CN116869154B - 一种葛根酵素及其制备方法和应用 - Google Patents

一种葛根酵素及其制备方法和应用

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Abstract

本发明提供一种葛根酵素及其制备方法和应用，该植物酵素的制备方法，包括如下步骤：步骤1，将柴葛根干粉碎，加水混匀，得到葛根粉混合液；步骤2，将葛根粉混合液与复合酶制剂混合酶解，得到酶解液；步骤3，酶解液中加入碳源混匀，混合液再进行二段发酵工艺，第一段发酵采用包含酵母菌和醋酸菌的菌剂进行有氧发酵，第二段发酵采用包含乳杆菌的菌剂进行无氧发酵；步骤4，将发酵后的混合液过滤至获得澄清溶液，即得。所获得的葛根酵素具有较高葛根素、葡萄糖醛酸等活性成分含量，且具有很好的抗氧化能力，具有保健作用，尤其是护肝功效。

Description

一种葛根酵素及其制备方法和应用
技术领域
本发明具体涉及一种葛根酵素及其制备方法和应用。
背景技术
葛根中主要有效成分为葛根异黄酮，主要包含葛根素、染料木苷、3-羟基葛根素、大豆苷元等，具有抗肿瘤、解热、益智、解酒等多种功效。古文《药性论》中曾记载葛根“开胃下食，解酒毒”。而葛根素在葛根异黄酮中占比最大，是葛根的唯一定量指标成分，具有解酒护肝的功能。依据现代科学研究可知，葛根素主要通过提高肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，加强肝对酒精的代谢清除能力，以及增强过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶的活性来提升自由基清除的能力，从而对酒精引起的炎症有一定缓解作用，使得谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力下降，缓解酒精性肝病的发生，另外，葛根素能有效降低TGF-β表达，降低因酒精引起的肝损伤。
植物酵素是指将植物进行深层发酵，得到的一种含生物活性物质的液体，理论上而言，将葛根制成酵素能提高抗氧化活性，并加强葛根的解酒护肝作用。并且葛根经微生物发酵，还可能产生更多的酚类物质、酶、有机酸等生物活性物质，进一步提高葛根的自由基清除能力，辅助缓解酒精性肝病的发生，提升葛根的护肝功效。
在现有技术中，CN113826886A公开了一种以粉葛根为原料，经过淀粉酶和糖化酶酶解后，接入植物乳杆菌，在30-40℃发酵24-48h。发酵结束后，添加塔格糖调节糖酸比，高压灭菌后得到粉葛根酵素。该发明工艺具有简易、周期短的优点，但选取的原料为粉葛根，最终获得的产品中葛根素含量低，接入的微生物单一且发酵时间短，使得乳酸含量低、酚类物质含量不高，导致产品功能性不强。
CN112655950A公开了一种以葛根、陈皮与冬瓜、青梅、大蒜果蔬为原料的综合酵素，该发明将葛根与陈皮混合破碎，加热熬煮后与果蔬制成混合液，大蒜蒸馏制取大蒜纯露和大蒜精油，混合液接入菌种发酵6个月后过滤，加入大蒜纯露，进行第二次发酵，发酵时间为2个月，发酵完毕，加入大蒜精油制备乳化液，进行第三次发酵，发酵时间为3个月，过滤得到酵素液，高温灭菌罐装得到葛根综合酵素。该发明方法原料种类多，前处理将葛根进行加热熬煮处理，而葛根素为热不稳定性质，因此会造成葛根素的损失，且采用多段发酵，周期过长，工艺复杂，不利于工业化生产。
发明内容
本发明旨在提供一种葛根酵素及其制备方法和应用，以解决现有葛根酵素存在的原料种类繁多、工艺复杂、周期长、工艺稳定性不佳、重现性不可控、不能在满足缩短周期、精简工艺的同时保证其功效等问题。
为了解决上述现有技术问题，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种葛根酵素，其通过对葛根的酶解液利用酵母菌和醋酸菌的混合菌剂有氧发酵后再利用含乳杆菌的菌剂进行二次无氧发酵得到。
优选地，所述葛根酵素的pH为3.7-4.0，以乳酸计的总酸含量为1.6-2.1wt％，葛根素含量为2.8-3.5mg/g。
优选地，所述葛根酵素中，葡萄糖醛酸含量为0.15-0.2mg/g，和/或羟基自由基清除率为80-88％，和/或DPPH清除率为84-93％，和/或ABTS清除率为64％-78％。
第二方面，本发明提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将柴葛根干粉加水混合，得到葛根粉混合液；
步骤2，将葛根粉混合液与复合酶制剂混合酶解，得到酶解液，其中，复合酶制剂为纤维素酶和淀粉酶的混合物；
步骤3，酶解液中加入碳源混合，混合液再进行二段发酵工艺，第一段发酵采用包含酵母菌和醋酸菌的菌剂进行有氧发酵，第一段菌剂接种量为混合液质量的1-2％；第二段发酵采用包含乳杆菌的菌剂进行无氧发酵，第二段发酵中菌剂接种量为混合液质量的3-5％；
步骤4，将发酵后的混合液进行分离获得澄清溶液，即得葛根酵素。
优选地，所述步骤1中，将柴葛根干粉碎成目数为80-100的细粉，柴葛根细粉与水的质量比为1：6-10，优选地是，柴葛根细粉与水的质量比为1：8-10。
优选地，所述步骤2中，纤维素酶和淀粉酶按照质量比为1-5：1混合；优选地，按照质量比为1-2：1混合；进一步优选地，按照质量比为2：1混合；
或者，所述复合酶制剂加入量为葛根粉混合液质量的1-2％；优选地，所述复合酶制剂加入量为葛根粉混合液质量的1-1.5％；进一步优选地，所述复合酶制剂加入量为葛根粉混合液质量的1.5％。
优选地，所述步骤2中，酶解的温度为50-60℃；优选为50-55℃；
和/或，酶解的pH为5.5-6.5；优选为6.0-6.5；
和/或，酶解的时间为3-6h；优选为5-6h。
优选地，所述步骤3中，碳源为蔗糖，加入量为酶解液质量的8-10％。
优选地，所述步骤3中，第一段发酵中酵母菌和醋酸菌的质量比为1：1-2，优选为1：1.5-1.6；菌剂接种量为混合液质量的1.0-1.6％，优选为1.0-1.2％；发酵温度为28-30℃，优选为30℃；发酵时间为7-9d，优选为7d；
和/或，第二段发酵中菌剂接种量为混合液质量的3％；发酵温度为35-37℃，优选为37℃；发酵时间为8-11d，优选为11d。
优选地，所述酵母菌为拜耳结合酵母，所述醋酸菌为葡糖酸醋杆菌；
和/或，所述菌剂为乳杆菌；优选的是，所述乳杆菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌的一种或多种；进一步优选的是，所述乳杆菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的混合菌剂；更加优选的是，所述乳杆菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌按照质量比为1：1的混合菌剂。
优选地，所述步骤4中，将发酵后的混合液经200-300目循环过滤，优选经200目循环过滤，至获得澄清溶液。
第三方面，本发明提供上述的葛根酵素在制备护肝产品上的应用。
第四方面，本发明提供上述的葛根酵素在制备抗氧化产品上的应用。
本发明的有益效果为：
本发明选定以柴葛根为起始原料，采用纤维素酶和淀粉酶的复合酶制剂将其进行酶解，以尽可能释放柴葛根中的活性成分，并产生一些新的有助于后续发酵的小分子活性物质以及可溶性纤维等营养成分。后续再采用二段发酵工艺进一步促进柴葛根中活性成分的释放和生成，有助于提高该植物酵素自由基清除、护肝、促消化等多重功效。
具体实施方式
在本发明的具体实施例中，所用仪器及试剂来源信息如表1所示。
表1
进一步需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过80目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入6倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝1：1)，酶解温度为50℃，酶解Ph＝5.5，酶解3h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量8％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至28℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：2，质量比)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的2％，有氧发酵9d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，植物乳杆菌的接种量为混合液质量的3％，无氧发酵8d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液经过200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
实施例2
本实施例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.3％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1，质量比)，酶解温度为50℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量8％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至30℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1，质量比)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的1％，有氧发酵8d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1)接种量为混合液质量的5％，无氧发酵9d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液经过300目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
实施例3
本实施例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至30℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1.5，质量比)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的1％，有氧发酵7d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，菌剂(植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)接种量为混合液质量的3％，无氧发酵11d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
对比例1
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过80目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入6倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝1：1)，酶解温度为50℃，酶解Ph＝5.5，酶解3h，得到柴葛根酶解液。
(3)发酵：加入酶解液质量8％的蔗糖充分混匀得到混合液，用五层纱布封住罐口，有氧发酵9d，后无氧发酵8d。
(4)过滤罐装：经200目循环过滤后得到柴葛根酵素。
对比例2
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过80目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根匀浆、加入6倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝1：1)，酶解温度为65℃，酶解Ph＝4.5，酶解6h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量8％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至28℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：2)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的2％，有氧发酵9d；调节温度至37℃，进行第二次发酵，植物乳杆菌接种量为混合液质量的3％，无氧发酵8d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液经过200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
对比例3
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌后冷却至30℃，第一次发酵接入混合液质量1％的复合菌剂(黄酒酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1.5)，有氧发酵7d，然后调节室温至37℃，第二次发酵接入混合液质量3％的菌剂(植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)，无氧发酵11d，得到柴葛根发酵液。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液经过200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
对比例4
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌后冷却至室温(25℃)，接入混合液质量4％的复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌：植物乳杆菌＝1：1.5：7.5)，调节室温至37℃，无氧发酵18d，得到柴葛根发酵液。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液经过200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
对比例5
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎呈纺锤状、淀粉含量充足的粉葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到粉葛根粉。
(2)酶解：取1kg粉葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到粉葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到粉葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至30℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1.5，质量比)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的1％，有氧发酵7d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，菌剂(植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)接种量为混合液质量的3％，无氧发酵11d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到粉葛根酵素。
对比例6
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、根部呈细长状、纤维性极强的葛麻姆根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到葛麻姆根粉。
(2)酶解：取1kg葛麻姆根粉，加入10倍的水充分混匀得到葛麻姆根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到葛麻姆根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至30℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1.5，质量比)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的1％，有氧发酵7d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，菌剂(植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)接种量为混合液质量的3％，无氧发酵11d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到葛麻姆根酵素。
对比例7
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：将酶解液灭菌冷却至30℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1.5，质量比)进行第一次发酵，接种量为酶解液质量的1％，有氧发酵7d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，菌剂(植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)接种量为酶解液质量的3％，无氧发酵11d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
对比例8
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至30℃，加入拜耳结合酵母进行第一次发酵，接种量为混合液质量的1％，有氧发酵7d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，菌剂(植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)接种量为混合液质量的3％，无氧发酵11d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
对比例9
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至30℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1.5，质量比)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的1％，有氧发酵7d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，菌剂(保加利亚乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)接种量为混合液质量的3％，无氧发酵11d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
对比例10
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至25℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1.5，质量比)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的1％，有氧发酵7d；然后调节温度至37℃，进行第二次发酵，菌剂(植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)接种量为混合液质量的3％，无氧发酵11d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
对比例11
本对比例提供一种葛根酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料筛选与处理：筛选无虫蛀霉烂、块茎膨大、粉少的柴葛根干，清洗晾干切丁粉碎，过100目筛网，得到柴葛根粉。
(2)酶解：取1kg柴葛根粉，加入10倍的水充分混匀得到柴葛根渣悬浊液，添加悬浊液质量1.5％的复合酶制剂(纤维素酶：淀粉酶＝2：1)，酶解温度为55℃，酶解Ph＝6.5，酶解5h，得到柴葛根酶解液。
(3)接种：加入酶解液质量10％的蔗糖充分混匀得到混合液，灭菌冷却至30℃，加入复合菌剂(拜耳结合酵母：葡糖酸醋杆菌＝1：1.5，质量比)进行第一次发酵，接种量为混合液质量的1％，有氧发酵7d；然后调节温度至40℃，进行第二次发酵，菌剂(植物乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1，质量比)接种量为混合液质量的3％，无氧发酵11d。
(4)过滤罐装：将发酵后所得溶液200目循环过滤至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到柴葛根酵素。
此外，本发明在工艺探索初期，也考察过三段发酵工艺对葛根酵素的影响，但三段工艺过于复杂，已经不符合工业化应用的要求，而且发酵结果会使乳酸含量减少，无法达到国家相关标准，经综合考量，完全不予考虑三段及以上发酵工艺。
相关检测
检测发酵前的柴葛根及实施例1-3，对比例1-11得到柴葛根酵素的总酸、pH值、葛根素含量、葡萄糖醛酸含量、DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、感官品鉴。
1)葛根素含量的测定方法依照《中国药典》RP-HPLC法，总酸含量的测定方法依照国标GB 12456-2021第一法。检测结果如表3所示。
2)葡萄糖醛酸的测定方法为：
1.葡萄糖醛酸标准曲线的绘制
配制2.00mg/mL的葡萄糖醛酸标准液。取标准液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于10mL的具塞试管中，在冰水浴中加入5mL四硼酸钠/硫酸溶液，摇匀，水浴加热5min后冷却至室温，再将试管置于冰水浴中，加入1.5mg/mL的间羟基联苯100μL并摇匀，以1mL蒸馏水做空白，在520nm处测定吸光度，以标准葡萄糖醛酸的质量浓度c(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2.试样中葡萄糖醛酸含量的测定
取实施例1-3与对比例1-11的柴葛根发酵液各0.1mL，稀释100倍，吸取1mL置于10mL具塞试管中，按标准曲线制备方法处理，在520nm处测定柴葛根发酵液的吸光度，再根据葡萄糖醛酸标准曲线得出柴葛根发酵液中葡萄糖醛酸的含量。
3)感官品鉴：随机选取30人按表2所示对实施例1-3和对比例1-11所得柴葛根酵素感官品鉴标准评分。
表2
表3所示为实施例1-3和对比例1-11中所得柴葛根酵素的总酸含量、pH值、葛根素含量、葡萄糖醛酸含量和感官品鉴得分。
表3
表3数据表明，本发明实施例1-3制备的柴葛根酵素产品的pH、总酸含量皆在行业标准(QB/T 5323-2018)范围内，且本发明实施例1-3制备的柴葛根酵素产品中葛根素含量、葡萄糖醛酸整体高于对比例，最高可达3.4mg/g、0.19mg/g。其中对比例1不接菌剂采用自然发酵，对比例5、6选用粉葛根、葛麻姆为原料，对比例7不添加碳源，对比例8中有氧发酵不添加葡糖酸醋杆菌，对比例9中将植物乳杆菌更换为保加利亚乳杆菌，对比例10改变有氧发酵温度，对比例11改变无氧发酵温度。结合以上因素与表3数据可得，由于原料选材、发酵菌种及条件不佳、不添加菌剂等问题导致对比例1、5-9、11在总酸含量上不能满足行业标准；不添加菌剂、酶解条件、原料选材不佳使得对比例1、2、5、6中葛根素含量低或为零；原料选材、发酵菌种及条件不佳等问题可导致pH值偏低、乳酸含量低、酒精等刺激性物质生成，使得对比例2-4、5-8的感官品鉴分数低。
4)应用评价：
1、DPPH自由基清除能力测定
分别将实施例1-3和对比例1-4制得的柴葛根酵素样品用去离子水稀释至1mg/mL，获得稀释液，取1mL稀释液，分别向其中加入1mL0.1mmol/LDPPH-无水乙醇溶液，混匀，室温避光条件下反应30min，得样品液，测量其在波长517nm处的吸光值(记为A1)，空白组用无水乙醇代替样品液测定其吸光值(记为A0)，对照组用无水乙醇代替DPPH-无水乙醇溶液反应测定其溶液的吸光值(记为A2)。DPPH自由基清除率根据以下公式进行计算，检测结果如表4所示。
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A1–A2)/A0]×100。
2、羟基自由基清除能力测定
分别将实施例1-3和对比例1-4制得的柴葛根酵素样品用去离子水稀释至1mg/mL，获得稀释液，取1mL稀释液，分别向其中加入1mL 6mmol/LFeSO4溶液和1mL 2.4mmol/L H2O2溶液，混匀，反应10min后，再加入1mL6mmol/L水杨酸溶液，在37℃条件下反应30min，得样品液，在波长510nm下测定其吸光值(A1)。空白组用蒸馏水代替样品液测定其吸光值(A0)，对照组用蒸馏水代替H2O2溶液反应后测定其吸光值(A2)。羟基自由基清除率根据以下公式进行计算，检测结果如表4所示。
羟基自由基清除率(％)＝[1–(A1–A2)/A0]×100。
3、ABTS自由基清除能力测定
分别将实施例1-3和对比例1-11制得的柴葛根酵素样品用去离子水稀释至1mg/mL，获得稀释液，将1mL浓度为7.4mmol/L的ABTS溶液与1ml浓度为2.6mmol/L的K2S2O4混合，避光静置16h，得到ABTS+储备液；使用前用无水乙醇溶液对ABTS+储备液进行适当的稀释，使该混合液在734nm处的吸光度范围为0.7±0.02，得到ABTS+工作液。取1.980mL ABTS+工作液与20μL样品稀释液混匀，30℃下反应10min，在734nm处测定吸光值A1；对照组以蒸馏水与乙醇混匀测定吸光值A2；空白组以蒸馏水代替样品稀释液测定吸光值A0。
ABTS自由基清除率(％)＝[1–(A1–A2)/A0]×100。
表4
表4数据证明，本发明实施例的3种抗氧化能力指标均优于对比例，其中实施例3抗氧化能力最强，证实了本发明制备的柴葛根酵素具备更强的抗氧化能力。
此外，CN10591717A也公开了一种以葛根与50多种果蔬为原料的葛根综合酵素，该发明方法采用一层鲜葛根匀浆一层红糖的填装方法，进行自然发酵，发酵时间为120-160天，同时按一层果蔬一层红糖进行填装，接入混菌进行一次发酵，发酵时间为120-160天，发酵完毕粗滤，将葛根残渣进行乙醇回流提取，得到葛根发酵提取液，与发酵液混合进行二次发酵，发酵时间为60-90天，得到葛根果蔬发酵原液，然后浓缩包装得到葛根酵素产品。该发明方法部分采用自然发酵，工艺周期长，易造成杂菌污染，且原料种类多，采用有机试剂回流提取用于食品生产，工艺未见绿色环保性，也不利于工业化放大生产。
而本发明选定以柴葛根为起始原料，采用纤维素酶和淀粉酶的复合酶制剂将其进行酶解，以尽可能释放柴葛根中的活性成分，并产生一些新的有助于后续发酵的小分子活性物质以及可溶性纤维等营养成分。后续再采用二段发酵工艺进一步促进柴葛根中活性成分的释放和新活性成分的生成，其中葡糖酸醋杆菌代谢可产生葡萄糖醛酸，可与肝脏中的有毒物质或其他活性物质的羧基、氨基及羟基结合，降低其毒性，同时使其更易排出体外，而葡糖醋杆菌与酵母菌进行混合培养过程中，可进一步增加葡萄糖醛酸的产量，并进一步提高柴葛根酵素的护肝作用，还能产生多种有机酸在提升口感的同时促进人体的消化吸收。本发明的葛根酵素中，葛根素含量为2.8-3.5mg/g，葡萄糖醛酸含量为0.15-0.2mg/g，羟基自由基清除率为80-88％，DPPH清除率为84-93％，ABTS清除率为64％-78％。并且整个工艺过程不采用有机试剂，原材料简单易得，工艺操控性强、稳定性好、重现性佳，可以在尽可能缩短周期的基础上充分发挥葛根酵素的功效。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (23)

1.一种葛根酵素，其特征在于，其通过对葛根的酶解液利用酵母菌和醋酸菌的混合菌剂有氧发酵后再利用含乳杆菌的菌剂进行二次无氧发酵得到，具体通过包含下述步骤的方法发酵得到：
步骤1，将柴葛根干粉加水混合，得到葛根粉混合液；
步骤2，将步骤1得到的所述葛根粉混合液与复合酶制剂混合酶解，得到酶解液，其中，复合酶制剂为纤维素酶和淀粉酶的混合物，其中，酶解的温度为50-55℃、酶解的pH为6.0-6.5、酶解的时间为5-6h，其中，所述纤维素酶的酶活为10000U/mL、淀粉酶酶活为40000U/mL；
步骤3，酶解液中加入碳源混合，混合液再进行二段发酵工艺，第一段发酵采用包含酵母菌和醋酸菌的菌剂进行有氧发酵，第一段菌剂接种量为混合液质量的1-2%；第二段发酵采用包含乳杆菌的菌剂进行无氧发酵，第二段发酵中菌剂接种量为混合液质量的3-5%，其中，第一段发酵时，发酵温度为28-30℃、发酵时间为7-8d；其中，第二段发酵时，发酵温度为35-37℃、发酵时间为9-11d；
其中，所述酵母菌为拜耳结合酵母，所述醋酸菌为葡糖酸醋杆菌，所述含乳杆菌的菌剂为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的组合，
步骤4，将发酵后的混合液进行分离获得澄清溶液，即得葛根酵素，
其中，所述葛根酵素含有乳酸、葛根素和葡萄糖醛酸；以乳酸计的总酸含量为1.6-2.1wt%、葛根素含量为2.8-3.5mg/g、葡萄糖醛酸含量为0.15-0.2mg/g,
其中，所述葛根酵素中，羟基自由基清除率为80-88%，和/或DPPH清除率为84-93%，和/或ABTS清除率为64-78%。
2.根据权利要求1所述的葛根酵素，其特征在于，所述葛根酵素pH为3.7-4.0。
3.权利要求1或2所述的葛根酵素的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
步骤1，将柴葛根干粉加水混合，得到葛根粉混合液；
步骤2，将步骤1得到的所述葛根粉混合液与复合酶制剂混合酶解，得到酶解液，其中，复合酶制剂为纤维素酶和淀粉酶的混合物，其中，酶解的温度为50-55℃、酶解的pH为6.0-6.5、酶解的时间为5-6h，其中，所述纤维素酶的酶活为10000U/mL、淀粉酶酶活为40000U/mL；
步骤3，酶解液中加入碳源混合，混合液再进行二段发酵工艺，第一段发酵采用包含酵母菌和醋酸菌的菌剂进行有氧发酵，第一段菌剂接种量为混合液质量的1-2%；第二段发酵采用包含乳杆菌的菌剂进行无氧发酵，第二段发酵中菌剂接种量为混合液质量的3-5%，其中，第一段发酵时，发酵温度为28-30℃、发酵时间为7-8d；其中，第二段发酵时，发酵温度为35-37℃、发酵时间为9-11d；
其中，所述酵母菌为拜耳结合酵母，所述醋酸菌为葡糖酸醋杆菌，所述含乳杆菌的菌剂为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的组合，
步骤4，将发酵后的混合液进行分离获得澄清溶液，即得葛根酵素，
其中，所述葛根酵素含有乳酸、葛根素和葡萄糖醛酸；以乳酸计的总酸含量为1.6-2.1wt%、葛根素含量为2.8-3.5mg/g、葡萄糖醛酸含量为0.15-0.2mg/g,
其中，所述葛根酵素中，羟基自由基清除率为80-88%，和/或DPPH清除率为84-93%，和/或ABTS清除率为64-78%。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，将柴葛根干粉碎成目数为80-100的细粉，柴葛根细粉与水的质量比为1：6-10。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，柴葛根细粉与水的质量比为1：8-10。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，纤维素酶和淀粉酶按照质量比为1-5：1混合，所述复合酶制剂加入量为葛根粉混合液质量的1-2%。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，按照质量比为1-2：1的比例混合。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，按照质量比为2：1的比例混合。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述复合酶制剂加入量为葛根粉混合液质量的1-1.5%。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述复合酶制剂加入量为葛根粉混合液质量的1.5%。
11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，碳源为蔗糖，加入量为酶解液质量的8-10%。
12.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，第一段发酵中酵母菌和醋酸菌的质量比为1：1-2；菌剂接种量为混合液质量的1.0-1.6%；第二段发酵中菌剂接种量为混合液质量的3%。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，第一段发酵中酵母菌和醋酸菌的质量比为1：1.5-1.6。
14.根据权利要求12所述的制备方法，第一段发酵中菌剂接种量为混合液质量的1.0-1.2%。
15.根据权利要求12所述的制备方法，第一段发酵中发酵温度为30℃。
16.根据权利要求12所述的制备方法，第一段发酵中发酵时间为7d。
17.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，第二段发酵中发酵温度为37℃。
18.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，第二段发酵中发酵时间为11d。
19.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为1：1。
20.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，将发酵后的混合液经200-300目循环过滤。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，经200目循环过滤，至获得澄清溶液。
22.权利要求1或2所述的葛根酵素在制备护肝产品中的应用。
23.权利要求1或2所述的葛根酵素在制备抗氧化产品中的应用。
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