CN116947978A - 一种glp-1和gip受体共激动多肽衍生物及其盐和制剂 - Google Patents

一种glp-1和gip受体共激动多肽衍生物及其盐和制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种GLP‑1和GIP受体共激动多肽衍生物及其盐和制剂。本发明提供的GLP‑1和GIP受体共激动多肽衍生物对GLP‑1R和GIPR具有共激活作用，具有更加合理的GLP‑1和GIP活性比，能够治疗胰岛素依赖性糖尿病，具备更合理的用药量潜力和更优异的治疗效果潜力。

Description

一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物及其盐和制剂
技术领域
本发明涉及多肽技术及其衍生物技术领域，尤其涉及一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物及其盐和制剂。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病，主要由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用不足所致。糖尿病可分为1型(Type1diabetesmellitus,T1DM)和2型(Type 2diabetes mellitus,T2DM)。其中，T1DM不产胰岛素，属胰岛素依赖性疾病；T2DM主要是由于机体对胰岛素反应不敏感，产生胰岛素抵抗，占糖尿病患者90％以上。糖尿病会导致多种致命性并发症，如肥胖、心血管疾病、肾病等，严重危害人类健康。糖尿病作为一种常见病、多发病，具有高致死率、高致残率的特点，目前，已经成为继肿瘤、高血压后威胁人类的第三大疾病。
肠降血糖素(incretin)是通过增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌来调控血糖的胃肠激素(Drucker，DJ和Nauck，MA，Lancet 368：1696-705(2006))。迄今为止有两种已知的肠降血糖素：胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)。
GIP是42个氨基酸的胃肠调节肽，由十二指肠和空肠上段K细胞分泌。最早的研究发现，GIP在一定条件下可抑制胃酸分泌，因此，其最早被称为“抑胃肽”，但后续研究发现，其具有通过在葡萄糖存在下刺激从胰腺β细胞分泌胰岛素以及保护胰腺β细胞的作用，及在葡萄糖内稳态中发挥生理作用；同时，在低血糖条件下，GIP则可诱导胰高血糖素产生，由此维持血糖平衡(Christensen et al.(2011)Diabetes 60:3103-9)，随后其被重新命名为葡萄糖依赖性促胰岛素多肽。
GLP-1是一种由肠道L细胞分泌的促胰素，其和胰高血糖素的氨基酸序列有近一半相同，具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素分泌及抑制胃排空等多种功能，同时，GLP-1作为一种肠源性激素，其是在营养物质(特别是碳水化合物)的刺激下才释放入血的，其促胰岛素分泌作用呈葡萄糖浓度依赖性，能够在血糖升高时发挥降糖作用，抑制胰高糖素分泌，增加饱腹感，减少饥饿感，从而达到降低血糖作用。此外，GLP-1还可作用于中枢神经系统(特别是下丘脑)抑制食欲，减少进食量，从而使人体产生饱胀感和食欲下降，减少卡路里的摄入量。
肠降血糖素的发现成功开发了两种新类别的用于治疗糖尿病的药物，分别是模拟内源性GLP-1作用的GLP-1受体激动剂和抑制内源性GLP-1和GIP二者的酶促失活的小分子化合物(口服DPP-4抑制剂)，现已上市的GLP-1受体激动剂例如ByettaTM、BydureonTM、LixisenatideTM和VictozaTM等；现已上市的DPP-4抑制剂例如JanuviaTM、GalvusTM、OnglyzaTM和Trajenta TM。不同于GLP-1自诞生起即被赋予厚望，GIP虽然发现早于GLP-1，但一直未能成为治疗糖尿病的药物，主要因为早期研究并未看到GIP在2型糖尿病患者体内的促进胰岛素分泌作用。但近年来的系列研究，正在逐渐证明GIP的作用，使其成为热门靶点之一。Weidenmaier等报道DPP-4抗性GIP类似物具有抗凋亡作用(Weidenmaier，SD，PLOSOne 5(3)：e9590(2010))。同时，在WO 2013/164483、WO 2014/192284和WO 2011/119657中描述了某些GIP类似物表现出GIP和GLP-1两者活性。有趣的是，在糖尿病和肥胖的小鼠模型中，GLP-1受体激动剂利拉鲁肽(Liraglutide)和酰化GIP类似物的组合表现出了比单独使用利拉鲁肽和GIP类似物进行治疗优越的降糖(g lucose-lowering)和促胰岛素分泌(insulinotropic)作用(Gault，VA，Clinical Science 121：107-117(2011))。在P.K.等也报道，GIP类似物ZP4165可增强GLP-1激动剂降血糖作用及减肥效果(/>etal.(2018)Diabetes ObesMetab 20:60-68)。Finan,B.等报道了一种对GLP-1R和GIPR具有共激活作用的单分子双促胰岛素(unimolecular dual incretins)多肽，其在db/db小鼠、ZDF大鼠、猴及人中均表现出较好的促进胰岛素分泌和降血糖作用(Finan et al.(2013)SciTransl Med 5:209ra151)。
鉴于GIP作用的发现，开发能够同时作用于GIP受体和GLP-1受体的双靶点协同激动剂逐渐成为热门研究方向。相比多种单受体激动剂的复合药物，单分子多重受体激动剂因不同信号通路可被同时激活，从而具有疗效最大化、副作用降低、药动学性质更稳定等优点。如专利CN201380032714.4、CN201480060723.9、CN201680005007.X等中均记载了一些基于GIP类似物的GLP-1和GIP受体共激动多肽化合物。截止目前，仍未有被批准上市的GLP-1和GIP受体共激动剂药物。
因此，目前仍需要提供一种GLP-1和GIP受体的共激动多肽及其衍生物，其可以提供优异的降糖和减重疗效，并具备良好的稳定性、免疫原性和长效性。
发明内容
定义
本发明中，有关肽(例如GLP-1或GIP)的术语“衍生物”表示经化学修饰(如共价修饰等)的肽或其类似物。典型的修饰包括酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。
本发明中，术语“脂肪族二酸”包括直链或支链脂族二羧酸，其具有至少两个碳原子并为饱和或不饱和的。脂肪族二酸的非限定实例为琥珀酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。
本发明中，术语“异构体”是指分子组成相同、但结构和性质不同的两种或多种化合物。
本发明中，术语“溶剂化物”通常指任何形式的根据本发明的活性化合物通过非共价键与另一分子(通常为极性溶剂)相结合，所获得的物质，具体可以是包括但不限于水化物和醇化物，例如甲醇化物。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”是指保留母体的生物活性的多肽或蛋白的盐。
本发明中，术语“药学上可接受的辅料”宽泛地指除活性治疗成分外的任何组分。辅料可以是惰性物质、无活性物质和/或非药学活性物质。
本发明中，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，例如，磷酸缓冲盐水溶液，水，乳液，例如油/水或水/油乳液，和各种类型的湿润剂。
本发明中，术语“组合物/制剂”可以是稳定化的制剂。术语“稳定化的制剂”是指具有提高的物理和/或化学稳定性(优选兼具)的制剂。通常，直到到达失效时间之前，制剂在使用和储存期间(符合推荐的使用和储存条件)必须是稳定的。
本发明中，术语“载体”是指可以将编码蛋白质或多肽的核苷酸片段可操作地插入其中以引起所述蛋白质或多肽表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒、人工染色体、噬菌体、病毒颗粒等。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。
载体可以是重组表达载体或克隆载体。本发明提供了载体(例如表达载体)，其含有编码本发明所述GIP和GLP-1双靶点多肽的核酸序列。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
本发明中，术语“重组表达载体”是编码基因的核酸分子，其在宿主细胞中表达且含有控制所述基因的表达的必需元件。通常，表达载体包含转录启动子、目的基因和转录终止子。
本发明中，宿主细胞是指可将包含编码目的蛋白质或多肽的核苷酸序列片段的载体引入到其中进行克隆或基因表达的细胞。适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。
本发明中，术语“治疗”包括抑制、减缓、停止或逆转现有症状或病患的进展或严重程度。
本发明中，术语“索马鲁肽”是指一种GLP-1类似物，其具有CAS登记号910463-68-2中的肽骨架和整体化合物结构。
本发明中，术语“Tirzepatide”是指一种GLP-1/GIP受体共激动多肽，其具有CAS登记号2023788-19-2中的肽骨架和整体化合物结构。
Tirzepatide是美国礼来公司开发的一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物，是目前进展最快的GLP-1和GIP受体共激动剂产品，目前已经完成临床实验，进入申报阶段。Tirzepatide可通过不同的信号转导途径调节β细胞功能，激活腺苷酸环化酶，增加环磷酸腺苷(cAMP)的胞内浓度，从而活化蛋白激酶A和cAMP直接的交换蛋白(Epac)。现有研究证实，Epac有两种亚型，其中1型可能对β细胞有保护作用，而2型则可促进葡萄糖诱导的胰岛素分泌。也因此，研究者认为，这可能是Tirzepatide相较于GLP-1受体激动剂具有更好的降糖效果的原因之一。总之，Tirzepatide并非GLP-1受体激动剂和GIP受体激动剂的简单相加，而是通过两者机制互补，实现“1+1＞2”的协同聚力效应，并进一步提高药物的疗效和安全性。
从目前的临床数据看，Tirzepatide具有不劣于索马鲁肽的降糖和减重效果，甚至优于后者的临床效果。但由于Tirzepatide具有较高的GIP活性，较低的GLP-1受体激动剂活性(远低于索马鲁肽)，其临床用药量是索马鲁肽的数倍(5倍至十几倍)，远高于索马鲁肽注射液的用药量。因此，基于GLP-1和GIP及其受体结构特点，设计获得一种相对较高GLP-1受体激动剂活性和相对低GIP受体激动剂活性的GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物或许是一种更优的选择。
因此，本发明一方面的目的即为提供一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物，其多肽序列具备更高的人源化序列，具备相对高的GLP-1受体激动剂活性和相对低GIP受体激动剂活性。优选地，本发明的共激动剂多肽衍生物具有下式所示氨基酸序列的多肽结构：
X1X2EGTFTSDYSIX13LX15EIAQX20X21FVX24WLIAX29X30X31X32；
其中：
X1选自Y或H；
X2选自Aib、V、T、I、G或A；
X13选自Aib、Y、V、T、I、G或A；
X15选自D或E；
X20选自Q、K或R；
X21选自E或A；
X24选自Q、N、A、E、R或K；
X29选自R、K或G；
X30选自R、K或G；
X31选自R、K或G；
X32选自R、K或G；且其中，位置X20、X24、X29、X30、X31、X32中仅有一个为K。
优选地，所述X1选自Y；
X2选自V、T或I；
X13选自V、T或I；
X15选自D或E；
X20选自K或R；
X21选自E；
X24选自R或K；
X29选自R；
X30选自R或G；
X31选自R或G；
X32选自R或G。
进一步优选地，所述X1选自Y；
X2选自V；
X13选自V；
X15选自D或E；
X20选自R；
X21选自E；
X24选自K；
X29选自R；
X30选自G；
X31选自G；
X32选自R。
更优选地，所述共激动剂多肽的氨基酸序列可以是：
YVEGTFTSDYSIVLEEIAQREFVKWLIARGGR；
YVEGTFTSDYSIVLEEIAQREFVKWLIARGRG；
YIEGTFTSDYSIILEEIAQREFVKWLIARGGR；
YIEGTFTSDYSIILEEIAQREFVKWLIARGRG；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQREFVKWLIARGGR；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQREFVKWLIARGRG；
YIEGTFTSDYSIILDEIAQREFVKWLIARGGR；或，
YIEGTFTSDYSIILDEIAQREFVKWLIARGRG。
更优选地，所述共激动剂多肽的氨基酸序列可以是YVEGTFTSDYSIVLEEIAQREFVKWLIARGGR(SEQ ID NO:1)或YVEGTFTSDYSIVLDEIAQREFVKWLIARGGR(SEQ ID NO:2)所示。
另一方面，本发明提供一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其具备相对高的GLP-1受体激动剂活性和相对低GIP受体激动剂活性。优选地，本发明的共激动剂多肽衍生物具有下式所示氨基酸序列的多肽结构：
YX2EGTFTSDYSIX13LX15X16IAQX20X21FVX24WLIAX29；
其中：
X2选自Aib、V、T、I、G或A；
X13选自Aib、Y、V、T、I、G或A；
X15选自D或E；
X16选自E、K或R；
X20选自Q、K或R；
X21选自E或A；
X24选自Q、N、A、E、R或K；
X29选自GGPSSGAPPPS、GGPSSGAPPP、GGPSSGAP、GGPSSGA、GGPSS、GGP、GG、GGPSSG、GGPSGP、GGSGA、GGPSSGA、GGPPPS；
且其中，位置X16、X20、X24中仅有一个为K。
优选地，所述X2选自V；
X13选自V；
X15选自D；
X20选自R；
X21选自A；
X24选自K；
X29选自GGPSSGAPPPS、GGPSSGAPPP、GGPSSGAP、GGPSSGA、GGPSS、GGP、GG、GGPSSG、GGPSGP、GGSGA、GGPSSGA、GGPPPS。
进一步优选地，X29为GGPSSGAPPPS。
更优选地，所述多肽的序列选自：
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:3)；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGAPPP；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGAP；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGA；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSS；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGP；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGG；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSG；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSGP；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGSGA；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGA；或，
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPPPS。
另一方面，本发明提供一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其多肽序列更接近人GLP-1分子序列，具备相对高的GLP-1受体激动剂活性和相对低GIP受体激动剂活性。优选地，本发明的共激动剂多肽衍生物具有下式所示氨基酸序列的多肽结构：
YX2EGTFTSDVSSYLEX16QAAX20EFIX24WLIAGX30；
其中：
X2选自Aib、V、T、I、G或S；
X16选自E或G；
X20选自K或R；
X24选自A、E、R或K；
X30选自RGR、RGRR、RGRRQ、RGRRQEW；
且其中，位置X20、X24中仅有一个为K。
优选地，所述X2为V；
X16为E；
X20为R；
X24为K；
X30选自RGR、RGRR、RGRRQ、RGRRQEW，优选所述X30为RGRR。
更优选地，所述多肽的序列选自：
YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGR；
YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGRR(SEQ ID NO:4)；
YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGRRQ；
YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGRRQEW。
另一方面，本发明所述衍生物通过其多肽序列上氨基酸K残基上的ε氨基与脂肪酸侧链连接。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明所述共激动剂多肽衍生物中使用的脂肪酸侧链结构为HOOC(CH2)nCO-，其中n为选自10-24的整数，更优选为16-20的整数。所述脂肪酸侧链选自HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)15CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)17CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)19CO-、HOOC(CH2)20CO-、HOOC(CH2)21CO-或HOOC(CH2)22CO-。
作为本发明的一种优选技术方案，所述脂肪酸侧链通过接头与氨基酸残基连接。
作为本发明的一种优选技术方案，所述接头选自：
其中，m为0-6的整数，例如0、1、2、3、4、5、6等，n为1-3的整数，例如1、2、3等，s为0-3的整数，例如0、1、2、3等，t为0-4的整数，例如0、1、2、3、4等，p为1-23的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23等。
作为本发明的一种具体实施方式，所述接头为：
其中，s为1，n为1或2，优选n为1。
对于上述优选的接头部分(当n为1时)，按照IUPAC命名法，可表示为γ-Glu-OEG-OEG；其中，OEG即“2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基”的简写。当选择HOOC(CH2)16CO-作为侧链时，上述侧链和接头的组合(酰基基团)，按照IUPAC命名法，可以被称为“[2-(2-[2-(2-[2-(2-)4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]”。
因此，优选地，本发明所述GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物选自如下化合物：
[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][YVEGTFTSDYSIVLEEIAQREFVKWLIARGGR](简称HS-GG055A)；或[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][YVEGTFTSDYSIVLDEIAQREFVKWLIARGGR](简称HS-GG055D)；
或[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGAPPPS](简称HS-GG004a)；
或[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGRR](简称HS-GG057a)。
本发明的共激动剂多肽可以通过传统的化学合成方法合成制备，也可以通过构建重组基因工程菌的方法表达制备。
另一方面，本发明提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含本发明所述的多肽或其衍生物、异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，以及药学上可接受的辅料。
另一方面，本发明提供了一种本发明所述的多肽或其衍生物、异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物、及其药物制剂在制备治疗代谢性疾病的药物中的应用。
本发明所述的代谢性疾病包括但不限于：糖尿病(I型糖尿病、II型糖尿病)、超重和肥胖、脂肪性肝炎(NASH、ASH)、心血管疾病、脂肪肝、肝硬化、非酒精性脂肪肝病、代谢综合征及各种糖尿病并发症。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供的GLP-1和GIP受体共激动多肽能够用于治疗胰岛素依赖性糖尿病，具备更加合理GLP-1和GIP活性比，具备更合理的用药量潜力和更优异的治疗效果潜力。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物的制备
本实施例提供了多种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物及其制备方法。具体的制备方法如下：
(1)化学合成法制备GLP-1和GIP受体共激动多肽序列
按照化学合成法，分别合成本发明多种GLP-1和GIP受体共激动多肽序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示，并测序验证合成序列正确后备用。
(2)制备长效GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物
按照下述方式，对步骤(1)制备的多肽分别进行脂肪酸修饰：多肽中加水，分别配制成4-6mg/mL溶解液，加入1M氢氧化钠调整pH至11.0-11.5，摇匀使蛋白完全溶解，HPLC定量多肽浓度；按多肽与十八烷二酸单叔丁酯-谷氨酸(1-叔丁酯)-AEEA-AEEA-OSU-摩尔比1:4称取脂肪酸粉末溶于乙腈中，将多肽样品与脂肪酸溶液混合，将混合液于4℃静置一小时，然后样品加水稀释5倍，用1M柠檬酸(或10％乙酸)调pH至4.8终止反应，放于4℃静置酸沉10min，酸沉后以13000g，4℃离心30min，然后将沉淀放于-80℃保存；
脂肪酸脱保护与纯化：向得到的沉淀中加入TFA至多肽终浓度约10mg/mL，震荡使沉淀溶解，置于室温静置脱保护30min，然后滴入4M的NaOH调节pH至7.5-8.5终止反应；
用蛋白纯化层析系统(赛谱SDL100)将反应终止后的反应液按4mL/min流速，泵入事先用平衡液3(10mM乙酸铵，20％乙腈)平衡过的UniPS10-300(购自苏州纳微科技有限公司)进行浓缩，平衡液3淋洗后，再按0-100％洗脱液(10mM乙酸铵，80％乙腈)梯度洗脱，收集洗脱峰经RP-HPLC检测纯度；
洗脱峰用水稀释3倍，酸沉调整pH至4.80，4℃酸沉30min，离心后沉淀中加入PBST缓冲液(pH7.0)复溶，并在-80℃冻存，得到HS-GG055A、HS-GG055D、HS-GG004a、HS-GG057a。
实施例2：HEK293/Luc/GLP1R细胞进行体外GLP-1受体结合活性测定
实验配方：(1)DMEM空白培养基；(2)共激动多肽衍生物：320nM、64nM、12.8nM、2.56nM、0.512nM、0.1024nM、0.02048nM、0.004096nM。其中阳性对照组(索马鲁肽)，实验组1(HS-GG055A)，实验组2(HS-GG055D)，实验组3(HS-GG004a)，实验组4(HS-GG057a)。
选取培养状态良好的HEK293/Luc/GLP1R细胞，弃去瓶中培养液，用PBS缓冲液洗1次，加入0.05％Trypsin消化液消化3分钟，然后加入DMEM基础培养基终止消化，离心收集细胞。用DMEM空白培养基调整细胞密度为8.0×105个/mL，50μL/孔接种于96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2条件下培养过夜。
用Fire-Lumi荧光素酶检测试剂盒检测共激动多肽衍生物的体外GLP-1受体结合活性：配制测定培养液，用测定培养液分步稀释样品至320nM，单次稀释倍数不超过10倍；之后在96孔板中按照进行5倍系列稀释，共8个梯度，每个稀释度做2个复孔。
从培养箱中取出培养好的细胞培养板，将稀释好的测定培养液加入细胞板中，每孔50μL，置于37℃、5％CO2条件下孵育6hr，从培养箱中取出样品板，放置至室温，加入100ulFire-Lumi检测液，反应5min，震荡10s，检测荧光强度；试验数据采用四参数回归计算法进行处理，可以计算出待测样品的EC50值；
对本发明共激动剂分批检测，检测结果见表1-3：
表1
表2
样品 序列 GLP1R,EC50(nM)
实验组3 HS-GG004a 1.215
阳性对照组 索马鲁肽 0.6682
表3
样品 序列 GLP1R,EC50(nM)
实验组4 HS-GG057a 1.379
阳性对照组 索马鲁肽 0.4806
实施例3：CHO-K1/GIPR/Ga15细胞进行体外GIP受体结合活性测定
实验配方：(1)F-12K空白培养基；(2)GLP-1衍生物：100nM、25nM、6.25nM、1.563nM、0.391nM、0.098nM、0.024nM、0.006nM。其中阳性对照组(人天然GIP)，实验组1(HS-GG055A)，实验组2(HS-GG055D)，实验组3(HS-GG004a)，实验组4(HS-GG057a)。
选取培养状态良好的CHO-K1/GIPR/Ga15细胞，弃去瓶中培养液，用PBS液摇洗1次，加入0.05％TRYPSIN消化液消化，然后加入F-12K基础培养液终止消化，离心收集细胞，用F-12K空白培养液调整细胞密度为8×105个/mL，5μL/孔接种于96孔细胞培养板中。
配制测定培养液(F-12K培养液添加0.5nMIBMX)，用测定培养液分步稀释样品至100nM，单次稀释倍数不超过10倍；之后在96孔板中按照进行4倍系列稀释，共8个梯度，每个稀释度做2个复孔。
在加入细胞的细胞培养板中，依次加入上述稀释好的样品，5μL/孔，37℃孵育30min；加入cAMP-d2工作液，5μL/孔；加入cAMPEu-Cryptate抗体工作液，5μL/孔；96孔板覆盖封板膜，室温孵育60分钟；培养结束后，去除封板膜，在FRET模式下(665nm，620nm)，用HTRF读取器进行检测，延迟时间150μs；数据收集时间500μs；试验数据采用四参数回归计算法进行处理，可以计算出待测样品的EC50值。
对本发明共激动剂分批检测，检测结果如表4-5所示：
表4
样品 序列 GIPR,EC50(nM)
实验组1 HS-GG055A 35.27
实验组2 HS-GG055D 7.064
实验组3 HS-GG004a 3.864
阳性对照组 人天然GIP(1-42) 0.8791
表5
样品 序列 GIPR,EC50(nM)
实验组4 HS-GG057a 68.93
阳性对照组 人天然GIP(1-42) 0.2901
由表1-3提供的体外GLP-1受体结合活性结果和表4-5提供的体外GIP受体结合活性结果可知，本公开提供的GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物具有相对高的GLP-1受体激动剂活性和相对低GIP受体激动剂活性。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京惠之衡生物科技有限公司
吉林惠升生物制药有限公司
<120> 一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物及其盐和制剂
<130> KP2117367.2
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Val Leu Glu Glu
1 5 10 15
Ile Ala Gln Arg Glu Phe Val Lys Trp Leu Ile Ala Arg Gly Gly Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Val Leu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Ala Gln Arg Glu Phe Val Lys Trp Leu Ile Ala Arg Gly Gly Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Val Leu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Ala Gln Arg Ala Phe Val Lys Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 4
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Ile Ala Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg

Claims (16)

1.一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述衍生物为酰化连接脂肪酸侧链的GLP-1和GIP受体共激动多肽，所述多肽的氨基酸序列如下式所示：
X1X2EGTFTSDYSIX13LX15EIAQX20X21FVX24WLIAX29X30X31X32；
其中：
X1选自Y或H；
X2选自Aib、V、T、I、G或A；
X13选自Aib、Y、V、T、I、G或A；
X15选自D或E；
X20选自Q、K或R；
X21选自E或A；
X24选自Q、N、A、E、R或K；
X29选自R、K或G；
X30选自R、K或G；
X31选自R、K或G；
X32选自R、K或G；
且其中，位置X20、X24、X29、X30、X31、X32中仅有一个为K。
2.根据权利要求1所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
所述X1选自Y；
X2选自V、T或I；
X13选自V、T或I；
X15选自D或E；
X20选自K或R；
X21选自E；
X24选自R或K；
X29选自R；
X30选自R或G；
X31选自R或G；
X32选自R或G。
3.根据权利要求2所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
所述X1选自Y；
X2选自V；
X13选自V；
X15选自D或E；
X20选自R；
X21选自E；
X24选自K；
X29选自R；
X30选自G；
X31选自G；
X32选自R。
4.根据权利要求1所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自：
YVEGTFTSDYSIVLEEIAQREFVKWLIARGGR；
YVEGTFTSDYSIVLEEIAQREFVKWLIARGRG；
YIEGTFTSDYSIILEEIAQREFVKWLIARGGR；
YIEGTFTSDYSIILEEIAQREFVKWLIARGRG；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQREFVKWLIARGGR；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQREFVKWLIARGRG；
YIEGTFTSDYSIILDEIAQREFVKWLIARGGR；或，
YIEGTFTSDYSIILDEIAQREFVKWLIARGRG。
5.一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述衍生物为酰化连接脂肪酸侧链的GLP-1和GIP受体共激动多肽，所述多肽的氨基酸序列如下式所示：
YX2EGTFTSDYSIX13LX15X16IAQX20X21FVX24WLIAX29；
其中：
X2选自Aib、V、T、I、G或A；
X13选自Aib、Y、V、T、I、G或A；
X15选自D或E；
X16选自E、K或R；
X20选自Q、K或R；
X21选自E或A；
X24选自Q、N、A、E、R或K；
X29选自GGPSSGAPPPS、GGPSSGAPPP、GGPSSGAP、GGPSSGA、GGPSS、GGP、GG、GGPSSG、GGPSGP、GGSGA、GGPSSGA或GGPPPS；
且其中，位置X16、X20、X24中仅有一个为K。
6.根据权利要求5所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
X2选自V；
X13选自V；
X15选自D；
X20选自R；
X21选自A；
X24选自K；
X29选自GGPSSGAPPPS、GGPSSGAPPP、GGPSSGAP、GGPSSGA、GGPSS、GGP、GG、GGPSSG、GGPSGP、GGSGA、GGPSSGA或GGPPPS；
优选地，X29为GGPSSGAPPPS。
7.根据权利要求5所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自：
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGAPPPS；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGAPPP；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGAP；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGA；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSS；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGP；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGG；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSG；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSGP；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGSGA；
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPSSGA；或，
YVEGTFTSDYSIVLDEIAQRAFVKWLIAGGPPPS。
8.一种GLP-1和GIP受体共激动多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述衍生物为酰化连接脂肪酸侧链的GLP-1和GIP受体共激动多肽，所述多肽的氨基酸序列如下式所示：
YX2EGTFTSDVSSYLEX16QAAX20EFIX24WLIAGX30；
其中：
X2选自Aib、V、T、I、G或S；
X16选自E或G；
X20选自K或R；
X24选自A、E、R或K；
X30选自RGR、RGRR、RGRRQ或RGRRQEW；
且其中，位置X20、X24中仅有一个为K。
9.根据权利要求8所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
X2为V；
X16为E；
X20为R；
X24为K；
X30选自RGR、RGRR、RGRRQ或RGRRQEW；
优选地，所述X30为RGRR。
10.根据权利要求8所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自：
YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGR；
YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGRR；
YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGRRQ；或，
YVEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIKWLIAGRGRRQEW。
11.根据权利要求1-10任一项所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述衍生物通过氨基酸K残基上的ε氨基与脂肪酸侧链连接。
12.根据前述任一项所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述脂肪酸侧链选自HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)15CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)17CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)19CO-、HOOC(CH2)20CO-、HOOC(CH2)21CO-或HOOC(CH2)22CO-。
13.根据前述任一项所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述脂肪酸侧链选自HOOC(CH2)16CO-。
14.根据前述任一项所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述脂肪酸侧链通过接头与氨基酸K连接。
15.根据前述任一项所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述接头为：
其中，s和n均为1。
16.包含权利要求1-15任一项所述的多肽衍生物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
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