CN116724854A - 一种植物内生菌的调理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物内生菌的调理方法，包括以下步骤：将石墨相氮化碳(g‑C3N4)与土壤、蛭石混匀形成调理剂施用于植物根部，所述调理剂中g‑C3N4浓度为100‑250mg/kg，蛭石添加量为所用土壤的1/3(v/v)。采用本发明的植物内生菌的调理方法对于提升作物益生菌相对丰度，增强作物内生菌多样性效果显著，并对作物养分吸收利用、生长发育有明显的促进作用。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，特别涉及一种植物内生菌的调理方法。
背景技术
石墨相氮化碳(g-C3N4)外观为淡黄色粉末，微溶于水，无毒。其结构中的C、N原子以sp2杂化形成高度离域的π共轭体系。因具有独特能带结构、优异的稳定性和良好生物相容性，g-C3N4被广泛应用于生物成像、燃料电池、光催化等领域。同时，由于g-C3N4具有高效吸附特性，且制备方法简单、无二次污染，作为污染物吸附材料，应用于重金属污染水体、土壤的修复工作。此外，g-C3N4还具有提升作物抗胁迫水平、促进作物生长的生物效应，研究表明g-C3N4可通过调节植物重金属转运体相关基因的表达，显著抑制重金属在水稻中的积累，进而降低重金属对水稻的毒性效应。在玉米生长阶段，添加10mg/L g-C3N4显著提高作物叶绿素含量，并通过上调光合作用相关蛋白的表达水平，显著提升电子传递率和净光合速率，进而促进作物生长。
蛭石是一种与蒙脱石相似的环境友好型层状硅酸盐矿物材料。一般由黑云母或金云母经热液蚀变或风化而成,部分蛭石由基性岩受酸性岩浆的侵蚀变质而成，自然条件下呈褐、黄、暗绿色，作为建筑材料、吸附剂、防火绝缘材料、机械润滑剂的重要原料而被广泛应用。在农业生产领域，蛭石主要作为种子保存剂、土壤调节剂、保湿剂、植物生长剂在作物种植过程中加以利用。
内生细菌存在于健康植物的组织和器官内部，并与植物形成复杂的共生、互惠关系。内生细菌在调节植物生长方面起到关键作用，包括调控植物激素分泌，促进作物生长；诱导植物体内重金属离子的细胞外排与生物固定，以缓解植物受到的重金属胁迫。外源添加植物调理剂可能通过改变内生菌的相对丰度，调控作物生理生化过程，进而促进作物生长。
g-C3N4在调控根际微生物、内生菌群落结构和微生物多样性等方面具有巨大潜力，对于拓展可持续的纳米农用化学品的应用，提升作物产量和品质、保障食品安全具有重要实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物内生菌的调理方法。通过调控作物内生菌群落结构，改善作物-内生菌共生系统，促进作物生长。
本发明的主要技术方案为：
一种植物内生菌的调理方法，包括以下步骤：
将石墨相氮化碳(g-C3N4)与土壤、蛭石混匀形成调理剂施用于植物根部，所述调理剂中g-C3N4浓度为100-250mg/kg，蛭石添加量为所用土壤的1/3(v/v)。
优选情况下，所述蛭石为层状结构，平均粒径为2-4mm。
优选情况下，所述g-C3N4为层状结构，厚度为3-7nm。
具体情况下，所述g-C3N4通过以下步骤制得：
在管式炉中将尿素在氮气环境下以5℃/min的升温速度加热至550℃，并在550℃下保温4h；将合成的g-C3N4冷却至室温，用去离子水洗涤三次；然后将g-C3N4在冻干机中冷冻干燥。
本发明基于我国提升农作物产量的重大需求，通过将g-C3N4与蛭石复合应用于植物内生菌的调理，调控作物内生菌群落结构，改善作物-内生菌共生系统。在提升作物益生菌相对丰度、促进作物生长方面取得显著效果。
附图说明
图1为本发明的植物内生菌调理剂的制备方法流程图。
图2为本发明的植物内生菌调理剂中g-C3N4的材料表征信息。
图3示出了实施例在土壤中施加两种不同剂量该调理剂后，盆栽水稻生长照片及植物地上部与根部生物量。
图4示出了实施例在土壤中施加两种不同剂量该调理剂后，盆栽水稻根部与地上部大量、微量元素积累情况。
图5示出了实施例在土壤中施加该调理剂后，盆栽水稻根部内生细菌多样性及群落结构的影响。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细说明本发明涉及的一种植物内生菌的调理方法，下述实施例仅仅是用于更具体详细地介绍该发明，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
一、植物内生菌调理剂的制备方法
参见图1，本发明所涉及的植物内生菌调理剂的制备方法为：
(1)4g尿素在氮气下以5℃/min的升温速度加热至550℃，并在管式炉中于550℃下保温4h。将合成的g-C3N4冷却至室温，用去离子水洗涤三次。然后将g-C3N4在冻干机中冷冻干燥。
(2)将土壤风干、筛分(<2mm)，与1/3(v/v)蛭石混合后使用。随后，将g-C3N4悬浮液与“土壤-蛭石”混合物混匀，使g-C3N4最终浓度为100-250mg/kg(图1)。
其中，步骤(1)所制得的g-C3N4的呈层状结构，厚度约为3-7nm。g-C3N4中碳和氮含量分别为34.78％和65.22％。g-C3N4的FTIR光谱特征峰位于约800cm-1和1200-1600cm-1，XRD谱图表明g-C3N4在13.9°和27.4°处有两个明显的特征峰。g-C3N4的Zeta电位和电导率分别为-23.56±0.87mV和1.411±0.51μS/cm(图2)。
二、水稻内生菌的调理实验
实验所需水稻于萌发前使用5％的双氧水消毒30min，随后使用去离子水清洗3遍，挑选大小相近的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中，种子于恒温培养箱中培养，温度设置为25℃，始终保持生长环境湿润，萌发2天后，挑选长势良好，长度相近的幼苗移植至蛭石穴盘中继续培养2周。土壤经风干、筛分(<2mm)后，与1/3(v/v)蛭石混合待用。将不同体积的g-C3N4悬浮液与制备好的土壤混合，使g-C3N4最终浓度分别为100和250mg/kg。随后，将两株水稻幼苗由蛭石中移栽至添加不同浓度的g-C3N4土壤中，土壤含水量始终保持在60％(w/w)。此外，每盆植物每周施加50mL 1/2浓度的Hoagland溶液(mg/l：472.5Ca(NO3)2，253KNO3，120.5MgSO4，68KH2PO4，40NH4NO3，36.7C10H12N2NaFe，22.3MnSO4，8.6ZnSO4，6.2H3BO3，0.83KI，0.25Na2MoO4，0.025CuSO4，0.025CoCl2)。实验全程在温室条件下进行(温度：26-34℃，光强：1680～1850μmol·m-2·s-1，相对湿度：78-83％，昼/夜光照周期：12小时/12小时)，持续30天。
水稻移栽30天后收获，分为地上部和根部，分别用自来水、去离子水冲洗3遍，吸干表面水分，分别称量地上部、根部生物量。随后，将植物样品置于冻干机冷冻干燥至恒重。分别称取不同处理组水稻根部、地上部约50和100mg干样，采用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES，iCAP 6500,Thermo Fisher Scientific,USA)测定微量、大量元素含量。利用引物799F(5′-3′:AACMGGATTAGATACCCKG)和1107R(5′-3′:CGCAACGAGCGCAACCC)扩增内生细菌的16s rRNA基因V5和V6区域。纯化的PCR产物在Illumina MiSeq PE250平台(Illumina,USA)构建文库并进行高通量测序。
数据处理：所有处理组均设置4个平行样，使用Excel计算平均值，使用SPSS19对实验数据进行单因素方差(ANOVA)分析，其中Duncan分析实验数据之间显著性变化(p<0.05)。
结果显示，暴露30天后，250mg/kg g-C3N4处理的水稻根部和地上部的鲜重分别比未处理的对照组增加29.9％和22.4％(图3A-C)。250mg/kg g-C3N4处理显著改变了水稻生长必需营养元素(S、K、Mg、Zn和Cu)的含量。250mg/kg g-C3N4处理下，地上部S、K和Mg含量分别比空白对照组提升了40.9％、65％和24.4％。对于微量营养元素，较之空白对照组，250mg/kg g-C3N4处理组显著提升了地上部Zn和Cu含量(其浓度分别增加84％和136％)。据此证明g-C3N4有效提升了作物对大量、微量必需营养元素的吸收与积累(图4A-E)，进而促进作物生长。
同时，250mg/kg g-C3N4显著提高了根部内生细菌Shannon指数和Simpson指数(分别提升13.1％和3.7％)，表明g-C3N4增强了植物内生细菌多样性(图5A、B)。在属水平上，250mg/kg g-C3N4处理组显著提高了根系中内生细菌Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Streptomyces、Tepidisphaera、Saccharimonadales和Thermosporothrix的相对丰度，其占比较之空白对照组分别显著提升0.55倍、2.29倍、3.37倍、3.13倍和1.80倍(图5C)。目前，国内外针对上述几种重要内生细菌的研究表明，Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium是一种促进植物生长的菌种，主要参与根际土壤环境与植物根部的氮同化过程，并对外源非生物胁迫具有高抗性。在重金属污染土壤环境中，Streptomyces可以增强作物对必需营养元素的吸收，诱导植物激素的生物合成，并通过分泌胞外聚合物与螯合剂(如铁载体和羟酸盐)以阻隔重金属，进而促进植物生长。Tepidisphaera主要以单细胞或不规则形态的聚集体出现，具有降解单糖、双糖和多糖的生物效能。Saccharimonadales是一种重要的植物共生细菌，主要调节植物养分(磷素和氮素)吸收利用。Saccharimonadales主要作用于磷循环过程，有利于提升作物对磷素的吸收水平。结合以上几种关键内生菌在作物生理生化过程中起到的重要作用，本实施例证明g-C3N4在提升植物根部促生内生菌相对丰度过程中起到的关键作用。
Claims (7)
1.一种植物内生菌的调理方法，其特征在于，包括以下步骤：
将石墨相氮化碳(g-C3N4)与土壤、蛭石混匀形成调理剂施用于植物根部，所述调理剂中g-C3N4浓度为100-250mg/kg，蛭石添加量为所用土壤的1/3(v/v)。
2.根据权利要求1所述的调理方法，其特征在于，所述蛭石为层状结构，平均粒径为2-4mm。
3.根据权利要求1所述的调理方法，其特征在于，所述土壤为风干、筛分后平均粒径<2mm的干土。
4.根据权利要求1所述的调理方法，其特征在于，所述g-C3N4呈层状结构，厚度为3-7nm。
5.根据权利要求1所述的调理方法，其特征在于，所述调理方法能够提升植物益生菌相对丰度，增强植物内生菌多样性。
6.根据权利要求1所述的调理方法，其特征在于，所述植物内生菌包括Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Streptomyces、Tepidisphaera、Saccharimonadales和Thermosporothrix。
7.根据权利要求1所述的调理方法，其特征在于，其中所述g-C3N4通过以下步骤制得：
在管式炉中将尿素在氮气环境中以5℃/min的升温速度加热至550℃，并在550℃下保温4h；将合成的g-C3N4冷却至室温，用去离子水洗涤三次；随后将g-C3N4在冻干机中冷冻干燥。
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