CN116732079A - 对异常球菌进行基因组编辑的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对异常球菌进行基因组编辑的方法及其应用。本发明提供的CRISPR基因编辑系统包含Cas表达元件和sgRNA表达元件，将两者转入异常球菌感受态细胞，可以实现对目的基因的识别和剪切。该CRISPR/Cas编辑系统能够实现基因组特定位点的基因敲除、插入、替换或点突变，有利于实现异常球菌的改造。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学基因组编辑领域，涉及一种对异常球菌进行基因组编辑的方法及其应用。
背景技术
耐辐射奇球菌Deinococcusradiodurans是迄今为止地球上发现的最耐辐射的生物之一，作为“世界上最顽强的细菌”，其对电离辐射、UV、过氧化氢和干燥等胁迫具有极强的抗性，是研究胁迫环境下细胞如何维持基因组完整性和稳定性的模式生物。为了探明更多功能未知基因对于耐辐射奇球菌超强胁迫抗性的作用，通常需要通过构建这些基因的缺失突变株并与野生型菌株作比较，来检测这些基因在细胞内行使的功能；或者为了更大限度利用耐辐射奇球菌的超强抗性对其进行定向改造，通常需要实现单个或多个基因的敲除、插入或替换。
目前用于耐辐射奇球菌的主要遗传操作工具包括三段连接式同源重组法、穿梭质粒、选择性标记、用于诱导基因表达的特征化启动子、利用Cre-lox系统产生基因缺失的策略等，但由于耐辐射奇球菌基因组的多拷贝性，其编辑需要进行多轮的筛选以寻找到纯合突变，用于耐辐射奇球菌中更高效和精确的全基因组工程的工具仍有待拓展。
基于成簇规律间隔短回文重复（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats, CRISPR）的相关技术自2012年首次应用于基因组编辑以来，表现出作为基因组编辑工具的巨大发展潜力。该技术主要由Cas核酸酶和一条单链嵌合向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）组成。Cas核酸酶蛋白在sgRNA的引导下识别并切割基因组DNA产生双链断裂，然后通过人为提供外源DNA修复模板进行同源重组修复，可以在基因组的任何位置快速而准确地实现包括基因敲除和基因插入在内的靶向编辑。归类于2类Ⅱ-A型CRISPR系统的Cas9是一种RNA引导的内切酶，与许多原核生物的CRISPR适应性免疫系统有关，在过去的十几年中被广泛应用于细胞和生物体水平的基因组编辑。然而，最常用于基因组编辑的Cas9蛋白在多种细菌中被报道具有较强的毒性。近年来，Cpf1（也称Cas12a）蛋白以其较低的细胞毒性及较强的编辑效率成为Cas9的有力替代。与CRISPR/Cas9系统不同，使用Ⅴ-A型CRISPR的核酸内切酶Cpf1的CRISPR/Cpf1系统只需要sgRNA即可发挥作用；且Cpf1本身具有RNA酶活性，可自行将pre-sgRNA加工为成熟的sgRNA，有利于实现多位点或多基因的同时编辑。
CRISPR基因组编辑技术已经在哺乳动物细胞及一些模式生物或工程菌中成功实现了高效的基因组编辑。但到目前为止，还没有在耐辐射奇球菌中进行基因组编辑的报道。因此，通过对CRISPR-Cas9/12a体系的改造，使其能够应用于耐辐射奇球菌中的基因编辑，将提高耐辐射奇球菌的遗传学操作效率，为后续基因生物学功能研究、菌种定向改造等提供有力的工具。
发明内容
为了克服现有障碍，实现对异常球菌如耐辐射奇球菌更为精准有效的基因组编辑，本发明提供了对异常球菌进行基因组编辑的方法及其应用。
一种对异常球菌进行基因组编辑的方法，
Cas核酸酶表达质粒pCasG具有Cas表达元件，sgRNA表达质粒pTarget具有sgRNA表达元件，将Cas核酸酶表达质粒pCasG和sgRNA表达质粒pTarget构成的CRISPR双质粒系统Ⅰ共转化入异常球菌感受态细胞中；或者先将Cas核酸酶表达质粒pCasG转化入异常球菌感受态细胞中得到转化子，再将sgRNA表达质粒pTarget转化入所述的转化子中，从而实现对异常球菌基因组的基因片段或个别核苷酸的删除、插入或替换编辑；或者
Cas表达元件和sgRNA表达元件位于同一个质粒pCRISPR上，用于Cas核酸酶和sgRNA的共表达，pCRISPR和含有同源重组修复模板的质粒pTemplate共同构成CRISPR/Cas双质粒系统 Ⅱ，先将pTemplate转化入异常球菌感受态细胞，培养转化株以提供时间让更多的重组发生，再将能同时表达Cas核酸酶和sgRNA的单个质粒pCRISPR转化入转化株，作为反选或产生靶序列的双链断裂以促进更多的重组事件发生，从而实现对异常球菌基因组的基因片段删除、插入或定点突变编辑。
所述核酸酶Cas选自AsCpf1、FnCpf1、LbCpf1或SpCasG9。
所述Cas核酸酶表达元件依次包含启动子、Cas核酸酶基因序列、由一段linker序列连接在Cas基因片段C端的eGFP基因片段、终止子；所述eGFP作为Cas核酸酶在胞内表达情况的标记。
所述sgRNA表达元件包含启动子、sgRNA序列，所述sgRNA用于引导Cas核酸酶靶向目的序列，目的序列包含Cas核酸酶识别位点。
所述pTemplate或sgRNA表达质粒pTarget上包含一段用于同源重组的修复模板片段，该片段包含靶序列上下游的同源臂。
所述Cas核酸酶表达质粒pCasG或pCRISPR上包含氯霉素抗性基因作为筛选标记基因，pTemplate或sgRNA表达质粒上pTarget包含筛选标记基因，所述筛选标记基因选自卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因。
所述质粒pCasG，pTarget，pTemplate以及pCRISPR是耐辐射异常球菌/大肠杆菌穿梭质粒。
所述的方法，使用CRISPR双质粒系统I进行异常球菌基因组编辑时，Cas核酸酶在sgRNA引导下靶向目标位点进行切割，产生的双链断裂通过异常球菌胞内强大的同源重组修复系统以及pTarget质粒上导入的同源重组修复模板进行修复，通过改变模板片段可实现靶位点基因片段或个别核苷酸的删除、插入或替换等不同编辑需求。
所述的方法，使用CRISPR双质粒系统II进行异常球菌基因组编辑时，pTemplate质粒上导入的同源重组模板通过异常球菌自身强大的同源重组能力随机地重组到异常球菌基因组的靶位点，而后使用Cas核酸酶在sgRNA引导下对目标位点进行切割，产生双链断裂杀死未能成功重组的细胞，或进一步促进靶位点的重组发生，通过改变模板片段可实现靶位点基因片段或个别核苷酸的删除、插入或替换等不同要求的编辑。
所述的方法，适用于异常球菌和原核细胞；所述的异常球菌包括中度嗜热菌Deinococcusgeothermalis，沙漠耐辐射菌Deinococcusdeserti，嗜放射异常球菌Deinococcusradiophilus，解蛋白异常球菌Deinococcusproteolyticus。
本发明的CRISPR/Cas系统能够改变耐辐射奇球菌基因组，效率可达100%，结果表明，CRISPR/Cas基因组编辑有潜力改变奇球菌的基因组。
附图说明
图1是本发明的CRISPR/Cas双质粒系统I中Cas蛋白表达质粒pCasG的一种结构示意图。
图2是本发明的CRISPR/Cas双质粒系统I中sgRNA表达质粒pTarget的一种结构示意图。
图3是本发明的CRISPR/Cas双质粒系统II中模板质粒pTemplate 的一种结构示意图。
图4是本发明的CRISPR/Cas双质粒系统II中Cas/sgRNA共表达质粒pCRISPR的一种结构示意图。
图5是本发明的CRISPR/Cas双质粒系统在耐辐射奇球菌中实现基因组编辑；在耐辐射奇球菌R1菌株中进行crtB基因敲除/替换的PCR验证和测序结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。
各实施例中使用的生物材料来源如下：
pYPQ230质粒（购自美国addgene公司，货号：86210）
pYPQ220质粒（购自美国addgene公司，货号：86208）
pJYS3_ΔcrtYf质粒（购自美国addgene公司，货号：85542）
pRADK质粒
实施例1
pCasG质粒构建：
pCasG质粒的组成如附图1所示。pCasG质粒的具体构建方法如下：
（1）以pYPQ230 / pYPQ220 / pJYS3_ΔcrtYf质粒为模板，通过PCR扩增得到含有LbCpf1 / AsCpf1 / FnCpf1蛋白的基因片段。
用于PCR扩增的引物序列为：
扩增LbCpf1基因5’引物序列SEQ ID No 1：
5’-CTCACAGGAGGACCCCATATGTCAAAGCTCGAGAAATTCACCA-3’
扩增LbCpf1基因3’引物序列SEQ ID No 2：
5’-CCCTTGCTCACCATACTAGTATGCTTTACGGATGTCTGAGCA-3’
扩增AsCpf1基因5’引物序列SEQ ID No 3：
5’- CTCACAGGAGGACCCCATATGACGCAGTTCGAGGGGTTCA-3’
扩增AsCpf1基因3’引物序列SEQ ID No 4：
5’- CCATACTAGTATTGCGGAGCTCTTGGATATAGG-3’
扩增FnCpf1基因5’引物序列SEQ ID No 5：
5’- CTCACAGGAGGACCCCATATGATGTCCATCTACCAAGAGTTTGTGAA-3’
扩增FnCpf1基因3’引物序列SEQ ID No 6：
5’- GTGTTATTGCGGTTCTGGACAAATT-3’
PCR扩增上述DNA片段，反应体系为：30 μl ddH2O，4 μl dNTP，10 μl 5×FastPfubuffer，2 μl 5’ primer(10μM)，2 μl 3’ primer(10μM)，1 μl模板DNA(100 ng/μl)，1 μlFastPfu DNA polymerase。
上述PCR反应体系配好以后进行聚合酶链式反应，循环如下：98℃ 2 min；之后98℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 2.5 min，共30个循环；最后72℃ 5 min。配制1%的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，120V 40 min，切下目的片段条带。使用DNA纯化回收试剂盒对产物分别进行回收。回收具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
（2）在金斯瑞生物科技有限公司合成针对耐辐射奇球菌密码子优化的eGFP蛋白基因片段，其序列SEQ ID No 7如示。
（3）使用NdeI和BamHI对pRADK质粒进行酶切，其反应体系如下：5 μl 10×buffer，5 μg pRADK质粒，2.5 μl NdeI，2.5 μl BamHI，最后加入适量ddH2O至总体积为50 μl。将反应体系在37℃下反应过夜，配制1%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，分离酶切产物，切割目的条带。使用Promega的DNA纯化回收试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
（4）利用重组试剂盒将步骤(1)(2)得到的两个DNA片段和步骤(3)中得到的pRADK质粒酶切产物组装成一个质粒。反应体系为：4 μl 5 × CE MultiS Buffer，0.015 nmol步骤(3)pRADK质粒酶切产物，0.045 nmol步骤(1)Cas基因片段，0.045 nmol eGFP基因片段，2μl Exnase MultiS加入适量ddH2O至总体积为20 μl，在37℃下反应30 min。将10 μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用质粒抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到杭州擎科生物公司进行测序确认。最终得到的质粒命名为pCasG质粒，其质粒图谱如图1。
该pCasG质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和耐辐射奇球菌中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌中为氨苄青霉素抗性，筛选浓度为100 μg/ml，在耐辐射奇球菌中为氯霉素抗性，筛选浓度为4 μg/ml；在于该质粒能在耐辐射奇球菌中表达Cas核酸酶蛋白；在于该质粒与pTarget质粒配合使用，能够在耐辐射奇球菌中进行基因组编辑，实现基因敲除、基因插入等功能。
实施例2
pTarget质粒构建：
pTarget质粒的组成如附图2所示。pTarget质粒的具体构建方法如下：
（1）以pRADK为模板，设计一对反向引物进行PCR扩增，得到不带氯霉素抗性基因且两端带有SpeI酶切位点的线性化载体，用于PCR扩增的引物序列如下：
pRADK质粒扩增5’引物序列SEQ ID No 8：
5’-CGGACTAGTTTTTTTTAAGGCAGTTATTGGT-3’
pRADK质粒扩增3’引物序列SEQ ID No 9：
5’-CGGACTAGTTTTAGCTTCCTTAGCTCCTG-3’
扩增上述DNA片段，反应体系为：30 μl ddH2O，4 μl dNTP，10 μl 5×FastPfubuffer，2 μl 5’primer(10μM)，2 μl 3’primer(10μM)，1 μl模板DNA(100 ng/μl)，1 μlFastPfu DNA聚合酶。
上述PCR反应体系配好以后进行聚合酶链式反应，设置循环如下：98℃ 2 min；之后98℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 2 min 30 s，共30个循环；最后72℃ 5 min。使用DNA纯化回收试剂盒对产物进行回收。回收具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
（2）使用SpeI对步骤(1)得到的线性化载体进行酶切，其反应体系如下：5 μl 10×buffer，2 μg 载体，2 μl SpeI，最后加入适量ddH2O至总体积为50 μl。该反应中所用buffer和酶均由Takara公司生产。将反应体系在37℃下反应过夜，配制1%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，分离酶切产物，切割目的条带。使用DNA纯化回收试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
（3）使用T4连接酶对步骤(2)得到的线性化载体进行连接，其反应体系如下：1 μl10×buffer，500 ng载体，1 μl T4 DNA连接酶，最后加入适量ddH2O至总体积为10 μl。将反应体系在16℃下反应过夜，将10 μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用质粒抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到杭州擎科生物公司进行测序确认。最终得到正确的质粒命名为pTarget质粒，其质粒图谱如图2。
该pTarget质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和耐辐射奇球菌中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌中为氨苄青霉素抗性，筛选浓度为100 μg/ml，在耐辐射奇球菌中为卡那霉素抗性，筛选浓度为20 μg/ml；在于含有XbaI和XhoI酶切位点，能够用来插入sgRNA表达元件；在于含有BamHI位点，能够用来插入修复模板；在于该质粒能在耐辐射奇球菌中稳定表达sgRNA；在于该质粒与pCasG质粒配合使用，能够在耐辐射奇球菌中进行基因组编辑，实现基因敲除、基因插入等功能。
实施例3
制备含有pCasG质粒的耐辐射奇球菌感受态：
（1）将实验室保种的耐辐射奇球菌R1菌株在TGY固体培养平板（0.5% Tryptone，0.1% Glucose，0.3% Yeast extract，固体培养基需再加1.5%琼脂粉）上划线，于30℃培养箱倒置培养过夜。挑取平板上的一个单克隆菌落接种于5 ml TGY 液体培养基中，在30°C摇床中以220 rpm的转速振摇过夜。第二天取适量菌液接种至10 ml新鲜的TGY液体培养基中，在30℃培养至OD6000.8-1.0时，在超净工作台将菌液分装至1.5 ml无菌的Eppendorf 管中，每管1 ml，2000 g离心3 min 收集菌体。在超净工作台弃去上清培养液后加入500 μl转化液（4×TGY 培养基，60 mM CaCl2各250μl，1:1混合），用移液枪轻轻吹打悬浮菌体，2000 g离心3 min收集菌体，重复上述操作一次。然后将菌体重新悬浮至500 μl转化液中，置于30℃摇床中培养90 min。
（2）取出步骤(1)中制备的耐辐射奇球菌R1菌株感受态，在冰上放置一段时间，加入待转化的1 μg实施例1中制备的pCasG质粒，混合均匀后冰浴45 min。然后将全部菌液转移至新鲜的5 ml TGY 液体培养基中，于30°C摇床中培养6-16 h，最后取100 μl转化液涂到含有4 μg/ml氯霉素的TGY 固体培养基平板上。待菌液被固体培养基吸收后，于30℃培养箱倒置培养，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。2-3天后在平板上挑取单克隆培养。
（3）取步骤(2)过夜培养的菌液适量，接种至10 ml新鲜的TGY液体培养基中，在30℃培养至OD600 0.8-1.0时，用实施例5的方法确认Cas与eGFP融合蛋白在耐辐射奇球菌中稳定表达后，在超净工作台将菌液分装至1.5 ml无菌的Eppendorf 管中，每管1 ml，2000 g离心3 min 收集菌体。在超净工作台弃去上清培养液后加入500 μl转化液（4×TGY 培养基，60 mM CaCl2各250μl ，1:1混合），用移液枪轻轻吹打悬浮菌体，2000 g离心3 min收集菌体，重复上述操作一次。然后将菌体重新悬浮至500 μl转化液中，置于30℃摇床中培养90min。
实施例4
pCasG/pTarget双质粒在耐辐射奇球菌中实现高效基因替换：
使用pCasG/pTarget构成的CRISPR双质粒系统可以在耐辐射奇球菌各种菌株中实现对不同基因的高效敲除。实验中选取crtB基因为例，在耐辐射奇球菌R1菌株中进行基因敲除实验，同时插入无活性的链霉素抗性基因部分片段完成替换。附图5为在R1菌株中进行crtB基因敲除的PCR验证以及DNA测序结果。
（1）先在目标基因上选定某一TTTN（N为A/C/G）序列后面21个碱基的DNA片段（这21个碱基被称为spacer，TTTN不包含在其中）。在金斯瑞生物科技有限公司合成含有GroES启动子和sgRNA序列以及spacer序列依次组装的DNA片段，其序列如下：
AsCpf1的sgRNA片段序列SEQ ID No 10：
5’ GGTAATTTCTACTCTTGTAGATCCGCCTCGTCCACGATGTCGTT-3’
FnCpf1的sgRNA片段序列SEQ ID No 11：
5’ GAATTTCTACTGTTGTAGATTCTGGGGTCGCAACTGTTTTCT-3’
LbCpf1的sgRNA片段序列SEQ ID No 12：
5’GGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCCGCCTCGTCCACGATGTCGTT-3’
（2）使用XbaI和XhoI对pTarget质粒进行酶切，其反应体系如下：5 μl 10×buffer，5 μg mipRADK质粒， 2.5 μl XbaI，2.5 μl XhoI，最后加入适量ddH2O至总体积为50 μl。将反应体系在37℃下反应过夜，配制1%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，分离酶切产物，切割目的条带。使用DNA纯化回收试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
（3）Gibson拼接法将步骤(1)得到的pTarget质粒酶切产物，和步骤(2)中得到的DNA片段组装成一个质粒。将10 μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用质粒抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到杭州擎科生物公司进行测序确认。得到正确的质粒命名为pTarget-crtB_sgRNA质粒。
（4）使用BamHI对pTarget-crtB_sgRNA质粒进行酶切，其反应体系如下：5 μl 10×buffer，4 μg pTarget-crtB_sgRNA质粒，4 μl BamHI，最后加入适量ddH2O至总体积为50 μl。将反应体系在37℃下反应过夜。使用DNA纯化回收试剂盒对双酶切产物进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
（5）扩增要敲除的目的基因上下游各~1500 bp的DNA片段及需要插入的DNA片段。以crtB基因为例扩增其上下游片段及插入的DNA片段所需的引物分别为：
crtB基因上游5’引物序列SEQ ID No 13：
5’-CGATGAGTTTTTCTAGGATCCCTTGGTCTGGTCGGGGTCG-3’
crtB基因上游3’引物序列SEQ ID No 14：
5’-CCTCATATGGCCTGCTTACAGAAAAGGAAAGA-3’
crtB基因下游5’引物序列SEQ ID No 15：
5’-AAAGCTTTCTGTCACCCCTCCGGGA-3’
crtB基因下游3’引物序列SEQ ID No 16：
5’-CCTGCAGGTCGAATCGGATCCGCGTTTGCCGGGTAGATTG-3’
插入片段5’引物序列SEQ ID No 17：
5’-TGTAAGCAGGCCATATGAGGGAAGCGGTGATCG-3’
插入片段3’引物序列SEQ ID No 18：
5’-GAGGGGTGACAGAAAGCTTTTATTTGCCGACTACCTT-3’
扩增上述DNA片段，反应体系为：30 μl ddH2O，4 μl dNTP，10 μl 5×FastPfubuffer，2 μl 5’primer(10μM)，2 μl 3’primer(10μM)，1 μl模板DNA(100 ng/μl)，1 μlFastPfu DNA聚合酶。
上述PCR反应体系配好以后进行聚合酶链式反应，设置循环如下：98℃ 2 min；之后98℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 2 min 30 s，共30个循环；最后72℃ 5 min。使用DNA纯化回收试剂盒对产物进行回收。回收具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。
（6）使用Gibson拼接法将上述步骤(5)得到的DNA片段插入到步骤(4)酶切后的pTarget-crtB_sgRNA质粒的BamHI位点中，得到pTarget-crtB质粒。反应体系为：4μl 5 ×CE MultiS Buffer，0.015 nmol步骤(4) pTarget-crtB_sgRNA质粒酶切产物，0.045 nmol步骤(5)各DNA片段，2 μl Exnase MultiS加入适量ddH2O至总体积为20 μl，在37℃下反应30 min。将10 μl反应产物转化到大肠杆菌感受态DH5α菌株中，并平铺在含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养平板上长出的转化菌株转接保存，并用质粒抽提试剂盒抽提质粒用于后续实验，质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。同时将质粒送到杭州擎科生物公司进行测序确认。最终得到的质粒命名为pTarget-crtB质粒。
（7）将构建的pTarget-crtB质粒转入实施例3制备的含有pCasG质粒的R1菌株感受态中。具体操作如下：取一管实施例3中制备的有pCasG质粒的R1菌株感受态细菌，在冰上放置一段时间，加入1 μg质粒，混合均匀后冰浴45 min。然后将全部菌液转移至新鲜的5 mlTGY 液体培养基中，于30°C摇床中培养6-16 h，最后取100 μl转化液涂到含有4 μg/ml氯霉素和20 μg/ml 卡那霉素的TGY 固体培养基平板上。待菌液被固体培养基吸收后，于30℃培养箱倒置培养，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。2-3天后在平板上挑取单克隆培养。
（8）耐辐射奇球菌R1菌株中的crtB基因与细菌的色素合成相关。当crtB基因失去功能时，会使菌株失去色素合成能力，从而使菌落颜色由红色转为白色。将步骤(7)中选取的单克隆菌落，在5 ml TGY液体培养基中于30℃摇床振摇培养过夜。同时选取一个野生型R1菌落在相同的条件下培养作为对照。第二天，野生型菌株的R1菌液显示为红色，crtB基因敲除成功的菌落则显示为白色，如图5。
（9）取上述步骤(8)中培养的菌液1-2 ml于洁净的Eppendorf 管中，12000 g离心1min，弃上清，加入200 μl溶菌酶溶液37℃孵育30 min，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA作为PCR模板扩增crtB基因上下游及内部部分。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。成功进行基因完全敲除/替换的菌株单克隆，其上下游PCR产物会与正常菌株的PCR产物长度不一致（在本实例中，插入的DNA片段与crtB基因片段大小相近，条带大小差异不明显），且内部片段PCR与正常菌株相比无条带，因此可通过琼脂糖凝胶上DNA片段的条带大小与有无来判断基因敲除/替换是否成功，如图5。
本步骤的特征在于：进行上下游PCR验证的引物位于crtB基因上下游的外侧，不在pTarget-crtB质粒中，这样就避免了pTarget-crtB质粒对PCR结果的干扰。
crtB基因敲除的PCR验证引物序列为：
crtB基因上游外侧5’引物序列：
5’-GGCTGCGCCTGAATGGTCTG-3’
crtB基因下游外侧3’引物序列：
5’-GCACGCGCTTGAGGTAGGTG-3’
crtB基因内部5’引物序列：
5’-GTGAGGTCTAGGGCCGGTTTG-3’
crtB基因内部3’引物序列：
5’-CAGCGAGCGCAGTTCCCAC-3’
实施例5
pCasG质粒能在耐辐射奇球菌中稳定表达Cas蛋白：
pCasG质粒在Cas蛋白的C端连接了eGFP蛋白，可以通过荧光显微镜观察含有pCasG质粒的耐辐射奇球菌R1菌株胞内是否有绿色荧光发生，从而确定转化菌株可以在胞内稳定表达Cas-eGFP融合蛋白，确保后续步骤有效进行。
（1）培养含有pCasG质粒的耐辐射奇球菌R1菌株至OD6001.0~2.0左右，取1 ml菌液于洁净的1.5 ml EP管中，3000 g离心3 min，弃上清，加入100 μl 1×PBS重新悬浮。取9 μl重新悬浮的菌液，加入10×DAPI核染料，染5-10 min，滴在载玻片上抹开风干，盖上盖玻片。
（2）首先确认Nikon Ti2荧光显微镜电源连接正常，打开外置荧光电源控制器开关，使汞灯开始工作；先把显微镜的物镜转盘转到低倍物镜档位，把准备观察的玻片（方向应是盖玻片朝下）放到显微镜载物台上；通过明场的卤素灯照明状态下逐步调节到合适的物镜倍数，找到样本的焦点平面，关闭卤素灯开关或把聚光镜对准C暗档，选择相应的荧光滤色镜，荧光光闸推至“O”的状态；通过目镜观察微调节显微镜视野内的清晰度并找寻最佳的位置；将显微镜机座右侧的分光旋钮旋到相机端口位置上，通过计算机进行图像采集保存。
（3）调出DS-QI MC Settings， Annotations and Measurements 等工具以调节分辨率、曝光时间等；为方便之后加标尺，选择相应的物镜放大倍数；背景颜色不正需做白平衡；黑白相机拍摄荧光照片可添加伪彩，并将不同颜色通道的图片merge到一起。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种对异常球菌进行基因组编辑的方法，其特征在于，
Cas核酸酶表达质粒pCasG具有Cas表达元件，sgRNA表达质粒pTarget具有sgRNA表达元件，将Cas核酸酶表达质粒pCasG和sgRNA表达质粒pTarget构成的CRISPR双质粒系统Ⅰ共转化入异常球菌感受态细胞中；或者先将Cas核酸酶表达质粒pCasG转化入异常球菌感受态细胞中得到转化子，再将sgRNA表达质粒pTarget转化入所述的转化子中，从而实现对异常球菌基因组的基因片段或个别核苷酸的删除、插入或替换编辑；或者
Cas表达元件和sgRNA表达元件位于同一个质粒pCRISPR上，用于Cas核酸酶和sgRNA的共表达，pCRISPR和含有同源重组修复模板的质粒pTemplate共同构成CRISPR/Cas双质粒系统 Ⅱ，先将pTemplate转化入异常球菌感受态细胞，培养转化株以提供时间让更多的重组发生，再将能同时表达Cas核酸酶和sgRNA的单个质粒pCRISPR转化入转化株，作为反选或产生靶序列的双链断裂以促进更多的重组事件发生，从而实现对异常球菌基因组的基因片段删除、插入或定点突变编辑。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶Cas选自AsCpf1、FnCpf1、LbCpf1或SpCasG9。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas核酸酶表达元件依次包含启动子、Cas核酸酶基因序列、由一段linker序列连接在Cas基因片段C端的eGFP基因片段、终止子；所述eGFP作为Cas核酸酶在胞内表达情况的标记。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA表达元件包含启动子、sgRNA序列，所述sgRNA用于引导Cas核酸酶靶向目的序列，目的序列包含Cas核酸酶识别位点。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pTemplate或sgRNA表达质粒pTarget上包含一段用于同源重组的修复模板片段，该片段包含靶序列上下游的同源臂。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas核酸酶表达质粒pCasG或pCRISPR上包含氯霉素抗性基因作为筛选标记基因，pTemplate或sgRNA表达质粒上pTarget包含筛选标记基因，所述筛选标记基因选自卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒pCasG，pTarget，pTemplate以及pCRISPR是耐辐射异常球菌/大肠杆菌穿梭质粒。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用CRISPR双质粒系统I进行异常球菌基因组编辑时，Cas核酸酶在sgRNA引导下靶向目标位点进行切割，产生的双链断裂通过异常球菌胞内强大的同源重组修复系统以及pTarget质粒上导入的同源重组修复模板进行修复，通过改变模板片段可实现靶位点基因片段或个别核苷酸的删除、插入或替换等不同编辑需求。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用CRISPR双质粒系统II进行异常球菌基因组编辑时，pTemplate质粒上导入的同源重组模板通过异常球菌自身强大的同源重组能力随机地重组到异常球菌基因组的靶位点，而后使用Cas核酸酶在sgRNA引导下对目标位点进行切割，产生双链断裂杀死未能成功重组的细胞，或进一步促进靶位点的重组发生，通过改变模板片段可实现靶位点基因片段或个别核苷酸的删除、插入或替换等不同要求的编辑。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，适用于异常球菌和原核细胞；所述的异常球菌包括中度嗜热菌Deinococcus geothermalis，沙漠耐辐射菌Deinococcus deserti，嗜放射异常球菌Deinococcus radiophilus，解蛋白异常球菌Deinococcus proteolyticus。
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