CN116529386A - 治疗诊断学探针及其用于靶向和/或标记egfr激酶和/或表达egfr家族成员细胞的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗诊断学探针及其用于靶向和/或标记EGFR激酶和/或表达EGFR家族成员细胞的应用。

Description

治疗诊断学探针及其用于靶向和/或标记EGFR激酶和/或表达 EGFR家族成员细胞的应用
技术领域
靶向和/或标记EGFR激酶和/或表达EGFR家族成员细胞的探针在临床诊断及治疗方面的应用。
背景技术
2018年，据估计全世界960万的病人死于癌症，然而如能进行早期诊断、及时监测病情进程和治疗反应，将会极大改善这些患者的存活率和生存质量。近些年来，对病人的血液和体液的检测技术发展迅速。与传统的组织活检相比，液体活检具有非侵入性和低成本的优点，可以多次实施追踪癌症进展，对于经济困难且有严重并发症的患者尤其重要。
液体活检依赖于肿瘤标记物的检测，包括循环肿瘤细胞及其DNA，或者过表达的蛋白标记物。目前，循环肿瘤细胞的检测需要先用免疫筛选或微流控技术进行富集，然后将富集的细胞进行基因组、转录组、及甲基化组的综合分析，评估和监测癌变的驱动因素、进展与转移程度。这两步法策略可应用于不同肿瘤的诊断。但其特异性和效率不高，尤其是在已经确定致癌标志物的情况下。另一方面，目前用于CTC免疫分类的抗体，具有广谱识别多种肿瘤细胞的特点，但它们不能监测细胞内致癌驱动因子的突变，也不能识别致癌驱动因子的构象变化。而这些致癌驱动因子的突变或构象变化往往是决定靶向药物治疗窗口和耐药性的关键。
例如，大约20％的非小细胞肺癌(NSCLC)与EGFR的细胞内激酶结构域突变有关。EGFR靶向抑制剂通常对激酶的某些突变状态敏感。而EGFR激酶的二次突变会导致对这些抑制剂的耐药性。因此，有必要开发新的方法，来有效富集肿瘤细胞并报告致癌生物标志物的突变状态。
EGFR与其同源蛋白HER2、HER3、HER4同属于受体酪氨酸激酶家族。它们在细胞的生长、分化、迁移中起着重要作用，并与多种癌症的发生、发展与转移密切相关，成为治疗这些癌症的关键靶点。EGFR的胞内激酶活性是通过配体诱导的受体二聚化，以浓度依赖的方式激活。伴随着激酶活性的变化，激酶的构象也发生改变。在没有配体结合时，受体的激酶域处于自抑制的、非激活状态(图3)。此时，激酶的α-C螺旋外摆，而活化环(Activation loop)向内折叠，阻挡了底物的结合。而当配体结合后，两个受体的激酶域靠近，形成类似Cyclin/CDK结合形式的非对称、激活态二聚体。此时，一个激酶作为激活的供体(Activator)将另一个激酶稳定在激活构象。处于激活构象的激酶，其α-C螺旋内摆，活化环向外伸展，便于底物的结合与磷酸化。致癌突变或EGFR的异常高表达会通过稳定激酶的激活态、或破坏激酶的非激活态等多种方式来使激酶活性失调。而EGFR的激酶抑制剂则通过竞争性抑制ATP的结合来抑制激酶的活性，并被广泛用于多种癌症的治疗。这些激酶抑制剂对于激酶的构象具有选择性，包括吉非替尼和PD168393，对EGFR的某些突变体非常敏感，可以用来报告激酶的突变或构象改变的状态。
前列腺癌是在男性恶性肿瘤中致死率最高的一种。2018年全世界前列腺癌确诊人数为120万，死亡人数为35.9万。而中国前列腺癌的发病率和死亡率近年呈明显上升趋势，且新确诊患者中癌症晚期比例高于欧、美国家。因此，如能早期诊断、及时监测病情进程和治疗反应将会极大改善这些患者的存活率和生存质量。
当前，超声或磁共振影像(MRI)引导的靶向穿刺活检是前列腺癌诊断的金标准，在临床上得到了广泛应用。在穿刺时，为防止漏检，需要对可疑灶进行多位点采样，然后对采集到的组织样本进行组化等染色分析。然而，这种有创的穿刺活检会导致血尿、血便、术后感染、迷走神经反射等一系列并发症。并且，由于采样的稀疏性，还会导致遗漏微小病灶和无法全面监测癌症进展状况的可能。因此，各种癌症液体活检技术应运而生。
癌症液体活检技术是通过收集患者的体液或血液来检测其中游离的癌症生物标志物。目前，用于癌症检测的生物标志物包括：循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞、或过表达的蛋白标志物。其中，循环肿瘤细胞是一些游离在体液或血液中的脱落的肿瘤细胞。这些循环肿瘤细胞的数量直接与肿瘤恶变程度及治疗预后相关，然而其特异性和效率不高。目前用于CTC免疫分类的抗体通常能够靶向许多不同种类癌症上的抗原。但这些抗体不能报告细胞内的突变或与肿瘤发生相关的生物标志物的构象改变。而这种突变或构象的改变在治疗窗口的选择及耐药性问题上往往是最关键的。因此，有必要开发一种新的方法，能够高效富集肿瘤细胞，并报告致癌生物标志物的突变状态，用于诊断和治疗。
另一方面，肿瘤细胞的表达或突变基因图谱不能直接转化为治疗策略，根据这些数据设计的临床试验在实践中可能会失败。例如，三分之一的前列腺癌患者都观察到EGFR过表达，并且EGFR过表达与前列腺癌的生化复发和激素难治状态有关。此外，有报道称EGFR突变与前列腺癌的加速发展有关。EGFR异常与前列腺癌进展之间的联系促使临床使用EGFR抑制剂治疗EGFR过表达的激素难治性患者。然而，多个中心的临床治疗失败了，这表明需要进一步对其致病机理进行研究，开发更精准的分型策略。
发明内容
我们基于结构设计开发了针对特定构象EGFR的模块化治疗型探针。我们展示了如何通过竞争实验筛选抑制剂，并对EGFR过表达或突变的细胞进行筛选及成像。有趣的是，我们发现D168393对一种活化的二聚体响应性更强，该构象不同于之前发现的非对称激活二聚体。
在这里，我们还设计了一种不可逆结合表皮生长因子受体(EGFR)激酶的模块化荧光探针。该探针可以以浓度依赖的方式特异性抑制EGFR激酶活性，通过流式细胞术选择性标记EGFR过表达细胞，与含致癌突变的EGFR结合敏感，并且优先与一种处于中间态的激酶二聚体结合，这种二聚体区别于经典的激活态非对称二聚体。
在第一个部分，本申请书以公式(1)呈现了这种诊断和治疗的探针：
模块2-L-模块1
(1)
其中，
L是一段链接子
模块1是一个靶向EGFR激酶的部分；以及
模块2是可选择的用来成像的探针，包括荧光探针，核磁共振和放射性探针；或者是可用于治疗的盐。
在第一部分的一个示例中，L是-C(O)O-or-C(O)NH-。
在第一部分另一个示例中，模块1是一种EGFR的激酶抑制剂。
在第一部分另一个示例中，模块1由公式表示(2):
其中
公式(2)中的R1是H，卤素(例如，F、Cl或Br)或C2-6炔基(例如，乙炔基)；
公式(2)中的R2是H，卤素(例如，F、Cl或Br)，C6-10芳香基C1-6烷氧基(例如，苯基甲氧基)或者5到6元杂芳香基C1-6烷氧基(例如，吡啶甲氧基，尤其是吡啶-2-甲氧基)，其中C6-10芳香基和5到6元杂芳香基可以被卤素(F、Cl或Br)取代(例如，公式(2)中的R2是3-氟苯基甲氧基)，而且5到6元杂芳香基包含1、2、3或4个选自O、S、N的杂原子；
公式(2)中的R3是H，任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基(例如，在公式(2)中的R3是甲氧基，乙氧基或甲氧基乙氧基)，5到6元杂环烷基氧基(例如，四氢呋喃氧基，特别是四氢呋喃-3-基氧基)，其中5到6元杂环烷基包括选自O、S和N的1到2个杂原子；
公式(2)中的R4，是模块1到L的连接点，是-(CH2)n-；而且n在公式(2)中可以是0，1，2，3，4，5或6。
在第一部分另一个示例中，模块2用公式(3)和公式(4)表示：
其中
公式(3)或公式(4)中的R1，是模块2到L的连接点，为-(CH2)n-；
公式(3)或公式(4)中的R2是-(CH2)nCH3；以及公式(3)或公式(4)中的n可以是独立的0，1，2，3，4，5或6；或者模块2由公式(5)或公式(6)表示：
其中
公式(5)或公式(6)中符号*表示模块2与L的连接点；公式(5)中的n分别为0，1，2，3，4，5或6；
其中，必要时，存在一种反离子。这可以是碱金属和碱土金属离子，特别是钠、钾、钙或镁离子组成的组中的一种。
在第一部分另一个示例中，治疗探针用公式(7)表示：
在本文中也被称为PDCy3或化合物2，
其中，必要时，存在一种反离子。这可以是碱金属和碱土金属离子，特别是钠、钾、钙或镁离子组成的组中的一种。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶是野生型的。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶含有L834R突变。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶含有V924R突变。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶含有V745M突变。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶含有两种或三种突变(L834R、V924R、V745M)例如L834R，V924R。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶呈现二聚化构象。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶呈现为野生型EGFR激酶二聚体样的构象。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶呈现为具有L834R突变的EGFR激酶二聚体样的构象。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶呈现为具有V924R突变的EGFR激酶二聚体样的构象。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶呈现为具有V745M突变的EGFR激酶二聚体样的构象。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶呈现含有L834R、V924R、V745M之中两种或三种突变的激酶二聚体构象，例如L834R，V924R。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶与肿瘤发生相关，尤其是转移性的，去势抵抗性的前列腺癌。
在第一部分另一个示例中，EGFR激酶的构象与肿瘤发生相关，尤其是转移性和/或去势抵抗性的前列腺癌。
在第二个部分中，本申请提供了用于诊断或治疗的探针，该探针是第一部分中所描述的用于靶向和/或标记EGFR激酶和/或表达EGFR家族成员细胞。
在第二部分另一个示例中，如第一部分所定义的治疗和诊断探针用来靶向和/或标记EGFR激酶。在第二部分另一个示例中，如第一部分所定义的治疗和诊断探针在高通量筛选平台上用来靶向和/或标记EGFR激酶。在第二部分另一个示例中，高通量筛选平台用于开发针对EGFR的抑制剂。
在第二部分另一个示例中，如第一部分所定义的治疗和诊断探针用于靶向和/或标记过表达EGFR或其家族成员的细胞。在第二部分另一个示例中，如第一部分所定义的治疗和诊断探针用于在体液活检中靶向和/或标记过表达EGFR或其家族成员的细胞。在第二部分另一个示例中，体液活检是非入侵性的。在第二部分另一个示例中，体液活检用于检测血液和/或体液中的肿瘤细胞。在第二部分另一个示例中，体液活检用于检测EGFR过表达，EGFR致癌突变和/或肿瘤细胞EGFR突变导致的抗药性。在第二部分另一个示例中，探针用于靶向和/或标记EGFR或其家族成员过表达细胞样品的检测。在第二部分另一个示例中，样品是体液(例如血液或尿液)或者活检组织。在第二部分另一个示例中，样品是尿液。
在第二部分另一个示例中，靶向和/或标记是通过以下步骤进行的：
将EGFR激酶和/或表达EGFR或其家族成员的细胞与治疗探针混合；以及
检测两者之间的结合水平。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶是野生型。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶具有L834R突变。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶具有V924R突变。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶具有V745M突变。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶具有L834R、V924R、V745M之中两种或三种突变，例如L834R，V924R。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶呈现二聚化构象。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶呈现为野生型EGFR激酶二聚体样的构象。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶呈现为具有L834R突变的EGFR激酶二聚体样的构象。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶呈现为具有V924R突变的EGFR激酶二聚体样的构象。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶呈现为具有V745M突变的EGFR激酶二聚体样的构象。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶呈现含有L834R、V924R、V745M之中两种或三种突变的激酶二聚体构象，例如L834R，V924R。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶与肿瘤发生相关，尤其是转移性的，去势抵抗性的前列腺癌。
在第二部分另一个示例中，EGFR激酶的构象与肿瘤发生相关，尤其是转移性和/或去势抵抗性的前列腺癌。
在第三个部分，本申请提供了诊断或治疗的探针在体液活检中的应用，就像在第一部分中描述的那样。
在第三部分的一个示例中，体液活检具有非侵入性。
在第三部分的另一个示例中，体液检测用于血液和/或体液肿瘤细胞的检测。
在第三部分的另一个示例中，体液活检被用于检测EGFR过表达，EGFR致癌突变和/或具有抗药性突变的肿瘤细胞。
在第四个部分，本申请提供了诊断和治疗探针在高通量筛选平台方面的应用，正如第一个部分中描述的。
在第四部分的另一个示例中，高通量筛选平台用于开发针对EGFR的抑制剂。
在第五方面，本本申请提供了在第一方面中定义的用于对患有EGFR过表达导致癌症的患者进行分层的治疗探针的使用。
在第五部分的另一个示例中，癌症是前列腺癌。在第五部分的另一个示例中，癌症具有转移和/或去势抵抗性。
在第五部分的另一个示例中，EGFR具有V745M突变。
在第五部分的另一个示例中，EGFR以二聚体的构象存在。
在第五部分的另一个示例中，EGFR以V745M突变型EGFR的二聚体构象的方式存在。
在第五部分的另一个示例中，分层按以下步骤进行：
将病人的样本与治疗探针混合；并确定两者之间的结合水平。
在第五部分的另一个示例中，样品是体液(例如血液或尿液)或者活检组织。在第五部分的另一个示例中，样品是尿液。
在第六个部分中，本申请在高通量筛选平台方面提供了如第一个部分描述的诊断和治疗的应用。
在第六部分的一个示例中，高通量筛选平台用于开发针对EGFR的抑制剂。
在第六部分的另一个示例中，EGFR激酶是野生型。在第六部分的另一个示例中，EGFR激酶具有L834R、V924R、V745M突变或同时具有其中两种或三种突变，比如L834R，V924R突变。
在第六部分的另一个示例中，EGFR以二聚体的构象存在。在第六部分的另一个示例中，EGFR激酶具有与野生型相同的的二聚化构象。在第六部分的另一个示例中，EGFR激酶具有由单点突变L834R、V924R、V745M或具有其中两种或三种突变形成的二聚化构象。例如L834R，V924R突变。
在第六部分的另一个示例中，EFGR激酶与肿瘤发生相关，尤其是前列腺癌，或转移性和/或去势抵抗性前列腺癌。
在第六部分的另一个示例中，EFGR激酶的构象与肿瘤发生相关，尤其是前列腺癌，或转移性和/或去势抵抗性前列腺癌。
在第六部分的另一个示例中，筛选通过以下步骤进行：纯化的EGFR或者用探针标记的EGFR过表达细胞，然后通过候选抑制剂与纯化的EGFR或EGFR过表达细胞的竞争性结合能力筛选候选的激酶抑制剂。
在第七个部分中，本申请提供了如第一个部分描述的富集EGFR过表达细胞的应用。
在第七部分的一个示例中，细胞过表达野生型EGFR。在第七部分的另一个示例中，细胞表达具有L834R、V924R、V745M突变或具有其中两种或三种突变的EGFR，如L834R，V924R突变。
在第七部分的另一个示例中，EFGR激酶与肿瘤发生相关，尤其是前列腺癌，或转移性和/或去势抵抗性前列腺癌。EFGR激酶的构象与肿瘤发生相关，尤其是前列腺癌，或转移性和/或去势抵抗性前列腺癌。
在第七部分的另一个示例中，富集按照以下步骤：如第一部分所说，用治疗的探针标记EGFR过表达细胞；然后收集EGFR过表达细胞。
本申请可以在不偏离其精神或范围的情况下以任何其他形式体现。本申请包括上述方面和示例的任何和所有组合。需要理解的是，任何示例可以与其它任何示例相结合。还需要理解的是，来自任何示例的单个元素可以与来自任何其他示例的任何和所有其他元素结合，以描述一个额外的示例。
图注
图一，EGFR靶向探针的模块化设计。A)如图用卡通的形式展示了EGFR激酶域的非激活(左，PDB 2GS7)和激活(右，PDB 2GS6)构象。在非激活构象中，激酶的α-C螺旋(青色)外旋，激活环(蓝色)形成一个小的螺旋以稳定α-C螺旋的位置。激活环上的致癌突变L834R用红色高亮显示。在活性构象中两个EGFR激酶形成一个特异性的非对称二聚体，一个作为激活子(浅蓝)稳定另一个(品红色)在激活构象。V924R突变(绿色)可以打破非对称二聚体。B)PD168393与EGFR激酶结合的结构总览(左)和细节(右)。PD168393(金色)结合在EGFR激酶(浅蓝色)的激活位点。PD168393的丙烯酰胺基团指向激酶外侧。与抑制剂相互作用的氨基酸残基用蓝色的棍状表示。C)诊断治疗探针的模块化设计。PD168393(靶向模块)和Cy3(成像模块)通过氨酰键链接。两个模块都可根据不同的应用需求而改变。
图2.PDCy3可特异性抑制EGFR激酶活性。A)PDCy3在DMSO中的荧光光谱。黑色，激发光谱；红色，发射光谱。B)PDCy3对EGFR激酶活性的剂量依赖性抑制。编码EGFR的质粒转染HEK293T细胞后无血清培养基饥饿2天，然后再用EGF,PDCy3或者吉非替尼处理。EGFR的表达和磷酸化水平分别用抗protein C和4G10的抗体检测。C)吉非替尼可以完全抑制PDCy3和EGFR的结合。转染EGFR的细胞用1μM PDCy3，10Nm EGF/1μM PDCy3，或5μM吉非替尼/10nMEGF/1μM PDCy3。通过流式细胞术分析PDCy3的结合和EGFR的表达情况(用528抗体检测)。D)PDCy3与表达EGFR细胞之间相对结合情况。PDCy3的相对结合水平等于PDCy3阳性细胞占比乘以这些细胞的平均荧光强度。条形图显示了三次实验的平均数和标准差。
图3。PDCy3对EGFR表达以及突变细胞结合敏感。A)通过流式细胞术对比不同浓度PDCy3对过表达EGFR的HEK293T细胞的结合。B)PDCy3在1μM作用浓度下，对比其与野生型和突变体EGFR的结合能力。C)以1μM PDCy3与细胞结合情况来反映EGFR突变对探针结合的影响指标。条形图显示了三次实验的平均数和标准差。
图4。EGFR二聚化对PDCy3敏感性的影响。A)通过在EGFR后添加split-YFP设计一个蛋白互补对。通过对受体在细胞表面的二聚化，可以获得重新折叠的YPF结构和恢复的荧光。B)通过上文设计的受体对研究EGFR二聚化与PDCy3结合的关系。每个突变被引入到受体对中。通过流式细胞术在1μM PDCy3作用浓度下检测到两个对PDCy3敏感程度不同的细胞群(标记为AB)。C)根据YFP的强度YFP阳性细胞被分为两个均匀的细胞亚群。PDCy3结合细胞的平均荧光强度和对应的标准差被绘制成这些细胞YFP强度的函数，YFP与EGFR二聚体的表达量相关。D)EGFR致癌突变和不对称二聚的对PDCy3结合的影响。PDCy3敏感细胞的分数根据三次实验计算出来。
图5.PD168393结合的EGFR激酶结构比较。(A-C)PD168393与EGFR激酶复合物晶体结构对比激活构象的野生型EGFR激酶结构(用浅蓝色卡通表示，PDB 2GS6)；A)含L834R突变的EGFR激酶与PD168393复合物(绿色，PDB 4LQM)；B)D770-D771 Ins NPG突变体激酶与PD168393复合物(浅粉色，PDB 4LRM)；C)EGFR L834R/T766M突变体激酶与PD168393复合物(黄色，PDB 4LL0)。D)激活状态EGFR结构与EGFR激酶同Mig6复合物的对比，后者有一个本质上无序的a-C螺旋(粉红色，PDB 2RF9)。(E-G)EGFR激酶结构的B因子比较。EGFR激活态(E),L834R/T766M突变体结合PD168393(F)，以及与Mig6结合(G)的结构根据它们Cα原子的B因子着色。活性构象中Lys721和Glu 736之间的盐桥在PD168393与L834R/T766M突变体激酶的复合物中被保留，(E,F)，但是在与Mig6的激酶复合物中被破坏(G)。
图6.癌症患者尿液样本的化学分层。A)流式细胞术检测不同受试者尿液样本与PDCy3探针的结合情况。每个受试者的尿液样本用特定浓度的PDCy3探针染色。被染色的样品通过流式细胞术来分析。B)不同浓度PDCy3探针处理下，比较不同受试者尿液中收集到的细胞与PDCy3结合情况。用PDCy3阳性细胞占比乘以PDCy3平均荧光强度来计算PDCy3的相对结合。C)通过RT-qPCR，比较不同受试者的样本间EGFR相对GAPDH的表达量。D)通过正向的Sanger测序检测到了受试者4的EGFR激酶域存在三个突变。以每个样本提取的RNA为模板，用诺维赞的高保真酶PCR扩增20个循环得到编码EGFR激酶域的cDNA片段。每个样本的PCR产物上的突变通过Sanger测序分析。E)鉴定出的EGFR激酶突变对PDCy3结合的影响。293T细胞瞬时转染了编码WT EGFR及其突变体的质粒。在指定浓度下通过流式细胞术分析PDCy3与这些转染细胞的结合。F)比较PDCy3与野生型EGFR和突变体的相对结合。在存在或不存在10nMEGF以及0.5μM PDCy3作用下，比较PDCy3与野生型EGFR和突变体的相对结合。PDCy3的相对结合用上文描述的方法计算。条形图显示了三次实验的平均数和标准差。G)已经鉴定的EGFR激酶突变体对激酶活性的影响。EGFR的表达和磷酸化水平分别用抗protein C和4G10的抗体通过western-blot检测。H)4号受试者活检标本HE染色。I)4号受试者活检标本雄激素受体表达的免疫组化染色。用抗体ab74272检测雄激素受体。
图7.EGFR在肿瘤患者中的表达和突变。A)通过Q-PCR比较不同受试者的样本中EGFR对于β-actin的相对表达水平。B)通过反向Sanger测序检测4号受试者EGFR激酶结构域的突变。C)鉴定出的EGFR突变对PDCy3结合的影响。293T细胞瞬时转染了编码WT EGFR及其突变体的质粒。在指定浓度下通过流式细胞术分析PDCy3与这些转染细胞的结合。
图8.对受试者4的标本进行组织活检。A)标本的HE染色。(B,C,D,E,F,G)表达雄激素受体(B),CK7(C),CK20(D),PSA(E),TTF(F)和Villin(G)的免疫组化染色。
例子.
例子1探针的准备
一般步骤
在Bruker AVIII 400上记录了核磁共振氢谱。
LCMS测量在Agilent 1200HPLC/6100SQ系统上运行，使用的条件如下:流动相:A:水(10mM NHHCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mm XBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
合成方案
在下列合成中，除非另有说明，如有必要，存在一个反离子，它是钠离子。
1.化合物a-1的合成:
将a-01(5.0g,26.56mmol)溶于AcOH(30mL)中，加入3-甲基丁烷-2-酮(4.58g,53.13mmol)。将混合物加热回流5小时。然后溶液冷却到室温。然后加入CH3COOK在2-丙醇中的饱和溶液，在此过程中观察到固体，过滤得到a-1 5.5g(74％)黄色固体。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 240.0[m+H]+；RT＝1.17min。
2.化合物a-2的合成:
2.2g 2,3,3-三甲基lindolenium-5-磺酸盐(a-1)悬浮于30mL甲基碘化物中。将反应混合物在密封管中加热至沸腾25小时。待混合物冷却后，倒出过量的碘化甲酯，并将残留物悬浮在50毫升丙酮中。将溶液过滤，得到a-2 2.48g(纯度98％)的粉红色固体。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 254.0[m+H]+。RT＝1.34min。
3.化合物a-3的合成:
将a-1(2.77g,10mmol)和6-溴正己酸(2.34g,12mmol)溶于环丁砜(2.5mL)中，在130℃下加热3小时。将反应混合物冷却到室温，然后将DCM添加到残渣中，得到的固体经过过滤，在减压条件下干燥，得到粉红色固体。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 353.0[M+H].RT＝1.19min.
4.化合物a-4的合成:
将β-CD(25.77g,21.48mmol)溶于水(200mL)中，加热至透明溶液，冷却至室温。在此澄清溶液中，逐滴加入胺(20.0g,214.75mmol)并搅拌，然后逐滴加入三乙二甲酸酯(15.91g,107.38mmol)，室温下搅拌一夜。反应完成后(TLC监测)，用乙酸乙酯萃取反应质量。结合有机层蒸发导致粗产物，再经正己烷-乙酸乙酯简单重结晶提纯，得到纯产物a-4为白色固体。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 196.0[M+H]+.RT＝1.83min.
5.化合物A的合成:
取A-3(2.95g,7.52mmol)和A-4(1.77g,9.03mmol)的乙酸(4.5mL)和乙酸酐(4.5mL)溶液在120℃下加热4小时。在甲醇中通过吸收光谱监测反应的完成情况。然后加入a-2(2.2g,7.52mmol)和更多的乙酸酐(4.5mL)和吡啶(4.5mL)。将混合物加热30分钟，直到anyl中间体消失(通过吸收光谱监测)。冷却反应混合物，倒入乙酸乙酯(50mL)中。粗品离心收集，用乙酸乙酯洗涤两次。制备型HPLC纯化得到化合物A(260mg)为深紫色固体。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 617.0[M+HI.RT＝1.15min.
'H NMR(400MHz,D20)8 8.43-8.36(t,J＝26.8Hz,1H),7.77-7.76(d,J＝1.6Hz,2H),7.71-7.68(m,J＝12Hz,2H),7.24-7.19(m,J＝20.8Hz,2H),6.27-6.20(m,J＝29.6Hz,2H),3.97-3.93(t,J＝14.4Hz,2H),3.54-3.47(d,J＝28Hz,3H),2.08-2.05(t,J＝14.8Hz,2H),1.72-1.66(m,J＝22.4Hz,2H),1.61(s,12H),1.53-1.46(t,J＝29.6Hz,2H),1.33-1.28(m,J＝23.6Hz,2H).
6.化合物e-1的合成:
将3-溴苯胺(1mL,9.5mmol)加入到e-01(2g,9.5mmol)的2-丙醇溶液中，室温下氩气下搅拌一夜。形成的沉淀经水和乙醚过滤洗涤后，真空干燥，得到6-硝基-4-(3-溴苯基氨基)喹唑啉(e-1)(72％)为黄色固体。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 344.0[M+H].RT＝1.90min.
7.化合物e-2的合成:
将分离的e-1(1.0g,2.80mmol)加入乙醇(1:2,58mL)和乙酸(2.8mL)水溶液中，加入Fe(1.95g.34.77mmol)，所得混浊混合物回流保存1小时。将反应冷却至室温，浓氨碱化，DCM萃取。有机层经Na2SO4干燥，减压浓缩得到目标化合物e-2为黄色固体。
流动相:A:水(0.1％TFA)B:ACN(0.1％TFA)，梯度:5％B,1.5min内增加到95％B，流速:1.5mL/min，色谱柱为4.6×50mm XBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 316.0[M+H]+.RT＝1.00min.
8.化合物e-3的合成:
在Dean-Stark条件下，4-氨基-1-丁醇(SM-1)(5g,56.09mmol)和邻苯二甲酸酐(8.30g,56.09mmol)在甲苯(150mL)中的混合物加热回流3h。经冷却、真空脱去溶剂得到的粗产物经闪速柱层析、PE/EA洗脱得到无色油，静置后为无色结晶固体12.4g(97％)。
流动相:A:水(10mm NH4HCO)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 219.0[M+H]+.RT＝1.52min.
9.化合物e-4的合成:
在-78℃下，将二甲亚砜(6.45ml，22.81mmol)的二氯甲烷溶液滴加到草酰氯(5.79g，45.61mmol)的二氯甲烷溶液中，然后滴加2-(4-羟丁基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮(e-3)(5.0g,22.81mmol)二氯甲烷。
搅拌20分钟后，加入三乙胺(9.23g,91.22mmol)的二氯甲烷溶液，升高反应温度至0℃，再搅拌30分钟。反应完成后，加入饱和氯化钠水溶液，然后用乙酸乙酯萃取。有机层用水和饱和氯化钠溶液洗涤，然后在无水硫酸钠上干燥。溶剂在减压条件下蒸馏，得到标题化合物(6.0g，纯度82％)
流动相:A:水(0.1％TFA)B:ACN(0.1％TFA)，梯度:5％B,1.5min内增加到95％B，流速:1.5mL/min，色谱柱为4.6×50mm XBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 217.0[M+H]+.RT＝1.05min.
10.化合物e-5的合成:
将4-酞咪丁醛(1.0g,4.60mmol)溶于CH2C12(10mL)中，用甲基(三苯基磷酸亚胺)乙酸酯(1.53g,4.60mmol)处理CH2C12(10mL)。1h后浓缩，倒置于硅胶柱上，填充PE/EA洗脱，得到产物为白色固体(79％)。
11.化合物e-6的合成:
将e-5(0.9g,3.29mmol)溶液和4N HCI(10mL)溶液在二氧六环中回流4小时。将溶液冷却到RT，并去除溶剂。残渣经柱层析(SiO2,DCM到乙酸乙酯)得到标题化合物为白色固体。
12.化合物e-7的合成:
e-2(1.0g,3.17mmol)、e-1(0.55g,2.11mmol)和HATU(0.63g,1.66mmol)溶于DCM(10mL)和DMF(1mL)中。加入n-乙基二异丙胺(0.041mg,3.17mmol)，室温搅拌2小时。有机层经DCM萃取，Na2SO4干燥浓缩得到粗产物，经硅胶柱(洗脱剂:DCM/MeOH)纯化。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 557.0[M+H]+.RT＝1.88min.
13.化合物E的合成:
将e-7(1.4g,2.52mmol)溶于乙醇(60mL)和CHC13(20mL)中，加热至80℃。NH2NH2。向溶液中加入H20(0.7mL)，在80℃加热1小时。然后将其冷却至室温，通过过滤除去沉淀，用乙醚洗涤。将滤液浓缩得到粗产物。制备型高效液相色谱纯化得到化合物E(600mg)为黄色固体。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
LC/MS m/z 425.0[M+H]+.RT＝1.60min.
14.PDCy3(化合物2)的合成:
化合物A(50mg,0.081mmol)、化合物E(51mg,0.12mmol)和HATU(33mg,0.088mmol)溶于DCM(2mL)中。然后加入n-乙基二异丙胺(20.9mg,0.16mmol)，室温搅拌2小时。用高效液相色谱前纯化得到化合物2(40mg)为粉红色固体。
流动相:A:水(10mm NH4HCO3)，B:MeCN。流速:1.8mL/min，色谱柱为4.6×50mmXBridge C18柱(3.5μm颗粒)。检测方法有二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)以及正/负电喷雾电离。
化合物2:
1-(6-((E)-6-(4-(3-bromophenylamino)quinazolin-6-ylamino)-6-oxohex-4-enylamino)-6oxohexyl)-3,3-dimethyl-2-((1E,3E)-3-(1,3,3-trimethyl-5-sulfonatoindolin-2-ylidene)prop-1-enyl)-3H-indolium-5-sulfonate
化学公式:C50H53BrN7O8S2 -
外观:粉红色固体
LC/MS m/z 1024.0[M+H]+,[M+H]+/2.RT＝1.46min.
'H NMR(400MHz,DMSO)δ10.37(s,1H),8.83(d,1H),8.68(s,1H),8.33(t,1H),8.13(s,1H),8.02-8.01(s,J＝2Hz,1H),7.80-7.99(d,J＝2Hz,1H),7.82-7.79(m,J＝11.2Hz,4H),7.72-7.66(m,J＝21.6Hz,2H),7.44-7.37(m,J＝28Hz,4H),7.22(s,1H),7.09(s,1H),7.96(s,1H),6.51-6.46(d,J＝17.6Hz,2H),4.30(s,1H),4.12(s,2H),3.65-3.63(d,J＝7.6Hz,3H),2.75-2.71(t,J＝17.6Hz,1H),2.33(s,1H),2.21-2.15(m,J＝24.4Hz,2H),1.90-1.85(m,J＝21.2Hz,2H),1.75-1.73(d,J＝8Hz,2H),1.68(s,12H),1.67-1.65(d,J＝10Hz,1H),1.5(s,2H).
例2。生物分析
材料和方法
材料。编码EGFR(1-988)和split YFP片段的质粒来源于Addgene(#11011，#27097和#22010)，获赠于Dr.Timothy A.Springer和Dr.Chang-Deng Hu。吉非替尼来源于Med-Chem Express(NJ,USA)重组人的EGF来源于义翘神州(中国)并按照建议重组和储存。限制性内切酶和Gibson重组试剂盒购于NEB(MA，USA)；DNA聚合酶购于诺维赞(中国)；抗蛋白C抗体购于金斯瑞(中国)；抗磷酸化抗体4G10购自于Merck Millipore(USA)。
PDCy3探针合成。PDCy3探针合成的细节详见补充方法。合成的材料通过BrukerAVIII 400上记录的IH NMR谱和Agilent 1200HPLC/6100SQ系统上运行的LCMS测量进行了表征。LCMS实验中，流动相A为水(10mM NH4HCO3)，流动相B为MeCN。在1.3分钟内，以5％B-95％B的线性梯度洗脱4.6x50mm XBridge C18柱(颗粒3.5um)。流速为1.8mL/min。检测方法为二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)和正/负电喷雾电离。
抑制EGFR激酶的活性。按照描述转染24孔板培养的HEK293T细胞。转染后的细胞在含6mM谷氨酰胺的EX-Cell 293无血清培养液(SIGMA)中饥饿44小时，然后用EGF、抑制剂或探针处理。用40ul/孔裂解缓冲液(50mM Tris,pH 7.5,150mM NaC1,1％TritonX-100,1％去氧胆酸钠，0.1％SDS,10mM EDTA,1mM Na3VO4,2mM PMSF)溶解细胞。裂解物13200g离心20min。吸取上清与6x SDS样品缓冲液混合，进行SDS-PAGE和Western blotting分析。EGFR的表达和磷酸化水平分别用抗protein C和4G10的抗体检测。
细胞筛选。在EX-Cell 293无血清培养基中饥饿44小时后，细胞转然后在37℃下用吉非替尼、PDCy3或EGF处理4小时。每孔的细胞用500μL预冷的PBS洗两次，然后用400μL重悬。最终细胞密度估计为5x105-1X106 cells/mL。每孔重悬的细胞加3μL抗EGFR 528抗体(santa cruz biotechnology inc,USA)，浓度为200μg/mL来检测EGFR的表达。冰浴30min后用冷的PBS洗两次，然后用400μL PBS重悬。然后，在每个样品中加入0.3μL FITC标记的二抗，浓度为2mg/mL。冰浴30min，用PBS洗涤3次，重悬于400ul/孔的PBS中，使用BD FACSCalibur机进行流式细胞仪分析。
蛋白质互补分析。对于蛋白质互补分析，我们设计了互补的两个构建:一个编码人EGFR(1-998)与split-YFP-N(1-172)片段融合表达，另一个编码人hEGFR(1-998)与split-YFP-C(155-238)片段融合表达。激酶突变同时引入两个互补构建中以形成互补对。所有构建都经过测序验证。将编码同一受体的配对结构共转染到HEK293T细胞中。转染的细胞在EX-Cell 293无血清培养液中饥饿44小时，然后用1μM PDCy3处理4小时。用流式细胞仪分析EGFR的二聚化以及二聚体与PDCy3的结合情况。
结果
该荧光探针可竞争性抑制EGFR的激酶活性。
分别对探针各模块的功能进行了分析。总的来说，该探针的荧光光谱与Cy3的光谱非常相似，除了发射光谱中在674nm处有一个额外的小峰(图2A)。在成像应用中，这个额外的小峰可以将PDCy3探针的探测范围扩展到可见红色区域，例如FRET实验。
然后，我们分析PDCy3探针对EGFR激酶活性的抑制作用(图2B)。本实验中，在有或没有10nM的EGF的情况下，不同浓度的PDCy3探针处理转染EGFR后的HEK293T细胞10min。western blotting检测EGF受体表达及磷酸化水平。如图2B所示，该探针能够以剂量依赖的方式抑制EGFR的激酶活性。在探针浓度为20μM时，EGFR激酶的活性被完全抑制。相比之下，5μM吉非替尼可完全抑制EGFR的激酶活性(图2B)。
我们用吉非替尼作为竞争性抑制剂，证实了PDCy3探针抑制EGFR激酶活性的特异性(图2C)。在有或无5μM吉非替尼的情况下，用EGFR特异性抗体528和PDCy3探针同时标记EGFR阳性或对照细胞。通过流式细胞术比较不同条件下PDCy3探针对表达EGFR细胞的结合能力。用10nM EGF处理并不能增强PDCy3探针与表达EGFR细胞的结合(图2C)。但是，在EGF存在的情况下，5μM吉非替尼可使表达EGFR的PDCy3阳性细胞数量从45.4％减少到5.3％(图2C)。这些结果表明，PDCy3探针可以特异性结合细胞表面的受体，并竞争性抑制EGFR的激酶活性。从另一个角度来看，本实验也证明了该PDCy3探针在竞争筛选EGFR抑制剂方面的实用性。
PDCy3探针对EGFR及其致癌突变敏感。
为了扩展PDCy3探针在诊断相关环境中的应用，我们优化了标记条件，使过表达EGFR的细胞可以用该探针进行更特意性地标记。我们比较了在不同浓度PDCy3标记EGFR过表达细胞和非过表达细胞的效率(图3A)。我们发现在1μM浓度下，EGFR阳性细胞可以被PDCy3特异性标记。在此条件下，该探针可标记超过84.9％的EGFR阳性细胞。同样条件下，经PDCy3探针标记的EGFR阴性细胞为6.7％，未转染细胞为1.4％。然而，当PDCy3浓度增加到5μM或更高时，未转染或转然后的EGFR阴性细胞也开始被非特异性地标记。
PDCy3探针是衍生自PD168393，兼容激活或非激活构象地激酶，在细胞表面缺乏EGF时,可以促进表皮生长因子受体的构象二聚化作用。我们探究了该探针是否对EGFR非对称二聚体或致癌地激活突变更敏感，EGFR非对称二聚体是激酶变构激活所需的(图3B)。L834R突变的引入会破坏EGFR激酶的非活性构像，使结合PDCy3的EGFR阳性细胞的数量从52.4％增加到65.9％(图3B,3C)。通过引入V924R突变破坏非对称激酶二聚体，这并没有减弱PDCy3与转染的EGFR阳性细胞的结合，反而增强了8％(图3B,3C)。
为了进一步研究EGFR激酶二聚化如何影响PDCy3结合，我们做了一个蛋白质互补实验。在实验中，我们将split-YFP片段重组到EGFR的C端，然后通过共转染受体组装的完整YFP来反映EGFR的二聚化水平(图4A)。如图4B所示表达EGFR二聚体的细胞被分为两个细胞群。在一个细胞群中，PDCy3的结合量随EGFR二聚体形成量线性增加(图4C)。在另一个细胞群中，PDCy3的结合量与EGFR二聚体形成量无关。L858R突变使两个受体二聚化的细胞群对PDCy3结合敏感(图4C)。然而，其中与其野生型相当的细胞群，对PDCy3结合的反应比另一个群体敏感5倍。此外，与野生型受体相比，对PDCy3敏感性较高的细胞群从38.4％下降到27.4％(图4C,4D)。另一方面，在L834R上引入的V924R突变并未阻断受体的二聚化(图4C,4D)。相反，它改变了对PDCy3敏感性较低的细胞群，使其独立于EGFR二聚体或对其产生抗性。此外，V924R突变使对PDCy3高敏感性的细胞群由27.4％提高到49.2％(图4C,4D)。这些结果表明，在细胞表面有两种不同的EGFR二聚体形式:一种对PDCy3结合高度敏感，另一种则不敏感。由于V924R突变可以破坏非对称激酶二聚体，所以对PDCy3具有高敏感性的二聚体应该不同于该形式的二聚体。
讨论
在本文中，我们提出了我们在模块化设计和开发靶向致癌受体的探针方面的概念。随着新药开发成本的急剧增加和治疗靶点的大幅减少，市场上使用的药物的重新评估越来越受到工业界和学术界的关注。我们基于结构设计，探索了重新编程的EGFR激酶抑制剂应用于药物筛选、细胞分选和蛋白质相互作用成像的潜力。我们模块化设计的好处包括但不限于可更换的成像和靶向模块。可更换成像模块可用于具有不同成像特性的不同生物学和/或治疗情况。另一方面，可更换靶向模块可用于检测不同目标或特定目标的不同状态。在我们的案例中，PDCy3对EGFR过表达细胞具有选择性，并且对L834R的致癌突变更敏感。未来的研究将解决该探针是否可用于临床诊断以及EGF受体如何在细胞表面动态相互作用。
基于对PDCy3探针结合的敏感性，我们鉴定出细胞表面EGFR二聚体的两种不同状态细胞群。这两个细胞群中，一个对PDCy3结合高度敏感，另一个不敏感。L834R突变促进了对PDCy3结合敏感性弱的二聚体的形成，而V924R突变促进了对PDCy3敏感性高的二聚体的形成。考虑到V924R突变可以破坏非对称的EGFR二聚体的活性构象，而L834R有利于激酶的活性构象，我们认为对PDCy3敏感性较弱的EGFR二聚体代表非对称的活性激酶二聚体。另一方面，我们认为对PDCy3具有高敏感性的EGFR二聚体实际上代表了另一种激酶结合状态。从早期的结构研究中，已经提出EGFR激酶结构域在体外既能形成非对称的活性二聚体，也能形成对称的非活性二聚体。直观地说，pdcy3敏感二聚体可能等同于或与对称的非活性激酶二聚体有关。然而，许多证据反对这种可能性。研究表明，吉非替尼和PD168393既能与EGFR激酶的活性构象兼容，也能与非活性构象兼容，能够驱动细胞表面未结合的EGFR的同二聚或异二聚化。相比之下，拉帕替尼和HKI-272都能使激酶稳定在非活性的构象中而不是另一种。这种差异归因于激酶的构象和动态特性。事实上，在分子动力学模拟中已经证明了EGFR激酶存在中间过渡态。有趣的是，PD168393结合EGFR激酶后的结构在其N叶和αC螺旋位置变化很大(rmsd从1.8A到2.7A，当它们的C叶叠加一起时)(图5A)。其中一个结构(PDB 4LLO)更接近于分子动力学模拟中发现的具有本质无序αC螺旋的中间态(PDB 2RF9)(图5B)。然而，我们提供了一个工具来研究EGFR二聚化和药物敏感性。结果表明，细胞表面存在两种状态不同的二聚化激酶受体。这两种不同的二聚化状态对激酶抑制剂有不同的敏感性。鉴定这种激酶二聚化和药物敏感性的差异可以为下一代疗法的发展提供信息。
例3.生物分析
受“背景”部分所述的这些未解决的挑战的启发，我们设计了针对与肿瘤发生相关的特定构象的EGFR激酶的模块化治疗诊断探针，并将基于探针的细胞检测技术应用于前列腺癌的化学分层。我们展示了使用这种探针竞争筛选抑制剂，筛选表皮生长因子受体过表达或突变的细胞，以及对细胞表面EGFR相互作用的成像等方面的实例。令人惊讶的是，我们发现EGFR激酶抑制剂PD168393对一种不同于非对称二聚体的活性中间状态更敏感。此外，我们基于探针的细胞检测技术对7名前列腺癌患者和1名疑似前列腺癌患者的8份尿液样本进行了检测。这些样本对探针的反应相同:一个对探针高度敏感，而其他样本则不然。EGFR突变仅在对探针具有高灵敏度的样品中检测到，而在其他野生型(WT)EGFR过表达的样品中未检测到。临床分析证实，样本对探针高度敏感的受试者进展到去势抵抗、转移阶段。
材料和方法
材料。编码EGFR(1-988)和split YFP片段的质粒来源于Addgene(#11011，#27097和#22010)，获赠于Dr.Timothy A.Springer和Dr.Chang-Deng Hu。吉非替尼来源于Med-Chem Express(NJ,USA)重组人的EGF来源于义翘神州(中国)并按照建议重组和储存。限制性内切酶和Gibson重组试剂盒购于NEB(MA，USA)；DNA聚合酶购于诺维赞(中国)；抗蛋白C抗体购于金斯瑞(中国)；抗磷酸化抗体4G10购自于Merck Millipore(USA)。抗CK7(ab181598)、抗CK20(ab76126)、抗雄激素受体(ab74272)、抗绒毛蛋白(ab130751)和抗TTF-1(ab72876)抗体来自Abcam(Cambridge,MA,USA)；抗PSA(31-1210-00)抗体来自RevMAbBiosciences(San Francisco,CA,USA)。
PDCy3探针合成。PDCy3探针合成的细节详见补充方法。合成的材料通过BrukerAVIII 400上记录的IH NMR谱和Agilent 1200HPLC/6100SQ系统上运行的LCMS测量进行了表征。LCMS实验中，流动相A为水(10mM NH4HCO3)，流动相B为MeCN。在1.3分钟内，以5％B-95％B的线性梯度洗脱4.6x50mm XBridge C18柱(颗粒3.5um)。流速为1.8mL/min。检测方法为二极管阵列(DAD)、蒸发光散射(ELSD)和正/负电喷雾电离。
抑制EGFR激酶的活性。按照描述转染24孔板培养的HEK293T细胞。转染后的细胞在含6mM谷氨酰胺的EX-Cell 293无血清培养液(SIGMA)中饥饿44小时，然后用EGF、抑制剂或探针处理。用40ul/孔裂解缓冲液(50mM Tris,pH 7.5,150mM NaC1,1％TritonX-100,1％去氧胆酸钠，0.1％SDS,10mM EDTA,1mM Na3VO4,2mM PMSF)溶解细胞。裂解物13200g离心20min。吸取上清与6x SDS样品缓冲液混合，进行SDS-PAGE和Western blotting分析。EGFR的表达和磷酸化水平分别用抗protein C和4G10的抗体检测。
细胞筛选。在EX-Cell 293无血清培养基中饥饿44小时后，细胞转然后在37℃下用吉非替尼、PDCy3或EGF处理4小时。每孔的细胞用500μL预冷的PBS洗两次，然后用400μL重悬。最终细胞密度估计为5x105-1X106cells/mL。每孔重悬的细胞加3μL抗EGFR 528抗体(santa cruz biotechnology inc,USA)，浓度为200μg/mL来检测EGFR的表达。冰浴30min后用冷的PBS洗两次，然后用400μL PBS重悬。然后，在每个样品中加入0.3μL FITC标记的二抗，浓度为2mg/mL。冰浴30min，用PBS洗涤3次，重悬于400ul/孔的PBS中，使用BD FACSCalibur机进行流式细胞仪分析。
蛋白质互补分析。对于蛋白质互补分析，我们设计了互补的两个构建:一个编码人EGFR(1-998)与split-YFP-N(1-172)片段融合表达，另一个编码人hEGFR(1-998)与split-YFP-C(155-238)片段融合表达。激酶突变同时引入两个互补构建中以形成互补对。所有构建都经过测序验证。将编码同一受体的配对结构共转染到HEK293T细胞中。转染的细胞在EX-Cell 293无血清培养液中饥饿44小时，然后用1μM PDCy3处理4小时。用流式细胞仪分析EGFR的二聚化以及二聚体与PDCy3的结合情况。
癌症患者尿液样本的细胞检测。收集每位癌症患者10-15mL尿液样本。4℃，300g离心10分钟收集细胞，然后PBS重悬。然后，每个样本中的细胞被分成三份:一份用于细胞检测；另一种用于RT-qPCR；其余与低温保护剂(80％胎牛血清和20％DMSO)按1:1比例混合，液氮中保存。用于细胞检测的细胞分别与0、0.5、1和5μM PDCy3共孵育，冰上暗孵育20分钟后，用流式细胞仪检测。
RT-qPCR分析。4℃、300g离心10分钟收集尿液样本中的细胞，并重悬于1ml Trizol中。静置5分钟后，每个样品中加入0.25mL氯仿。室温孵育5分钟后，4℃，13,700g离心15分钟，分别取每个样品的水相，以1:1(v/v)的比例与异丙醇混合。-20℃静置30分钟后，4℃13700g离心15分钟，弃上清，75％乙醇洗沉淀。然后，微风风干半小时，分别溶于20uL经DEPC处理的H2O中。
如制造商所述，分别使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis试剂盒和FastStart Essential DNA Green Master试剂盒(Roche，USA)进行提取的RNA的逆转录和基因表达的q-PCR定量。实验中使用的引物列于表1。使用LightCycler-96机器通过q-PCR分析确定来自每个受试者的每个基因的表达。通过使用一式三份提取的RNA样品确定实验统计数据。
表1:q-PCR分析引物
HE染色。脱蜡和复水后，将5um长的切片用苏木精溶液染色5分钟，然后在1％酸性乙醇(1％HCl，70％乙醇)中浸泡5次。切片用蒸馏水冲洗，伊红溶液染色3分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明。使用Leica DM2500显微镜检查和拍照安装的载玻片。
免疫组织化学。福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)切片脱蜡并用3％H2O2封闭。使用微波在0.01M柠檬酸盐中进行两次抗原修复，每次10分钟，然后将切片冷却60分钟。载玻片用3％山羊血清封闭，并分别用各种一抗标记。然后，用与Envision-plus HRP标记的聚合物偶联的二抗标记载玻片，并用DAB染色液(中山金桥，北京)染色。使用Mayer-苏木精进行复染。
道德的声明。每个入组患者均获得知情同意。本研究获得天津医科大学第二医院伦理委员会批准(证书#KY2017K010)。
结果
EGFR激酶活性的竞争性抑制
分别对探针各模块的功能进行了分析。总的来说，该探针的荧光光谱与Cy3的光谱非常相似，除了发射光谱中在674nm处有一个额外的小峰(图2A)。在成像应用中，这个额外的小峰可以将PDCy3探针的探测范围扩展到可见红色区域，例如FRET实验。
然后，我们分析PDCy3探针对EGFR激酶活性的抑制作用(图2B)。本实验中，在有或没有10nM的EGF的情况下，不同浓度的PDCy3探针处理转染EGFR后的HEK293T细胞10min。western blotting检测EGF受体表达及磷酸化水平。如图2B所示，该探针能够以剂量依赖的方式抑制EGFR的激酶活性。在探针浓度为20μM时，EGFR激酶的活性被完全抑制。相比之下，5μM吉非替尼可完全抑制EGFR的激酶活性(图2B)。
我们用吉非替尼作为竞争性抑制剂，证实了PDCy3探针抑制EGFR激酶活性的特异性(图2C)。在有或无5μM吉非替尼的情况下，用EGFR特异性抗体528和PDCy3探针同时标记EGFR阳性或对照细胞。通过流式细胞术比较不同条件下PDCy3探针对表达EGFR细胞的结合能力。用10nM EGF处理并不能增强PDCy3探针与表达EGFR细胞的结合(图2C)。但是，在EGF存在的情况下，5μM吉非替尼可使表达EGFR的PDCy3阳性细胞数量从45.4％减少到5.3％(图2C)。这些结果表明，PDCy3探针可以特异性结合细胞表面的受体，并竞争性抑制EGFR的激酶活性。从另一个角度来看，本实验也证明了该PDCy3探针在竞争筛选EGFR抑制剂方面的实用性。
对致瘤性EGFR突变敏感，但对非对称激酶二聚不敏感
为了表征PDCy3的特异性，我们比较了不同PDCy3浓度下EGFR过表达细胞和非过表达细胞的标记效率(图3A)。我们发现在1μM浓度下，EGFR阳性细胞可以被PDCy3特异性标记。在此条件下，该探针可标记超过84.9％的EGFR阳性细胞。同样条件下，经PDCy3探针标记的EGFR阴性细胞为6.7％，未转染细胞为1.4％。然而，当PDCy3浓度增加到5μM或更高时，未转染或转然后的EGFR阴性细胞也开始被非特异性地标记。
PDCy3探针是衍生自PD168393，兼容激活或非激活构象地激酶，在细胞表面缺乏EGF时,可以促进表皮生长因子受体的构象二聚化作用。我们探究了该探针是否对EGFR非对称二聚体或致癌地激活突变更敏感，EGFR非对称二聚体是激酶变构激活所需的(图3B)。L834R突变的引入会破坏EGFR激酶的非活性构像，使结合PDCy3的EGFR阳性细胞的数量从52.4％增加到65.9％(图3B,3C)。通过引入V924R突变破坏非对称激酶二聚体，这并没有减弱PDCy3与转染的EGFR阳性细胞的结合，反而增强了8％(图3B,3C)。
为了进一步研究EGFR激酶二聚化如何影响PDCy3结合，我们做了一个蛋白质互补实验。在实验中，我们将split-YFP片段重组到EGFR的C端，然后通过共转染受体组装的完整YFP来反映EGFR的二聚化水平(图4A)。如图4B所示表达EGFR二聚体的细胞被分为两个细胞群。在一个细胞群中，PDCy3的结合量随EGFR二聚体形成量线性增加(图4C)。在另一个细胞群中，PDCy3的结合量与EGFR二聚体形成量无关。L858R突变使两个受体二聚化的细胞群对PDCy3结合敏感(图4C)。然而，其中与其野生型相当的细胞群，对PDCy3结合的反应比另一个群体敏感5倍。此外，与野生型受体相比，对PDCy3敏感性较高的细胞群从38.4％下降到27.4％(图4C,4D)。另一方面，在L834R上引入的V924R突变并未阻断受体的二聚化(图4C,4D)。相反，它改变了对PDCy3敏感性较低的细胞群，使其独立于EGFR二聚体或对其产生抗性。此外，V924R突变使对PDCy3高敏感性的细胞群由27.4％提高到49.2％(图4C,4D)。这些结果表明，在细胞表面有两种不同的EGFR二聚体形式:一种对PDCy3结合高度敏感，另一种则不敏感。由于V924R突变可以破坏非对称激酶二聚体，所以对PDCy3具有高敏感性的二聚体应该不同于该形式的二聚体。
基于探针的细胞术对前列腺癌的分层研究
在两项小型队列研究中，估计超过30％的前列腺癌患者与EGFR过表达相关，约10-15％的患者与EGFR突变相关。这些表达或基因改变真的与EGFR功能障碍有关吗？如何有效识别EGFR异常激活的患者？EGFR功能障碍如何与前列腺癌的发病机制相关联？哪些亚型的患者可以从EGFR抑制剂治疗中获益？为了进一步理解这些问题，我们建立了基于探针的细胞术，并根据尿液样本对前列腺癌患者进行分类。总共有7名前列腺癌患者被纳入我们的小队列研究(表2)。
表2:入组受试者临床资料
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尿液样本分别用0.0、0.5、1.0、5.0μM探针在4℃下标记半小时，然后用流式细胞术进行分析。通过结合探针的荧光强度和SSC区分不同的细胞群(图6A)。不同受试者的尿液样本对探针显示出不同反应，用探针相对结合程度对探针浓度的函数表示(图6A,6B)。尤其是4号受试者样本的敏感性显著高于其他受试者(图6B)。在0.5μM浓度的探针下，其与样品的相对结合度比其他探针的平均值高13.6倍。在0.5和1.0μM浓度下的探针相对于5.0μM浓度下的探针的分数分别为0.28和0.30。而其他样品在0.5和1.0μM探针处相对结合分数最高分别为0.1和0.16。
为了进一步了解这些样本在基于探针的细胞术中的不同反应谱，我们通过RT-qPCR和Sanger测序分析了这些样本的表达和突变状态(图6C、6D、7A、7B)。在RT-qPCR中，除1号和4号外的所有样本中都检测到了EGFR的过表达(图6C,7A)。此外，在4号受试者的样本中，通过双向Sanger测序发现了EGFR激酶结构域上的三个单核苷酸多态性(SNPs)(V745M、G800D和P770T)，而在其他样本中未发现(图6D,7B)。在非吉非替尼治疗的肺癌患者中发现了V745M突变，但意义不确定，而在头颈部鳞状细胞癌中发现了G800D突变，提示为药物反应，未提供标准(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)。P770T突变在癌症研究中尚未见报道(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)。因此，我们测试了这些突变的激酶活性和对探针敏感程度(图6E-G,7C)。在瞬时转染的293T细胞中，V745M突变体的激酶活性高于WT受体，但G800D、P770T等组合突变体的激酶活性受到一定程度的损害(图6G)。与它们的激酶活性一致，转染V745M突变体和WT受体的细胞在流式细胞术中表现出对PDCy3的高敏感性，但转染G800D、P770T及其组合的细胞对探针没有反应(图6E,6F,7C)。综上所述，EGFR上的激活突变V745M可以解释从4号样品探针敏感性增强的原因。
检查4号受试者的活检标本，证实患者为转移性前列腺癌，雄激素受体过表达(图6H,6I,8)。后来的回顾性检查发现该病例为去雄抵抗(表2)。
讨论
有效的患者分层对前列腺癌的诊断和治疗至关重要。目前，在临床研究中广泛采用组织标本检测和基因图谱分析。然而，通过这些技术检测到的基因、免疫或代谢生物标记物的异常变异，并不能对应个性化治疗策略的潜在的药物反应。然而，我们仍未充分认识肿瘤异质性和突变压力相关的庞大遗传和表观遗传变异。这些局限性阻碍了新治疗策略的发展，并使我们对如何将遗传分析与临床应用相关联的理解复杂化。我们的化学分层策略是利用患者的体液来检测个性化的药物反应，并据此对患者进行分型。通过在一项小型组研究中使用这种液体活检技术，我们证明了一名带有EGFR激活突变(V745M)前列腺癌患者对我们设计的治疗探针高度敏感，并且该患者患有转移性肿瘤。在同一患者中，还发现了另外两个伴发的失活突变(G800D和P770T)，表明与癌症进展相关的突变频率或异质性的增加。此外，我们发现那些过表达野生型EGFR的患者对该探针没有表现出高敏感性，这与早期多中心临床研究的报告一致。我们设想在未来的临床研究中，化学分层结合液体活检可以对基因图谱进行补充。
我们的化学分层建立在针对与肿瘤发生相关的特定构象的EGFR激酶的治疗诊断探针的模块化设计上。在我们基于结构的设计中，我们探索了重新编程已验证的EGFR激酶抑制剂以应用于药物筛选、细胞分选和蛋白质相互作用成像的潜力。我们模块化设计的好处包括但不限于可更换的成像和靶向模块。可更换的成像模块可用于具有不同成像特性的不同生物学和/或治疗环境。另一方面，可更换的靶向模块可用于检测其他目标或特定目标的其他状态。在我们的案例中，PDCy3对EGFR过表达细胞具有选择性，并且对EGFR激活突变更敏感，包括L834R(一种特征明确的突变)和V745M(本研究中发现的一种突变)。
基于对PDCy3探针结合的敏感性，我们鉴定出细胞表面EGFR二聚体的两种不同状态细胞群。这两个细胞群中，一个对PDCy3结合高度敏感，另一个不敏感。L834R突变促进了对PDCy3结合敏感性弱的二聚体的形成，而V924R突变促进了对PDCy3敏感性高的二聚体的形成。考虑到V924R突变可以破坏非对称的EGFR二聚体的活性构象，而L834R有利于激酶的活性构象，我们认为对PDCy3敏感性较弱的EGFR二聚体代表非对称的活性激酶二聚体。另一方面，我们认为对PDCy3具有高敏感性的EGFR二聚体实际上代表了另一种激酶结合状态。从早期的结构研究中，已经提出EGFR激酶结构域在体外既能形成非对称的活性二聚体，也能形成对称的非活性二聚体。直观地说，pdcy3敏感二聚体可能等同于或与对称的非活性激酶二聚体有关。然而，许多证据反对这种可能性。研究表明，吉非替尼和PD168393既能与EGFR激酶的活性构象兼容，也能与非活性构象兼容，能够驱动细胞表面未结合的EGFR的同二聚或异二聚化。相比之下，拉帕替尼和HKI-272都能使激酶稳定在非活性的构象中而不是另一种。这种差异归因于激酶的构象和动态特性。事实上，在分子动力学模拟中已经证明了EGFR激酶存在中间过渡态。有趣的是，PD168393结合EGFR激酶后的结构在其N叶和α℃螺旋位置变化很大(rmsd从1.8A到2.7A，当它们的C叶叠加一起时)(图5A)。其中一个结构(PDB 4LLO)更接近于分子动力学模拟中发现的具有本质无序αC螺旋的中间态(PDB 2RF9)(图5B)。然而，我们提供了一个工具来研究EGFR二聚化和药物敏感性。结果表明，细胞表面存在两种状态不同的二聚化激酶受体。这两种不同的二聚化状态对激酶抑制剂有不同的敏感性。
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Claims (26)

1.一种治疗探针，用式(1)表示：
模块2-L-模块1
(1)
其中，
L是一段链接子
模块1是一个靶向EGFR激酶的部分；以及
模块2是可选择的用来成像的探针，包括荧光探针，核磁共振和放射性探针；或者是可用于治疗的盐。
2.权利要求1中的治疗探针，其中L是-C(O)O-或-C(O)NH-。
3.权利要求1或2中的治疗探针，其中模块1是一种EGFR的激酶抑制剂。
4.权利要求1-3中任何一个的治疗探针，其中模块1由公式表示(2)：
其中
公式(2)中的R1是H，卤素或C2-6炔基(例如，乙炔基)；
公式(2)中的R2是H，卤素，C6-10芳香基C1-6烷氧基或者5到6元杂芳香基C1-6烷氧基，其中C6-10芳香基和5到6元杂芳香基可以被卤素取代，而且5到6元杂芳香基包含1、2、3或4个选自O、S、N的杂原子；
公式(2)中的R3是H，任选被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基，5到6元杂环烷基氧基，其中5到6元杂环烷基包括选自O、S和N的1到2个杂原子；
公式(2)中的R4，是模块1到L的连接点，是-(CH2)n-；且
n在公式(2)中可以是0，1，2，3，4，5或6。
5.权利要求1-4中任何一个的治疗探针，模块2用公式(3)和公式(4)表示：
其中
公式(3)或公式(4)中的R1，是模块2到L的连接点，为-(CH2)n-；
公式(3)或公式(4)中的R2是-(CH2)nCH3；以及
公式(3)或公式(4)中的n可以是独立的0，1，2，3，4，5或6；或者
模块2由公式(5)或公式(6)表示：
18FCH2-(CH2)n-* (5)
其中
公式(5)或公式(6)中符号*表示模块2与L的连接点；
公式(5)中的n分别为0，1，2，3，4，5或6；
其中，必要时，存在一种反离子，所述反离子选自碱金属和碱土金属离子。
6.权利要求1-5中任何一个的治疗探针，治疗探针用公式(7)表示：
其中，必要时，存在一种反离子。这可以是碱金属和碱土金属离子，特别是钠、钾、钙或镁离子组成的组中的一种。
7.权利要求1-6中任何一个的治疗探针中，EGFR激酶含有L834R、V924R、V745M突变，或L834R、V924R、V745M中的两种或三种突变。
8.权利要求1-7中任何一个的治疗探针中，EGFR激酶呈现二聚化构象。
9.权利要求1-8中任何一个的治疗探针中，EGFR激酶的构象与肿瘤发生相关，优选与前列腺癌相关，更优选与转移性的和/或去势抵抗性的前列腺癌相关。
10.使用权利要求1-9中的任何一种治疗探针来靶向和/或标记EGFR激酶和/或表达EGFR或其家族成员的细胞。
11.使用权利要求10，EGFR激酶含有L834R、V924R、V745M突变或其中的两种或三种突变。
12.使用权利要求10或11，EGFR激酶呈现二聚化构象。
13.使用权利要求10-12中的任何一项，EGFR激酶的构象与肿瘤发生相关，尤其是转移性的，去势抵抗性的前列腺癌。
14.使用权利要求1-9中任何一种的治疗探针对表达EGFR的癌症患者进行分层。
15.使用权利要求14，其中癌症是前列腺癌，并且更优选转移性和/或去势抵抗性前列腺癌。
16.权利要求书14或15的使用，其中EGFR具有V745M突变。
17.使用权利要求14-16中的任何一种，其中EGFR以二聚体构象形式存在。
18.使用权利要求14-17中的任何一项，其中EGFR为V745M突变的EGFR形成的二聚体构象。
19.使用权利要求14-18中的任何一种，其中分层是通过以下步骤进行的：将患者的样本与治疗探针混合；并确定两者之间的结合水平。
20.权利要求19的使用，其中样本是体液(如血液或尿液)或活检组织。
21.使用权利要求1-9中的任何一种治疗探针来富集表达EGFR的细胞。
22.权利要求21的使用，其中细胞表达的EGFR是野生型或具有L834R、V924R、V745M的突变或L834R、V924R和V745M的任意两种或三种的组合。
23.权利要求书21或22的使用，其中EGFR以二聚体形式存在。
24.使用权利要求21-23中的任何一项，EGFR激酶与肿瘤发生相关，尤其是转移性的，去势抵抗性的前列腺癌。
25.使用权利要求21-24中的任何一项，EGFR激酶的构象与肿瘤发生相关，尤其是转移性的，去势抵抗性的前列腺癌。
26.使用权利要求21-25中的任何一项，其中富集细胞是通过以下步骤进行的：按照第一个方面所定义的用治疗探针标记表达EGFR的细胞；收集被标记的过表达EGFR细胞。
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