CN116855541A - 一种Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的构建方法及其应用，涉及基因工程技术领域。该构建方法包括：将Siat8a基因敲除的F0代突变体与野生型斑马鱼外交，经测序获得Siat8a基因突变的F1代突变体；将所述F1代突变体中的雌鱼和雄鱼内交，经测序获得Siat8a基因突变的F2代纯合子突变体，即为所述Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型。利用该构建方法可以成功将斑马鱼GD3合成关键基因Siat8a敲除，构建得到斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型，从而有助于开展Siat8a基因的相关研究。

Description

一种Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的构建 方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的构建方法及其应用。

背景技术

Siat8a基因位于第12号染色体的p12区，编码人类ST8SIA1/GD3 synthase(GD3S)的基因。GD3S是一种α-N-乙酰神经氨酸α-2,8-唾液酸转移酶亚家族中的一员，也称为ST8SiaI，能够催化GD3神经节苷脂及其下游b系列神经节苷脂的合成。因此，Siat8a基因调控神经节苷脂的合成，而神经节苷脂作为一类含唾液酸的特殊鞘糖脂，在中枢神经系统中高度表达，与神经系统的发育密切相关，表现在促进神经元和轴突的生长发育，参与突触可塑性的调节，调节早期大脑发育等方面。其中，GD3是小鼠神经干/祖细胞中主要的神经节苷脂种类，占总神经节苷脂的80％以上，其被认为是未成熟的神经外胚层细胞的标志物。GD3等神经节苷脂在神经元分化过程中是必需的，在发育过程中迁移的神经元、生长的轴突和增殖的雪旺神经胶质细胞中均可检测到GD3S的表达。然而，目前尚未有报道通过CRISPR/Cas9技术构建Siat8a基因敲除的体内模型，深入研究Siat8a在神经发育方面的功能及其分子机制。

斑马鱼作为模式生物优势突出。首先研究表明大约70％的人类基因在斑马鱼中具有功能同源物，其次斑马鱼饲养方便且成本低、胚胎透明、繁殖力强、发育迅速，受精后三天(3days post fertilization，3dpf)即可发育出较完善的神经系统，5dpf个体基本发育完全。在神经功能方面，斑马鱼具有与人类具有同源功能的几个关键脑区，如斑马鱼端脑区域的外侧大脑皮层负责记忆过程，而缰核与恐惧反应相关，分别类似于海马体和杏仁核；斑马鱼还拥有与人类相似的功能性血脑屏障；在斑马鱼的神经递质谱中检测到许多重要的神经递质；表现出较多与人类相似的复杂行为，包括社交、运动、情感和防御等，这对神经科学研究十分重要，在研究人类中枢神经系统疾病上有很好的应用前景。

基因编辑技术飞速发展，广泛应用于动物模型的构建、基因功能研究、疾病发病机制研究中。CRISPR/Cas9作为一种新型基因编辑技术，具有高位点特异性、设计灵活和易于操作的特点。CRISPR/Cas9基因编辑系统由Cas9、gRNA和基因组这三个部分组成。gRNA与Cas9蛋白先于体外形成核酸蛋白复合物导向基因组中目的序列，其中gRNA负责对基因组进行特异性DNA识别，gRNA中的20个bp会与基因组的一条链匹配，基因组序列的3’端的PAM序列与Cas9蛋白结合，开启Cas9蛋白的剪切活性，将DNA双链剪断，导致机体非同源重组修复错误百出，以达到基因敲除的目的。

目前虽然有研究通过其它基因编辑技术将Siat8a基因缺陷小鼠模型应用于癌症等疾病研究中，但小鼠繁殖周期长，获得基因突变体纯合子的时间、经济成本高，将其应用于药物和天然功效因子的快速筛选中仍有很大局限。目前还未出现通过基因编辑系统敲除Siat8a基因构建斑马鱼体内模型的技术公开。

发明内容

本发明的目的是提供一种Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的构建方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该构建方法可以将斑马鱼GD3合成关键基因Siat8a敲除，构建得到斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型，从而有助于探究体内Siat8a基因的生物学功能，明确神经节苷脂合成障碍对斑马鱼神经发育的影响，并对快速筛选及评价具有神经发育活性的药物及天然功效因子具有应用价值。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种对斑马鱼进行Siat8a基因敲除的方法，包括以SEQ ID NO.1所示序列为靶点，利用基因编辑系统对斑马鱼的胚胎进行Siat8a基因敲除，获得Siat8a基因敲除的F0代突变体的步骤。

进一步地，所述基因编辑系统为CRISPR/Cas9系统。

进一步地，所述CRISPR/Cas9系统使用的gRNA是以pGH-T7-zCas9质粒为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，再将所述扩增产物进行转录得到的。

进一步地，所述胚胎为发育至单细胞期的野生型胚胎。

本发明还提供一种Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的构建方法，包括以下步骤：

利用上述的方法获得Siat8a基因敲除的F0代突变体；

将Siat8a基因敲除的F0代突变体与野生型斑马鱼外交，经测序获得Siat8a基因突变的F1代突变体；

将所述F1代突变体中的雌鱼和雄鱼内交，经测序获得Siat8a基因突变的F2代纯合子突变体，即为所述Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型。

本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型在研究Siat8a基因的生物学功能中的应用。

本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型在筛选或评价具有神经发育活性的药物或天然功效因子中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明基于基因编辑技术，首次创新性实现斑马鱼GD3合成关键基因Siat8a的敲除，从而构建得到了斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型。通过比较分析Siat8a基因敲除型与野生型斑马鱼的形态表现、运动行为以及脑组织发育，明确了Siat8a缺陷对斑马鱼表型及神经发育的影响。本发明有助于探究体内Siat8a基因的生物学功能，明确神经节苷脂合成障碍对斑马鱼神经发育的影响，这对于快速筛选及评价具有神经发育活性的药物及天然功效因子具有应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为Siat8a基因敲除打靶位点示意图；

图2为靶点1gRNA体外转录纯化凝胶电泳结果；

图3为Siat8a基因靶点1的有效性检测结果；

图4为Siat8a基因敲除(靶点1)纯合子(Siat8a^-/-)和野生型斑马鱼(WT)基因序列比对结果图；

图5为实施例2中Siat8a基因敲除突变体与野生型斑马鱼体内神经节苷脂含量对比；

图6为实施例3中Siat8a基因敲除突变体与野生型斑马鱼表型分析结果；其中，A：野生型和Siat8a基因突变体的形态发育示意图；B：野生型和Siat8a基因突变体48hpf异常形态变化；

图7为实施例3中Siat8a基因敲除突变体与野生型斑马鱼的行为学分析结果；其中，A：5dpf斑马鱼自发运动轨迹；B：5dpf斑马鱼的运动速率；

图8为实施例3中Siat8a基因敲除突变体与野生型斑马鱼7dpf大脑发育图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所提供的Siat8a基因突变的F0代斑马鱼是通过CRISPR/Cas9系统构建，但还可以采用其它常规的基因编辑方法来获得Siat8a基因突变的F0代斑马鱼。

实施例1

一种Siat8a基因敲除型斑马鱼的构建方法：

一、靶点设计

根据斑马鱼Siat8a基因序列(NCBI登录号为NM 553210)，通过CRISPR/Cas9靶点设计网站https://www.crisprscan.org/sequence/，根据靶位点设计原则，设计Siat8a基因的靶位点(于第1号外显子区域选择2个位点)，如图1所示。

靶点1序列：GGAGATGTAGCTGGAACCAT(SEQ ID NO.1)。

靶点2序列：GGGCAGGAACCAGAGCCGCGG(SEQ ID NO.2)。

二、针对Siat8a基因敲除

1设计检测引物

1.1特异性靶点1的引物

设计特异性靶位点PCR引物。选取靶位点前500bp后500bp的区域设计检测引物，扩增产物长度在300-600bp之间，前后引物和靶位点的距离均不低于80bp。

所述靶点1的长引物序列为：taatacgactcactataGGAGATGTAGCTGGAACCATgttttagagcta gaa(SEQ ID NO.3)，gRNA接头引物序列为：GAAATTAATACGACTCACTATA(SEQ IDNO.4)。

在NCBI上查询斑马鱼Siat8a基因的基因组序列，利用Primer 5.0软件设计引物Forward Primer、Forward Primer用以检测靶点1敲除的有效性。

Forward Primer：TAGAACAACCCAGCAAAC(SEQ ID NO.5)；

Forward Primer：ACCAGCGGTAAAGGCAAC(SEQ ID NO.6)。

1.2特异性靶点2的引物

根据引物设计规则，设计所述靶点2的长引物序列为：taatacgactcactataGGGCAGGAACCAGAGCCGCGGgttttagagctagaa(SEQ ID NO.7)，gRNA接头引物序列为：GAAATTAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO.4)。

利用Primer 5.0软件设计斑马鱼Siat8a基因的引物Forward Primer、ForwardPrimer用以检测靶点2敲除的有效性。

Forward Primer：AGCCCTACTCATCCTTTGAGG(SEQ ID NO.8)；

Forward Primer：TCAACCTTGTCTACGTGACCATA(SEQ ID NO.9)。

2gRNA扩增与体外转录

2.1gDNA合成及纯化

利用primer star PCR获得含有斑马鱼Siat8a基因敲除靶点的gDNA1及gDNA2片段。以pGH-T7-zCas9质粒(购于国家斑马鱼中心)为模板，分别使用引物对1和引物对2进行扩增，具体扩增程序为：循环数为35，退火温度为60℃，延伸时间30s。扩增产物条带大小约100bp，经DNA纯化试剂盒纯化获得DNA片段。

其中，引物对1：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；引物对2：:SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.4。

2.2体外转录合成gRNA

以上述2.1获得的gDNA片段为模板，采用T7高产转录试剂盒，按照试剂盒说明书操作步骤进行体外转录，获得含有斑马鱼Siat8a基因两个不同靶点的gRNA，分别为gRNA1、gRNA2。反应体系如表1所示(20μL)：

表1

试剂	添加量(μL)
		5×T7 RNA polymerase Buffer	4
DTT(100mM)	1
		10mM NTP	5
RNase Inhibitor	0.5
		Temp DNA	3(总量>1200ng)
T7RNA Polymerase	1
		DEPC水	加至20

2.3gRNA纯化

用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA；吸取纯化后的gRNA溶液1μL进行浓度检测；并将其分装、标记、保存于-80℃中待用。

合成纯化后的gRNA1测得浓度为270ng/μL，OD_260/280在2.0左右；gRNA2测得浓度为301ng/μL，OD_260/280在2.0左右。电泳结果如图2所示，表明gRNA1和gRNA2的浓度以及纯度均达到后续显微注射敲除的要求。

3斑马鱼胚胎注射Cas9蛋白和gRNA

将Cas9蛋白稀释10倍，浓度为200ng/μL，分别与gRNA1和gRNA2(浓度均为100ng/μL)混合，得到两种混合物；调节显微注射仪参数，注射压强(Pi)调节为10，注射时间(Ti)为0.1s；选取发育至单细胞期的正常野生型斑马鱼胚胎，整齐摆放在注射模具上，分别将两种混合物显微注射至胚胎卵黄中，每胚胎注射量为2nL；注射过的胚胎立即放置于E3培养液中，28℃继续孵化培养。

4Siat8a基因靶位点有效性检测

(1)提取注射斑马鱼基因组

待胚胎发育至48hpf，分别从经过和未经过“3斑马鱼胚胎注射Cas9蛋白和gRNA”部分注射的斑马鱼胚胎中随机挑选30枚，每管6枚。采用Alb溶液(NaOH/EDTA)在95℃下孵育35min后，加入10μL的40mM Tris-HCl，吹打震荡混匀，离心，以提取基因组DNA。

(2)PCR扩增、测序

采用50μL体系扩增。PCR反应体系：PCR Taq Mix，25μL；分别取靶点1的上/下游引物(SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6)，及靶点2的上/下游引物(SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10)各2.5μL；基因组DNA，10μL；DEPC水，10μL；设置38个循环。将扩增后的靶片段进行基因测序，根据起峰位置判断gRNA的有效性。

结果如图3所示，结果显示F0胚胎靶点PCR产物测序显示靶位点之前没有杂峰，之后次峰明显，2个靶位点后的基因片段均出现缺失情况，表明2个靶点均具有敲除效率。但是，靶点1的敲除效率更高，且靶点1敲除的F0代斑马鱼死亡率仅为5％，而靶点2敲除F0代斑马鱼胚胎的死亡率为11.2％，靶点1较靶点2的死亡率低50％。因此选择靶点1进行后续基因敲除及突变体筛选。

5斑马鱼Siat8a基因F0代突变体筛选

选取更有效的靶点1，大批量注射斑马鱼胚胎，并将注射完的F0代胚胎饲养至性成熟。麻醉、剪尾、按照上述方法提取F0代斑马鱼基因组，经PCR扩增后测序。若测序结果靶位点之前没有杂峰，之后次峰明显，且可以从次峰中读出碱基顺序，则表明斑马鱼中存在Siat8a基因发生突变体，即获得Siat8a基因敲除的F0代突变体。

6斑马鱼Siat8a基因F1代突变体筛选

将F0代突变体与野生型斑马鱼外交；受精24h后，分别取每条雌鱼的胚胎4枚提取基因组，经PCR扩增，测序进行可遗传性及有效突变检测，获得Siat8a基因突变的F1代斑马鱼，并养至性成熟。

7斑马鱼Siat8a基因F2代纯合子突变体筛选

性成熟的F1代斑马鱼逐条剪尾、提取基因组并测序。筛选发生同种类型Siat8a基因突变的F1代雌、雄斑马鱼内交，获得F2代胚胎，并养至性成熟，筛选获得F2代基因敲除纯合子突变体。

针对F2代突变体进行基因测序，分析结果如图4，与野生型斑马鱼(WT)相比，F2代基因敲除纯合子突变体的Siat8a基因出现13个碱基缺失，由此成功获得与GD3神经节苷脂合成有关的Siat8a基因敲除斑马鱼突变体，即斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型。

实施例2

对实施例1构建的Siat8a基因敲除斑马鱼突变体与野生型斑马鱼中神经节苷脂含量及种类的分析。实验分组按照：野生型斑马鱼雌雄1:1配对(胚胎为野生型，标记为WT)；Siat8a基因敲除纯合子与野生型斑马鱼1:1配对(胚胎为Siat8a杂合子，标记为Siat8a^+/－)；Siat8a纯合子雌雄1:1配对(胚胎为Siat8a纯合子，标记为Siat8a^－/－)。获得的胚胎按照上述分组分为三组，在恒温培养箱中培养。

LC-MS/MS分析斑马鱼神经节苷脂含量变化。分别取各组6dpf的斑马鱼30条，冻干(蛋白浓度需大于1mg)。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定斑马鱼的蛋白浓度；采用Svennerholm法提取神经节苷脂，干燥后复溶至100μL氯仿/甲醇/水(2:1:0.15，v/v)。通过LC-MS/MS检测野生型、Siat8a基因敲除杂合子及纯合子斑马鱼神经节苷脂含量变化，结果如图5所示。结果显示，相比于野生型，Siat8a基因敲除导致斑马鱼GD3合酶参与合成的GD3、GD2、GD1b含量显著降低；同时导致GD3上游的GM3、GM2、GD1a含量升高。

实施例3斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的应用

1.斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型表型分析。按照实施例2中的实验分组，对各组斑马鱼发育进行发育表型分析：

(1)统计、分析48hpf野生型斑马鱼与Siat8a^+/－及Siat8a^－/－斑马鱼胚胎的死亡率、发育阻滞、眼部色素变浅情况，计算公式如下：

死亡率(％)＝死亡胚胎数/总胚胎数×100％

畸形率(％)＝异常数/总胚胎数×100％

眼部色素变浅率(％)＝异常数/总胚胎数×100％

(2)幼鱼发育形态分析

在胚胎发育至48hpf和72hpf时，每组随机取10条幼鱼，在适当温度(26±1℃)的环境下，通过体式显微镜下观察并拍照幼鱼发育情况，结果如图6所示。结果显示，与野生型相比，神经节苷脂合成障碍的Siat8a^－/－斑马鱼死亡率明显升高，且出现神经发育迟缓，眼睛黑色素含量减少斑马鱼的比列显著增加。

2.斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的运动行为分析

采用Noldus仪检测Siat8a基因敲除斑马鱼自由泳动情况。按照实施例2中的实验分组，每组选取6条5dpf的幼鱼，置于24孔板中，等待1h待其适应后，置于Noldus仪器中，适应10min左右，使用Ethovision XT软件设置程序：记录2min的幼鱼运动轨迹。光照刺激实验的设置程序为：10s光照刺激后继续记录2min的自由泳动情况。每组记录重复2次。后期导出后进行运动轨迹和运动速度分析，结果如图7所示。结果显示，野生型斑马鱼的运动轨迹呈有规律的圆弧，杂合子则轨迹杂乱，出现较多的小绕圈的重复运动，运动强度也明显降低；纯合子则呈现完全不规律的运动，杂乱无章，重复小圈环绕，运动距离明显减少；进一步对2min内运动速率分析发现，杂合子和纯合子斑马鱼的运动速率均显著低于野生型斑马鱼。表明Siat8a基因敲除的神经节苷脂合成障碍斑马鱼的运动认知能力明显受损，这可能与神经发育受阻相关。

3.斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的大脑发育分析

为了分析Siat8a基因敲除斑马鱼的神经发育状况，对斑马鱼的脑组织进行HE染色分析。按照实施例2的分组，待斑马鱼幼鱼发育至7dpf时，从每组中随机选取8条斑马鱼于1.5mL离心管中，加入1mL 4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋后进行HE染色，结果如图8所示。结果显示与野生型斑马鱼大脑相比，Siat8a^+/－斑马鱼杂合子的大脑中颗粒细胞稀疏，排列不紧密；而Siat8a^+/－斑马鱼除了颗粒细胞明显减少外，脑面积也明显变小。脑的面积与颗粒细胞数与大脑是否正常发育十分相关。Siat8a基因敲除的神经节苷脂合成障碍斑马鱼的脑组织发育明显受阻。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种对斑马鱼进行Siat8a基因敲除的方法，其特征在于，包括以SEQ ID NO.1所示序列为靶点，利用基因编辑系统对斑马鱼的胚胎进行Siat8a基因敲除，获得Siat8a基因敲除的F0代突变体的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑系统为CRISPR/Cas9系统。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统使用的gRNA是以pGH-T7-zCas9质粒为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，再将所述扩增产物进行转录得到的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎为发育至单细胞期的野生型胚胎。

5.一种Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用权利要求1-4任一项所述的方法获得Siat8a基因敲除的F0代突变体；

将Siat8a基因敲除的F0代突变体与野生型斑马鱼外交，经测序获得Siat8a基因突变的F1代突变体；

将所述F1代突变体中的雌鱼和雄鱼内交，经测序获得Siat8a基因突变的F2代纯合子突变体，即为所述Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型。

6.一种根据权利要求5所述的构建方法构建得到的Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型在研究Siat8a基因的生物学功能中的应用。

7.一种根据权利要求5所述的构建方法构建得到的Siat8a基因敲除斑马鱼神经节苷脂合成障碍模型在筛选或评价具有神经发育活性的药物或天然功效因子中的应用。