CN116942820A - 细胞焦亡干预剂在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了细胞焦亡干预剂在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用，本发明通过建立动物牙齿移动模型发现焦亡促进剂可明显加速正畸牙齿移动，通过对组织学染色发现焦亡促进剂可激活牙槽骨中破骨细胞，加速牙槽骨改建。同时观察到焦亡抑制剂可明显减速正畸牙齿移动，且敲除焦亡关键基因后牙齿移动速度显著降低，这说明焦亡在牙齿移动过程中扮演着重要作用。同时发现焦亡促进剂作用到加力的牙周膜干细胞后可促进其分泌破骨诱导相关因子，提示其可以促进破骨细胞生成，焦亡抑制剂则抑制破骨诱导相关因子的分泌。

Description

细胞焦亡干预剂在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及细胞焦亡干预剂在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用。
背景技术
正畸是一门研究错合畸形的学科，主要通过骨改建让牙齿得以移动。骨改建的原理是牙周膜干细胞(PDLSCs)在牙周膜中受到压力后分泌RANKL等促进破骨细胞生成从而吸收压力侧牙槽骨，张力侧PDLSCs受到牵张力后成骨向分化促进张力侧新骨形成，从而使牙齿到达新的位置。
但在临床中经常遇到牙齿移动缓慢甚至难以移动的患者，这可能由于骨改建效率低下，破骨细胞无法激活，这会延长正畸治疗的周期并增加治疗风险。正畸周期的延长会增加患口腔疾病的风险，如龋齿、牙根吸收等。同时，由于正畸过程中难以清洁牙齿，长期的正畸治疗还会增加釉质脱矿、牙龈炎和牙周炎的风险。因此，如何健康快速的移动牙齿是正畸治疗的一个目标。
目前临床中加速正畸治疗的方式主要是骨皮质切开术，但是这种手术需要将骨皮质切开，创伤较大，会给患者带来额外的疼痛。因此如何无创、健康的加速正畸牙齿移动是亟待解决的问题。
发明内容
技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了细胞焦亡干预剂在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用。
技术方案：本发明第一方面，提供了细胞焦亡干预剂在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用。
进一步的，所述细胞焦亡干预剂包括细胞焦亡促进剂和细胞焦亡抑制剂；优选的，所述细胞焦亡促进剂选自重楼皂苷VI(PPVI)，所述焦亡抑制剂选自MCC950。
所述细胞焦亡促进剂能够促进正畸牙齿移动，所述细胞焦亡抑制剂能够抑制正畸牙齿移动。
所述细胞焦亡干预剂能够影响破骨细胞形成和破骨相关因子表达，具体地，焦亡促进剂能促进破骨细胞形成和促进破骨相关因子的表达，焦亡抑制剂能够抑制破骨细胞形成和抑制破骨相关因子表达。
本发明第二方面，提供了一种包含细胞焦亡干预剂的组合物。
本发明第三方面，提供了所述的组合物在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用。其调控方法和调控机制如上所述。
本发明第四方面，提供了细胞焦亡干预剂在牙周膜干细胞体外培养中的应用，所述细胞焦亡干预剂能够影响破骨细胞生成。
本发明第五方面，提供了一种能够影响破骨细胞生成的牙周膜干细胞体外培养用培养基，所述培养基中含有细胞焦亡干预剂。
本发明第六方面，提供了一种能够影响破骨细胞生成的牙周膜干细胞体外培养方法，所述方法包括采用含细胞焦亡干预剂的培养基培养。
优选的，一种促进破骨生成的牙周膜干细胞体外培养方法，包括以下步骤：采用含焦亡促进剂的培养基培养。培养方法为：α-MEM培养基中加入焦亡促进剂，置于5％ CO2浓度的37℃孵箱中培养，作用6小时后PDLSCs分泌的RANKL/OPG比例明显增加。
本发明发现焦亡高度参与急性炎症环境并能调节骨改建，焦亡促进剂Polyphyllin VI(PPVI)被证明可促进破骨细胞的激活，这提示PPVI可能在正畸牙齿过程中会激活破骨细胞，促进骨改建从而加速牙齿移动。
有益效果：本发明提供了细胞焦亡干预剂在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用，尤其是焦亡促进剂加速正畸牙齿移动的应用，体内研究发现焦亡促进剂可激活牙槽骨中破骨细胞，加速牙槽骨改建，从而促进正畸牙齿移动。同时发现焦亡促进剂可促进牙周膜干细胞分泌破骨诱导相关因子，提示其可以促进破骨细胞生成。本发明还提供了促进破骨生成的牙周膜干细胞培养方法。
附图说明
图1为建立牙齿移动模型后7d观察焦亡促进剂PPVI可明显增加牙齿移动距离，而焦亡抑制剂MCC950会降低牙齿移动速度。
图2为建立牙齿移动模型后7d观察焦亡促进剂PPVI可明显增加牙周膜中焦亡水平，同时TRAP染色显示焦亡促进剂可明显激活破骨细胞；而焦亡抑制剂MCC950会降低牙周膜中焦亡水平，减少破骨细胞数量。
图3为临床牙周膜干细胞加力后体外培养模型的建立。通过收集临床正畸诊断性排齐牙齿患者加过力的正畸牙齿，体外提取受力牙周膜干细胞和非受力牙周膜干细胞，对比其差异，可更好的模拟临床加力环境。
图4为建立体外对牙周膜干细胞加力模拟临床牙周膜干细胞加力环境模型。通过提取牙周膜干细胞，细胞贴壁后用玻璃板和钢珠对其加力，模拟临床中受力环境。
图5为焦亡促进剂和焦亡抑制剂作用于体外加压的PDLSCs后焦亡水平的变化。其中，(a)为Western Blot检测焦亡相关蛋白的表达变化，发现焦亡促进剂可显著增加PDLSCs焦亡的表达，焦亡抑制剂可抑制焦亡的表达，右图为Western Blot半定量统计图；(b)为RT-qPCR检测焦亡相关基因的表达变化，发现焦亡促进剂可显著增加PDLSCs焦亡的表达，而焦亡抑制剂MCC950会抑制焦亡表达水平；
图6为破骨诱导因子RANKL和骨保护素OPG表达的变化。其中，(a)Western Blot检测RANKL和OPG的表达变化，发现焦亡促进剂可显著增加PDLSCs RANKL/OPG的表达，焦亡抑制剂可抑制RANKL/OPG的表达，右图为Western Blot半定量统计图；(b)为RT-qPCR检测RANKL和OPG的表达变化，发现焦亡促进剂可显著增加PDLSCs RANKL/OPG的表达，焦亡抑制剂可抑制RANKL/OPG的表达。
具体实施方式
实施例1
为了验证焦亡促进剂PPVI对牙齿移动速度的影响，我们通过建立小鼠牙齿移动模型进行验证。
实验组中将弹簧绑于小鼠右侧切牙和第一磨牙之间，使弹簧力量为20-30g。分别对小鼠隔天进行腹腔注射0.9％NaCl，5mg/kg PPVI，20mg/kg MCC950，7天后取小鼠颌骨进行固定，后进行micro-CT扫描。
结果显示：
正畸力会促进牙齿移动，焦亡促进剂PPVI可明显增加牙齿移动距离，而焦亡抑制剂MCC950会降低牙齿移动速度，见图1；
结论：
焦亡促进剂可促进正畸牙齿移动。
实施例2
为了验证焦亡促进剂促进了牙周膜中的焦亡水平及破骨细胞生成，用免疫组化染色观察牙周膜中焦亡相关蛋白的表达，用TRAP染色观察破骨细胞形态和数量。免疫组化具体实验方法为：将小鼠牙槽骨用石蜡包埋、切片，用二甲苯及梯度酒精进行脱蜡后用蛋白酶K和胰蛋白酶进行抗原修复；加入3％过氧化氢后用胎牛血清进行封闭，一抗4℃过夜。第二天加入二抗室温孵育30分钟，用DAB显色，后用苏木素复染、树胶封片。TRAP染色实验方法为：将小鼠牙槽骨切片，用二甲苯及梯度酒精进行脱蜡后用TRAP固定液固定，用索莱宝TRAP孵育液浸染60分钟，甲基绿复染，封片。
结果显示：
焦亡促进剂可明显增加牙周膜中焦亡相关蛋白的表达，而焦亡抑制剂减少了牙周膜中焦亡相关蛋白的表达。TRAP染色显示，焦亡促进剂可增加牙周膜中破骨细胞的数量，其形态也更加典型，焦亡抑制剂则减少破骨细胞的数量，见图2。
结论：
焦亡促进剂会增加牙周膜中焦亡水平且增加破骨细胞数量。
实施例3
为了模拟临床加力后的牙周膜干细胞体外培养环境，建立临床加力牙周膜干细胞模型。通过收集临床正畸诊断性排齐牙齿患者加过力的正畸牙齿，体外提取受力牙齿的牙周膜干细胞和非受力牙齿的牙周膜干细胞，培养到第二代时进行后续实验，对比同一患者受力及非受力细胞焦亡水平的差异。临床加力牙周膜干细胞模型可以更好的模拟临床加力环境，图3。
结论：
临床正畸诊断性排齐牙齿患者加过力的正畸牙齿，体外提取受力牙周膜干细胞和非受力牙周膜干细胞进行培养及检测可用于模拟体内加力环境中的牙周膜干细胞。
实施例4
为了模拟体内加力环境中牙周膜干细胞状态，建立体外对牙周膜干细胞加力模型。收集正畸患者因治疗需要拔出的前磨牙，刮取根中1/3牙周膜，用胶原酶I对其进行消化从而提取牙周膜干细胞，对其进行传代，至第4代时将细胞铺在六孔板中。待细胞长至80％后将玻璃板放于孔板中，在玻璃板上加入装有钢珠的15ml离心管盖子。通过这种方式对牙周膜干细胞加力，模拟临床中受力环境，见图4；
结论：
通过提取牙周膜干细胞，细胞贴壁后用玻璃板和钢珠对其加力，可模拟临床中受力环境。
实施例5
为了验证焦亡促进剂PPVI对牙周膜干细胞焦亡的促进作用，我们通过体外对牙周膜干细胞加力观察焦亡水平。
由于前期实验发现对牙周膜干细胞施加1.5g/cm2的力值作用6小时焦亡水平增加最明显，本实验选用1.5g/cm2的力值作用6小时，并提前18小时加入焦亡促进剂PPVI(4μM)和焦亡抑制剂MCC950(10μM)，收样后用Western Blot和RT-qPCR检测焦亡水平。
结果显示：
焦亡促进剂可明显增加焦亡相关蛋白及基因的表达，焦亡抑制剂会抑制焦亡的表达。见图5a及图5b。
结论：
焦亡促进剂可明显增加PDLSCs焦亡相关蛋白及基因的表达。
实施例6
为了验证焦亡促进剂对PDLSCs促进破骨细胞生成的影响，对加压的PDLSCs进行焦亡促进剂和抑制剂的干预。
本实验选用1.5g/cm2的力值作用6小时，并提前18小时加入焦亡促进剂PPVI(4μM)和焦亡抑制剂MCC950(10μM)，收样后用Western Blot和RT-qPCR检测破骨相关因子RANKL、OPG的表达。
结果显示：焦亡促进剂可增加RANKL/OPG的蛋白及基因表达，焦亡抑制剂降低RANKL/OPG的蛋白及基因表达，见图6a及图6b。
结论：焦亡促进剂可增加RANKL/OPG的蛋白及基因表达，这有助于破骨细胞的生成。

Claims (10)

1.细胞焦亡干预剂在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞焦亡干预剂包括细胞焦亡促进剂和细胞焦亡抑制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞焦亡促进剂在制备促进正畸牙齿移动药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞焦亡抑制剂在制备抑制正畸牙齿移动药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞焦亡干预剂能够影响破骨细胞形成和破骨相关因子表达。
6.一种包含细胞焦亡干预剂的组合物。
7.权利要求6所述的组合物在制备调节正畸牙齿移动药物中的应用。
8.细胞焦亡干预剂在牙周膜干细胞体外培养中的应用，其特征在于，所述细胞焦亡干预剂能够影响破骨细胞生成。
9.一种能够影响破骨细胞生成的牙周膜干细胞体外培养用培养基，其特征在于，所述培养基中含有细胞焦亡干预剂。
10.一种能够影响破骨细胞生成的牙周膜干细胞体外培养方法，其特征在于，所述方法包括采用含细胞焦亡干预剂的培养基培养。
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