链；所述反转录体系以10μL计，包括：7.5μL模板液、10×RT Mix 1.0μL、HiScript III Enzyme Mix 1.0μL和A组引物/B组引物0.5μL；
(3)将A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链混合，利用反转录病毒整合酶打断，得片段化链；
(4)对所述片段化链进行链置换后作为模板，利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，构建得到诺如病毒文库。
优选的，步骤(4)中所述链置换的体系以90μL计，包括：片段化链34.0μL、VAHTSHiFi Amplification Mix 50.0μL、PCR Primer Mix 3for Illumina 5.0μL和TSE 1.0μL；
所述链置换的程序，包括：热盖105℃；55℃5min；60℃5min；95℃5min。
优选的，构建得到诺如病毒文库后，还包括纯化文库。
本发明还提供了上述诺如病毒特异性反转录引物组、上述文库构建试剂盒或利用上述文库构建方法构建得到的诺如病毒文库在诺如病毒全基因组测序中的应用。
有益效果：本发明提供了诺如病毒特异性反转录引物，通过1137条GI和GII组诺如病毒的完整序列比对保守区域进而设计保守区域引物。采用所述特异性的引物，可以针对诺如病毒针对性的反转录，对诺如病毒的序列进行初步的筛选和富集，提高有效序列的浓度，增加文库的构建成功率。
本发明建立了基于TRACE-seq理论构建的基于转座酶的诺如病毒文库制备方法，并最终应用于诺如病毒的全基因组测序。本发明所述文库的构建方法，包括四部分内容(图1)：RNA反转录，RNA-cDNA双链酶切，PCR扩增和产物纯化。使用基于食源性诺如病毒序列设计的引物，将RNA分为试管A和B两管，进行特异性的反转录反应；RNA-cDNA双链直接用修饰的Tn5转座酶酶切；高保真DNA聚合酶在末端延伸后将cDNA扩增成测序文库；纯化的产物可直接用于测序。
本发明还构建了与上述制备方法对应的文库构建试剂盒，在片段打断步骤，不依赖超声切断，采用转座酶法，片段大小更稳定；在片段打断过程自动添加了通用片段，只需一步就可以完成index的添加，减少了建库流程，节约了建库时间；相比传统建库方法和试剂盒，采用本发明所述试剂盒完成建库只需要上机测序较少的数据量就可以得到更多的基因片段，降低测序成本。
附图说明
图1为基于Tn5转座酶的RNA-cDNA双链酶切法的文库制备原理图；
图2为基于TRACE-seq的食源性诺如病毒阳性样本的测序结果图；序列通过RdRp区和衣壳蛋白VP1进行基因分型，绿色表示获得的与食源性诺如病毒的基因覆盖率，蓝色高度表示获得的序列在每个位置的测序深度；
图3为TRACE-seq方法和mRNA-seq方法k-mer的物种分布热图；样本下机数据大小在左侧列出，主要的食源性致病微生物在横坐标上列出；每种病原体的有效k-mer数量通过柱高和颜色显示，颜色从蓝色到红色表明k-mer数量的增加；有效k-mer数量与相关颜色之间的关系显示在右上角；诺如病毒的k-mer数量用红色箭头指向。
具体实施方式
本发明提供了一种诺如病毒特异性反转录引物组，包括独立包装的A组引物和B组引物；
所述A组引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.13所示；
所述B组引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14～SEQ ID No.25所示。
本发明所述引物组选择的原则，优选包括1)片段区域高度保守；2)引物长度为12～14bp；3)引物间隔1000～1500bp，基于所述原则，通过1137条GI和GII组诺如病毒的完整序列比对保守区域进而设计保守区域引物。经过验证本发明所述反转录引物组能特异性的反转录诺如病毒全基因组序列。
表1建库过程中的特异性反转录引物
本发明提供了一种诺如病毒特异性反转录方法，包括提取诺如病毒RNA后依次进行预变性和DNA去除，得模板液；
将所述模板液分别与上述诺如病毒特异性反转录引物组中的A组引物和B组引物构建反转录体系，进行反转录反应，得A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链；
所述反转录体系以10μL计，包括：7.5μL模板液、10×RTMix 1.0μL、HiScript IIIEnzyme Mix 1.0μL和A组引物/B组引物0.5μL。
本发明对于诺如病毒RNA的提取方法并没有特殊限定，优选利用试剂盒进行提取，如采用HiPure Viral RNAKit(广州美基生物科技有限公司，中国)或其他等效RNA提取试剂盒，裂解液中不加入Carrier RNA，最后RNA纯化时使用30.0μL RNase-Free ddH2O洗脱。
本发明对提取得到的诺如病毒RNA进行预变性，所述预变性优选包括将提取得到的诺如病毒RNA于65℃加热5min，然后在0～4℃环境中静置2min。本发明实施例中，优选在加热后直接置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
本发明优选在所述预变性后利用gDNA去除基因组DNA，更优选包括利用预变性RNA12.0μL和5×gDNAwiperMix 3.0μL构建体系，42℃孵育2min。
本发明以上述去除基因组DNA的预变性RNA为模板，分别与A组引物和B组引物构建反转录体系，用移液器轻轻吹打混匀，在PCR仪上设置如下程序反应：105℃热盖；25℃5min；37℃30min；85℃5s。本发明所述反转录体系中，A/B组引物的终浓度优选均为10μM。
本发明还提供了一种诺如病毒的文库构建试剂盒，包括上述诺如病毒特异性反转录引物组和反转录病毒整合酶。
本发明所述反转录病毒整合酶优选包括Tn5转座酶，Tn5 VR100/VR10/VR1均可。
本发明还提供了一种诺如病毒的文库构建方法，包括以下步骤：(1)提取诺如病毒RNA后依次进行预变性和DNA去除，得模板液；
(2)将所述模板液分别与上述诺如病毒特异性反转录引物组中的A组引物和B组引物构建反转录体系，进行反转录反应，得A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链；所述反转录体系以10μL计，包括：7.5μL模板液、10×RT Mix 1.0μL、HiScript III Enzyme Mix1.0μL和A组引物/B组引物0.5μL；
(3)将A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链混合，利用反转录病毒整合酶打断，得片段化链；
(4)对所述片段化链进行链置换后作为模板，利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，构建得到诺如病毒文库。
本发明所述模板液和RNA-cDNA双链的获取方法优选与上述相同在此不再赘述。
本发明得到RNA-cDNA双链后，将A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链混合，利用反转录病毒整合酶打断，得片段化链。本发明优选将A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链进行等量混合，构建32.0μL反应体系：等量混合液20.0μL、Tagmentbuffer 10.0μL和Tn5 VR100/VR10/VR12.0μL，使用移液器轻轻吹打充分混匀。本发明所述打断的程序优选包括：热盖105℃；55℃15min，10℃∞。反应完成后，在反应液中加入2.0μL TStopSolution；涡旋震荡混匀后，室温孵育5min。
得片段化链后，本发明对所述片段化链进行链置换后作为模板，利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，构建得到诺如病毒文库。本发明所述链置换的体系以90μL计，优选包括：片段化链34.0μL、VAHTS HiFi Amplification Mix50.0μL、PCR Primer Mix 3forIllumina 5.0μL和TSE 1.0μL；所述链置换的程序，优选包括：热盖105℃；55℃5min；60℃5min；95℃5min。
本发明所述PCR扩增的体系以100.0μL计，优选包括：模板90.0μL、N5XX5.0μL和N7XX 5.0μL。本发明所述N5XX和N7XX优选来自TruePrep Index Kit V2/V3 for Illumina(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)，该市售试剂盒中各提供8种N5XX/N6XX和12种N7XX/N8XX，可根据样本数量和Index搭配策略自行选择。本发明在配置完成所述PCR扩增体系后，进行PCR扩增：热盖105℃；95℃预变性1min；98℃变性20s，60℃退火15s，72℃延伸30s，20个循环；72℃再延伸5min，4℃保存。本发明所述PCR扩增体系中，所述PCR PrimerMix 3for Illumina优选为市售试剂盒中的产品，如TruePrep RNA Library Prep Kit forIllumina(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)或诺唯赞配套的接头mix(TD202)，实施例中以TruePrep RNA Library Prep Kit for Illumina为例进行说明。
本发明在构建得到所述诺如病毒文库后，优选还包括纯化文库，实施例中优选使用VAHTSDNA Clean Beads(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)纯化文库，使用前将磁珠平衡至室温并涡旋振荡充分混匀，在所述纯化后，即可直接使用IlluminaX-10平台进行2×150bp双端测序。
本发明还提供了上述诺如病毒特异性反转录引物组、上述文库构建试剂盒或利用上述文库构建方法构建得到的诺如病毒文库在诺如病毒全基因组测序中的应用。
本发明的基于转座酶的诺如病毒特异性建库方法，具有分析不同基因型的诺如病毒多重感染病毒序列全基因组的能力，结合NGS高通量的特点，可以对下机数据中不同的病毒序列进行有效的区分和拼接。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种基于转座酶的GI\GII组诺如病毒靶向建库方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、适用于特异性RNA病毒的TRACE-seq建库方法
结合TruePrep RNA Library Prep Kit for Illumina(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)或其他等效建库试剂盒，对针对性RNA病毒的TRACE-seq建库方法进行如下修改：
1)阳性样本病毒RNA提取
采用HiPure Viral RNAKit(广州美基生物科技有限公司，中国)或其他等效RNA提取试剂盒，裂解液中不加入Carrier RNA，最后RNA纯化时使用30.0μL RNase-Free ddH2O洗脱。
2)RNA模板预变性
取12.0μL提取的RNA 65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
3)基因组DNA去除：预变性RNA 12.0μL和5×gDNAwiperMix 3.0μL；用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。
4)逆转录反应
根据表1所示引物，分A/B管进行操作：步骤3)反应液7.5μL、10×RT Mix1.0μL、HiScript III Enzyme Mix 1.0μL和引物A/B组0.5μL；
用移液器轻轻吹打混匀，在PCR仪上运行如下程序：热盖105℃；25℃5min；37℃30min；85℃5s。
5)片段化
室温解冻Tagmentbuffer，上下颠倒混匀后备用。A/B管合并，在Nuclease-free离心管中配制如下混合液：步骤4)反应液20.0μL、Tagmentbuffer 10.0μL和Tn5 VR100/VR10/VR12.0μL；
使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
将反应管置于PCR仪中，运行程序：热盖105℃；55℃15min；10℃∞；
反应完成后，在反应液中加入2.0μLTStop Solution；
涡旋震荡混匀后，室温孵育5min。
6)链置换
室温解冻所需试剂，混匀后备用。在PCR管中配制如下混合液：步骤5)反应液34.0μL、VAHTS HiFi Amplification Mix 50.0μL、PCR Primer Mix 3for Illumina 5.0μL、TSE1.0μL。
用移液器轻轻吹打或涡旋混匀，在PCR仪上运行程序：热盖105℃；55℃5min；60℃5min；95℃5min。
7)文库扩增
在PCR管中配制如下混合液：步骤6)反应液90.0μL、N5XX 5.0μL和N7XX 5.0μL；
TruePrep Index KitV2/V3 forIllumina(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)中各提供8种N5XX/N6XX和12种N7XX/N8XX，可根据样本数量和Index搭配策略自行选择。
使用移液器吹打混匀，在PCR仪上设置如下程序反应：热盖105℃；95℃1min；98℃20s，60℃15s，72℃30s，20循环；72℃5min；4℃∞。
8)文库纯化
a.使用80.0μL(0.8×)VAHTSDNA Clean Beads(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)纯化文库，使用前将磁珠平衡至室温并涡旋振荡充分混匀。
b.涡旋振荡混匀VAHTSDNA Clean Beads，并吸取80.0μL加入至100.0μL文库扩增产物中，充分混匀，室温孵育5min。
c.将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。
d.保持反应管始终处于磁力架上，加入200.0μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。
e.重复步骤d，总计漂洗两次。
f.保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
g.将反应管从磁力架上取出，加入22.0μLNuclease-free ddH2O洗脱。充分混匀，室温孵育5min。
h.将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20.0μL上清至新的灭菌PCR管中，-20℃保存。
9)使用IlluminaX-10平台进行2×150bp双端测序。
2、文库qPCR定量
使用VAHTS Library Quantification Kit for Illumina(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)、基于染料qPCR法对NGS文库测定浓度。
a)准备适量文库稀释液，根据说明书按照稀释度1/1,000～1/100,000稀释待测文库。稀释后置于冰上备用。
b)解冻VAHTS SYBR qPCR MasterMix、qPCRPrimer Mix(VAHTS LibraryQuantification Kit for Illumina；南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)、DNAStandard 1-6(VAHTS Library Quantification Kit for Illumina；南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)，解冻后上下颠倒充分混匀，并短暂离心将溶液收集至管底，置于冰上备用，用完后立即放回-20℃保存。
在qPCR管中配制如下体系：VAHTS SYBR qPCRMasterMix 10.0μL、qPCR PrimerMix 2.0μL、DNA Standard 1-6或稀释后的文库或Nuclease-free ddH2O4.0μL、Nuclease-free ddH2O 4.0μL；
在NTC阴性对照反应管中加入灭菌蒸馏水；在样本反应管中加入稀释后的文库；在标准曲线反应管中加入DNA Standards。加入DNA Standards时，应按照DNA Standard 6至1的顺序(低浓度至高浓度)依次加入，以免气溶胶污染影响标准曲线的线性。
按照下述条件进行qPCR反应：95℃5min；95℃10s，60℃20s，35循环；溶解曲线。
使用有效范围内的Ct(作为纵坐标)和对应标准品浓度Log[pM](作为横坐标)绘制标准曲线。绘制的标准曲线相关系数R2应不低于0.99，斜率应位于-3.1～-3.6之间(扩增效率位于90％-110％之间)。如标准曲线参数不佳，应重复试验。
不同批次实验所得标准曲线不同，标准曲线符合相关系数及斜率要求即可。定量结果用于后续上机测序时上样量作参考。
实施例2
使用11份诺如病毒临床阳性样本采用实施例1的方法进行测试。每个样本的原始下机数据为6-240MB，所有测试样本均获得7kb以上的食源性NoV基因组序列。测试方法所用的基因型包括GI.3[P10]、GI.4[P4]、GI.5[P5]、GI.8[P8]、GII.2[P16]、GII.3[P12]、GII.4[P31]-Sydney_2012、GII.6[P7]、GII.12[P33]、GII.13[P21]、GII.14[P7]和GII.21[P21]，说明该方法适用于多种基因型食源性NoV的基因序列获取，具有NoV全基因组NGS的普适性和通用性。BLAST分数用于评估序列生物学相关性，所有序列均高于70.0，表明组装的序列与数据库中的NoV序列相似度高(图2)。很少报道的基因型序列(包括GI.3[P10]、GI.4[P4]、GI.5[P5]和GI.8[P8])的BLAST得分相对较低，这种情况主要是由于数据库中缺少足够的对应基因分型的全基因组序列所致。大多数序列覆盖了整个ORF区域(图2)，少数样本中缺少5’或3’末端序列，这对主要编码蛋白区域的基因分型或进化分析没有影响。
从读段覆盖度表现来看(图2)，未发现不同样本间、同一测序深度不足的特殊位置，表明此方法的Tn5转座酶识别RNA-DNA双链的酶切位点不具有特异性，与理论上随机剪切的说明一致。此外，特异性引物的加入，也未对测序深度造成特定点的影响，表明该方法通过投入特异性反转录引物实现目标病毒序列测序的方法可靠。
同时，发现样本SJTU-1030和SJTU-7565分别包含两种不同基因型的诺如病毒，为多重感染样本，且序列拼接完全，未出现交叉影响。在样本SJTU-18C7中鉴定出了三种不同的食源性NoV基因型，拼接出GII.13[P21]的全长基因组和两个具有3kb大小的GI.8[P8]和GII.21[P21]型NoV的基因组片段。根据研究(Danlei Liu,Zilei Zhang,Shenwei Liet.al.Fingerprinting of human noroviruses co-infections in a possiblefoodborne outbreak by metagenomics[J].International Journal ofFoodMicrobiology,2020,333,108787.)，发现在多重感染中总会存在一种基因型的NoV在排毒量上占主导地位，且读段分布超过65％，这种情况会导致多重感染样本中次要毒株的读段数目被稀释，因此难以获得次要基因型病毒的完整基因组信息，但是通过本发明试剂盒可以得到多重感染的完整基因组信息。综上所述，本发明的基于转座酶的诺如病毒特异性建库方法，具有分析多重感染病毒序列全基因组的能力，结合NGS高通量的特点，可以对下机数据中不同的病毒序列进行有效的区分和拼接。
在本发明的方法中，通过特异性引物的逆转录反应筛选病毒的序列，下机数据中诺如病毒k-mer的比例得到大幅提升(红色箭头)，有效k-mer平均值从2.2×104提升到8.5×104，同时其他食源性致病菌的k-mer数量从105降至102数量级。从k-mer分布图还可以看出，该方法具有很高的针对性，无法实现类似于传统mRNA-seq方法的效果，即对所有带有poly-A尾微生物的RNA进行宏基因组分析(图3)。因此该技术主要适用于针对诺如病毒的测序。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种诺如病毒特异性反转录引物组，其特征在于，包括独立包装的A组引物和B组引物；
所述A组引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.13所示；
所述B组引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14～SEQ ID No.25所示。
2.一种诺如病毒特异性反转录方法，其特征在于，包括提取诺如病毒RNA后依次进行预变性和DNA去除，得模板液；
将所述模板液分别与权利要求1所述诺如病毒特异性反转录引物组中的A组引物和B组引物构建反转录体系，进行反转录反应，得RNA-cDNA双链；
所述反转录体系以10μL计，包括：7.5μL模板液、10×RTMix 1.0μL、HiScript IIIEnzyme Mix 1.0μL和A组引物/B组引物0.5μL。
3.根据权利要求2所述诺如病毒特异性反转录方法，其特征在于，所述预变性包括将提取得到的诺如病毒RNA于65℃加热5min，然后在0～4℃环境中静置2min。
4.根据权利要求2或3所述诺如病毒特异性反转录方法，其特征在于，所述反转录反应的程序，包括：105℃热盖；25℃5min；37℃30min；85℃5s。
5.一种诺如病毒的文库构建试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述诺如病毒特异性反转录引物组和反转录病毒整合酶。
6.根据权利要求5所述文库构建试剂盒，其特征在于，所述反转录病毒整合酶包括Tn5转座酶。
7.一种诺如病毒的文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取诺如病毒RNA后依次进行预变性和DNA去除，得模板液；
(2)将所述模板液分别与权利要求1所述诺如病毒特异性反转录引物组中的A组引物和B组引物构建反转录体系，进行反转录反应，得A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链；所述反转录体系以10μL计，包括：7.5μL模板液、10×RT Mix 1.0μL、HiScript III EnzymeMix 1.0μL和A组引物/B组引物0.5μL；
(3)将A组的RNA-cDNA双链和B组的RNA-cDNA双链混合，利用反转录病毒整合酶打断，得片段化链；
(4)对所述片段化链进行链置换后作为模板，利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，构建得到诺如病毒文库。
8.根据权利要求7所述文库构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述链置换的体系以90μL计，包括：片段化链34.0μL、VAHTS HiFiAmplification Mix50.0μL、PCR PrimerMix3forIllumina 5.0μL和TSE 1.0μL；
所述链置换的程序，包括：热盖105℃；55℃5min；60℃5min；95℃5min。
9.根据权利要求7或8所述文库构建方法，其特征在于，构建得到诺如病毒文库后，还包括纯化文库。
10.权利要求1所述诺如病毒特异性反转录引物组、权利要求5或6所述文库构建试剂盒或利用权利要求7～9任一项所述文库构建方法构建得到的诺如病毒文库在诺如病毒全基因组测序中的应用。
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