CN117058071A - 一种拟穴青蟹卵巢发育时期数的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种拟穴青蟹卵巢发育时期的无伤检测方法，其包括如下步骤：取得以卵巢发育时期数为变量、以卵巢与头胸甲的横截面积比值为因变量的拟合曲线方程；筛选符合条件待检测个体；进行麻醉预处理；将待检测个体置于光源下照射、以使其头胸甲上呈现出卵巢的阴影轮廓；取得光源照射下包括所述头胸甲的图像；分别取得所述图像上的头胸甲上的卵巢阴影轮廓的面积值，头胸甲的图像面积值，计算取得两者的比值；将该比值作为因变量代入拟合曲线方程中，求得对应于该因变量的变量，将该变量四舍五入求整后即为雌性拟穴青蟹个体的卵巢发育时期数。本发明能够避免对被检测拟穴青蟹造成躯体损伤，保证被检测拟穴青蟹继续用于生产销售和苗种繁育。
Description
技术领域
本发明属于医用器械技术领域，具体来说涉及一种拟穴青蟹卵巢发育时期数的检测方法。
背景技术
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是一种重要的海洋渔业资源和海水养殖蟹类，具有体型大、生长快、营养丰富和肉质鲜美的特点，深受人们喜爱。拟穴青蟹的卵巢在发育成熟后富含大量的蛋白质和脂肪、属于可食用组织。拟穴青蟹的卵巢发育成熟过程主要分为五个时期，分别为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅴ期，其中Ⅴ期为卵巢成熟时期，拟穴青蟹的卵巢在这五个发育时期呈现出显著不同的变化特征。生产实践中，性腺发育饱满的雌蟹不仅具有较高的商业价值，同时也是苗种繁育的亲本挑选标准。因此，判定拟穴青蟹的卵巢发育状况对于正确评估养成雌蟹的商品价值、开展繁育亲本的筛选均具有重要的参考意义。现有技术中，对拟穴青蟹卵巢发育时期的检测方法是对拟穴青蟹进行解剖，观察卵巢外部形态和卵巢的切片组织形态，这就意味着检测过程中需要杀死拟穴青蟹并解剖其卵巢组织。这种检测方法虽然比较准确，但需要杀死选取的拟穴青蟹。因此只能作为抽样检测使用，实践中无法大范围普及到每一个雌性拟穴青蟹个体。申请号为200910054769.0的发明专利公开了一种活体穿刺技术检查蟹类卵巢发育的方法，通过穿刺技术从活蟹体内取出少量卵巢组织检验卵巢的发育情况。但是此种方法在穿刺过程中会对蟹类的卵巢造成创伤，导致检测后的蟹类不再适合进入苗种繁育的亲本筛选环节。因此，如何开发出一种新的拟穴青蟹卵巢发育时期的鉴定方法，以克服现有技术中存在的上述缺陷。是本领域技术人员需要研究的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹卵巢发育时期数的检测方法，能够在执行卵巢发育时期数检测时，避免对被检测拟穴青蟹造成躯体损伤，保证被检测拟穴青蟹能够继续用于生产销售和苗种繁育。
本发明提供的技术方案是一种拟穴青蟹卵巢发育时期数的检测方法，
其包括如下步骤：
步骤100：取得以雌性拟穴青蟹个体的卵巢发育时期数b为变量、以雌性拟穴青蟹个体的卵巢横截面积与头胸甲横截面积的比值a为因变量的拟合曲线方程；
步骤200：筛选出卵巢进入快速发育阶段的待检测的雌性拟穴青蟹个体；
步骤300：对筛选出的雌性拟穴青蟹个体进行检测预处理；
步骤400：将完成检测预处理的雌性拟穴青蟹个体放置于光源下照射、使雌性拟穴青蟹个体的头胸甲上映射出卵巢阴影；
步骤500：取得光源照射下所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲的图像；
步骤600：分别取得所述图像上的头胸甲的图像面积值CA，卵巢阴影的面积值SA，并计算出图像面积比值AR＝SA/CA；
步骤700：将所述图像面积比值AR作为因变量代入所述拟合曲线方程中，求得对应于该因变量的变量，将所述变量进行四舍五入求整、所得的数值即为所述雌性拟穴青蟹个体的卵巢发育时期数。
优选的是，所述步骤100包括：
步骤110：选取雌性拟穴青蟹样本；
步骤120：取得雌性拟穴青蟹样本的卵巢横截面积与头胸甲横截面积的比值a；
步骤130：解剖雌性拟穴青蟹样本、取得雌性拟穴青蟹样本的卵巢发育时期数b；
步骤140：将所述比值a和卵巢发育时期数b存入样本数据集中，基于所述样本数据集取得所述拟合曲线方程。
优选的是，所述雌性拟穴青蟹样本的样本数量为至少300个，所述拟合曲线方程为：
y＝0.50822-0.37331/(1+(x/3.11082)11.56429)，R2＝0.97312。
优选的是，根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤200包括：筛选出腹脐部呈暗绿色或黑色、腹脐内长有外伸出刚毛的雌性拟穴青蟹个体，所述刚毛的伸出长度为2-5mm。
优选的是，所述步骤200包括：筛选出质量为200-500g的雌性拟穴青蟹个体。
优选的是，所述步骤300包括：
步骤310：将筛选出的雌性拟穴青蟹个体进行冷冻麻醉；
步骤320：清洁完成冷冻麻醉的所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面的水渍和有机污渍。
优选的是，所述步骤310包括：
将筛选出的雌性拟穴青蟹个体在内部温度为0-5℃的冰盒中放置8-12分钟。
优选的是，所述步骤320包括：
采用湿巾擦拭所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面的水渍；
采用75％医用酒精棉擦拭所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面附着的有机污渍。
优选的是，所述步骤400包括：
以LED手电筒作为光源对所述雌性拟穴青蟹个体进行照射，所述LED手电筒的光通量为1000lm，所述LED手电筒的光源面积为7000-8000mm2.。
优选的是，所述步骤500包括：
在所述头胸甲的一侧放置参考标尺，使用相机拍摄包括雌性拟穴青蟹个体的全部头胸甲的照片，将所述照片转化为图像文件；
所述步骤600包括：
从所述图像文件中裁剪出头胸甲图片以及卵巢阴影图片；
将所述图像文件、头胸甲图片以及卵巢阴影图片分别输入Digimizer 6.0软件，所述Digimizer 6.0软件计算出头胸甲的图像面积值CA，卵巢阴影的面积值SA，图像面积比值AR＝SA/CA。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
首先，本发明在实现对拟穴青蟹的卵巢发育时期检测过程中，避免对被检测拟穴青蟹造成躯体损伤，保证被检测拟穴青蟹能够继续用于生产销售和苗种繁育。
其次，本发明仅需一次性对约300-400个样本进行数据处理，即可取得拟合度较高的拟合曲线方程以实现普适性的检测操作，满足对拟穴青蟹个体的大规模全覆盖检测，极大的提高了检测效率。
最后，本发明相对于现有技术操作流程较短，且操作难度较低，降低了对检测人员操作水平的门槛。
附图说明
图1为实施例1的流程示意图。
图2为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅰ期)的头胸甲示意图。
图3为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅰ期)的卵巢阴影示意图。
图4为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅰ期)的卵巢组织切片示意图。
图5为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅱ期)的头胸甲示意图。
图6为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅱ期)的卵巢阴影示意图。
图7为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅱ期)的卵巢组织切片示意图。
图8为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅲ期)的头胸甲示意图。
图9为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅲ期)的卵巢阴影示意图。
图10为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅲ期)的卵巢组织切片示意图。
图11为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅳ期)的头胸甲示意图。
图12为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅳ期)的卵巢阴影示意图。
图13为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅳ期)的卵巢组织切片示意图。
图14为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅴ期)的头胸甲示意图。
图15为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅴ期)的卵巢阴影示意图。
图16为应用例1中雌性拟穴青蟹卵巢时期(Ⅴ期)的卵巢组织切片示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1，请参考图1：
一种拟穴青蟹卵巢发育时期数的检测方法，其包括如下步骤：
步骤100：取得以雌性拟穴青蟹个体的卵巢发育时期数为变量、以雌性拟穴青蟹个体的卵巢的横截面与头胸甲的面积比值为因变量的拟合曲线方程；
步骤200：筛选出卵巢进入快速发育阶段的待检测的雌性拟穴青蟹个体；
步骤300：对筛选出的雌性拟穴青蟹个体进行检测预处理；
步骤400：将完成检测预处理的雌性拟穴青蟹个体放置于光源下照射、使雌性拟穴青蟹个体的头胸甲上映射出卵巢阴影；
步骤500：取得光源照射下所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲的图像；
步骤600：分别取得所述图像上的头胸甲的图像面积值CA，卵巢阴影的面积值SA，并计算出图像面积比值AR＝SA/CA；
步骤700：将所述图像面积比值AR作为因变量代入所述拟合曲线方程中，求得对应于该因变量的变量，将所述变量进行四舍五入求整、所得的数值即为所述雌性拟穴青蟹个体的卵巢发育时期数。
通过采用上述技术方案：针对拟穴青蟹在进入快速发育阶段后，头胸甲尺寸无显著变化，而卵巢尺寸在发育成熟过程中逐渐增大这一特性，并利用拟穴青蟹壳体腔内除卵巢外其他器官组织均具有一定透光性这一生理特点，利用强光照射即可在拟穴青蟹的头胸甲处映射出卵巢的阴影轮廓，并通过图像处理工具取得两者之间的比值。通过建立拟穴青蟹的卵巢横截面与头胸甲的面积比值与卵巢发育时期数值的数学关系，将拟穴青蟹的卵巢检测过程转化为基于图像处理的数学模型运算和预测过程，由此，规避了现有技术中对拟穴青蟹的身体损伤，使得被检测拟穴青蟹能够继续用于生产销售和苗种繁育。
在一些应用场景中，所述步骤100包括：
步骤110：选取雌性拟穴青蟹样本；
步骤120：取得雌性拟穴青蟹样本的卵巢的横截面与头胸甲的面积比值a；
步骤130：解剖雌性拟穴青蟹样本、取得雌性拟穴青蟹样本的卵巢发育时期数b；
步骤140：将所述比值a和卵巢发育时期数b存入样本数据集中，基于所述样本数据集取得所述拟合曲线方程。
通过采用上述技术方案：在现有的解剖拟穴青蟹检测卵巢检测方法的基础上，进一步取得样本的卵巢的横截面与头胸甲面积比值数据，使之与基于解剖取得的卵巢发育时期相结合，形成描述两者数据关系的拟合曲线方程，由于充分利用的解剖拟穴青蟹检测卵巢检测方法实现数据的收集，减少了前期生成拟合曲线方程的物料成本。同时，由于雌性拟穴青蟹的生理特点具有共性。因此拟合曲线方程一旦生成便具有普适性，无需对其进行反复生成，从而大大节约了检测的时间成本。需要说明的是，步骤120既可以采取类似或等同于本发明步骤200-600的方法，以卵巢阴影与头胸甲的图像面积比值作为卵巢的横截面与头胸甲的面积比值，也可以在解剖过程中基于实际测量雌性拟穴青蟹的头胸甲及卵巢实现数据的取得。实践中，所述雌性拟穴青蟹样本的样本数量为至少300个，所获取的拟合曲线方程为：
y＝0.50822-0.37331/(1+(x/3.11082)11.56429)，R2＝0.97312。
在一些应用场景中，所述步骤200包括：筛选出腹脐部呈暗绿色或黑色、腹脐内长有向外伸出刚毛的雌性拟穴青蟹个体，所述刚毛的伸出长度为2-5mm。所述雌性拟穴青蟹个体的质量为200-500g。
在实践中发明人发现：雌性拟穴青蟹在卵巢进入快速发育阶段前，其腹脐部壳体主要呈白色、且腹脐内未有刚毛向外伸出，而在进入快速发育阶段后逐渐转化为暗绿色或黑色，且腹脐内有刚毛向外伸出。因此通过采用上述技术方案，可以最直观的筛选出卵巢进入快速发育阶段的雌性拟穴青蟹个体，较好的保证检测对象的有效性，以及提高筛选速度。
此外，发明人经统计还发现：雌性拟穴青蟹在卵巢进入快速发育阶段后处于卵巢发育阶段的拟穴青蟹体重在200-500g不等，只有少数拟穴青蟹的体重高于500g；另一方面，高于500g的拟穴青蟹，其头胸甲面积一般偏大，故卵巢与头胸甲的面积比值关系不再适用于该拟合曲线方程。因此，通过限定雌性拟穴青蟹的质量为200-500g，可以进一步提升检测对象的有效性。
在一些应用场景中，所述步骤300包括：
步骤310：将筛选出的雌性拟穴青蟹个体进行冷冻麻醉；
步骤320：清洁完成冷冻麻醉的所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面的水渍和有机污渍。
通过采用这种技术方案：针对本发明中存在对雌性拟穴青蟹个体进行定位摄像的需求，为避免过程中雌性拟穴青蟹个体在后继步骤中对人体造成伤害，因此设置对雌性拟穴青蟹个体进行冷冻麻醉的预处理缓解。在本例中：统一采用将雌性拟穴青蟹个体放置在内部温度为0-5℃的冰盒中放置8-12分钟，实践中，也可以根据实际情况调整其他冷冻麻醉方式以及冷冻时长。同时，针对本发明中存在的对雌性拟穴青蟹个体进行光照以使得卵巢阴影在头胸甲显现的技术需求，设置对雌性拟穴青蟹个体的头胸甲进行清洁的技术环节，提高头胸甲的透光度，避免水渍和污渍影响所述步骤400的成像效果。在本例中：采用湿巾擦拭所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面的水渍；采用75％医用酒精棉擦拭所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面附着的污渍。实践中，也可以根据实际情况调整清洗方式和清洗工具。
在一些应用场景中，以LED手电筒作为光源对所述雌性拟穴青蟹个体进行照射，所述LED手电筒的光通量为1000lm，所述LED手电筒的光源面积为7000-8000mm2.。
通过采用这种技术方案：手电筒照射相对于固定式光源照射具有操作更方便，对外部环境适应性更强的优势，将LED手电筒的光源面积设置为7000-8000mm2，可保证将头胸甲整体放置于光源下。
在一些应用场景中，所述步骤500包括：
在所述头胸甲的一侧放置参考标尺，使用相机拍摄包括雌性拟穴青蟹个体的全部头胸甲的照片，将所述照片输入电脑中转化为图像文件。采用photoshop等图像处理软件分别从所述图像文件中裁剪出参考标尺图片和头胸甲图片，并从所述头胸甲图片中裁剪出卵巢阴影图片；使用Digimizer 6.0软件分别计算出头胸甲的图像面积值CA，卵巢阴影的面积值SA，图像面积比值AR＝SA/CA。
通过采用这种技术方案：在拍照时设置参考标尺，使Digimizer 6.0软件通过参考标尺获取计算比例尺，从而快速取得头胸甲的图像面积值以及卵巢阴影的图像面积值。Digimizer 6.0软件为一款成熟的图像处理软件，其内置的运算功能在此不再赘述。
应用例1，请参考图2-16：
以中国水产科学研究院东海水产研究所浙江宁海研究中心拟穴青蟹苗种繁育平台为例，取交配后的雌性拟穴青蟹共计5只，采用如实施例1所述步骤进行检测操作，得到卵巢阴影与头胸甲的面积比值AR分别为(0.134956，0.154212，0.293009，0.489547，0.507167)；最后，将AR值(0.134956，0.154212，0.293009，0.489547，0.507167)作为因变量y分别代入拟合曲线方程y＝0.50822-0.37331/(1+(x/3.11082)11.56429)，分别得到x值为(1.4288708，2.418933，3.0289568，4.0127009，5.1670681)，四舍五入取整数，即判定5只拟穴青蟹的卵巢发育时期分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期。
结论验证：将5只拟穴青蟹分别解剖，取卵巢组织于波恩试液中固定保存24h后，经过70％酒精漂洗三次后放置在70％酒精中于-20℃条件下保存；随后，制作石蜡切片，HE染色后观察卵巢组织形态学特征，判定为卵巢发育Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期(如图4、图7、图10、图13、图16)，结论与本发明检测结论一致。
以上结合各附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明做出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种拟穴青蟹卵巢发育时期数的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤100：取得以雌性拟穴青蟹个体的卵巢发育时期数b为变量、以雌性拟穴青蟹个体的卵巢横截面积与头胸甲横截面积的比值a为因变量的拟合曲线方程；
步骤200：筛选出卵巢进入快速发育阶段的待检测的雌性拟穴青蟹个体；
步骤300：对筛选出的雌性拟穴青蟹个体进行检测预处理；
步骤400：将完成检测预处理的雌性拟穴青蟹个体放置于光源下照射、使雌性拟穴青蟹个体的头胸甲上映射出卵巢阴影；
步骤500：取得光源照射下所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲的图像；
步骤600：分别取得所述图像上的头胸甲的图像面积值CA，卵巢阴影的面积值SA，并计算出图像面积比值AR＝SA/CA；
步骤700：将所述图像面积比值AR作为因变量代入所述拟合曲线方程中，求得对应于该因变量的变量，将所述变量进行四舍五入求整、所得的数值即为所述雌性拟穴青蟹个体的卵巢发育时期数。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤100包括：
步骤110：选取雌性拟穴青蟹样本；
步骤120：取得雌性拟穴青蟹样本的卵巢横截面积与头胸甲横截面积的比值a；
步骤130：解剖雌性拟穴青蟹样本、取得雌性拟穴青蟹样本的卵巢发育时期数b；
步骤140：将所述比值a和卵巢发育时期数b存入样本数据集中，基于所述样本数据集取得所述拟合曲线方程。
3.根据权利要求2述检测方法，其特征在于，所述雌性拟穴青蟹样本的样本数量为至少300个，所述拟合曲线方程为：
y＝0.50822-0.37331/(1+(x/3.11082)11.56429)，R2＝0.97312。
4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤200包括：筛选出腹脐部呈暗绿色或黑色、腹脐内长有向外伸出刚毛的雌性拟穴青蟹个体，所述刚毛的伸出长度为2-5mm。
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述步骤200包括：筛选出质量为200-500g的雌性拟穴青蟹个体。
6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤300包括：
步骤310：将筛选出的雌性拟穴青蟹个体进行冷冻麻醉；
步骤320：清洁完成冷冻麻醉的所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面的水渍和有机污渍。
7.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，所述步骤310包括：
将筛选出的雌性拟穴青蟹个体在内部温度为0-5℃的冰盒中放置8-12分钟。
8.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，所述步骤320包括：
采用湿巾擦拭所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面的水渍；
采用75％医用酒精棉擦拭所述雌性拟穴青蟹个体的头胸甲、去除所述头胸甲表面附着的有机污渍。
9.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤400包括：
以LED手电筒作为光源对所述雌性拟穴青蟹个体进行照射，所述LED手电筒的光通量为1000lm，所述LED手电筒的光源面积为7000-8000mm2。
10.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于，
所述步骤500包括：
在所述头胸甲的一侧放置参考标尺，使用相机拍摄包括雌性拟穴青蟹个体的全部头胸甲的照片，将所述照片转化为图像文件；
所述步骤600包括：
从所述图像文件中裁剪出头胸甲图片以及卵巢阴影图片；
将所述图像文件、头胸甲图片以及卵巢阴影图片分别输入Digimizer 6.0软件，所述Digimizer 6.0软件计算出头胸甲的图像面积值CA，卵巢阴影的面积值SA，图像面积比值AR＝SA/CA。
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|---|---|---|---|
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