CN116694624A - 一种常温快速提取粪便核酸的提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种常温快速提取粪便核酸的提取试剂盒及提取方法，其包括裂解结合液、除杂液和碱性溶液；所述除杂液，包括质量浓度为5‑10％的硫酸铝铵和质量浓度为1‑3％的正辛醇；所述碱性溶液，其OH‑的浓度为10‑30mM；该提取试剂盒提取的粪便DNA纯度高且浓度可达455ng/ul以上，能够实现粪便样品经除杂后裂解结合同步进行，提取时间约25min且提取率高于市售DNA提取试剂盒。本发明提供的粪便核酸提取方法，预处理过程能够特异性吸附除去腐殖酸，而对DNA影响小且裂解过程无需与蛋白酶K结合使用，常温即可提取粪便DNA，能够避免高温对DNA分子结构的破环。

Description

一种常温快速提取粪便核酸的提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明属于核酸提取领域，更具体地，涉及一种常温快速提取粪便核酸的提取试剂盒及提取方法。
背景技术
粪便样本是肠道疾病研究和肠道临床检测的重要样本来源。研究表明，粪便样本中含有大量消化道脱落细胞及游离核酸，其中脱落细胞和游离核酸常常被用于结直肠癌等消化道疾病的分子初筛普查。目前常用的核酸提取方法是磁珠提取法，与之配套的核酸提取试剂盒也是应用广泛，但现有市售的粪便核酸提取试剂盒的提取率一般较低。
磁珠法提取核酸通常分为四步:裂解--结合--洗涤--洗脱，如专利CN 107937391A人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液、及其制备方法和应用和专利CN 114107289 A粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法。现有研究中已有提取试剂能够将裂解和结合同步进行，如专利CN 116179540A一种粪便DNA提取试剂盒及粪便DNA提取方法，在提取过程中无需再添加结合液，但粪便成分复杂，除肠道脱落细胞及游离核酸外，还含有腐殖酸、微生物、蛋白质、无机盐、脂肪及未消化的食物纤维，而一般常规分离提纯核酸技术并不能有效地去除这些杂质，尤其是腐殖酸(Humic acid，HA)，这主要是因为腐殖酸与DNA具有相似的理化性质，在水相中容易与DNA共提取，而腐殖酸的残留会严重影响提取的DNA的浓度和纯度。虽然专利CN 114231526 A一种高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，在样本预处理过程中添加缓冲液，以缓冲液中的聚合氯化铝作为絮凝剂，吸附样本中的腐殖酸，但最终提取的DNA浓度较低(DNA浓度小于60ng/ul)。因此，研究一种能够提取纯度和浓度均较高的粪便DNA提取试剂盒具有重要意义，利于快速从粪便样本中提取高质量核酸，尤其是能够快速从粪便样本中高丰度提取纯的DNA。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种常温快速提取粪便核酸的提取试剂盒及提取方法，其目的在于意外发现在粪便样本预处理中添加10-30mM NaOH、质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和质量浓度为1-3％的正辛醇，能够对粪便中腐殖酸有很好吸附作用而其对核酸吸附能力差，提取的DNA纯度高(A260/A280大于1.8)；基于磁珠法提取粪便DNA时，添加裂解结合液能够实现粪便样品经除杂后裂解结合同步进行，提取的DNA浓度可达455ng/ul以上，且常温即可提取粪便DNA，由此解决现有磁珠法核酸提取试剂盒提取粪便DNA，其提取浓度和纯度较低的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种常温快速提取粪便DNA的提取试剂盒，其包括裂解结合液、除杂液和碱性溶液；所述除杂液，包括质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和质量浓度为1-3％的正辛醇；所述碱性溶液，其OH-的浓度为10-30mM。
优选地，所述粪便DNA提取试剂盒，其所述除杂液中硫酸铝铵质量浓度为8-10％、正辛醇质量浓度为2-3％；所述碱性溶液包括10-30mM NaOH。
优选地，所述粪便DNA提取试剂盒，其所述裂解结合液包括2-3mol/L异硫氰酸胍、50-100mmol/L的Tris-HCl、15-20mmol/L的重金属螯合剂、1-2mol/L的NaCl、质量浓度为5-12％的PEG6000。
优选地，所述粪便DNA提取试剂盒，其所述NaCl浓度为1mol/L、PEG6000质量浓度为10-12％。
优选地，所述粪便DNA提取试剂盒，其还包括粪便保存液、磁珠悬浮液、洗涤液和洗脱液。
优选地，所述粪便DNA提取试剂盒，其所述磁珠悬浮液为二氧化硅表面磁珠，磁珠粒径为50-200nm，浓度50-100mg/ml；所述粪便保存液为PBS缓冲液，pH为7.2-7.4。
按照本发明的另一方面，还提供了一种常温快速提取粪便DNA的方法，其包括以下步骤：
将获得的粪便样本与粪便保存液充分混合，离心获得上清液1；
向获得的上清液1中按照1g粪便样本加入10-100ul除杂液，混合吸附样本中腐殖酸，再加入碱性溶液直至无絮状沉淀形成，离心获得上清液2；所述除杂液包括质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和质量浓度为1-3％的正辛醇；所述碱性溶液，其OH-的浓度为10-30mM；
在常温条件下，向获得的上清液2中同时加入裂解结合液和磁珠悬浮液，形成DNA-磁珠复合物后再加洗涤液洗涤、洗脱液洗脱，获得粪便DNA。
优选地，所述常温快速提取粪便DNA的方法，其所述裂解结合液为2-3mol/L异硫氰酸胍、100mmol/L的Tris-HCl、20mM的乙二胺四乙酸、1mol/L的NaCl、10-12％的PEG6000。
优选地，所述常温快速提取粪便DNA的方法，其所述磁珠悬浮液为二氧化硅表面磁珠悬浮液，磁珠粒径为50-200nm，浓度为50-100mg/ml。
优选地，所述常温快速提取粪便DNA的方法，其当粪便样本为固态粪便时，按照粪便质量与粪便保存液体积比为1:5混合；当粪便样本为粪便悬浊液时，按照粪便悬浊液与粪便保存液体积为2:3混合。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
由于本发明提供的提取试剂盒，在粪便样本预处理中添加质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和质量浓度为1-3％的正辛醇，其对杂质腐殖酸的吸附作用强，其对腐殖酸的吸附效果显著优于10％的硫酸铝铵，且对核酸的吸附作用差，可特异性吸附腐殖酸，而添加的OH-与硫酸铝铵反应生成氢氧化铝，能够使被吸附的腐殖酸随形成的絮状沉淀而彻底除去，提取的DNA纯度高(A260/A280大于1.8)，采用该提取试剂盒提取的粪便DNA，其浓度可达455ng/ul以上。
另外其裂解结合液能够实现粪便样品经除杂后裂解结合同步进行，利于缩短粪便DNA的提取时间，能够将现有的提取时间由65min缩短至25min，试剂成分简单、利于降低成本，采用本发明提供的核酸提取试剂盒提取的粪便DNA的纯度高，且与现有市售粪便DNA提取试剂盒相比，其提取的DNA量更高，应用前景广阔。
附图说明
图1是本发明的粪便DNA提取试剂盒与市售DNA提取试剂盒提取效果比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
采用磁珠法提取核酸，核酸的提取率和提取纯度主要受预处理和提取液如裂解液、结合液等的影响，若提取的核酸量和纯度不高，不但不能有效的检出，甚至还会影响检测结果的判断。尤其是粪便样本，成分复杂、杂质多，其中的腐殖酸分子富含羧基，是一种酸性聚电解质，可在溶液中电离为阴离子；而常规的核酸提取在沉淀DNA步骤中，添加的助沉剂如无水乙醇会竞争腐殖酸周围的水分子，大量单价阳离子如Na+可以中和腐殖酸分子上的负电荷，降低腐殖酸分子之间的排斥力，可促进腐殖酸和DNA的聚集和共沉淀。
为除去样品中的腐殖酸，一般通过添加絮凝剂如硫酸铝铵吸附腐殖酸而除去，但是絮凝剂同时也会吸附核酸，导致絮凝过程核酸沉淀，造成提取的DNA量少。为减少絮凝剂对DNA的吸附，专利CN 115532242 A腐殖酸吸附剂及其制备方法土壤DNA提取试剂盒，提供了一种由蛋白质复合物(植物蛋白粉、硫酸铝铵和氢氧化钠)、盐酸胍和水组成的腐殖酸吸附剂，其中蛋白粉是降低腐殖酸吸附剂吸附核酸的关键，而盐酸胍浓度会影响蛋白质复合物的稳定性，从而影响蛋白质复合物选择性吸收效果，可见，其对粪便样本中的腐殖酸的吸附效果尚不清楚。
本发明发现在粪便样品预处理中添加10-30mM NaOH、5-10％的硫酸铝铵和1-3％的正辛醇，能够对粪便样本中的腐殖酸有很好的吸附除去而对核酸吸附效果差，且其对腐殖酸的吸附效果显著优于硫酸铝铵，测定的A260/A280大于1.8，说明提取的DNA纯度高；粪便样品经预处理后添加裂解结合液可实现裂解结合同步进行，优选的裂解结合液为2-3M异硫氰酸胍、50-100mM的Tris-HCl、15-20mM的重金属螯合剂、1-2M的NaCl、质量浓度为5-12％的PEG6000，能够使得基于磁珠法提取的粪便DNA的纯度和浓度均较高，且常温即可提取粪便DNA。
尤其是裂解结合液为2-3M异硫氰酸胍、100mM的Tris-HCl、20mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、1M的NaCl、10-12％的PEG6000，采用该裂解结合液与二氧化硅表面磁珠配合提取DNA，获得的粪便DNA浓度可达455ng/ul以上，且仅需25min即可完成一个样本的提取。
基于上述发现，本发明提供了一种常温快速提取粪便DNA的提取试剂盒，其包括裂解结合液、除杂液和碱性溶液；所述除杂液包括质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和质量浓度为1-3％正辛醇，所述碱性溶液，其OH-的浓度为10-30mM，其中碱性溶液与硫酸铝铵分开存放。
实验结果表明，在粪便样本预处理过程中添加质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和1-3％的正辛醇，其对粪便样品中腐殖酸的吸附效果显著优于硫酸铝铵，而对核酸的吸附效果差，而碱性溶液的添加能够与硫酸铝铵反应生成氢氧化铝，使吸附的腐殖酸随之絮凝沉淀而彻底除去。
优选，所述硫酸铝铵的质量浓度为8-10％，所述正辛醇的质量浓度为2-3％，硫酸铝铵和正辛醇浓度较高，利于吸附粪便样品中的腐殖酸等杂质。
在一些实施例中所述碱性溶液包括10-30mM NaOH。
优选所述裂解结合液为2-3M异硫氰酸胍、50-100mM的Tris-HCl、15-20mM的重金属螯合剂、1-2M的NaCl、质量浓度为5-12％的PEG6000，pH为7-8。
在本发明提供的裂解结合液体系下，2-3M异硫氰酸胍足够使细胞裂解释放核酸，同时使蛋白质变性、多糖沉淀，进而释放DNA，而15-20mM的重金属螯合剂能够结合酶所必需的Ca2+、Mg2+等金属离子，进而抑制核酸酶的活性，避免释放出来的DNA被核酸酶分解，利于保护提取的DNA分子不被降解；5-12％的PEG6000和1-2M的NaCl能够起到促进释放后的核酸与磁珠结合，可起到协同作用，实现边裂解边结合，利于提取高丰度的DNA。该裂解结合液与二氧化硅表面磁珠配合使用，能够使粪便样品经除杂后裂解结合同步进行，能够快速提取纯度和浓度较高的粪便DNA。另外，本发明提供的裂解结合液成分简单，有机试剂较少，利于减少裂解结合过程中有机试剂对DNA分子的破环或吸附，利于提取高质量的DNA。
所述金属螯合剂，包括乙二胺四乙酸(EDTA)。
优选，所述裂解结合液中异硫氰酸胍浓度为2-3M、PEG6000质量浓度为10-12％、Tris-HCl的浓度为100mM、NaCl浓度为1M。
进一步地，所述粪便DNA提取试剂盒，还包括磁珠悬浮液、洗涤液和洗脱液；
在一些实施例中所述磁珠悬浮液为二氧化硅表面磁珠悬浮液，磁珠浓度为50mg/ml，粒径为50-200nm。
在一些实施例中所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，其中洗涤液1为2M的盐酸胍和50％的无水乙醇，洗涤液2为75％的无水乙醇；所述洗脱液为无核酸酶的灭菌去离子水。
优选所述DNA提取试剂盒还包括粪便保存液，所述粪便保存液为PBS缓冲液(pH：7.2-7.4)，具体按照NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmolL、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L配制获得。
实验表明，采用本发明提供的粪便DNA提取试剂盒，在粪便样本预处理时，其除杂液能够很好吸附杂质腐殖酸而对DNA吸附作用差，OH-的添加能够与硫酸铝铵反应生成氢氧化铝，使吸附的腐殖酸随之絮凝沉淀而彻底除去；其裂解结合液与磁珠配合使用能够特异性结合粪便DNA，能够实现粪便样品经除杂后裂解结合同步进行，且裂解过程无需添加蛋白酶K，结合过程无需再额外添加结合液，即可常温快速提取核酸，尤其是磁珠为二氧化硅表面磁珠，粒径为50-200nm，二氧化硅表面磁珠悬浮性好，抗干扰结合能力强，利于提取高质量DNA。
另外，本发明还提供了一种粪便样本DNA的提取方法，其包括以下步骤：
(1)粪便样本预处理：将获取的粪便样本与粪便保存液混合，离心获取上清液1；向获得的上清液1中先添加除杂液后添加碱性溶液，直至无絮状沉淀形成，离心获取上清液2，即为除去腐殖酸等杂质后的待提取样本；
在一些实施例中按照1g粪便样本添加10-100μL除杂液；所述除杂液包括质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和质量浓度为1-3％的正辛醇；所述碱性溶液，其OH-的浓度为10-30mM。
在一些实施例中所述粪便保存液为PBS缓冲液，pH：7.2～7.4，当粪便样本为固态粪便时，按照粪便质量与粪便保存液体积比为1:5混合；当粪便样本为粪便悬浊液时，按照粪便悬浊液与粪便保存液体积为2:3混合。
所述PBS缓冲液(pH7.2-7.4)，具体按照NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmolL、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L配制获得。
(2)常温提取粪便核酸：向步骤(1)获得的上清液2中同时加入裂解结合液和磁珠悬浮液，充分混匀裂解，同时使游离出来的核酸结合在磁珠表面，再经洗涤液洗涤、洗脱液洗脱，获得粪便DNA。
在一些实施例中按照上清液2：裂解结合液：磁珠悬浮液的体积比为400：500：20加入混合，使裂解结合同步进行；所述裂解结合液为2-3mol/L异硫氰酸胍、100mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的乙二胺四乙酸、1mol/L的NaCl、质量浓度为10-12％的PEG6000；所述磁珠悬浮液为二氧化硅表面磁珠悬浮液，磁珠粒径为50-200nm，浓度50-100mg/ml。
在一些实施例中所述洗涤液包括洗涤液1和洗涤液2，其中洗涤液1为2M的盐酸胍和50％的无水乙醇，洗涤液2为75％的无水乙醇；所述洗脱液为无核酸酶的灭菌去离子水。
以下为实施例：
实施例1常温快速提取DNA的提取试剂盒
本发明提供的提取试剂盒包括但不仅限于如下配比：
本实施例中提取试剂盒包括裂解结合液、除杂液和碱性溶液；
其中所述裂解结合液为2mol/L异硫氰酸胍、100mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、1mol/L的NaCl、质量浓度为10％的PEG6000(聚乙二醇6000)；碱性溶液为10mM NaOH；除杂液为质量浓度为5％的硫酸铝铵和质量浓度为1％的正辛醇的混合液，硫酸铝铵和正辛醇也可以单独存放，只要碱性溶液与硫酸铝铵在使用前不共存即可。
对比例1
提取试剂盒包括裂解结合液、除杂液和碱性溶液；
其中裂解结合液为2mol/L异硫氰酸胍、100mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、1mol/L的NaCl、质量浓度为10％的PEG6000(聚乙二醇6000)；碱性溶液为10mM NaOH；除杂液为质量浓度为10％的硫酸铝铵溶液。
对比例2
提取试剂盒包括裂解结合液、除杂液；
其中裂解结合液为2mol/L异硫氰酸胍、100mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、1mol/L的NaCl、质量浓度为10％的PEG6000(聚乙二醇6000)；除杂液为质量浓度为1％的正辛醇溶液。
对比例3
提取试剂盒包括裂解结合液；
其中裂解结合液为2mol/L异硫氰酸胍、100mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、1mol/L的NaCl、质量浓度为10％的PEG6000(聚乙二醇6000)。
实施例2粪便DNA的提取
分别采用实施例1和对比例1-3中的提取试剂盒对同一粪便样本进行核酸提取，并结合磁珠法和自动核酸提取仪，每种提取试剂盒分别提取两个粪便样本的基因组DNA，具体的包括如下步骤：
(1)粪便样本的预处理：
称取0.1g固态粪便样本转移至一个干净的离心管，向离心管加入500μL粪便保存液，3mm钢珠或者锆珠进行匀浆处理，充分震荡混匀至肉眼无可见的粪便颗粒即可，再12000rpm离心2-5min，取上清液；
在本实施例中固态粪便样本也可以为保存的粪便液，即充分混匀保存的粪便液，悬浮后，取200μL粪便悬浊液，向其中加入300μL的粪便保存液，3mm钢珠或者锆珠进行匀浆处理，充分震荡混匀至肉眼无可见的粪便颗粒即可，再12000rpm离心2-5min，取上清液。
上述粪便保存液为PBS缓冲液(pH7.2-7.4)，具体按照如下配制获得：
1L的PBS缓冲液中NaCl 137mmol、KCl 2.7mmol、Na2HPO4 4.3mmol、KH2PO41.4mmol，并调至pH为7.4。
向上述获得的上清液中加入除杂液用于吸附腐殖酸，其中采用实施例1或对比例1中提取试剂，先加除杂液混匀吸附腐殖酸后再加入NaOH溶液直至无絮状沉淀产生，NaOH溶液加入后会与硫酸铝铵反应生成氢氧化铝絮凝沉淀进而彻底除去腐殖酸，12000 rpm离心3-5 min，取上清液待提取。在本实施例中按照粪便质量0.1g添加1-10μL除杂液于上清液中。
(2)磁珠法一步提取DNA：使用NanoMagBio S-48自动核酸提取仪提取DNA，具体如下：
取400μL(1)获得的上清液到裂解结合液&磁珠板中(预分装试剂省略此步)非预分装试剂请于裂解开始后，分装各组分(使用前务必充分摇匀)到不同的深孔板中，按裂解结合液&磁珠500μL/孔(1-7)、洗涤液Ⅰ600μL/孔(2-8)、洗涤液Ⅱ600μL/孔(3-9列)、洗脱液100μL/孔分液(5-11列)，将深孔板放在仪器的卡槽中，放好搅拌套，运行程序；
上述洗涤液I为由2M的盐酸胍和50％的无水乙醇组成；洗涤液Ⅱ为由75％的无水乙醇组成；洗脱液为无核酸酶的灭菌去离子水，磁珠为二氧化硅表面磁珠悬浮液，磁珠浓度为50mg/ml，粒径为50-200nm；在本实例中洗涤液I和洗涤液Ⅱ以及洗脱液还可以采用现有的任一一种，只要提取的DNA符合提取要求即可。
自动化程序结束后，将第5、11列的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中，即为提取的粪便样本的DNA，所需提取时间仅需25min。
上述提取DNA浓度测定结果具体如下表1所示：
表1不同提取试剂盒提取的DNA纯度和浓度比较
蛋白质在280 nm处的紫外光吸收达到了最大值，核酸在240～290 nm的紫外波段有一个强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm左右，而蛋白质在这一区域有很弱的吸收，230nm处是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。A260/A280、A260/A230是核酸纯度的指示值，通常纯净DNA的样品A260/A280大于1.8，A260/A230大于2.0。一般A260/A280比值低于1.8，表示存在蛋白质或者酚类物质等杂质，A260/A230小于2.0，表示存在碳水化合物、盐类、有机溶剂等杂质，即提取的核酸不够纯。
由表1可知，四种提取试剂盒中的裂解结合液均能够在不添加蛋白酶K和结合液的条件下提取DNA，实现裂解和结合同步进行，但是提取的DNA纯度和浓度存在明显差异，其中采用实施例1和对比例1中的除杂液预处理后粪便样品提取的DNA纯度较高(A260/A280大于1.8)，但是对比例1裂解结合液提取的DNA浓度低，主要是硫酸铝铵吸附腐殖酸时也会吸附样品中的核酸，可见本发明提供的提取试剂盒能够减少硫酸铝铵对DNA的吸附，可保留更多目标提取物。
硫酸铝铵是常用的絮凝剂，一般随着添加浓度的增大其吸附杂质如腐殖酸的效果越好，而对比实施例1和对比例1中的提取试剂可知，本发明提取试剂盒中质量浓度为5％的硫酸铝铵和1％的正辛醇的除杂液的除杂效果明显优于质量浓度为10％的硫酸铝铵，而由对比例2可知，仅添加质量浓度为1％的正辛醇溶液除杂效果差，提取的DNA纯度低，可见硫酸铝铵和正辛醇起到了协同作用。
在本实施例中所需提取时间仅需25min，相比现有裂解和结合分步提取的时间65min(还需添加蛋白酶K)，本发明提供的裂解结合液能够显著地缩短粪便DNA提取时间，且能够在常温条件下提取，利于保证DNA的完整性，其提取的粪便DNA的浓度可达486.23ng/ul，提取率高。
实施例3DNA提取试剂盒
所述DNA提取试剂盒，包括裂解结合液、除杂液、碱性溶液、100mg/ml的二氧化硅表面磁珠悬浮液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液和粪便保存液；
其中裂解结合液为3mol/L异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、15mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)、1mol/L的NaCl、12％的PEG6000；除杂液为质量浓度为8％的硫酸铝铵和质量浓度为2％的正辛醇的混合溶液；碱性溶液为10mM NaOH；洗涤液1为2M的盐酸胍和50％的无水乙醇，洗涤液2为75％的无水乙醇，洗脱液为无核酸酶的灭菌去离子水。
所述粪便保存液为PBS缓冲液(pH7.2-7.4)，具体的按照NaCl 137mmol/L、KCl2.7mmolL、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L配制而成。
实施例4不同粪便DNA提取试剂盒提取效果的比较
本实施例比较本发明提供的DNA提取试剂盒与3种市售DNA提取试剂盒对粪便样本DNA的提取效果，具体如下：
DNA提取试剂盒1：包括裂解结合液、除杂液、碱性溶液、磁珠悬浮液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；
其中裂解结合液为2mol/L异硫氰酸胍、100mmol/L的Tris-HCl、20mM的EDTA(乙二胺四乙酸)、1mol/L的NaCl、10％的PEG6000；
除杂液为质量浓度为5％的硫酸铝铵和1％的正辛醇混合液；碱性溶液为10mMNaOH；
磁珠悬浮液为粒径为50-200nm、浓度为50mg/ml的二氧化硅表面磁珠悬浮液；洗涤液1为2M的盐酸胍和50％的无水乙醇，洗涤液2为75％的无水乙醇；洗脱液为无核酸酶的灭菌去离子水。
DNA提取试剂盒2：磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒(DP712)，厂家：天根生化科技(北京)有限公司，该试剂盒中结合液为异丙醇；
DNA提取试剂盒3：磁珠法土壤与粪便DNA提取试剂盒(CW2556)，厂家：康伟世纪，该试剂盒中结合液为异丙醇；
DNA提取试剂盒4：磁珠粪便DNA提取试剂盒(D6358)，厂家：广州美基生物科技有限公司，该试剂盒中结合液为异丙醇；
粪便样本DNA提取：DNA提取试剂盒1提取同实施例2，DNA提取试剂盒2-4按相应说明书进行提取。
上述4种试剂盒提取粪便DNA结果如图1所示。
由图1可知，采用本发明提供的粪便DNA提取试剂盒，提取的DNA含量更高，提取率相比市售试剂盒更高。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种常温快速提取粪便DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液、除杂液和碱性溶液；所述除杂液，包括质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和质量浓度为1-3％的正辛醇；所述碱性溶液，其OH-的浓度为10-30mM。
2.如权利要求1所述的粪便DNA提取试剂盒，其特征在于，所述除杂液中硫酸铝铵质量浓度为8-10％、正辛醇质量浓度为2-3％；所述碱性溶液包括10-30mM NaOH。
3.如权利要求1或2所述的粪便DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液包括2-3mol/L异硫氰酸胍、50-100mmol/L的Tris-HCl、15-20mmol/L的重金属螯合剂、1-2mol/L的NaCl、质量浓度为5-12％的PEG6000。
4.如权利要求3所述的粪便DNA提取试剂盒，其特征在于，所述NaCl浓度为1mol/L、PEG6000质量浓度为10-12％。
5.如权利要求1至4任意一项所述的粪便DNA提取试剂盒，其特征在于，还包括粪便保存液、磁珠悬浮液、洗涤液和洗脱液。
6.如权利要求5所述的粪便DNA提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液为二氧化硅表面磁珠，磁珠粒径为50-200nm，浓度50-100mg/ml；所述粪便保存液为PBS缓冲液，pH为7.2-7.4。
7.一种常温快速提取粪便DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将获得的粪便样本与粪便保存液充分混合，离心获得上清液1；
向获得的上清液1中按照1g粪便样本加入10-100ul除杂液，混合吸附样本中腐殖酸，再加入碱性溶液直至无絮状沉淀形成，离心获得上清液2；所述除杂液包括质量浓度为5-10％的硫酸铝铵和质量浓度为1-3％的正辛醇；所述碱性溶液，其OH-的浓度为10-30mM；
在常温条件下，向获得的上清液2中同时加入裂解结合液和磁珠悬浮液，形成DNA-磁珠复合物后再加洗涤液洗涤、洗脱液洗脱，获得粪便DNA。
8.如权利要求7所述的常温快速提取粪便DNA的方法，其特征在于，所述裂解结合液为2-3mol/L异硫氰酸胍、100mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的乙二胺四乙酸、1mol/L的NaCl、质量浓度为10-12％的PEG6000。
9.如权利要求7所述的常温快速提取粪便DNA的方法，其特征在于，所述磁珠悬浮液为二氧化硅表面磁珠悬浮液，磁珠粒径为50-200nm，浓度50-100mg/ml。
10.如权利要求7所述的常温快速提取粪便DNA的方法，其特征在于，当粪便样本为固态粪便时，按照粪便质量与粪便保存液体积比为1:5混合；当粪便样本为粪便悬浊液时，按照粪便悬浊液与粪便保存液体积为2:3混合。
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