CN116507315A - 用于组织填充、组织间隔和组织膨胀的丝-透明质酸组合物 - Google Patents

用于组织填充、组织间隔和组织膨胀的丝-透明质酸组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN116507315A
CN116507315A CN202180050630.8A CN202180050630A CN116507315A CN 116507315 A CN116507315 A CN 116507315A CN 202180050630 A CN202180050630 A CN 202180050630A CN 116507315 A CN116507315 A CN 116507315A
Authority
CN
China
Prior art keywords
composition
tissue
fibroin
spf
silk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180050630.8A
Other languages
English (en)
Inventor
G·H·奥特曼
C·J·博斯克斯
徐鹏
E·金
P·亚科诺
J·福蒂尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Natural Evolution Co
Original Assignee
Natural Evolution Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Natural Evolution Co filed Critical Natural Evolution Co
Priority claimed from PCT/US2021/038157 external-priority patent/WO2021258030A1/en
Publication of CN116507315A publication Critical patent/CN116507315A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本文提供了透明质酸和丝心蛋白或丝心蛋白片段组织填充物及其制备和使用方法。

Description

用于组织填充、组织间隔和组织膨胀的丝-透明质酸组合物
相关申请的交叉引用
本申请是要求2020年6月19日提交的美国临时申请63/041,678、2020年6月19日提交的美国临时申请63/041,616和2020年6月19日提交的美国临时申请63/041,581的权益的国际申请，这些临时各申请通过引用整体并入本文。
背景技术
丝是由多种昆虫和蜘蛛产生的天然聚合物。蚕丝心蛋白包含丝芯蛋白、丝心蛋白和由非丝状蛋白-丝胶蛋白组成的胶状涂层。历史上已经研究了丝在医学领域中的用途。透明质酸(玻尿酸)是一种糖胺聚糖，其分布在整个身体中，并且在结缔组织和上皮组织中发现。由于其生物相容性和结构益处，它是医疗装置和可植入材料中的有用组分。
人体软组织的结构部分地归因于细胞外基质，所述细胞外基质包含胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖。可能发生软组织缺陷，其扭曲、变形或以其他方式改变软组织结构。这样的结构可通过使用组织填充物来恢复，这些组织填充物可沉积在缺陷部位以修复缺陷。例如，可将组织填充物放置在面部皱纹的部位以修复皱纹。
然而，在本领域中需要新的组织填充物，其修复许多组织缺陷同时提供可调的特性，这可以允许针对特定组织缺陷定制组织填充物。
发明内容
在一些实施方案中，本公开涉及包含丝心蛋白或丝心蛋白片段、透明质酸(HA)以及聚乙二醇(PEG)和/或聚丙二醇(PPG)的生物相容性组织填充物，其中所述HA的一部分通过一个或多个连接剂部分而被改性或交联，所述一个或多个连接剂部分包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和仲醇中的一种或多种，其中所述连接剂部分在所述连接剂的一端处连接至所述HA。在一些实施方案中，丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分被改性或交联。在一些实施方案中，丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分交联至HA。在一些实施方案中，丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分交联至丝心蛋白或丝心蛋白片段。在一些实施方案中，丝心蛋白或丝心蛋白片段基本上不含丝胶蛋白。
在一些实施方案中，丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分具有选自约12kDa、约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa、约48kDa和约100kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，丝心蛋白或丝心蛋白片段具有1至约5.0的多分散性。在一些实施方案中，丝心蛋白或丝心蛋白片段具有约1.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分具有低分子量、中等分子量或高分子量。
在一些实施方案中，组织填充物具有约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％的改性度(MoD)。在一些实施方案中，使用二环氧-PEG、多缩水甘油基-PEG、二缩水甘油基-PEG、二环氧-PPG、多缩水甘油基-PPG、二缩水甘油基-PPG或它们的任何组合作为交联剂来获得改性或交联。在一些实施方案中，使用具有约200Da、约500Da、1000Da、约2,000Da或约6000Da的MW的聚乙二醇二缩水甘油醚来获得改性或交联。在一些实施方案中，使用具有约380Da或约640Da的MW的聚乙二醇二缩水甘油醚来获得改性或交联。
在一些实施方案中，组织填充物还包含利多卡因。在一些实施方案中，组织填充物中的利多卡因的浓度为约0.3％。
在一些实施方案中，组织填充物是凝胶。在一些实施方案中，组织填充物是水凝胶。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，组织填充物是单相的。在一些实施方案中，组织填充物中的HA和丝的总浓度为约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL或约30mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中HA与丝心蛋白或丝心蛋白片段的比率为约92/8、约93/7、约94/6、约95/5、约96/4、约97/3、约18/12、约27/3、约29.4/0.6、约99/1、约92.5/7.5或约90/10。在一些实施方案中，组织填充物是真皮填充物。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，组织填充物是可注射的。在一些实施方案中，组织填充物可通过30G或27G针注射。在一些实施方案中，组织填充物具有约5Pa至约500Pa的储能模量(G’)。在一些实施方案中，组织填充物的储能模量(G’)为约5Pa、约6pa、约7Pa、约8Pa、约9Pa、约10Pa、约11Pa、约12Pa、约13Pa、约14Pa、约15Pa、约16Pa、约17Pa、约18Pa、约19Pa、约20Pa、约21Pa、约22Pa、约23Pa、约24Pa、约25Pa、约26Pa、约27Pa、约28Pa、约29Pa、约30Pa、约31Pa、约32Pa、约33Pa、约34Pa、约35Pa、约36Pa、约37Pa、约38Pa、约39Pa、约40Pa、约41Pa、约42Pa、约43Pa、约44Pa、约45Pa、约46Pa、约47Pa、约48Pa、约49Pa、约50Pa、约51Pa、约52Pa、约53Pa、约54Pa、约55Pa、约56Pa、约57Pa、约58Pa、约59Pa、约60Pa、约61Pa、约62Pa、约63Pa、约64Pa、约65Pa、约66Pa、约67Pa、约68Pa、约69Pa、约70Pa、约71Pa、约72Pa、约73Pa、约74Pa、约75Pa、约76Pa、约77Pa、约78Pa、约79Pa、约80Pa、约81Pa、约82Pa、约83Pa、约84Pa、约85Pa、约86Pa、约87Pa、约88Pa、约89Pa、约90Pa、约91Pa、约92Pa、约93Pa、约94Pa、约95Pa、约96Pa、约97Pa、约98Pa、约99Pa、约100Pa、约101Pa、约102Pa、约103Pa、约104Pa、约105Pa、约106Pa、约107Pa、约108Pa、约109Pa、约110Pa、约111Pa、约112Pa、约113Pa、约114Pa、约115Pa、约116Pa、约117Pa、约118Pa、约119Pa、约120Pa、约121Pa、约122Pa、约123Pa、约124Pa或约125Pa。在一些实施方案中，G’通过约1Hz、约5Hz或约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，组织填充物具有约1Pa·s至约10Pa·s的复数粘度。在一些实施方案中，复数粘度通过约1Hz、约5Hz或约10Hz的振荡应力测量。
在一些实施方案中，本公开涉及治疗有需要的受试者中的病况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的任何本文所述的组织填充物，例如包含丝心蛋白或丝心蛋白片段、透明质酸(HA)以及聚乙二醇(PEG)和/或聚丙二醇(PPG)的生物相容性组织填充物，其中所述HA的一部分通过一个或多个连接剂部分而被改性或交联，所述一个或多个连接剂部分包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和仲醇中的一种或多种，其中所述连接剂部分在所述连接剂的一端处连接至所述HA。在一些实施方案中，病况是皮肤病况。在一些实施方案中，皮肤病况选自皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹、皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、脸颊凹陷、薄唇、后眼窝缺陷、面部褶皱和皱纹。
在一些实施方案中，本公开涉及在有需要的受试者中进行美容处理的方法，其包括向所述受试者施用有效量的任何本文所述的组织填充物，例如包含丝心蛋白或丝心蛋白片段、透明质酸(HA)以及聚乙二醇(PEG)和/或聚丙二醇(PPG)的生物相容性组织填充物，其中所述HA的一部分通过一个或多个连接剂部分而被改性或交联，所述一个或多个连接剂部分包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和仲醇中的一种或多种，其中所述连接剂部分在所述连接剂的一端处连接至所述HA。
在一些实施方案中，将组织填充物施用于所述受试者的真皮区域中。在一些实施方案中，本文所述的方法包括增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。在一些实施方案中，本文所述的方法包括面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括使用抗生物降解、生物侵蚀、生物吸收和/或生物再吸收至少约3天、约7天、约14天、约21天、约28天、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月的组织填充物。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用组织填充物，其导致炎症应答与由包含基本上相似的HA的对照组织填充物诱导的炎症应答相比降低，其中所述对照组织填充物不包含丝心蛋白或丝心蛋白片段。在一些实施方案中，向所述受试者施用所述组织填充物导致炎症应答与由包含基本上相似的HA的对照组织填充物诱导的炎症应答相比降低，其中所述对照组织填充物不包含丝心蛋白或丝心蛋白片段和/或PEG或PPG。在一些实施方案中，向所述受试者施用任何组织填充物导致胶原产生与由包含基本上相似的HA的对照组织填充物诱导的胶原产生相比增加，其中所述对照组织填充物不包含丝心蛋白或丝心蛋白片段，或其中所述对照组织填充物不包含丝心蛋白或丝心蛋白片段和/或PEG或PPG。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含：糖胺聚糖，其选自透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)、淀粉、藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、角叉菜胶和瓜尔胶；和活性剂，其选自酶抑制剂、麻醉剂、药用神经毒素、抗氧化剂、抗感染剂、抗炎剂、紫外(UV)光阻挡剂、染料、激素、免疫抑制剂和抗炎剂；其中所述糖胺聚糖的一部分通过包含烷烃或烷基链、醚基团和仲醇中的一种或多种的交联部分而交联；并且其中使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联。在一些实施方案中，糖胺聚糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，相对于HA总量，交联HA的％w/w量为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，交联HA的交联度为约1％至约100％。在一些实施方案中，交联HA的交联度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，交联HA的交联度为约1％至约15％。在一些实施方案中，交联HA的交联度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％和约15％中的一种或多种。
在一些实施方案中，交联HA包含含有聚乙二醇(PEG)链的交联部分。在一些实施方案中，交联剂和/或交联前体包含环氧基团。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联，所述交联剂、交联前体或活化剂选自多环氧连接剂、二环氧连接剂、多环氧-PEG、二环氧-PEG、多缩水甘油基-PEG、二缩水甘油基-PEG、聚丙烯酸酯PEG、二丙烯酸酯PEG、1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油氧基丁烷、二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、UV光、戊二醛、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCDI)、季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、己二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、碳二亚胺，以及它们的任何组合。在一些实施方案中，使用多官能环氧化合物获得交联，所述多官能环氧化合物选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油多缩水甘油醚、二甘油多缩水甘油醚、甘油多缩水甘油醚、三羟甲基丙烷多缩水甘油醚、季戊四醇多缩水甘油醚和山梨醇多缩水甘油醚。在一些实施方案中，使用交联剂和/或交联前体获得交联，所述交联剂和/或交联前体选自聚乙二醇二缩水甘油醚、二环氧PEG、PEG二缩水甘油醚、聚氧乙烯双缩水甘油醚、PEGDE和PEGDGE。在一些实施方案中，使用平均Mn为约500、约1000、约2000或约6000的聚乙二醇二缩水甘油醚获得交联。在一些实施方案中，使用具有2至25个乙二醇基团的聚乙二醇二缩水甘油醚获得交联。在一些实施方案中，使用交联剂和/或交联前体获得交联，所述交联剂和/或交联前体选自多环氧丝心蛋白连接剂、二环氧丝心蛋白连接剂、多环氧丝心蛋白片段连接剂、二环氧丝心蛋白片段连接剂、多缩水甘油基丝心蛋白连接剂、二缩水甘油基丝心蛋白连接剂、多缩水甘油基丝心蛋白片段连接剂和二缩水甘油基丝心蛋白片段连接剂。
在一些实施方案中，本发明涉及一种组织填充物，其还包含有机化合物和/或无机化合物。在一些实施方案中，无机化合物包括钙羟磷灰石。在一些实施方案中，将钙羟磷灰石配制成直径为约1μm至约100μm、约1μm至约10μm、约2μm至约12μm、约3μm至约10μm、约4μm至约15μm、约8μm至约12μm、约5μm至约10μm、约6μm至约12μm、约7μm至约20μm、约9μm至约18μm或约10μm至约25μm的颗粒。在一些实施方案中，钙羟磷灰石的浓度为约0.001％至约5％。在一些实施方案中，钙羟磷灰石的浓度为约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.011％、约0.012％、约0.013％、约0.014％、约0.015％、约0.016％、约0.017％、约0.018％、约0.019％或约0.02％。在一些实施方案中，钙羟磷灰石的浓度为约0.05％、约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约1.05％、约1.1％、约1.15％、约1.2％、约1.25％、约1.3％、约1.35％、约1.4％、约1.45％、约1.5％、约1.55％、约1.6％、约1.65％、约1.7％、约1.75％、约1.8％、约1.85％、约1.9％、约1.95％或约2％。
在一些实施方案中，有机化合物包括选自甘氨酸、L-脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸。
在一些实施方案中，本发明涉及包含HA的组织填充物，其中HA获自链球菌细菌或获自枯草芽孢杆菌细菌。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含：糖胺聚糖，其选自透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)、淀粉、藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、角叉菜胶和瓜尔胶；和麻醉剂；其中所述糖胺聚糖的一部分通过包含烷烃或烷基链、醚基团和仲醇中的一种或多种的交联部分而交联；并且其中使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联。在一些实施方案中，麻醉剂是利多卡因。在一些实施方案中，组织填充物中的麻醉剂的浓度为约0.001％至约5％。在一些实施方案中，组织填充物中的利多卡因的浓度为约0.3％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含：糖胺聚糖，其选自透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)、淀粉、藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、角叉菜胶和瓜尔胶；和麻醉剂；其中所述糖胺聚糖的一部分通过包含烷烃或烷基链、醚基团和仲醇中的一种或多种的交联部分而交联；并且其中使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联；其中所述组织填充物是凝胶。在一些实施方案中，组织填充物是水凝胶。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，组织填充物中的HA的总浓度为约10mg/mL至约50mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的HA的总浓度为约15mg/mL、约16mg/mL,17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL或约30mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的交联HA的浓度为约10mg/mL至约50mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的交联HA的浓度为约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL或约30mg/mL。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含：糖胺聚糖，其选自透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)、淀粉、藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、角叉菜胶和瓜尔胶；和麻醉剂；其中所述糖胺聚糖的一部分通过包含烷烃或烷基链、醚基团和仲醇中的一种或多种的交联部分而交联；并且其中使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联；所述组织填充物包含丝蛋白或丝蛋白片段(SPF)。在一些实施方案中，丝蛋白是丝心蛋白。在一些实施方案中，丝蛋白是基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白。在一些实施方案中，SPF具有范围为约1kDa至约250kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约5kDa至约150kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约6kDa至约17kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约17kDa至约39kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约39kDa至约80kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有低分子量。在一些实施方案中，SPF具有中等分子量。在一些实施方案中，SPF具有高分子量。在一些实施方案中，丝蛋白片段(SPF)具有约1.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有最高达60％的结晶度。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，相对于SPF的总量，交联SPF的％w/w量为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，交联SPF的交联度为约1％至约100％。在一些实施方案中，交联SPF的交联度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，交联SPF的交联度为约1％至约15％。在一些实施方案中，交联SPF的交联度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％和约15％中的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含：糖胺聚糖，其选自透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)、淀粉、藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、角叉菜胶和瓜尔胶；和麻醉剂；其中所述糖胺聚糖的一部分通过包含烷烃或烷基链、醚基团和仲醇中的一种或多种的交联部分而交联；并且其中使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联；所述组织填充物包含丝蛋白或丝蛋白片段(SPF)，其中所述SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，交联SPF包含交联部分，该交联部分包含烷烃或烷基链和/或醚基团。在一些实施方案中，交联SPF包含含有聚乙二醇(PEG)链的交联部分。在一些实施方案中，交联SPF包含含有仲醇的交联部分。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联。在一些实施方案中，交联剂和/或交联前体包含环氧基团。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联，所述交联剂、交联前体或活化剂选自多环氧连接剂、二环氧连接剂、多环氧-PEG、二环氧-PEG、多缩水甘油基-PEG、二缩水甘油基-PEG、聚丙烯酸酯PEG、二丙烯酸酯PEG、1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油氧基丁烷、二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、UV光、戊二醛、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCDI)、季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、己二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、碳二亚胺，以及它们的任何组合。在一些实施方案中，使用多官能环氧化合物获得交联，所述多官能环氧化合物选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油多缩水甘油醚、二甘油多缩水甘油醚、甘油多缩水甘油醚、三羟甲基丙烷多缩水甘油醚、季戊四醇多缩水甘油醚和山梨醇多缩水甘油醚。在一些实施方案中，使用选自聚乙二醇二缩水甘油醚、二环氧PEG、PEG二缩水甘油醚、聚氧乙烯双缩水甘油醚、PEGDE和PEGDGE的交联剂和/或交联前体获得交联。在一些实施方案中，使用平均Mn为约500、约1000、约2000或约6000的聚乙二醇二缩水甘油醚获得交联。在一些实施方案中，使用具有2至25个乙二醇基团的聚乙二醇二缩水甘油醚获得交联。在一些实施方案中，使用交联剂和/或交联前体获得交联，所述交联剂和/或交联前体选自多环氧丝心蛋白连接剂、二环氧丝心蛋白连接剂、多环氧丝心蛋白片段连接剂、二环氧丝心蛋白片段连接剂、多缩水甘油基丝心蛋白连接剂、二缩水甘油基丝心蛋白连接剂、多缩水甘油基丝心蛋白片段连接剂和二缩水甘油基丝心蛋白片段连接剂。在一些实施方案中，SPF的一部分联至HA。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，组织填充物是凝胶。在一些实施方案中，组织填充物是水凝胶。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，组织填充物中的SPF的总浓度为约0.1mg/mL至约15mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的SPF的总浓度为约0.1mg/mL、约0.5mg/mL、约1mg/mL、约1.5mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约5.5mg/mL、约6mg/mL、约6.5mg/mL、约7mg/mL、约7.5mg/mL、约8mg/mL、约8.5mg/mL、约9mg/mL、约9.5mg/mL、约10mg/mL、约10.5mg/mL、约11mg/mL、约11.5mg/mL、约12mg/mL、约12.5mg/mL、约13mg/mL、约13.5mg/mL、约14mg/mL、约14.5mg/mL或约15mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的交联SPF的浓度为约0.1mg/mL至约15mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的交联SPF的浓度为约0.1mg/mL、约0.5mg/mL、约1mg/mL、约1.5mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约5.5mg/mL、约6mg/mL、约6.5mg/mL、约7mg/mL、约7.5mg/mL、约8mg/mL、约8.5mg/mL、约9mg/mL、约9.5mg/mL、约10mg/mL、约10.5mg/mL、约11mg/mL、约11.5mg/mL、约12mg/mL、约12.5mg/mL、约13mg/mL、约13.5mg/mL、约14mg/mL、约14.5mg/mL或约15mg/mL。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含：糖胺聚糖，其选自透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)、淀粉、藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、角叉菜胶和瓜尔胶；和麻醉剂；其中所述糖胺聚糖的一部分通过包含烷烃或烷基链、醚基团和仲醇中的一种或多种的交联部分而交联；并且其中使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联；所述组织填充物任选地包含丝蛋白或丝蛋白片段(SPF)，其中所述SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，组织填充物是真皮填充物。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，组织填充物是可注射的。在一些实施方案中，组织填充物具有约25Pa至约1500Pa的储能模量(G’)。在一些实施方案中，组织填充物的储能模量(G’)为约25Pa、约26Pa、约27Pa、约28Pa、约29Pa、约30Pa、约31Pa、约32Pa、约33Pa、约34Pa、约35Pa、约36Pa、约37Pa、约38Pa、约39Pa、约40Pa、约41Pa、约42Pa、约43Pa、约44Pa、约45Pa、约46Pa、约47Pa、约48Pa、约49Pa、约50Pa、约51Pa、约52Pa、约53Pa、约54Pa、约55Pa、约56Pa、约57Pa、约58Pa、约59Pa、约60Pa、约61Pa、约62Pa、约63Pa、约64Pa、约65Pa、约66Pa、约67Pa、约68Pa、约69Pa、约70Pa、约71Pa、约72Pa、约73Pa、约74Pa、约75Pa、约76Pa、约77Pa、约78Pa、约79Pa、约80Pa、约81Pa、约82Pa、约83Pa、约84Pa、约85Pa、约86Pa、约87Pa、约88Pa、约89Pa、约90Pa、约91Pa、约92Pa、约93Pa、约94Pa、约95Pa、约96Pa、约97Pa、约98Pa、约99Pa、约100Pa、约101Pa、约102Pa、约103Pa、约104Pa、约105Pa、约106Pa、约107Pa、约108Pa、约109Pa、约110Pa、约111Pa、约112Pa、约113Pa、约114Pa、约115Pa、约116Pa、约117Pa、约118Pa、约119Pa、约120Pa、约121Pa、约122Pa、约123Pa、约124Pa或约125Pa。在一些实施方案中，本文G'通过约0.1至约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，G’通过约1Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，G’通过约5Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，G’通过约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，组织填充物具有约1Pa·s至约10Pa·s的复数粘度。在一些实施方案中，组织填充物具有约1Pa·s、约1.5Pa·s、约2Pa·s、约2.5Pa·s、约3Pa·s、约3.5Pa·s、约4Pa·s、约4.5Pa·s、约5Pa·s、约5.5Pa·s、约6Pa·s、约6.5Pa·s、约7Pa·s、约7.5Pa·s、约8Pa·s、约8.5Pa·s、约9Pa·s、约9.5Pa·s或约10Pa·s的复数粘度。在一些实施方案中，复数粘度通过约0.1至约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，复数粘度通过约1Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，复数粘度通过约5Hz的振荡应力测量。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者中的病况的方法，和/或一种在有需要的受试者中进行美容处理的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的生物相容性组织填充物，所述生物相容性组织填充物包含：糖胺聚糖，其选自透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)、淀粉、藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、角叉菜胶和瓜尔胶；和麻醉剂；其中所述糖胺聚糖的一部分通过包含烷烃或烷基链、醚基团和仲醇中的一种或多种的交联部分而交联；并且其中使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联；所述组织填充物任选地包含丝蛋白或丝蛋白片段(SPF)，其中所述SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，病况是皮肤病况。在一些实施方案中，皮肤病况选自皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹、皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、脸颊凹陷、薄唇、后眼窝缺陷、面部褶皱和皱纹。在一些实施方案中，将组织填充物施用于受试者的真皮区域。在一些实施方案中，所述方法是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。在一些实施方案中，所述方法是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。在一些实施方案中，组织填充物抗生物降解、生物侵蚀、生物吸收和/或生物再吸收至少约3天、约7天、约14天、约21天、约28天、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。在一些实施方案中，与由包含多糖和利多卡因的对照组织填充物诱导的炎症应答相比，向受试者施用组织填充物导致炎症应答降低，其中对照组织填充物不包含丝蛋白片段(SPF)。在一些实施方案中，与由包含多糖和利多卡因的对照组织填充物诱导的胶原产生相比，向受试者施用组织填充物导致胶原产生增加，其中对照组织填充物不包含丝蛋白片段(SPF)。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一个实施方案中，本发明包括可由丝和透明质酸制备的组织填充物。
在一些实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含平均分子量范围为约1kDa至约250kDa的丝蛋白片段(SPF)。在一些实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含平均分子量范围为约5kDa至约150kDa的丝蛋白片段(SPF)。在一些实施方案中，SPF具有范围为约6kDa至约17kDa的平均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约17kDa至约39kDa的平均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约39kDa至约80kDa的平均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约80kDa至约150kDa的平均分子量。
在一些实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含最高达约0％至100％的与丝蛋白片段(SPF)交联的SPF。在一些实施方案中，使用交联剂如BDDE或本文所述的其他交联剂之一将SPF交联至SPF。在一些实施方案中，交联度最高达约100％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和透明质酸(HA)，其中最高达约0％至100％的SPF交联至SPF，并且使用交联剂如BDDE或本文所述的其他交联剂之一将SPF交联至SPF，并且SPF交联度最高达约100％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和透明质酸(HA)，其中使用交联剂如BDDE或本文所述的其他交联剂之一将最高达100％的HA交联至HA。在一些实施方案中，最高达约100％的SPF交联至SPF，其中使用交联剂如BDDE或本文所述的其他交联剂之一将SPF交联至SPF，并且SPF交联度最高达约100％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和透明质酸(HA)，其中0％至100％的HA是非交联的。在一些实施方案中，最高达约100％的SPF是交联的，其中使用交联剂如BDDE或本文所述的其他交联剂之一来交联SPF，并且SPF交联度最高达约100％。在一些实施方案中，所有HA是非交联的。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和透明质酸(HA)，其中0％至100％的SPF交联至HA。在一些实施方案中，使用交联剂如BDDE或本文所述的交联剂之一交联SPF和HA。在一些实施方案中，SPF-HA交联度最高达约100％。在一些实施方案中，最高达100％的HA交联至HA。在一些实施方案中，使用交联剂如BDDE或本文所述的交联剂之一将HA交联至HA。在一些实施方案中，至少0.1％的HA是非交联的。在一些实施方案中，所有HA是非交联的。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和透明质酸(HA)，其中至少0.1％的HA是非交联的。在一些实施方案中，最高达约100％的SPF是交联的，其中使用交联剂如BDDE或本文所述的其他交联剂之一来交联SPF，并且SPF交联度最高达约100％。在一些实施方案中，所有HA是非交联的。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和透明质酸(HA)，其中至少0.1％的SPF交联至HA。在一些实施方案中，使用交联剂如BDDE或本文所述的交联剂之一交联SPF和HA。在一些实施方案中，SPF-HA交联度最高达约100％。在一些实施方案中，最高达100％的HA交联至HA。在一些实施方案中，使用交联剂如BDDE或本文所述的交联剂之一将HA交联至HA。在一些实施方案中，至少0.1％的HA是非交联的。在一些实施方案中，所有HA是非交联的。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，其中SPF基本上不含丝胶蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性凝胶组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性水凝胶组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)、多糖和水。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，其中SPF的结晶度为约0％至约60％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，并且还包含活性剂。在一些实施方案中，活性剂可以是酶抑制剂、麻醉剂、药用神经毒素、抗氧化剂、抗感染剂、血管扩张剂、反射剂、抗炎剂、紫外(UV)光阻挡剂、染料、激素、免疫抑制剂或抗炎剂。在一个实施方案中，麻醉剂是利多卡因。
在一个实施方案中，本发明涉及一种可注射生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖。在一些实施方案中，G'通过约0.1至约10Hz的振荡应力测量。在一个实施方案中，G’通过约1Hz的振荡应力测量。
在一个实施方案中，本发明涉及一种制备生物相容性组织填充物的方法，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述方法包括提供SPF溶液，和向所述溶液中加入胶凝促进剂，所述胶凝促进剂可以是任何给质子物质。
在一个实施方案中，本发明涉及一种制备生物相容性组织填充物的方法，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述方法包括提供SPF溶液，和使所述溶液经受机械激发。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者中的病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的生物相容性组织填充物，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖。在一些实施方案中，病况是皮肤病况。在一些实施方案中，皮肤病况可以是皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹、皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、脸颊凹陷、太阳穴凹陷、唇薄、后眼窝缺陷、面部褶皱或皱纹。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在有需要的受试者中进行美容处理的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的生物相容性组织填充物，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖。
在一些实施方案中，本发明的方法包括将生物相容性组织填充物施用于受试者的真皮区域，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖。
在一个实施方案中，本发明的方法包括施用生物相容性组织填充物，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述方法可以是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。
在一个实施方案中，本发明的方法包括施用生物相容性组织填充物，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5-约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述方法可以是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。
在一个实施方案中，根据本发明的方法施用的包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖的生物相容性组织填充物在施用后抗生物降解、生物吸收和/或生物再吸收至少约3天。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，组织填充物还包含交联部分，例如环氧衍生的交联部分。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，组织填充物还包含交联部分，例如环氧衍生的交联部分。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。
在一些实施方案中，相对于SPF的总量，交联SPF的％w/w量为最高达约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
在一些实施方案中，SPF的交联度为最高达约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
在一些实施方案中，相对于HA的总量，交联HA的％w/w量为最高达约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
在一些实施方案中，HA的交联度为最高达约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联。在一些实施方案中，交联剂和/或交联前体包含环氧基团。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联。在一些实施方案中，交联剂和/或交联前体包含环氧基团。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联，所述交联剂、交联前体或活化剂选自1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油氧基丁烷、二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、UV光、戊二醛、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCDI)、季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、己二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、碳二亚胺，以及它们的任何组合。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得交联，所述交联剂、交联前体或活化剂选自1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油氧基丁烷、二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、UV光、戊二醛、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCDI)、季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、己二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、碳二亚胺，以及它们的任何组合。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物凝胶，例如真皮填充物凝胶，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，凝胶还包含水。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物凝胶，例如真皮填充物凝胶，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，凝胶还包含水。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物水凝胶，例如真皮填充物水凝胶，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，水凝胶还包含水。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物水凝胶，例如真皮填充物水凝胶，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，水凝胶还包含水。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF具有最高达约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％或大于60％的结晶度。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF具有最高达约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％或大于60％的结晶度。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，组织填充物还包含活性剂。在一些实施方案中，活性剂选自酶抑制剂、麻醉剂、药用神经毒素、抗氧化剂、抗感染剂、抗炎剂、紫外(UV)光阻断剂、染料、激素、免疫抑制剂和抗炎剂。在一些实施方案中，麻醉剂是利多卡因。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，组织填充物还包含活性剂。在一些实施方案中，活性剂选自酶抑制剂、麻醉剂、药用神经毒素、抗氧化剂、抗感染剂、抗炎剂、紫外(UV)光阻断剂、染料、激素、免疫抑制剂和抗炎剂。在一些实施方案中，麻醉剂是利多卡因。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性可注射组织填充物，例如可注射真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性可注射组织填充物，例如可注射真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。
在一个实施方案中，本发明涉及具有约50Pa至约1500Pa的储能模量(G’)的生物相容性组织填充物，例如具有约50Pa至约1500Pa的储能模量(G’)的真皮填充物，所述填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，G'通过约0.1至约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，G’通过约1Hz的振荡应力测量。
在一个实施方案中，本发明涉及具有约50Pa至约1500Pa的储能模量(G’)的生物相容性组织填充物，例如具有约50Pa至约1500Pa的储能模量(G’)的真皮填充物，所述填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，交联包括化学键交联。在一些实施方案中，一部分交联是零长度交联。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，G'通过约0.1至约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，G’通过约1Hz的振荡应力测量。
在一些实施方案中，本发明涉及一种制备生物相容性组织填充物例如真皮填充物的方法，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述方法包括提供包含SPF和多糖的组合物，和向溶液中加入交联剂、交联前体、活化剂或胶凝促进剂，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，组织填充物还包含交联部分，例如环氧衍生的交联部分。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。
在一些实施方案中，本发明涉及一种制备生物相容性组织填充物例如真皮填充物的方法，所述生物相容性组织填充物包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述方法包括提供包含SPF和多糖的组合物，和向溶液中加入交联剂、交联前体、活化剂或胶凝促进剂，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，组织填充物还包含交联部分，例如环氧衍生的交联部分。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。
在一些实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者中的病况例如皮肤病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，组织填充物还包含交联部分，例如环氧衍生的交联部分。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，皮肤病况选自皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹、皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、脸颊凹陷、薄唇、后眼窝缺陷、面部褶皱和皱纹。在一些实施方案中，将组织填充物施用于受试者的真皮区域中。在一些实施方案中，所述方法是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。在一些实施方案中，所述方法是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。在一些实施方案中，组织填充物抗生物降解、生物侵蚀、生物吸收和/或生物再吸收至少约3天、约7天、约14天、约21天、约28天、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。
在一些实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者中的病况例如皮肤病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，组织填充物还包含交联部分，例如环氧衍生的交联部分。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，皮肤病况选自皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹、皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、脸颊凹陷、薄唇、后眼窝缺陷、面部褶皱和皱纹。在一些实施方案中，将组织填充物施用于受试者的真皮区域中。在一些实施方案中，所述方法是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。在一些实施方案中，所述方法是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。在一些实施方案中，组织填充物抗生物降解、生物侵蚀、生物吸收和/或生物再吸收至少约3天、约7天、约14天、约21天、约28天、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。
在一些实施方案中，本发明涉及在有需要的受试者中进行美容处理的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF的平均重均分子量范围为约1kDa至约250kDa、约5kDa至约150kDa、约6kDa至约17kDa、约17kDa至约39kDa或约39kDa至约80kDa。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，组织填充物还包含交联部分，例如环氧衍生的交联部分。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，将组织填充物施用于受试者的真皮区域中。在一些实施方案中，所述方法是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。在一些实施方案中，所述方法是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。在一些实施方案中，组织填充物抗生物降解、生物侵蚀、生物吸收和/或生物再吸收至少约3天、约7天、约14天、约21天、约28天、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。
在一些实施方案中，本发明涉及在有需要的受试者中进行美容处理的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的生物相容性组织填充物，例如真皮填充物，其包含多分散性为约1.5至约3.0的丝蛋白片段(SPF)和多糖，所述SPF具有低分子量、中等分子量和/或高分子量。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，SPF的一部分是交联的。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，多糖的一部分交联至多糖。在一些实施方案中，组织填充物还包含交联部分，例如环氧衍生的交联部分。在一些实施方案中，一部分交联是自交联。在一些实施方案中，交联SPF的部分为至多约100％。在一些实施方案中，交联多糖的部分为至多约100％。在一些实施方案中，多糖是透明质酸(HA)。在一些实施方案中，SPF基本上不含丝胶蛋白。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，将组织填充物施用于受试者的真皮区域中。在一些实施方案中，所述方法是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。在一些实施方案中，所述方法是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。在一些实施方案中，组织填充物抗生物降解、生物侵蚀、生物吸收和/或生物再吸收至少约3天、约7天、约14天、约21天、约28天、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。
在一些实施方案中，本发明涉及生物相容性组织填充物，其包含透明质酸(HA)和麻醉剂，其中所述HA的一部分被一种或多种连接剂部分改性，所述连接剂部分包含烷烃或烷基链、醚基团和仲醇中的一种或多种，其中所述连接剂部分在所述连接剂的一端处连接至所述HA。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得改性。在一些实施方案中，组织填充物中的HA的改性度(MoD)为约10.0％、约10.1％、约10.2％、约10.3％、约10.4％、约10.5％、约10.6％、约10.7％、约10.8％、约10.9％、约11.0％、约11.1％、约11.2％、约11.3％、约11.4％、约11.5％、约11.6％、约11.7％、约11.8％、约11.9％、约12.0％、约12.1％、约12.2％、约12.3％、约12.4％、约12.5％、约12.6％、约12.7％、约12.8％、约12.9％、约13.0％、约13.1％、约13.2％、约13.3％、约13.4％、约13.5％、约13.6％、约13.7％、约13.8％、约13.9％、约14.0％、约14.1％、约14.2％、约14.3％、约14.4％、约14.5％、约14.6％、约14.7％、约14.8％、约14.9％、约15.0％、约15.1％、约15.2％、约15.3％、约15.4％、约15.5％、约15.6％、约15.7％、约15.8％、约15.9％、约16.0％、约16.1％、约16.2％、约16.3％、约16.4％、约16.5％、约16.6％、约16.7％、约16.8％、约16.9％、约17.0％、约17.1％、约17.2％、约17.3％、约17.4％、约17.5％、约17.6％、约17.7％、约17.8％、约17.9％、约18.0％、约18.1％、约18.2％、约18.3％、约18.4％、约18.5％、约18.6％、约18.7％、约18.8％、约18.9％、约19.0％、约19.1％、约19.2％、约19.3％、约19.4％、约19.5％、约19.6％、约19.7％、约19.8％、约19.9％或约20.0％。在一些实施方案中，相对于组织填充物中的HA总量，改性HA的％w/w量为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
在一些实施方案中，改性HA包含交联HA，其中交联HA的交联度为约1％至约100％。在一些实施方案中，交联HA的交联度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，交联HA的交联度为约1％至约15％。
在一些实施方案中，改性或交联HA包含含有聚乙二醇(PEG)链的连接剂或交联部分。在一些实施方案中，交联剂和/或交联前体包含环氧基团。在一些实施方案中，使用交联剂、交联前体或活化剂获得改性或交联，所述交联剂、交联前体或活化剂选自多环氧连接剂、二环氧连接剂、多环氧-PEG、二环氧-PEG、多缩水甘油基-PEG、二缩水甘油基-PEG、聚丙烯酸酯PEG、二丙烯酸酯PEG、1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油氧基丁烷、二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、UV光、戊二醛、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCDI)、季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、己二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、碳二亚胺，以及它们的任何组合。在一些实施方案中，使用多官能环氧化合物获得改性或交联，所述多官能环氧化合物选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油多缩水甘油醚、二甘油多缩水甘油醚、甘油多缩水甘油醚、三羟甲基丙烷多缩水甘油醚、季戊四醇多缩水甘油醚和山梨醇多缩水甘油醚。在一些实施方案中，使用交联剂和/或交联前体获得改性或交联，所述交联剂和/或交联前体选自聚乙二醇二缩水甘油醚、二环氧PEG、PEG二缩水甘油醚、聚氧乙烯双缩水甘油醚、PEGDE和PEGDGE。在一些实施方案中，使用平均Mn为约500、约1000、约2000或约6000的聚乙二醇二缩水甘油醚获得改性或交联。在一些实施方案中，使用具有约2至约25个乙二醇基团的聚乙二醇二缩水甘油醚获得改性或交联。在一些实施方案中，使用交联剂和/或交联前体获得改性或交联，所述交联剂和/或交联前体选自多环氧丝心蛋白连接剂、二环氧丝心蛋白连接剂、多环氧丝心蛋白片段连接剂、二环氧丝心蛋白片段连接剂、多缩水甘油基丝心蛋白连接剂、二缩水甘油基丝心蛋白连接剂、多缩水甘油基丝心蛋白片段连接剂和二缩水甘油基丝心蛋白片段连接剂。
在一些实施方案中，组织填充物还包含有机化合物和/或无机化合物。在一些实施方案中，无机化合物包括钙羟磷灰石。在一些实施方案中，将钙羟磷灰石配制成直径为约1μm至约100μm、约1μm至约10μm、约2μm至约12μm、约3μm至约10μm、约4μm至约15μm、约8μm至约12μm、约5μm至约10μm、约6μm至约12μm、约7μm至约20μm、约9μm至约18μm或约10μm至约25μm的颗粒。在一些实施方案中，钙羟磷灰石的浓度为约0.001％至约5％。在一些实施方案中，钙羟磷灰石的浓度为约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.011％、约0.012％、约0.013％、约0.014％、约0.015％、约0.016％、约0.017％、约0.018％、约0.019％或约0.02％。在一些实施方案中，钙羟磷灰石的浓度为约0.05％、约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％、约1％、约1.05％、约1.1％、约1.15％、约1.2％、约1.25％、约1.3％、约1.35％、约1.4％、约1.45％、约1.5％、约1.55％、约1.6％、约1.65％、约1.7％、约1.75％、约1.8％、约1.85％、约1.9％、约1.95％或约2％。在一些实施方案中，有机化合物包括选自甘氨酸、L-脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸。
在一些实施方案中，HA从链球菌细菌或从枯草芽孢杆菌细菌获得。在一些实施方案中，活性剂是利多卡因。在一些实施方案中，组织填充物中的活性剂的浓度为约0.001％至约5％。在一些实施方案中，组织填充物中的利多卡因的浓度为约0.3％。
在一些实施方案中，本文公开的组织填充物是凝胶。在一些实施方案中，组织填充物是水凝胶。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，组织填充物中的HA的总浓度为约10mg/mL至约50mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的HA的总浓度为约15mg/mL、约16mg/mL,17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL或约30mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的改性或交联HA的浓度为约10mg/mL至约50mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的改性或交联HA的浓度为约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL或约30mg/mL。
在一些实施方案中，所公开的组织填充物还包含丝蛋白或丝蛋白片段(SPF)。在一些实施方案中，丝蛋白是丝心蛋白。在一些实施方案中，丝蛋白是基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白。在一些实施方案中，SPF具有范围为约1kDa至约250kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约5kDa至约150kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约6kDa至约17kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约17kDa至约39kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有范围为约39kDa至约80kDa的平均重均分子量。在一些实施方案中，SPF具有低分子量。在一些实施方案中，SPF具有中等分子量。在一些实施方案中，SPF具有高分子量。在一些实施方案中，丝蛋白片段(SPF)具有约1.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有最高达60％的结晶度。
在一些实施方案中，本发明涉及包含HA和SPF的组织填充物，其中SPF的一部分是改性或交联的。在一些实施方案中，相对于SPF的总量，改性或交联SPF的％w/w量为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，改性或交联SPF的改性或交联度为约1％至约100％。在一些实施方案中，改性或交联SPF的改性或交联度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，改性或交联SPF的改性或交联度为约1％至约15％。在一些实施方案中，改性或交联SPF的改性或交联度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％和约15％中的一种或多种。
在一些实施方案中，改性或交联SPF包含含有烷烃或烷基链和/或醚基的连接剂或交联部分，其中连接剂或交联部分在连接剂或交联部分的一端处连接至SPF。在一些实施方案中，改性或交联SPF包含含有聚乙二醇(PEG)链的连接剂或交联部分。在一些实施方案中，改性或交联SPF包含含有仲醇的连接剂或交联部分。在一些实施方案中，使用改性剂或交联剂、改性或交联前体或活化剂获得改性或交联。在一些实施方案中，改性剂或交联剂和/或改性或交联前体包含环氧基团。在一些实施方案中，使用改性剂或交联剂、改性或交联前体或活化剂获得改性或交联，所述改性剂或交联剂、改性或交联前体或活化剂选自多环氧连接剂、二环氧连接剂、多环氧PEG、二环氧PEG、多缩水甘油基PEG、二缩水甘油基PEG、聚丙烯酸酯PEG、二丙烯酸酯PEG、1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油氧基丁烷、二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、UV光、戊二醛、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCDI)、季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、己二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、碳二亚胺，以及它们的任何组合。在一些实施方案中，使用多官能环氧化合物获得改性或交联，所述多官能环氧化合物选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油多缩水甘油醚、二甘油多缩水甘油醚、甘油多缩水甘油醚、三羟甲基丙烷多缩水甘油醚、季戊四醇多缩水甘油醚和山梨醇多缩水甘油醚。
在一些实施方案中，使用选自聚乙二醇二缩水甘油醚、二环氧PEG、PEG二缩水甘油醚、聚氧乙烯双缩水甘油醚、PEGDE和PEGDGE的改性剂或交联剂和/或改性或交联前体获得改性或交联。在一些实施方案中，使用平均Mn为约500、约1000、约2000或约6000的聚乙二醇二缩水甘油醚获得改性或交联。在一些实施方案中，使用具有约2至约25个乙二醇基团的聚乙二醇二缩水甘油醚获得改性或交联。在一些实施方案中，使用改性剂或交联剂和/或改性或交联前体获得改性或交联，所述改性剂或交联剂和/或改性或交联前体选自多环氧丝心蛋白连接剂、二环氧丝心蛋白连接剂、多环氧丝心蛋白片段连接剂、二环氧丝心蛋白片段连接剂、多缩水甘油基丝心蛋白连接剂、二缩水甘油基丝心蛋白连接剂、多缩水甘油基丝心蛋白片段连接剂和二缩水甘油基丝心蛋白片段连接剂。
在一些实施方案中，本发明涉及包含HA和SPF的组织填充物，其中SPF的一部分联至HA。在一些实施方案中，本发明涉及包含HA和SPF的组织填充物，其中SPF的一部分交联至SPF。在一些实施方案中，组织填充物是凝胶。在一些实施方案中，组织填充物是水凝胶。在一些实施方案中，组织填充物还包含水。在一些实施方案中，组织填充物中的SPF的总浓度为约0.1mg/mL至约15mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的SPF的总浓度为约0.1mg/mL、约0.5mg/mL、约1mg/mL、约1.5mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约5.5mg/mL、约6mg/mL、约6.5mg/mL、约7mg/mL、约7.5mg/mL、约8mg/mL、约8.5mg/mL、约9mg/mL、约9.5mg/mL、约10mg/mL、约10.5mg/mL、约11mg/mL、约11.5mg/mL、约12mg/mL、约12.5mg/mL、约13mg/mL、约13.5mg/mL、约14mg/mL、约14.5mg/mL或约15mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的改性或交联SPF的浓度为约0.1mg/mL至约15mg/mL。在一些实施方案中，组织填充物中的改性或交联SPF的浓度为约0.1mg/mL、约0.5mg/mL、约1mg/mL、约1.5mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约5.5mg/mL、约6mg/mL、约6.5mg/mL、约7mg/mL、约7.5mg/mL、约8mg/mL、约8.5mg/mL、约9mg/mL、约9.5mg/mL、约10mg/mL、约10.5mg/mL、约11mg/mL、约11.5mg/mL、约12mg/mL、约12.5mg/mL、约13mg/mL、约13.5mg/mL、约14mg/mL、约14.5mg/mL或约15mg/mL。
在一些实施方案中，本发明涉及包含改性或交联HA和/或改性或交联SPF的组织填充物，其中所述组织填充物是真皮填充物。在一些实施方案中，组织填充物是可生物降解的。在一些实施方案中，组织填充物是可注射的。在一些实施方案中，组织填充物具有约25Pa至约1500Pa的储能模量(G’)。在一些实施方案中，组织填充物的储能模量(G’)为约25Pa、约26Pa、约27Pa、约28Pa、约29Pa、约30Pa、约31Pa、约32Pa、约33Pa、约34Pa、约35Pa、约36Pa、约37Pa、约38Pa、约39Pa、约40Pa、约41Pa、约42Pa、约43Pa、约44Pa、约45Pa、约46Pa、约47Pa、约48Pa、约49Pa、约50Pa、约51Pa、约52Pa、约53Pa、约54Pa、约55Pa、约56Pa、约57Pa、约58Pa、约59Pa、约60Pa、约61Pa、约62Pa、约63Pa、约64Pa、约65Pa、约66Pa、约67Pa、约68Pa、约69Pa、约70Pa、约71Pa、约72Pa、约73Pa、约74Pa、约75Pa、约76Pa、约77Pa、约78Pa、约79Pa、约80Pa、约81Pa、约82Pa、约83Pa、约84Pa、约85Pa、约86Pa、约87Pa、约88Pa、约89Pa、约90Pa、约91Pa、约92Pa、约93Pa、约94Pa、约95Pa、约96Pa、约97Pa、约98Pa、约99Pa、约100Pa、约101Pa、约102Pa、约103Pa、约104Pa、约105Pa、约106Pa、约107Pa、约108Pa、约109Pa、约110Pa、约111Pa、约112Pa、约113Pa、约114Pa、约115Pa、约116Pa、约117Pa、约118Pa、约119Pa、约120Pa、约121Pa、约122Pa、约123Pa、约124Pa或约125Pa。在一些实施方案中，G'通过约0.1至约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，G’通过约1Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，G’通过约5Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，G’通过约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，组织填充物具有约1Pa·s至约10Pa·s的复数粘度。在一些实施方案中，组织填充物具有约1Pa·s、约1.5Pa·s、约2Pa·s、约2.5Pa·s、约3Pa·s、约3.5Pa·s、约4Pa·s、约4.5Pa·s、约5Pa·s、约5.5Pa·s、约6Pa·s、约6.5Pa·s、约7Pa·s、约7.5Pa·s、约8Pa·s、约8.5Pa·s、约9Pa·s、约9.5Pa·s或约10Pa·s的复数粘度。在一些实施方案中，复数粘度通过约0.1至约10Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，复数粘度通过约1Hz的振荡应力测量。在一些实施方案中，复数粘度通过约5Hz的振荡应力测量。
在一些实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者中的病况的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的组织填充物，所述组织填充物包含改性或交联HA和/或改性或交联SPF。在一些实施方案中，病况是皮肤病况。在一些实施方案中，皮肤病况选自皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹、皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、脸颊凹陷、薄唇、后眼窝缺陷、面部褶皱和皱纹。
在一些实施方案中，本发明涉及在有需要的受试者中进行美容处理的方法，其包括向受试者施用有效量的组织填充物，所述组织填充物包含改性或交联HA和/或改性或交联SPF。在一些实施方案中，将组织填充物施用于受试者的真皮区域中。在一些实施方案中，所述方法是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。在一些实施方案中，所述方法是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。
在本文所述方法的一些实施方案中，组织填充物抗生物降解、生物侵蚀、生物吸收和/或生物再吸收至少约3天、约7天、约14天、约21天、约28天、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。在本文所述方法的一些实施方案中，与由包含多糖和利多卡因的对照组织填充物诱导的炎症应答相比，向受试者施用组织填充物导致炎症应答降低，其中所述对照组织填充物不包含丝蛋白片段(SPF)。
在本文所述方法的一些实施方案中，与由包含多糖和利多卡因的对照组织填充物诱导的胶原产生相比，向受试者施用组织填充物导致胶原产生增加，其中所述对照组织填充物不包含丝蛋白片段(SPF)。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其包含SPF纳米颗粒或微粒。在一些实施方案中，颗粒被整合到凝胶中。在一些实施方案中，颗粒共价地整合到凝胶中。在一些实施方案中，颗粒非共价地整合到凝胶中。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物包含利多卡因或如本文所述的任何其他麻醉剂。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物不包含如本文所述的麻醉剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其还包含本领域已知的任何纳米颗粒和/或微粒。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒包含己内酯。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒包含纤维素。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒被整合到凝胶中。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒共价连接。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒非共价连接。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物包含利多卡因或如本文所述的任何其他麻醉剂。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物不包含如本文所述的麻醉剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其还包括整合到凝胶中的纳米纤维或微纤维。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维共价连接。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维非共价连接。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物包含利多卡因或如本文所述的任何其他麻醉剂。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物不包含如本文所述的麻醉剂。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维包含本文所述的SPF。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维包含己内酯。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维包含纤维素。
在一些实施方案中，本公开提供了凝胶，例如但不限于水凝胶，并且不限于用于本文所述的任何使用方法，所述凝胶和/或水凝胶包含SPF纳米颗粒或微粒。在一些实施方案中，凝胶和/或水凝胶可以包含或不包含本文所述的HA。在一些实施方案中，除了包埋在基质中的SPF纳米颗粒或微粒之外，凝胶和/或水凝胶基质不包含本文所述的SPF。在一些实施方案中，凝胶和/或水凝胶是本领域已知的任何凝胶或水凝胶。在一些实施方案中，颗粒被整合到凝胶中。在一些实施方案中，颗粒共价地整合到凝胶中。在一些实施方案中，颗粒非共价地整合到凝胶中。在一些实施方案中，凝胶或水凝胶包含利多卡因或如本文所述的任何其他麻醉剂。在一些实施方案中，凝胶或水凝胶不包含如本文所述的麻醉剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其被配置成递送另一种分子、化合物、药物等。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含如本文所述的游离丝和/或游离SPF。在一些实施方案中，游离丝和/或游离SPF增强胶原蛋白表达。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含视黄醇。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含维生素，包括但不限于维生素C。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含炎性剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含抗炎剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种刺激上皮细胞再生的试剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种刺激伤口愈合的试剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种刺激疼痛控制的试剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种能够提供持续释放的试剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种润滑剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其还包含显像剂。在一些实施方案中，显像剂选自碘、DOPA和成像纳米颗粒。在一些实施方案中，显像剂选自顺磁性显像剂和超顺磁性显像剂。在一些实施方案中，显像剂选自基于NP的磁共振成像(MRI)造影剂、正电子发射断层扫描(PET)/单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像剂、超声活性颗粒和光学活性(例如发光、荧光、红外)颗粒。在一些实施方案中，显像剂是SPECT显像剂、PET显像剂、光学显像剂、MRI或MRS显像剂、超声显像剂、多模态显像剂、X射线显像剂或CT显像剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，用于递送与特定区域相关的药物，包括但不限于注射区域。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其还包含微粒或微胶囊。在一些实施方案中，微粒或微胶囊还包含药物。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其中所述组合物或组织填充物是不透射线的。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，和本文所述的所有使用方法，其还包含基本上为固体的丝组合物，所述丝组合物包含本文所述的SPF，其具有选自低分子量、中等分子量和高分子量的平均重均分子量和1至约5的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有1至约1.5的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有约1.5至约2.0的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有约1.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有约2.0至约2.5的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有约2.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，所述组合物还包含相对于SPF约0.01％(w/w)至约10％(w/w)的丝胶蛋白。在一些实施方案中，SPF被配制成颗粒。在一些实施方案中，颗粒具有约1μm至约1000μm的尺寸。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物中的SPF从包含SPF片段的前体溶液获得，所述SPF片段具有选自低分子量、中等分子量和高分子量的平均重均分子量和1至约5的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有1至约1.5的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有约1.5至约2.0的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有约1.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有约2.0至约2.5的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有约2.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液还包含相对于前体溶液中的SPF约0.01％(w/w)至约10％(w/w)的丝胶蛋白。在一些实施方案中，在获得基本上为固体的丝组合物中的丝心蛋白片段之前，前体溶液中的SPF在前体溶液中至少10天时未自发地或逐渐地胶凝并且在颜色或浊度上未明显改变。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物中的SPF是通过选自冷冻干燥法、薄膜蒸发法、盐析法和PVA-辅助法的方法从前体溶液中获得的。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约0.01重量％至约10.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约0.01重量％至约1.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约1.0重量％至约2.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约2.0重量％至约3.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约3.0重量％至约4.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约4.0重量％至约5.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约5.0重量％至约6.0重量％存在于组合物或组织填料中。
在一个方面，本公开包括治疗或预防通过向有需要的受试者施用治疗而缓解的病症、疾病或病况的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含本发明的组织填充物。在一些实施方案中，所述组合物通过注射施用。
本公开考虑了可通过施用治疗如放射、冷冻治疗或药物治疗来缓解的任何疾病、病症或病况。疾病、病症和病况的非限制性实例包括宫颈癌、直肠癌、肺肿瘤、纵隔淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、良性前列腺增生(BPH)、月经过多、子宫肌瘤和前列腺癌。参见例如US 8,257,723、US 7,744,913、US 20170056689、US 20160338793、US 7,771,339、CA 2,498,166和US 6,746,465，所有这些专利通过引用整体并入本文。
治疗的非限制性实例包括冷冻手术；放射治疗，包括但不限于外射束放射治疗(例如，3D适形或调强放射治疗)、间质前列腺近距离放射治疗(例如，使用永久或临时性种子，或在装载之后使用高剂量率远距)、使用伽马照射的外部放射治疗、高能光子射束治疗、质子射束治疗、中子射束治疗、重粒子射束治疗、近距离放射治疗、热辐射或它们的任何组合；和药物治疗(局部)如酒精组织消融或使用NaCl晶体或高渗性溶液的高渗性消融或物理组织操作(例如解剖)。另一个实施方案是这些技术用于前列腺癌或妇科癌症的近距离放射治疗的用途。近距离放射治疗包括将放射性同位素放置在肿瘤、靶器官或其他组织内或附近。例如，近距离放射治疗技术是将永久性I-125放射性种子放置到前列腺中以治疗前列腺癌。妇科的应用包括涉及使组织从要被放射瞄准的另一组织移位的实施方案。
在一些实施方案中，将组合物施用于第一组织和第二组织之间。在一些实施方案中，将组合物施用于第一组织和第二组织之间的空间中。在一些实施方案中，第一组织相对于第二组织移位。在一些实施方案中，照射第一组织。在一些实施方案中，与第一组织在不存在所述组合物的情况下将接收的辐射剂量相比，第一组织接收基本上相同的辐射剂量。在一些实施方案中，照射第二组织。在一些实施方案中，与第二组织在不存在所述组合物的情况下将接收的辐射剂量相比，第二组织接收较低的辐射剂量。在一些实施方案中，第二组织基本上不接收辐射剂量。
一些实施方案还提供了用于通过放射来治疗身体组织的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将有效量的本文所述的组合物注射到身体的第一组织(例如前列腺)和第二组织(例如直肠)之间的空间中，所述第二组织可以是极为敏感的器官；以及通过放射来治疗第一组织，由此在所述空间内的组合物减少了放射通入第二组织中。
在一个方面，本公开描述了一种使组织移位以保护组织免受诸如放射治疗或冷冻治疗的治疗的影响的方法。一个实施方案涉及使用本文所述的组合物来相对于要接受治疗的组织使组织移位。另一个实施方案涉及引入本文所述的组合物以对第一组织进行放射并且使第二组织移位。在一些实施方案中，第一组织靠近第二组织。在另一个实施方案中，所述方法包括将本文所述的组合物注射到组织之间的空间中的步骤；并且可以还包括照射组织之一，使得另一组织接收比在没有组合物的情况下更少的辐射。
组织是广义的术语，其涵盖身体的一部分：例如肿瘤组织、细胞群、细胞群和间质、器官、器官的一部分或身体的解剖部分，例如直肠、卵巢、前列腺、神经、软骨、骨、脑或其部分。在一些实施方案中，第一组织和第二组织各自独立地包括肿瘤组织、细胞群、细胞群和间质、器官、器官的一部分或身体的解剖部分。
在一些实施方案中，术语“第一组织”和“第二组织”表示两种组织类型(例如，前列腺-直肠、子宫-直肠、子宫-小肠、膀胱-子宫、卵巢-肠、子宫-膀胱、肝-胆囊、肺-纵隔、纵隔-肺、乳腺-胸壁、食道-脊柱、甲状腺-血管、甲状腺-咽喉、小肠和大肠-腹膜后腔、肾-肝、胰腺-胃、胰腺-脊柱、胃-肝、胃-脊柱等)或同一组织类型的不同组织区域。应当理解，在后一种情况下，两个组织区域可以是自然相邻的，并通过纤维连接组织(例如，肺叶)连接，并且可以通过引入切口而分离。在一些实施方案中，第一组织包括肿瘤组织，并且第二组织包括器官。在一些实施方案中，第一组织包括器官，并且第二组织包括器官。在一些实施方案中，第一组织包括前列腺，并且第二组织包括直肠。在一些实施方案中，第一组织包括前列腺的一部分，并且第二组织包括直肠的一部分。在一些实施方案中，第一组织包括阴道后壁/子宫颈，并且第二组织包括直肠。在一些实施方案中，第一组织包括直肠，第二组织包括前列腺。在一些实施方案中，第一组织包括肺，并且第二组织包括纵隔。在一些实施方案中，第一组织包括乳房，并且第二组织包括腹壁。参见例如US 20160338793，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，将本文所述的组合物注射到迪氏空间(Denonvilliers’space)中可以改变前列腺暴露于辐射时直肠接受的辐射剂量。“迪氏空间”是位于直肠和前列腺之间的区域。参见，例如，de Castro Abreu等，2014年，International J.Urology 21:416-418，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，将组合物施用于迪氏空间中。
在一个方面，本公开描述了一种使有需要的受试者中的第一组织移位以保护第一组织免受治疗的影响的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括使第一组织相对于第二组织移位。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述组合物注射到第一组织和第二组织之间的空间中。在一些实施方案中，所述方法中的空间是迪氏空间。在一些实施方案中，所述方法包括在第一组织和第二组织之间注射组合物以在组织之间形成空间。在一些实施方案中，照射第二组织。
在一些实施方案中，与第一组织在不存在所述组合物的情况下将接收的放射性剂量相比，第一组织接收较少的放射性剂量。在一些实施方案中，第一组织和第二组织各自独立地包括选自肿瘤组织、细胞群、细胞群和间质、器官、器官的一部分或身体的解剖部分的组织。在一些实施方案中，第一组织包括器官，并且第二组织包括肿瘤组织。在一些实施方案中，第一组织包括器官，并且第二组织包括器官。在一些实施方案中，第一组织包括直肠，并且第二组织包括前列腺。
在一些实施方案中，本发明包括用于使敏感身体组织相对于作为治疗方案的靶标的另一身体组织移位以有效减少由针对靶组织的治疗诱导或产生的对敏感组织的副作用或在敏感组织中的副作用的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将本文所述的组合物注射到敏感身体组织(例如直肠)和靶身体组织(例如前列腺)之间的空间中；以及对靶身体组织进行治疗方案，由此使敏感身体组织由于存在组合物而较少受到治疗的影响。
在本公开的一个方面，本文所述的组合物是可生物降解的。在一些实施方案中，所述组合物能够通过水解、蛋白水解、酶降解、体内细胞作用或它们的组合而生物降解。在一些实施方案中，所述组合物能够通过酶降解而生物降解。在一些实施方案中，酶是透明质酸酶。可通过触诊或其他观察来测量生物降解，以检测组合物在引入患者后的体积变化。在一些实施方案中，发生生物降解的合适时长是在将组合物引入体内后一天至十二个月之间。在一些实施方案中，所述组合物可在原位保持其他时间段，包括从一周至三个月以及两周至八周。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以在植入后少于约两个月内生物降解，如对于从前列腺使直肠组织移位的情况优选的。对于特定用途的生物可降解性的时间可由完成放射过程所需的时间确定，如本领域普通技术人员将理解的，对于不同的放射应用和施用放射治疗的整个过程的不同要求，所述时间可以变化。在一些实施方案中，通过生物降解在受试者中去除组合物。
在一个方面，本公开描述了从受试者中去除本公开的组合物的方法。在一个非限制性实例中，施用于组织的组合物可随后通过使组合物降解而被去除。在一个实施方案中，通过降解去除组合物。在一个实施方案中，通过生物降解在受试者中去除组合物。在一个方面，本文所述的方法还包括其中通过生物降解在受试者中去除组合物的步骤。在一些实施方案中，去除步骤包括向所述受试者施用引起生物降解的组合物。在一些实施方案中，生物降解是水解、蛋白水解、酶降解、体内细胞作用或它们的组合。在一些实施方案中，去除步骤包括向所述受试者施用包含酶的组合物。在一些实施方案中，所述组合物能够通过透明质酸酶的酶促降解而生物降解。
在本公开的一个方面，本文所述的组合物是不透射线的。如本文所用，术语“不透射线的”用于描述对X射线或其他形式的辐射不透明的材料。在一些实施方案中，所述组合物对组织的保护是通过阻断对另一组织施用的辐射来实现。在一些实施方案中，组合物阻断约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的辐射。在一些实施方案中，组织接收比其在不存在本文所述的组合物的情况下将接受的辐射少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的辐射。
在本公开的一个方面，描述了用于将本文所述的组合物递送至身体的装置。在一些实施方案中，所述装置装载有本文所述的组合物，并且将所述组合物引入体内，优选地使得体内的第一组织和第二组织之间的距离由此增加。另外的步骤可以包括向组织施加一定剂量的辐射，优选地使得第二组织接收的辐射少于第一组织和第二组织之间的距离没有增加时接收的辐射。另外的步骤还可以是对第一组织或第二组织或者附近的组织实施低温处理。辐射可以替代地被引导到第三组织，使得第一组织或第二组织由于其与其他组织分离而接收较低量的辐射。第一组织和第二组织可以在体内彼此相邻，或者可以被其他组织彼此分开。在许多情况下，这种分离不会降低实现第一组织和第二组织之间的分离的有益效果。
如本领域普通技术人员所理解的，用于分离组织的组合物体积取决于待治疗组织和待彼此分离的组织的构型。在许多情况下，约20立方厘米(cc's或mls)的体积是合适的。在其他实施方案中，可能需要少至1cc。其他体积在5-1000cc的范围内，以及其间的所有范围，例如5-400cc、10-30cc、15-25、cc、10-150cc、20-200cc、15-500cc、50-1000cc和30-200cc。在一些实施方案中，本文所述的组合物在不同的时间以两个剂量施用，以便允许组织伸展并容纳组合物，从而接收与以其他方式能够获得的体积相比更大体积的组合物。
递送装置的一个实例是注射器。本文所述的组合物可装载到注射器中并通过针注射到体内。另一个实例是接受例如折叠的、去溶胀的或滚制的组合物并提供推进机构以将组合物通过针或导管推进体内的装置。推进可以通过例如手柄、活塞、气体或液体的力来实现。
另一个实施方案是用于将本文所述的组合物引入体内的试剂盒。该试剂盒可以包括组合物和用于将组合物递送至身体的装置。实施方案包括使用说明书。实施方案包括与组合物混合或与其分开的麻醉剂。实施方案包括试剂盒，其中递送装置是注射器，并且其他实施方案包括用于注射器的针，并且可以包括用于施用组合物和/或麻醉剂的针。
说明书可以包括在试剂盒中。说明书可以包括指导使用者使用工具包的文字。说明书可以全部或部分地包括在试剂盒中，包括作为插页出现在标签上、包装上、小册子上、研讨会传单上、研讨会展示页上、互联网教学课程中或在互联网或内联网网站上。例如，试剂盒上的标签可以参考具有说明书的互联网地址。说明书可以包括对本文所阐述的实施方案的解释。说明书可以包括剂量直方图和对使用的合适的组合物体积的解释。
在一些实施方案中，本公开的方法还包括施用麻醉剂。在一些实施方案中，麻醉剂在施用本文所述的组合物之前施用。在一些实施方案中，麻醉剂是局部麻醉剂，特别是用于将本文所述的组合物施用于身体的1％利多卡因。利多卡因可以用于进行神经传导阻滞。在一个实施方案中，用于麻醉应用的针是短的22号针和7cm的22号脊椎穿刺针。在一个实施方案中，用于通过注射器注射递送填充物的针是3.5cm长的8号脊椎穿刺针。试剂盒可以包括麻醉剂。
在一个方面，本公开包括治疗或预防有需要的受试者的病症、疾病或病况的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到组织中。在一些实施方案中，所述组合物包含本文所述的组织填充物。
在一些实施方案中，如本领域普通技术人员将理解的，组织与病症、疾病或病况相关。例如，当将本公开的组合物施用于组织中实现对病症、疾病或病况的缓解、治疗、预防或改善时，组织可能与病症、疾病或病况相关。
本公开考虑了任何类型的组织。组织是广义的术语，其涵盖身体的一部分：例如肿瘤组织、细胞群、细胞群和间质、器官、器官的一部分或身体的解剖部分，例如直肠、卵巢、前列腺、神经、软骨、骨、脑或其部分。参见例如US 8257723，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，组织是器官。在一些实施方案中，组织是器官的一部分。组织的非限制性实例包括尿道、尿道括约肌、食管下端括约肌、膈、直肠、声带、喉和皮肤。在一些实施方案中，组织包括内脏器官壁的一部分。在一些实施方案中，组织是尿道或尿道括约肌的一部分。在一些实施方案中，组织是食管下端括约肌或膈的一部分。在一些实施方案中，组织是尿道括约肌的一部分。在一些实施方案中，组织是直肠的一部分。在一些实施方案中，组织是声带或喉的一部分。在一些实施方案中，组织是皮肤的一部分。
在一些实施方案中，使组织增大、膨胀或以其他方式降低组织的扩张性实现对病症、疾病或病况的治疗或预防。在一些实施方案中，所述组合物的施用导致组织的膨胀。在一些实施方案中，通过组织的膨胀来治疗或预防病症、疾病或病况。
在一些实施方案中，如本领域普通技术人员将理解的，将组合物施用于组织的壁中。在一些实施方案中，组织包括内脏器官壁的一部分。在一些实施方案中，将组合物施用于直肠壁的一定区域中。在一些实施方案中，该直肠壁区域在肛门括约肌附近。在一些实施方案中，将组合物施用于内括约肌壁中。在一些实施方案中，将组合物施用于内括约肌中。
本公开考虑了可以使用本公开的组合物来缓解、治疗、预防或改善的任何病症、疾病或病况。病症、疾病或病况的非限制性实例包括尿失禁、胃食管反流病(GERD)、膀胱输尿管反流、皮肤缺陷、大便失禁、牙组织缺陷、声带组织缺陷、喉缺陷和其他非真皮软组织缺陷。参见例如US 9,295,648、US 8,932,637、US 8,882,654、US 9,308,301、US 7,780,980、CA 2,133,756、US 6,060,053、US 8,394,400、US 8,821,857和US 6,660,301，所有这些专利通过引用整体并入本文。
在一个方面，本公开描述了治疗尿失禁的方法。无论是在广大社区还是在健康护理环境中，尿失禁都是影响所有年龄和身体健康水平的人的普遍问题。在医学上，尿失禁使患者易患尿路感染、压迫性溃疡、会阴皮疹和尿脓毒病。在社会和心理层面，尿失禁与尴尬、社会污名化、抑郁症有关，尤其是对老年人来说，增加了住院的危险(Herzo等，Ann.Rev.Gerontal.Geriatrics,9:74(1989))。尿失禁类型的实例包括但不限于压力性尿失禁、固有括约肌缺陷(ISD)、急迫性尿失禁、溢流性尿失禁和遗尿。参见例如US 9,295,648、US 9,308,301、US 7,780,980、CA 2,133,756、US 6,060,053、US 8,394,400和US 6,660,301，所有这些专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到与尿失禁相关的组织中。在一些实施方案中，组织是尿道或尿道括约肌。在一些实施方案中，组织是尿道或尿道括约肌的一部分。在一些实施方案中，所述组合物的施用导致尿道或尿道括约肌或其一部分的膨胀，以治疗或预防尿失禁。
在一个方面，本公开描述了治疗胃食管反流病(GERD)的方法。GERD描述了酸性和酶性液体从胃到食管的反流。它引起胸骨后的灼热感，可能伴随胃酸反流到口中或甚至肺中。确定疾病严重性的GERD并发症包括食管组织糜烂，和正常上皮被病理组织替代的食管溃疡。参见例如US 9,295,648、US 9,308,301和US 6,660,301，所有这些专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到与胃食管反流病相关的组织中。在一些实施方案中，组织是食管下端括约肌或膈。在一些实施方案中，组织是食管下端括约肌或膈的一部分。在一些实施方案中，所述组合物的施用导致尿道或尿道括约肌或其一部分的膨胀，以治疗或预防胃食管反流病。
在一个方面，本公开描述了治疗膀胱输尿管反流(尿反流病)的方法。尿反流病或“膀胱输尿管反流”在其医学术语中简单地表示在排尿期间尿在输尿管中向后流动。该疾病常发于幼儿中。输尿管是连接肾和膀胱的管。尿液被认为是沿从肾到膀胱这一个方向流动。当尿液从膀胱上升到肾脏时，它会导致人的健康问题。参见例如US 9,295,648、US 6,060,053和US 8,394,400，所有这些专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到与膀胱输尿管反流相关的组织中。在一些实施方案中，组织是尿道括约肌。在一些实施方案中，组织是尿道括约肌的一部分。在一些实施方案中，所述组合物的施用导致尿道括约肌或其一部分的膨胀，以治疗或预防膀胱输尿管反流。
在一个方面，本公开描述了治疗大便失禁的方法。大便失禁在老年人中最常见，是丧失了将粪便保留在直肠中的自主控制。在大多数情况下，大便失禁是由于肛门内括约肌非自主受损伤所致。内括约肌可能由于松弛或不连续而功能不全。许多不同的肌肉损伤可引起肛门内括约肌的不连续或破坏。参见例如US 8,882,654、US 9,308,301和US 8,394,400，所有这些专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到与大便失禁相关的组织中。在一些实施方案中，组织是直肠。在一些实施方案中，组织是直肠的一部分。在一些实施方案中，将组合物施用于直肠壁的一定区域中。在一些实施方案中，该直肠壁区域在肛门括约肌附近。在一些实施方案中，将组合物施用于内括约肌中。在一些实施方案中，所述组合物的施用导致直肠、直肠壁或内括约肌或其一部分的膨胀，以治疗或预防大便失禁。
在一个方面，本公开描述了治疗声带组织缺陷或喉缺陷的方法。声带组织缺陷或喉缺陷的非限制性实例包括声门闭合不全、单侧声带麻痹、双侧声带麻痹、麻痹性发声障碍、非麻痹性发声障碍、痉挛性发声障碍或它们的组合。在其他实施方案中，本公开的方法还可以用于管理或治疗导致声带不正确闭合的疾病、病症或其他异常，例如声带不全麻痹(“轻瘫”)、声带整体弱化，例如，由于年老(“老年性喉症(presbylaryngis)”)和/或声带瘢痕化(例如，归因于先前的手术或放射治疗)。参见例如US 9,295,648和US 8,821,857，所有这些专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到与声带组织缺陷或喉缺陷相关的组织中。在一些实施方案中，组织是声带或喉。在一些实施方案中，组织是声带或喉的一部分。在一些实施方案中，所述组合物的施用导致声带或喉或其一部分的膨胀，以治疗或预防声带组织缺陷或喉缺陷。
在一个方面，本公开描述了治疗皮肤缺陷的方法。由于衰老、日晒环境暴露和其他因素、体重减轻、生育、疾病如痤疮和癌症以及外科手术而对皮肤造成的损伤经常导致皮肤轮廓缺陷和其他皮肤异常。皮肤缺陷的非限制性实例包括痤疮和癌症。在一些实施方案中，皮肤缺陷是皮肤轮廓缺陷。皮肤轮廓缺陷的实例包括但不限于眉间纹、忧虑纹、皱纹、眼角皱纹(crow's feet)、木偶纹、牵伸痕以及由损伤、创伤、咬伤、外科手术和意外引起的内部或外部疤痕。参见例如US 9,295,648、US 8,932,637、US 8,821,857和US 6,660,301，所有这些专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到与皮肤缺陷相关的组织中。在一些实施方案中，组织是皮肤。在一些实施方案中，组织是皮肤的一部分。在一些实施方案中，所述组合物的施用导致皮肤或其一部分的膨胀，以治疗或预防皮肤缺陷。
在一个方面，本公开描述了在有需要的受试者中引起真皮增大的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到皮肤中或皮肤的一部分中。在一些实施方案中，本发明的皮肤增大方法尤其适用于治疗皮肤轮廓缺陷。
在一个方面，本公开描述了在受试者中引起组织膨胀的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到受试者的需要组织膨胀的区域中。在一些实施方案中，组织膨胀治疗或预防受试者的病症、疾病或病况。
在本公开的一个方面，本文所述的组合物是可生物降解的。在一些实施方案中，所述组合物能够通过水解、蛋白水解、酶降解、体内细胞作用或它们的组合而生物降解。在一些实施方案中，所述组合物能够通过酶降解而生物降解。在一些实施方案中，酶是透明质酸酶。可通过触诊或其他观察来测量生物降解，以检测组合物在引入患者后的体积变化。在一些实施方案中，发生生物降解的合适时长是在将组合物引入体内后一天至十二个月之间。在一些实施方案中，所述组合物可在原位保持其他时间段，包括从一周至三个月以及两周至八周。在一些实施方案中，本文所述的组合物可在植入后少于约两个月内生物降解。在一些实施方案中，通过生物降解在受试者中去除组合物。
在一个方面，本公开描述了组织减积的方法。在一个非限制性实例中，用本公开的可生物降解的组合物膨胀的组织可以通过使组合物降解来减小体积。在一个方面，本文所述的方法还包括组织减积步骤。在一些实施方案中，减积步骤包括向受试者施用引起生物降解的组合物。在一些实施方案中，所述组合物引起水解、蛋白水解、酶降解、体内细胞作用或它们的组合。在一些实施方案中，减积步骤包括向受试者施用包含酶的组合物。在一些实施方案中，酶是透明质酸酶。
在本公开的一个方面，本文所述的组合物是不透射线的。如本文所用，术语“不透射线的”用于描述对X射线或其他形式的辐射不透明的材料。在一些实施方案中，所述组合物对组织的保护是通过阻断对另一组织施用的辐射来实现。在一些实施方案中，组合物阻断约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的辐射。在一些实施方案中，组织接受比其在不存在本文所述的组合物的情况下将接受的辐射少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的辐射。
本领域普通技术人员可以理解，在本文所述方法中施用的组合物体积取决于待治疗组织和待相互分离组织的构型。在许多情况下，约20立方厘米(cc’s或mls)的体积是合适的。在其他实施方案中，可能需要少至1cc。其他体积在5-1000cc的范围内，以及其间的所有范围，例如5-400cc、10-30cc、15-25、cc、10-150cc、20-200cc、15-500cc、50-1000cc和30-200cc。在一些实施方案中，本文所述的组合物在不同的时间以两个剂量施用，以便允许组织伸展和容纳填充物，从而接收与以其他方式能够获得的体积相比更大体积的组合物。
递送装置的一个实例是注射器。本文所述的组合物可装载到注射器中并通过针注射到体内。另一个实例是接受例如折叠的、去溶胀的或滚制的填充物并提供推进机构以将组合物通过针或导管推进体内的装置。推进可以通过例如手柄、活塞、气体或液体的力来实现。
另一个实施方案是用于将本文所述的组合物引入体内的试剂盒。该试剂盒可以包括组合物和用于将填充物递送至身体的装置。实施方案包括使用说明书。实施方案包括与组合物混合或与其分开的麻醉剂。实施方案包括试剂盒，其中递送装置是注射器，并且其他实施方案包括用于注射器的针，并且可以包括用于施用组合物和/或麻醉剂的针。
说明书可以包括在试剂盒中。说明书可以包括指导使用者使用工具包的文字。说明书可以全部或部分地包括在试剂盒中，包括作为插页出现在标签上、包装上、小册子上、研讨会传单上、研讨会展示页上、互联网教学课程中或在互联网或内联网网站上。例如，试剂盒上的标签可以参考具有说明书的互联网地址。说明书可以包括对本文所阐述的实施方案的解释。说明书可以包括剂量直方图和对使用的合适的填充剂物体积的解释。
在一些实施方案中，本公开的方法还包括施用麻醉剂。在一些实施方案中，麻醉剂在施用本文所述的组合物之前施用。在一些实施方案中，麻醉剂是局部麻醉剂，特别是用于将本文所述的组合物施用于身体的1％利多卡因。利多卡因可以用于进行神经传导阻滞。在一个实施方案中，用于麻醉应用的针是短的22号针和7cm的22号脊椎穿刺针。在一个实施方案中，用于通过注射器注射递送填充物的针是3.5cm长的8号脊椎穿刺针。试剂盒可以包括麻醉剂。
在一些实施方案中，本公开提供了可用于减轻炎症的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含抗炎剂。抗炎剂的非限制性实例包括环孢霉素、氢化可的松、醋酸氢化可的松、地塞米松21-磷酸酯、氟轻松、甲羟松、泼尼松龙21-磷酸酯、醋酸泼尼松龙、氟米龙、倍他米松和曲安西龙。在一些实施方案中，抗炎剂是环孢菌素。
在一些实施方案中，本公开提供了可用于伤口愈合的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含伤口愈合剂。伤口愈合剂的实例包括抗生素、消毒剂、伤口愈合剂等。活性药物的实例包括蜂斗菜酸(fucic acid)、积雪草(centelia asiatica)、mucotyrin、新霉素、杆菌肽、庆大霉素、(FGF)、肝成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子生长促进剂如生长因子(HGF)和指示细胞生长因子(EGF)等，优选蜂斗菜酸或其药学上可接受的盐、利凡诺(Acrinol)和三氯生。
在本公开的一个方面，本文所述的组合物是可生物降解的。在一些实施方案中，通过水解、蛋白水解、酶降解、体内细胞作用或它们的组合实现生物可降解性。在一些实施方案中，所述组合物能够通过酶降解而生物降解。在一些实施方案中，酶促降解是透明质酸酶酶促降解。可通过触诊或其他观察来测量生物降解，以检测组合物在引入患者后的体积变化。在一些实施方案中，发生生物降解的合适时长是在将组合物引入体内后一天至十二个月之间。在一些实施方案中，所述组合物可在原位保持其他时间段，包括从一周至三个月以及两周至八周。在一些实施方案中，本文所述的组合物可在植入后少于约两个月内生物降解。在一些实施方案中，通过生物降解在受试者中去除组合物。在一些实施方案中，所述组合物是体内可生物降解的。
在本公开的一个方面，所述组合物还包含润滑剂。润滑剂的非限制性实例包括甘油、聚乙二醇400(PEG 400)和丙二醇。在一些实施方案中，润滑剂是持续润滑剂。在一些实施方案中，润滑剂包含丝心蛋白或丝心蛋白片段或丝心蛋白片段的一部分。
在一些实施方案中，基于丝心蛋白的蛋白片段组合物还包含增稠剂或胶凝剂，其选自羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、环糊精、葡聚糖、明胶、羧甲基纤维素、丙二醇、聚乙二醇、聚山梨醇酯80、聚乙烯醇、聚维酮、蔗糖、果糖、麦芽糖、角叉菜胶、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、阿拉伯树胶、半乳甘露聚糖、果胶以及它们的组合。在没有增稠剂的情况下，一旦乳液液滴的半径大于0.5μm，O/W乳液就会表现出乳化不稳定性。
在一些实施方案中，基于丝心蛋白的蛋白片段组合物包含约0.01重量％至约10.0重量％的增稠剂/胶凝剂。在一些实施方案中，基于丝心蛋白的蛋白片段组合物包含约0.2重量％至约2.0重量％的增稠剂/胶凝剂。在一些实施方案中，基于丝心蛋白的蛋白片段组合物包含选自由以下项组成的组的量的增稠剂/胶凝剂：约0.01重量％、约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1.0重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、约2.0重量％、约2.1重量％、约2.2重量％、约2.3重量％、约2.4重量％、约2.5重量％、约2.6重量％、约2.7重量％、约2.8重量％、约2.9重量％、约3.0重量％、约3.1重量％、约3.2重量％、约3.3重量％、约3.4重量％、约3.5重量％、约3.6重量％、约3.7重量％、约3.8重量％、约3.9重量％、约4.0重量％、约4.1重量％、约4.2重量％、约4.3重量％、约4.4重量％、约4.5重量％、约4.6重量％、约4.7重量％、约4.8重量％、约4.9重量％、约5.0重量％、约5.1重量％、约5.2重量％、约5.3重量％、约5.4重量％、约5.5重量％、约5.6重量％、约5.7重量％、约5.8重量％、约5.9重量％、约6.0重量％、约6.1重量％、约6.2重量％、约6.3重量％、约6.4重量％、约6.5重量％、约6.6重量％、约6.7重量％、约6.8重量％、约6.9重量％、约7.0重量％、约7.1重量％、约7.2重量％、约7.3重量％、约7.4重量％、约7.5重量％、约7.6重量％、约7.7重量％、约7.8重量％、约7.9重量％、约8.0重量％、约8.1重量％、约8.2重量％、约8.3重量％、约8.4重量％、约8.5重量％、约8.6重量％、约8.7重量％、约8.8重量％、约8.9重量％、约9.0重量％、约9.1重量％、约9.2重量％、约9.3重量％、约9.4重量％、约9.5重量％、约9.6重量％、约9.7重量％、约9.8重量％、约9.9重量％和约10.0重量％，所述量按照基于丝心蛋白的蛋白片段组合物计。
在一些实施方案中，增稠剂/胶凝剂是基于丝心蛋白的蛋白片段组合物总重量的约0.2重量％的透明质酸。
在一些实施方案中，当产生丝凝胶时，使用酸来帮助促进胶凝。在一个实施方案中，当产生包含中性或碱性分子和/或治疗剂的丝凝胶时，可以添加酸以促进胶凝。在一个实施方案中，当产生丝凝胶时，提高pH(使凝胶更具碱性)增加凝胶的贮存稳定性。在一个实施方案中，当产生丝凝胶时，提高pH(使凝胶更具碱性)使得更大量的酸性分子被加载到凝胶中。
在一些实施方案中，丝凝胶包含由本文所述的基于丝心蛋白的片段和天然乳化剂形成的多层液晶凝胶网络。多层液晶是仿生的，并且起到屏障和保水功能。多层液晶网络可通过将高HLB主乳化剂(例如，亲水性表面活性剂)和第二低至中等HLB助乳化剂(例如，疏水性表面活性剂)组合而在水包油乳液中形成。高HLB的主乳化剂使界面张力降低并促进外水相中小油滴的形成。低HLB助乳化剂形成凝胶网络。这种网络结构通过防止油滴的乳油化和聚结以及通过增加粘度来稳定乳液。
在一些实施方案中，乳液的多层液晶凝胶网络还包含增稠剂，所述增稠剂选自丙烯酸聚合物、角叉菜胶、黄原胶、瓜尔胶和硅酸镁铝以及它们的组合。在一些实施方案中，增稠剂是角叉菜胶、黄原胶和瓜尔胶。在一些实施方案中，增稠剂以按乳液的总重量计约0.05重量％至约0.5重量％的量存在于乳液中。
在一些实施方案中，基于丝心蛋白的蛋白片段以按丝凝胶的总重量计约0.001重量％至约10.0重量％的重量存在于丝凝胶中。在一些实施方案中，基于丝心蛋白的蛋白片段以按丝凝胶的总重量计约0.001重量％至约5.0重量％的重量存在于丝凝胶中。在一些实施方案中，基于丝心蛋白的蛋白片段以按丝凝胶的总重量计约0.001重量％至约1.0重量％的重量存在于丝凝胶中。在一些实施方案中，基于丝心蛋白的蛋白片段以按丝凝胶的总重量计约10重量％范围的重量存在于丝凝胶中。
在一个方面，本公开描述了治疗或预防有需要的受试者的病症、疾病或病况的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用本公开的组合物。
附图说明
将参照附图进一步解释当前公开的实施方案。所示的附图不一定是按比例的，而是重点通常放在图示说明当前公开的实施方案的原理上。
图1是显示用于产生本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段(SPF)的各个实施方案的流程图。
图2是显示在提取和溶解步骤期间，在产生本公开的SPF的方法期间可以被修改的各种参数的流程图。
图3是汇总本公开的丝蛋白溶液中LiBr和碳酸钠(Na2CO3)浓度的表。
图4是汇总本公开的丝蛋白溶液中LiBr和Na2CO3浓度的表。
图5是汇总本公开的丝蛋白溶液的分子量的表。
图6和图7是表示提取体积对％质量损失的影响的图。
图8是汇总由不同浓度的LiBr和由不同的提取和溶解尺寸溶解的丝的分子量的表。
图9是汇总提取时间对在100℃提取温度、100℃LiBr和100℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图10是汇总提取时间对在100℃提取温度、煮沸LiBr和60℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图11是汇总提取时间对在100℃提取温度、60℃LiBr和60℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图12是汇总提取时间对在100℃提取温度、80℃LiBr和80℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图13是汇总提取时间对在100℃提取温度、80℃LiBr和60℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图14是汇总提取时间对在100℃提取温度、100℃LiBr和60℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图15是汇总提取时间对在100℃提取温度、140℃LiBr和140℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图16是汇总提取温度对在60分钟提取时间、100℃LiBr和100℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图17是汇总LiBr温度对在60分钟提取时间、100℃提取温度和60℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图18是汇总LiBr温度对在30分钟提取时间、100℃提取温度和60℃烘箱溶解(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图19是汇总烘箱/溶解温度对在100℃提取温度、30分钟提取时间和100℃溴化锂(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图20是汇总烘箱/溶解温度对在100℃提取温度、60分钟提取时间和100℃溴化锂(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图21是汇总烘箱/溶解温度对在100℃提取温度、60分钟提取时间和140℃溴化锂(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图22是汇总烘箱/溶解温度对在100℃提取温度、30分钟提取时间和140℃溴化锂(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图23是汇总烘箱/溶解温度对在100℃提取温度、60分钟提取时间和80℃溴化锂(烘箱/溶解时间变化)的条件下处理的丝的分子量的影响的图。
图24是汇总在不同条件，包括提取时间、提取温度、溴化锂(LiBr)温度、用于溶解的烘箱温度、用于溶解的烘箱时间下处理的丝的分子量的图。
图25是汇总在烘箱/溶解温度等于LiBr温度的条件下处理的丝的分子量的图。
图26是丝/HA制剂在水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在各种浓度下的图片，其表明丝/HA制剂产生均匀的不透明溶液。第一个未标记的小瓶是对照小瓶(22mg/mL HA水溶液)。
图27是注射器中沉积的含水丝/HA制剂的照片，其表明丝/HA制剂产生均匀的不透明溶液。对照是22mg/mL HA水溶液。
图28是描绘丝-HA和HA水凝胶的降解曲线的图表。
图29是注射了对照真皮填充物(包含利多卡因的市售HA填充物)的豚鼠中的皮内区域的图片；炎症程度的增加由肉芽肿面积的程度反映。市售填充物以蓝色/灰色材料表示。在7天时可以观察到与该材料相关的肉芽肿性炎症。
图30是注射了对照真皮填充物(包含利多卡因的市售HA填充物)的豚鼠中的皮内区域的图片；市售产品以蓝色/灰色材料表示。在30天时，可观察到伴随纤维化的炎症。
图31是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(24mg/ml HA，9.6mg/ml丝，BDDE交联)的豚鼠中的皮内区域的图片；与对照注射相比，肉芽肿面积减少表明急性炎症应答可忽略不计，并且与对照相比，丝-HA填充物的生物降解性更好。在7天时有非常少的炎症。炎症是局部的，并且有时难以发现。没有注意到植入材料。
图32是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(24mg/ml HA，9.6mg/ml丝，BDDE交联)的豚鼠中的皮内区域的图片；在30天时，炎症极难发现并且极少。没有注意到植入材料。
图33是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(24mg/ml HA，0.48mg/ml丝，BDDE交联)的豚鼠中的皮内区域的图片；填充物在7天内导致局部轻度炎症。炎症是慢性的。这种炎症需要密切的评价以进行鉴定，因为它是局部的和最少的。没有观察到植入材料。
图34是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(24mg/ml HA，0.48mg/ml丝，BDDE交联)的豚鼠中的皮内区域的图片；30天的图像表明甚至更少的炎症。与7天植入物相比，甚至更难以鉴定。没有观察到植入材料。
图35是描绘丝-HA水凝胶的浊度测量的图表。黑色曲线(a)：标准透射率；红色曲线(b)：透射率加前向散射。
图36是描绘不含丝的HA水凝胶的浊度测量的图表。黑色曲线(a)：标准透射率；红色曲线(b)：透射率加前向散射。
图37是注射了对照真皮填充物的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。
图38是注射了本发明的HA真皮填充物(24mg/ml HA，PEGDE交联，样品C4-表25)的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。
图39是注射有本发明的丝-HA真皮填充物(22.8mg/ml HA，1.2mg/ml丝，PEGDE交联，样品L-表25)的豚鼠中皮内区域的代表性组织学图片。
图40是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(23.76mg/ml HA，0.24mg/ml丝，PEGDE交联，样品M-表25)的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。
图41是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(22.8mg/ml HA，1.2mg/ml丝，PEGDE交联，样品N-表25)的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。
图42是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(22.8mg/ml HA，1.2mg/ml丝，PEGDE交联，样品O-表25)的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。
图43是显示植入后7天凝胶降解的组织学结果的图(表25制剂-BDDE交联制剂大部分降解；评分：0-正常；1-极少；2-轻度；3-中度；和4-重度)。
图44是显示植入后7天凝胶迁移的组织学结果的图(表25制剂；评分：0-正常；1-极少；2-轻度；3-中度；和4-重度)。
图45是显示植入后7天炎症的组织学结果的图(表25制剂-未观察到组织坏死，未观察到血液凝固，并且对对照制剂和一些试验制剂观察到的胶原沉积极少；评分：0-正常；1-极少；2-轻度；3-中度；和4-重度)。
图46是显示巨噬细胞植入后7天的组织学结果的图(表25配方；评分：0-正常；1-极少；2-轻度；3-中度；和4-重度)。
图47A和图47B显示了渗析前后具有各种丝浓度的水凝胶的G'。图47A：以100gm/ml交联的混合HA，和图47B：以25mg/ml交联的单一MW HA。
图48A和图48B显示了在渗析过程中具有各种丝浓度的水凝胶的溶胀比。图48A：以100mg/ml交联的混合HA，和图48B：以25mg/ml交联的单一MW HA。
图49A和图49B分别显示了中等分子量和低分子量丝溶液的校准曲线。
图50A和图50B显示了具有未知丝浓度的稀释的丝-HA凝胶的吸收光谱；每个丝-HA凝胶样品的理论丝浓度(mg/ml)显示于表26中。
图51显示了无丝(红色；在整个波长间隔内较高的透射率)和具有3mg/ml丝(蓝色；在整个波长间隔内较低的透射率)的HA水凝胶的浊度测量；较高的透射率％表明样品较不浑浊，具有较低的光学不透明度。
图52说明PEG交联的丝心蛋白片段的特征离子(LC MS/MS谱显示用PEG交联的丝的特征离子)。
图53A-B说明半定量评估(评分越低越好；显示对照组的总评分为6.9，并且测试组的总评分为3.8)；7-天组织学图像：(图53A)和丝真皮填充物(图53B)。
图54显示1-ml注射器中的丝真皮填充物，其显示具有悬浮的细丝纤维的混浊的水凝胶。
图55A-C说明G’、MoD和注射力的测试结果。丝-HA水凝胶的储能模量G'(图55A)、改性度MoD(图55B)和注射力(图55C，30号针)表示为制剂中的丝与丝和HA的总量的比率的函数(％丝＝100*(丝浓度)/(丝和HA的组合浓度))。所有制剂的HA浓度＝24.7mg/ml，并且PEG以约30％w/w存在。图55A和图55C中三个样品的平均值±标准偏差作图。在图55B中，对于每次测量组合多个水凝胶样品。
图56说明超过100种候选真皮填充物的储能模量G'和注射力IF的测试结果。(蓝点)，通过30G x 1/2针测量的IF(橙色点)，通过27G x 1/2针测量的IF。HA和丝的总浓度范围为15mg/mL至26mg/mL。
图57说明用(实线)和不用丝(虚线)配制的HA水凝胶和竞争物水凝胶产品(Ultra Plus XC，虚线)的吸收光谱。绘制的是每种水凝胶的三个测量值的平均值。
图58A说明AS-V1(白色)或Ultra Plus XC(黑色)的体外水凝胶可逆性。近似1g的每种水凝胶用150U透明质酸酶在37℃下消化30分钟，并测量剩余凝胶的重量。对于总共600U的透明质酸酶，经120分钟再重复该过程3次。水凝胶降解的程度表示为剩余水凝胶与原始水凝胶的重量比(％)。绘制的是每个时间点的三个样品的平均值±标准偏差。
图58B说明AS-V1(白色)或Ultra Plus XC(黑色)的体内水凝胶可逆性。近似0.1mL的每个注射水凝胶部位用0.1mL透明质酸酶消化并观察30分钟，以确定基于剩余推注的逆转。额外的可逆性注射次数由额外的透明质酸酶注射次数表示。在61％和47％的情况AS-V1和/>Ultra Plus XC分别仅需要一次可逆性注射。
图59说明用AS-V1(白色)或Ultra Plus XC(黑色)注射的豚鼠的Draize皮肤刺激性测试结果。在每个时间点(注射后第1-5天)测试六只动物；每只动物接受在背侧真皮中分开约1cm间隔的0.1mL AS-V1的3次注射和/>Ultra Plus XC的3次注射。绘制的数据是每日平均评分±标准偏差；最高可能的评分是8。
图60A-D说明用AS-V1(顶部圆圈，以蓝色指示)或Ultra Plus XC(底部圆圈，以红色指示)注射的豚鼠中的注射后瘀伤的测试结果。图60A和图60B显示注射后3-天的测试结果。图60C和图60D显示注射后4-天的测试结果。在每个时间点(注射后第3天和第4天)测试六只动物；每只动物接受在背侧真皮中分开约1cm间隔的0.1mL AS-V1的3次注射和/>Ultra Plus XC的3次注射。显示来自两只动物的代表性瘀伤图像(图60A和图60B，或图60C和图60D)。
图61A-D说明用AS-V1(实线)或Ultra Plus XC(虚线)注射后的炎症(图61A)、体内水凝胶可逆性(降解，图61B和图61D)和水凝胶迁移(图61C和图61E)的动物测试结果。在每个时间点(注射后7天、30天、3个月、6个月和12个月)测试六只动物；每只动物接受在背侧真皮中分开约1cm间隔的0.1mL AS-V1的3次注射和/>Ultra Plus XC的3次注射。来自豚鼠背侧真皮的组织切片用苏木精和伊红染色，并且代表性切片由不知情的病理学家评分。绘制的数据是每个时间点的平均评价评分±标准偏差。对于炎症，最高可能评分为28，而对于水凝胶降解和迁移，最高可能评分为4。图61F说明用AS-V1(实线)或Juvéderm Ultra Plus XC(虚线)的炎症应答的测试结果。在每个时间点(注射后7天、30天、90天、180天和365天)测试六只动物；每只动物接受在背侧真皮中分开约1cm间隔的0.1ml AS-V1的3次注射和/>Ultra Plus XC的3次注射。来自豚鼠背侧真皮的组织切片用苏木精和伊红染色，并且代表性切片由不知情的病理学家评分。绘制的数据是每个时间点的平均评价评分±标准偏差。对于炎症，最高可能评分为28。
图62A-J说明GLP豚鼠研究的代表性组织学载片，其比较AS-V1(测试)顶行(A、C、E、G和I)和Ultra Plus XC(对照)底行(B、D、F、H和J)。样品A和B分别代表7天的测试和对照，样品C和D分别代表30天的测试和对照，样品D和F分别代表90天的测试和对照，样品G和H分别代表180天的测试和对照，并且样品I和J分别代表365天的测试和对照。
图63A-D说明在用AS-V1(图63A、B)或Ultra Plus XC(图63C、D)注射后3个月(图63A、C)或6个月(图63B、D)真皮组织的代表性组织学。来自豚鼠背部真皮的组织切片用苏木精和伊红染色。代表性切片来自用0.1mL AS-V1或/>Ultra Plus XC注射的六只动物。放大25倍。
图64说明在本公开的方法和凝胶中使用的示例性HA的NMR谱，NMR谱具有指定标记；标记为“a”的峰被指定并归一化为3，并且从3.30至4.05的峰的积分为11。
图65说明本公开的示例性凝胶的NMR谱，包括基于峰积分计算凝胶MoD。
图66A-66C说明在不同研磨阶段由本文所述的冻干得到的低MW丝固体。图66A说明从冻干瓶中取出后立即出现的低MW丝固体的粗颗粒图66B说明在研磨中途的尺寸减小的颗粒。图66C说明在完成研磨时具有均匀粒度分布的细颗粒。
图67说明中等MW丝固体的固体颗粒。
图68说明在本文所述的薄膜蒸发法中形成的两种不同粒度的固体丝颗粒的实例。
图69A和图69B说明通过本文所述的溶液沉淀方法制备的微粒的实例。
图70说明用于本文所述用途的经研磨的丝粉末。
图71说明SMA真皮填充物注射力(IF)相对于储能模量(G')。
图72说明SMA真皮填充物注射力(IF)相对于损耗模量(G”)。
图73说明SMA真皮填充物储能模量(G')相对于Tan(δ)。
图74说明SMA真皮填充物注射力(IF)相对于复数粘度(η*)。
图75说明SMA真皮填充物储能模量(G')相对于损耗模量(G”)。
图76说明SMA真皮填充物储能模量(G')相对于丝+HA浓度。
尽管上述附图阐述了当前公开的实施方案，但是如讨论中所指出的，也设想其他实施方案。本公开通过代表性而非限制性的方式呈现了说明性实施方案。本领域技术人员可以设计出许多其他修改和实施方案，它们落入当前公开的实施方案的原理的范围和精神内。
具体实施方式
真皮填充物已经彻底改变了软组织增大技术，近年来由于期望微创美容手术的美国(美国)老龄化人口的需求增加，对于矫正中度至重度皮肤皱纹和皱褶变得越来越流行。事实上，在过去三十年内，真皮填充物已经成为医学和美容皮肤病学两者的重要部分。在医学上，真皮填充物用于矫正HIV感染治疗下的患者中的衰弱疤痕、形态不对称和面部脂肪萎缩。在美容上，真皮填充物用于使皮肤皱褶最少化并提升整个上脸、中脸和下脸的凹陷疤痕，消除前额细纹和鱼尾纹。真皮填充物通过恢复体积和提升、矫正颧骨脂肪垫的下降和软化鼻唇沟皱褶来逆转这些影响。随着真皮填充物的使用越来越受欢迎，并且由于没有一种产品适用于所有适应症，可用的真皮填充物产品的数量也已经增加，其中仅在过去约5年中，FDA批准了5种用于软组织增大的新产品。最初，可以使用自体组织和动物源性胶原；现在，真皮填充物选项包括生物聚合物和合成植入物。真皮填充物非限制性地分为三种类型：临时(非永久性)、半永久性和永久性。胶原、透明质酸(HA)和其他生物基和可生物降解的填充物是暂时的，其效果持续几个月至两年；半永久性填充物具有持续几年的效果，并且包括可生物降解的聚-L-乳酸和基于钙羟磷灰石钙的产品；永久性填充物产品可以持续五年或更多年，并且包括不可生物降解的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酰胺水凝胶和液体硅酮。
遗憾的是，在数十年的研究和开发后，目前的真皮填充物仍然存在局限性。已经报道，在一些患者中注射目前可用的真皮填充物产品导致不良反应。这些包括立即疼痛、超敏反应和过敏反应、注射后早期肿胀、红斑、感染、过度矫正和坏死、注射后晚期疱疹(HSV)活化、皮肤变蓝(描述为丁达尔效应)、结节或肉芽肿形成，以及永久性的注射后疤痕。一般而言，更持久的填充物产品导致这些反应更严重，而更临时的产品，诸如基于HA的填充物，导致反应不太严重。同时，公众可能更喜欢一种既能提供更持久的结果又避免这些经常难以解决的并发症的产品。达到该目标的一种策略是对基于透明质酸(HA)的水凝胶改性以增加其寿命。天然存在于皮肤中的HA在体内具有高周转率，使得将HA用作持久的真皮填充物是一种挑战。为了改善其临床持久性，可以经由HA链的交联来增强HA在真皮填充物中的稳定性。交联限制了降解因子(诸如透明质酸酶和活性氧种类(例如超氧化物))接近单个HA链，保护它们免于降解。此外，经由一种具体方法(VyCrossTM技术)交联的HA最近已经与迟发性硬皮病变(真皮填充物所见的更严重的不良反应之一)的发生率增加相关。对于真皮真皮填充物，期望水凝胶材料表现出适当的粘弹性和变形抗性(具有较高G'的“更硬”材料)、注射期间易于流动(低IF)以及寿命或体内降解抗性(通常用更高的MoD实现)。
由于这些原因，正在研究改性和优化基于HA的水凝胶的其他策略；预期这些在维持耐久性的同时避免不良事件的潜力更大。丝心蛋白的使用拥有许多优点：与其他生物材料相比，具有独特的使其具有显著的强度和韧性的结构，并且具有采用不同结构构象的固有能力，丝心蛋白单元可以自组装成数十种不同的更高阶的聚合物，而不需要经常对活生物体具有有害影响的溶剂、增塑剂或催化剂。除了将丝心蛋白加入基于HA的水凝胶之外，使用聚乙二醇(PEG)(一种具有证明的生物相容性的聚合物)在控制丝-HA真皮填充物凝胶的机械特性中提供了额外的益处。持续数十年，PEG已经本身或作为递送生物活性剂的其他载体/涂层的改性物使用，增强纳米载体的生物相容性、亲水性、稳定性和生物降解性，并经常有效地降低生物活性剂和载体的毒性。本公开提供新型的基于丝的组织和/或真皮填充物制剂和产品以提供新的治疗选项，其避免最近在真皮填充物市场中看到的不良事件问题。可以制备具有不同特征的本文所述的含丝组织和/或真皮填充物，其将单独满足大量不同美学和医学适应症的需要，同时维持生物相容性概况。
尽管已经研究了丝-HA复合材料在组织工程中作为支架的各种用途，但对它们作为组织和/或真皮填充剂的探索扩展了丝-HA水凝胶的可能用途，并且代表了极具前景的组织和/或真皮填充物的配制的新方法的基础。本公开描述了建立一种新型平台-活化的丝水凝胶平台–用于配制储能模量(G')不同的丝整合的HA水凝胶-对于开发用于不同适应症的组织和/或真皮填充物产品是重要的–同时维持促进产品寿命(高MoD)的特征。事实上，领先候选物(AS-V1)在体外和体内性能中显示希望，表明用于皮内组织填充物应用的合适特性，其具有可操作IF下的高MoD和期望的G'(参见下文实施例32-35)。
将丝掺入基于HA的真皮填充物在多个方面提供了有利的选择。丝蛋白的掺入可能帮助避免当前真皮填充物产品出现的一些不利影响。例如，与市售产品相比，AS-V1表明对UV至蓝色可见光的吸收增加，表明它不太可能导致患者皮肤的丁达尔型发蓝，并且因此可能更适用于浅表美学矫正。已经对于一些填充物产品观察到形成损伤/结节，这可能是由于高度交联或使用多种尺寸(分子量)的HA，诸如在VyCrossTM技术中发生的。这可以用含丝水凝胶避免，因为使用单一尺寸的HA，并且可以容易调节MoD。
此外，AS-V1在安全性和效力测试中的表现与当前的市场领导者相比相当或更好。生物相容性测试证实在表明的所有三种凝胶组分用于体内使用的安全性上建立的预期：(1)作为皮肤的粘弹性细胞外基质的天然组分的HA；(2)贯穿历史已经用于不同生物医学应用中(包括用于真皮组织重建)的丝；和(3)作为生物相容性聚合物的PEG(参见下文实施例32-35)。事实上，AS-V1满足ISO 10993生物相容性研究中的所有标准，并且在体内研究中引起最少的注射后刺激和瘀伤，以及炎症，其水平与商业产品所见的那些相似或更低。AS-V1和商业产品之间的寿命、降解、迁移和可逆性的体内水凝胶性能特征也是相似的。具体而言，AS-V1真皮填充物符合期望的寿命标准，其中注射后12个月保持的凝胶体积与Ultra Plus XC(已知作为鼻唇沟褶皱治疗持续12个月的商业产品)相当(下文图61D-E和图62A-J)。此外，丝-HA凝胶比/>Ultra Plus XC更顺利地掺入皮肤的胶原基质中(下文图63A-D)；这可能是两种凝胶之间的粘度差异和/或包含丝蛋白的结果，所述假设将在将来的研究中进行测试。
将丝掺入基于HA的真皮填充物的策略在多个方面是有利的，从开发的配制平台(其具有生成适合于各种美学和医学适应症的一系列真皮填充物产品的潜力)的多功能性，到所得凝胶的优异生物相容性。
由丝掺入基于HA的真皮填充物导致的主要优势如下：(1)对于不同的目标应用，组织和/或真皮填充物产品需要不同的机械特性、寿命和可逆性概况。因为丝心蛋白可以自组装成数十种不同的高阶的聚合物/结构构象，并且对温度、湿度和pH的变化具有天然弹性，水凝胶的物理化学和机械特性，包括其结合水的能力(膨胀的潜能)，可以通过改变与单一较小的HA链组合的丝的浓度来控制，而不是混合不同的HA形式或改变交联剂的浓度。这指向本文描述的平台生成各种丝-HA真皮填充物制剂的能力；(2)因为丝-HA水凝胶具有表明可能避免丁达尔效应的特性、具有与目前可用的基于HA的产品相似的可逆性概况和掺入无毒、生物相容性纯化丝心蛋白和PEG交联剂，它们的使用引起不良事件的可能性相对低。
本文所述的活化丝水凝胶平台利用丝心蛋白自组装成数十种不同的高阶的聚合物/结构构象的独特能力及其对温度、湿度和pH变化的天然回弹性。通过此平台，水凝胶的生物物理特性，包括其结合水的能力(膨胀的潜能)及其与皮肤的相互作用，可以通过改变与单一较小的HA链组合的丝的浓度来控制，而不是混合不同的HA形式或不同浓度的交联剂。事实上，活化的丝水凝胶平台已经被用来生成具有各种结构特征的产品文库(下文图56)，从中可以针对不同的目标应用优化对于患者中的性能至关重要的凝胶特性，诸如机械特性和寿命。
SPF定义和性质
如本文所用，“丝蛋白片段”(SPF)包括以下的一种或多种：如本文定义的“丝心蛋白片段”；如本文定义的“重组丝片段”；如本文定义的“蛛丝片段”；如本文定义的“丝心蛋白样蛋白片段”；和/或如本文定义的“经化学修饰的丝片段”。SPF可以具有本文所述的任何分子量值或范围，和本文所述的任何多分散性值或范围。如本文所用，在一些实施方案中，术语“丝蛋白片段”还指包含至少两个相同的重复单元或由至少两个相同的重复单元组成的丝蛋白，所述重复单元各自独立地选自天然存在的丝多肽或其变体、天然存在的丝多肽的氨基酸序列或两者的组合。
SPF分子量和多分散性
在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约1kDa至约5kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约5kDa至约10kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约10kDa至约15kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约15kDa至约20kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约14kDa至约30kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约20kDa至约25kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约25kDa至约30kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约30kDa至约35kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约35kDa至约40kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约39kDa至约54kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约40kDa至约45kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约45kDa至约50kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约50kDa至约55kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约55kDa至约60kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约60kDa至约65kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约65kDa至约70kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约70kDa至约75kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约75kDa至约80kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约80kDa至约85kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约85kDa至约90kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约90kDa至约95kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约95kDa至约100kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约100kDa至约105kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约105kDa至约110kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约110kDa至约115kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约115kDa至约120kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约120kDa至约125kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约125kDa至约130kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约130kDa至约135kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约135kDa至约140kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约140kDa至约145kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约145kDa至约150kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约150kDa至约155kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约155kDa至约160kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约160kDa至约165kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约165kDa至约170kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约170kDa至约175kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约175kDa至约180kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约180kDa至约185kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约185kDa至约190kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约190kDa至约195kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约195kDa至约200kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约200kDa至约205kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约205kDa至约210kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约210kDa至约215kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约215kDa至约220kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物具有选自约220kDa至约225kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约225kDa至约230kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约230kDa至约235kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约235kDa至约240kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约240kDa至约245kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约245kDa至约250kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约250kDa至约255kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约255kDa至约260kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约260kDa至约265kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约265kDa至约270kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约270kDa至约275kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约275kDa至约280kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约280kDa至约285kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约285kDa至约290kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约290kDa至约295kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约295kDa至约300kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约300kDa至约305kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约305kDa至约310kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约310kDa至约315kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约315kDa至约320kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约320kDa至约325kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约325kDa至约330kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约330kDa至约335kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约335kDa至约340kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约340kDa至约345kDa的平均重均分子量的SPF。在一个实施方案中，本公开的组合物包含具有选自约345kDa至约350kDa的平均重均分子量的SPF。
在一些实施方案中，本公开的组合物包括SPF组合物，其选自组合物#1001至#2450，具有选自约1kDa至约145kDa的重均分子量，和选自1至约5(包括但不限于1的多分散性)、1至约1.5(包括但不限于1的多分散性)、约1.5至约2、约1.5至约3、约2至约2.5、约2.5至约3、约3至约3.5、约3.5至约4、约4至约4.5和约4.5至约5的多分散性：
/>
/>
/>
/>
如本文所用，“低分子量”、“低MW”或“低-MW”SPF可以包括具有选自约5kDa至约38kDa、约14kDa至约30kDa或约6kDa至约17kDa的重均分子量或平均重均分子量的SPF。在一些实施方案中，某些SPF的目标低分子量可以是约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa、约17kDa、约18kDa、约19kDa、约20kDa、约21kDa、约22kDa、约23kDa、约24kDa、约25kDa、约26kDa、约27kDa、约28kDa、约29kDa、约30kDa、约31kDa、约32kDa、约33kDa、约34kDa、约35kDa、约36kDa、约37kDa或约38kDa的重均分子量。
如本文所用，“中等分子量”、“中等MW”或“中-MW”SPF可包括重均分子量或平均重均分子量选自约31kDa至约55kDa或约39kDa至约54kDa的SPF。在一些实施方案中，某些SPF的目标中等分子量可以是约31kDa、约32kDa、约33kDa、约34kDa、约35kDa、约36kDa、约37kDa、约38kDa、约39kDa、约40kDa、约41kDa、约42kDa、约43kDa、约44kDa、约45kDa、约46kDa、约47kDa、约48kDa、约49kDa、约50kDa、约51kDa、约52kDa、约53kDa、约54kDa或约55kDa的重均分子量。
如本文所用，“高分子量”、“高MW”或“高-MW”SPF可以包括重均分子量或平均重均分子量选自约55kDa至约150kDa的SPF。在一些实施方案中，某些SPF的目标高分子量可以是约55kDa、约56kDa、约57kDa、约58kDa、约59kDa、约60kDa、约61kDa、约62kDa、约63kDa、约64kDa、约65kDa、约66kDa、约67kDa、约68kDa、约69kDa、约70kDa、约71kDa、约72kDa、约73kDa、约74kDa、约75kDa、约76kDa、约77kDa、约78kDa、约79kDa或约80kDa。
在一些实施方案中，本文所述的分子量(例如低分子量丝、中等分子量丝、高分子量丝)可以转化为相应SPF内所含的近似数目的氨基酸，如本领域普通技术人员所理解的。例如，氨基酸的平均重量可以为约110道尔顿，即110g/mol。因此，在一些实施方案中，线性蛋白的分子量除以110道尔顿可以用于近似其中所含的氨基酸残基的数目。
在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自1至约5.0的多分散性，包括但不限于1的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自约1.5至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自1至约1.5的多分散性，包括但不限于1的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自约1.5至约2.0的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自约2.0至约2.5的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自约2.5至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自约3.0至约3.5的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自约3.5至约4.0的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自约4.0至约4.5的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有选自约4.5至约5.0的多分散性。
在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有1的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.1的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.2的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.3的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.4的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.5的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.6的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.7的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.8的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约1.9的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.0的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.1的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.2的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.3的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.4的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.5的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.6的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.7的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.8的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约2.9的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.0的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.1的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.2的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.3的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.4的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.5的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.6的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.7的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.8的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约3.9的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.0的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.1的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.2的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.3的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.4的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.5的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.6的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.7的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.8的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约4.9的多分散性。在一个实施方案中，本公开的组合物中的SPF具有约5.0的多分散性。
在一些实施方案中，在具有低、中等和/或高分子量SPF的组合的本文所述的组合物中，这样的低、中等和/或高分子量SPF可以具有相同或不同的多分散性。
丝心蛋白片段
制备丝心蛋白或丝心蛋白片段的方法和它们在各种领域中的应用是已知的并例如描述在美国专利9,187,538、9,511,012、9,517,191、9,522,107、9,522,108、9,545,369和10,166,177、10,287,728和10,301,768中，所有这些专利通过引用整体并入本文。来自家蚕(Bombyx mori)的生丝由两种主要蛋白质组成：丝心蛋白(约75％)和丝胶蛋白(约25％)。丝心蛋白是具有提供刚度和强度的半结晶结构的纤维状蛋白。本文中所用的术语“丝心蛋白”是指具有约370,000Da的重均分子量的家蚕的茧的纤维。粗制蚕纤维由丝心蛋白的双线组成。将这些双纤维结合在一起的胶粘剂物质是丝胶蛋白。丝心蛋白由具有约350,000Da的重均分子量的重链(H链)和具有约25,000Da的重均分子量的轻链(L链)组成。丝心蛋白是具有占据该聚合物的主要组分的大疏水结构域(其具有高分子量)的两亲聚合物。疏水区被小的亲水性间隔物所中断，并且链的N端和C端也是高度亲水性的。H链的疏水结构域含有Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser的重复六肽序列和Gly-Ala/Ser/Tyr二肽的重复，其可形成稳定的反平行折叠(anti-parallel-sheet)微晶。L链的氨基酸序列不重复，因此L链更亲水和相对弹性。丝心蛋白分子中的亲水(Tyr、Ser)和疏水(Gly、Ala)链段交替排列以实现丝心蛋白分子的自组装。
本文提供生产可跨越多个行业用于各种应用的纯的和高度可规模化的丝心蛋白片段混合物溶液的方法。不希望受制于任何特定理论，但相信，这些方法同样适用于本文中所述的任何SPF的片段化，包括但不限于重组丝蛋白，和类丝蛋白或丝心样蛋白的片段化。
本文中所用的术语“丝心蛋白”包括蚕丝丝心蛋白和昆虫或蛛丝蛋白。在一个实施方案中，丝心蛋白获自家蚕。来自家蚕的生丝由两种主要蛋白质组成：丝心蛋白(约75％)和丝胶蛋白(约25％)。丝心蛋白是具有提供刚度和强度的半结晶结构的纤维状蛋白。本文中所用的术语“丝心蛋白”是指具有约370,000Da的重均分子量的家蚕的茧的纤维。将这些不溶性丝心蛋白原纤转化成水溶性丝心蛋白片段要求加入浓缩中性盐(例如8-10M溴化锂)，其干扰原本使丝心蛋白不溶于水的分子间和分子内离子键合和氢键合。制备丝心蛋白片段和/或它们的组合物的方法是已知的并例如描述在美国专利9,187,538、9,511,012、9,517,191、9,522,107、9,522,108、9,545,369和10,166,177中。
将来自家蚕的生丝茧切成碎片。将丝茧碎片在Na2CO3的水溶液中在约100℃下处理约60分钟以去除丝胶蛋白(脱胶)。所用的水的体积等于约0.4x生丝重量，并且Na2CO3量为约0.848x生丝茧碎片的重量。将所得脱胶丝茧碎片在约60℃下用去离子水漂洗三次(每次漂洗20分钟)。每个周期的漂洗水的体积为0.2L x生丝茧碎片的重量。从脱胶丝茧碎片中去除过量水。在去离子水洗涤步骤后，将湿脱胶丝茧碎片在室温下干燥。将脱胶丝茧碎片与LiBr溶液混合，并将混合物加热至约100℃。将升温的混合物置于干燥烘箱中并在约100℃下加热约60分钟以实现天然丝蛋白的完全溶解。将所得丝心蛋白溶液使用切向流过滤(TFF)和10kDa膜经去离子水过滤和渗析72小时。所得丝心蛋白水溶液具有约8.5重量％的浓度。然后，将该8.5％丝溶液用水稀释以产生1.0％丝溶液。TFF随后可用于进一步浓缩纯丝溶液至20.0％w/w丝/水的浓度。
通过一系列水更换进行的丝渗析是手动和时间密集的过程，其可通过改变某些参数加速，例如在渗析前稀释丝溶液。渗析过程可以通过使用半自动设备，例如切向流过滤系统，来规模化制造。
在一些实施方案中，丝溶液在各种制备条件参数下制备，所述参数例如：90℃30分钟、90℃60分钟、100℃30分钟和100℃60分钟。简言之，制备9.3M LiBr并使其在室温下静置至少30分钟。将5mL LiBr溶液添加到1.25g丝中并置于60℃烘箱中。在4、6、8、12、24、168和192小时从各组中取出样品。
在一些实施方案中，丝溶液在各种制备条件参数下制备，所述参数例如：90℃30分钟、90℃60分钟、100℃30分钟和100℃60分钟。简言之，将9.3M LiBr溶液加热至四个温度之一：60℃、80℃、100℃或沸腾。将5mL热LiBr溶液添加到1.25g丝中并置于60℃烘箱中。在1、4和6小时从各组中取出样品。
在一些实施方案中，丝溶液在各种制备条件参数下制备，所述参数例如：使用四种不同的丝提取组合：90℃30分钟、90℃60分钟、100℃30分钟和100℃60分钟。简言之，将9.3MLiBr溶液加热至四个温度之一：60℃、80℃、100℃或沸腾。将5mL热LiBr溶液添加到1.25g丝中并置于与LiBr相同温度的烘箱中。在1、4和6小时从各组中取出样品。将1mL各样品添加到7.5mL 9.3M LiBr中并冷藏以用于粘度测试。
在一些实施方案中，通过用中性溴化锂盐溶解生的未脱胶、部分脱胶或已脱胶的蚕纤维而获得SPF。将生蚕丝在所选温度和其他条件下加工以去除任何丝胶蛋白和实现片段混合物的所需重均分子量(MW)和多分散性(PD)。可改变工艺参数的选择以根据预期用途实现不同的最终丝蛋白片段特性。所得最终片段溶液是具有百万分率(ppm)至检测不到的水平的工艺污染物的丝心蛋白片段和水，这是在制药、医疗和消费者眼部护理市场中可接受的水平。可根据所需用途和性能要求进一步改变SPF的浓度、尺寸和多分散性。
图1是显示用于生产本公开的纯丝心蛋白片段(SPF)的各种实施方案的流程图。应该理解的是，并非所有图示步骤都是制备本公开的所有丝溶液所必需的。如图1，步骤A中所示，可以使用茧(热处理或未经热处理)、丝纤维、丝粉、蛛丝或重组蛛丝作为丝源。如果由来自家蚕的生丝茧开始，可将茧切成小碎片，例如尺寸大致相等的碎片，步骤B1。然后在步骤C1a中，生丝被提取和漂洗以去除任何丝胶蛋白。这产生基本无丝胶蛋白的生丝。在一个实施方案中，将水加热至84℃至100℃(理想地为沸腾)的温度，然后将Na2CO3(碳酸钠)加入沸水中，直到Na2CO3完全溶解。将生丝添加到沸水/Na2CO3(100℃)中并浸没约15-90分钟，在此煮沸较长时间产生较小的丝蛋白片段。在一个实施方案中，水体积等于约0.4x生丝重量，并且Na2CO3体积等于约0.848x生丝重量。在一个实施方案中，水体积等于0.1x生丝重量，Na2CO3体积保持在2.12g/L。
随后，排干水溶解的Na2CO3溶液，并从丝心蛋白纤维中去除过量的水/Na2CO3(例如，用手使丝心蛋白提取物成环，使用机器的旋转循环等)。将所得丝心蛋白提取物用通常在约40℃至约80℃的温度范围内的温至热水漂洗以去除任何残留的吸附丝胶蛋白或污染物，更换水的体积至少一次(视需要重复多次)。所得丝心蛋白提取物是基本脱除丝胶蛋白的丝心蛋白。在一个实施方案中，在约60℃的温度下用水漂洗所得的丝心蛋白提取物。在一个实施方案中，每个循环的漂洗水的体积等于0.1L至0.2L×生丝重量。可能有利的是搅拌、翻转或循环漂洗水以使漂洗效果最大化。在漂洗后，从提取的丝心蛋白纤维中去除过量的水(例如用手或用机器挤丝心蛋白提取物)。或者，本领域技术人员已知的方法，如压力、温度或其他试剂或它们的组合可用于丝胶蛋白提取。或者，可以从虫中直接取出丝腺(100％无丝胶蛋白的丝蛋白)。这将得到无丝胶蛋白的液体丝蛋白，蛋白结构没有任何改变。
然后将提取的丝心蛋白纤维完全干燥。一旦干燥，使用环境温度至沸点的温度下添加到丝心蛋白中的溶剂溶解提取的丝心蛋白，步骤C1b。在一个实施方案中，溶剂是溴化锂(LiBr)溶液(LiBr的沸点为140℃)。或者，提取的丝心蛋白纤维未干燥，而是湿的并置于溶剂中；随之可以改变溶剂浓度以实现与将干燥丝加入溶剂时类似的浓度。LiBr溶剂的终浓度可在0.1M至9.3M的范围内。可通过改变处理时间和温度以及溶解溶剂的浓度实现提取的丝心蛋白纤维的完全溶解。可以使用其他溶剂，包括但不限于磷酸盐磷酸、硝酸钙、氯化钙溶液或其他浓无机盐水溶液。为了确保完全溶解，应该将丝纤维完全浸在已加热的溶剂溶液中，然后保持在约60℃至约140℃的温度下1-168小时。在一个实施方案中，应该将丝纤维完全浸在溶剂溶液中，然后置于温度约100℃的干燥烘箱中约1小时。
将丝心蛋白提取物添加到LiBr溶液中(反之亦然)时的温度对完全溶解丝心蛋白所需的时间和最终SPF混合物溶液的所得分子量和多分散性具有影响。在一个实施方案中，丝溶剂溶液浓度小于或等于20％w/v，此外，在引入或溶解过程中的搅拌可以用于促进在不同温度和浓度下的溶解。LiBr溶液的温度提供对制成的丝蛋白片段混合物的分子量和多分散性的控制。在一个实施方案中，较高温度更快地溶解丝，以提供增强的工艺可扩展性和丝溶液的大规模生产。在一个实施方案中，使用加热至80℃-140℃的温度的LiBr溶液减少在烘箱中实现完全溶解所需的时间。改变时间和溶解溶剂在60℃或以上的温度将改变和控制由原始分子量的天然丝心蛋白形成的SPF混合物溶液的MW和多分散性。
或者，可以绕过提取将整个茧直接置于溶剂，如LiBr中，步骤B2。这要求随后从丝和溶剂溶液中滤出蚕颗粒并使用本领域中已知的用于分离疏水和亲水蛋白的方法(如柱分离和/或色谱法、离子交换、用盐和/或pH化学沉淀，和/或酶消化和过滤或提取)去除丝胶蛋白，所有方法都是标准蛋白质分离方法的常见实例而非限制，步骤C2。或者，可以绕过提取将已去除蚕的未经热处理的茧置于溶剂，如LiBr中。上述方法可用于丝胶蛋白分离，优点在于未经热处理的茧含有明显更少的虫碎屑。
可以使用渗析通过相对于一定体积的水渗析该溶液而从所得溶解的丝心蛋白片段溶液中去除溶解溶剂，步骤E1。渗析之前的预过滤有助于从丝和LiBr溶液中去除任何碎片(即，蚕残留物)，步骤D。在一个实例中，在渗析和视需要的可能浓缩之前，使用3μm或5μm过滤器以200-300mL/min的流速过滤0.1％至1.0％的丝-LiBr溶液。如上所述的本文所公开的方法利用时间和/或温度将浓度从9.3M LiBr降至0.1M至9.3M的范围以促进过滤和下游渗析，特别是在考虑建立可规模化的工艺方法时。或者，不使用额外的时间或温度，可用水稀释9.3M LiBr-丝蛋白片段溶液以促进碎屑过滤和渗析。在所需的时间和温度过滤下的溶解结果是半透明无粒子的、室温贮存稳定的、具有已知MW和多分散性的丝蛋白片段-LiBr溶液。定期更换渗析水直到溶剂被去除是有利的(例如，在1小时、4小时后更换水，然后每12小时更换一次，总共更换6次水)。可基于用于丝蛋白溶解和片段化的溶剂的所得浓度变化水体积更换的总次数。渗析后，可以进一步过滤最终的丝溶液以去除任何残留的碎片(即，蚕残留物)。
或者，切向流过滤(TFF)，其是一种用于分离和纯化生物分子的快速有效的方法，可用于从所得溶解的丝心蛋白溶液中去除溶剂，步骤E2。TFF提供高纯丝蛋白片段水溶液，并确保该方法可规模化，从而以受控和可重复的方式生产大量溶液。可在TFF之前稀释丝-LiBr溶液(在水或LiBr中从20％降至0.1％丝)。在TFF处理之前的如上所述的预过滤可保持过滤效率并有可能避免由于存在碎屑颗粒而在过滤器表面上产生丝凝胶边界层。在TFF之前的预过滤也有助于从丝和LiBr溶液中除去任何残留的碎片(即，蚕残留物)，所述残留的碎片可能导致所得的仅含水的溶液的自发或长期胶凝，步骤D。再循环的或单程的TFF可用于产生0.1％丝至30.0％丝(更优选地，0.1％-6.0％丝)的水-丝蛋白片段溶液。基于溶液中的丝蛋白片段混合物的所需浓度、分子量和多分散性，可能需要不同截留尺寸的TFF膜。对于例如通过改变提取煮沸时间的长度或在溶解溶剂(例如LiBr)中的时间和温度制成的不同分子量的丝溶液，可能需要1-100kDa的膜。在一个实施方案中，使用TFF 5或10kDa膜来纯化丝蛋白片段混合物溶液并产生最终期望的丝水比率。在去除溶解溶剂(例如LiBr)之后也可以使用单程TFF、TFF和本领域中已知的其他方法，如降膜蒸发器浓缩该溶液(所得到的所需浓度为0.1％至30％丝)。这可用作本领域中已知用于制备水基溶液的标准HFIP浓缩方法的替代。也可以使用较大孔的膜滤出小丝蛋白片段并产生具有和/或没有较窄的多分散性值的较高分子量丝的溶液。
使用配备蒸发光散射检测器(ELSD)的HPLC系统可进行用于检测LiBr和Na2CO3的测定法。通过相对于浓度绘制的被分析物的所得峰面积的线性回归进行计算。本公开的许多制剂的多于一个样品用于样品制备和分析。通常，将不同制剂的四个样品直接称入10mL容量瓶中。将样品悬浮在5mL的20mM甲酸铵(pH 3.0)中，并在2至8℃下保持2小时，偶尔摇动以从膜中提取分析物。在2小时后，将该溶液用20mM甲酸铵(pH3.0)稀释。将来自容量瓶的样品溶液转移到HPLC小瓶中并进样到HPLC-ELSD系统中以估算碳酸钠和溴化锂。
发现为丝蛋白制剂中的Na2CO3和LiBr的量化开发的分析方法在10-165μg/mL的范围内是线性的，RSD对于注射精度为2％，对于面积为1％，对于碳酸钠和溴化锂的保留时间分别为0.38％和0.19％。该分析方法可用于丝蛋白制剂中的碳酸钠和溴化锂的定量测定。
图2是显示在提取和溶解步骤期间在产生本公开的丝蛋白片段溶液的过程期间可以修改的各种参数的流程图。可改变所选方法参数以根据预期用途实现不同的最终溶液特性，例如分子量和多分散性。应该理解的是，并非所有图示步骤都是制备本公开的所有丝溶液所必需的。
在一个实施方案中，可用于多样化应用的丝蛋白片段溶液根据下列步骤制备：由家蚕形成丝茧碎片；在约100℃下在Na2CO3水溶液中提取碎片约60分钟，其中水体积等于约0.4×生丝重量且Na2CO3量为约0.848×碎片重量，以形成丝心蛋白提取物；在一定体积的漂洗水中在约60℃下漂洗丝心蛋白提取物三次，每次漂洗约20分钟，其中每个周期的漂洗水等于约0.2L×碎片重量；从丝心蛋白提取物中去除过量水；干燥丝心蛋白提取物；将干燥的丝心蛋白提取物溶解在LiBr溶液中，其中将LiBr溶液首先加热至约100℃以产生丝-LiBr溶液并保持；将丝-LiBr溶液置于约100℃的干燥烘箱中约60分钟以实现天然丝蛋白结构的完全溶解和进一步片段化成具有所需分子量和多分散性的混合物；过滤溶液以去除来自蚕的任何残留碎屑；用水稀释溶液以产生1.0重量％丝溶液；和使用切向流过滤(TFF)从溶液中去除溶剂。在一个实施方案中，使用10kDa的膜来纯化丝溶液并产生最终期望的丝水比率。TFF随后可用于将丝溶液进一步浓缩到在水中2.0重量％丝的浓度。
不希望受制于任何特定理论，但改变提取(即时间和温度)、LiBr(即添加到丝心蛋白提取物中(或反之亦然)时LiBr溶液的温度)和溶解(即时间和温度)参数得到具有不同粘度、均匀性和颜色的溶剂-丝溶液。也不希望受制于任何特定理论，但提高提取温度、延长提取时间、在溶解丝时起初和随时间经过使用更高温度的LiBr溶液和增加在温度下(例如在如此处所示的烘箱或替代热源中)的时间都得到粘度更低和更均匀的溶剂-丝溶液。
提取步骤可在更大容器中完成，例如可维持在60℃至100℃或其之间的温度的工业洗涤机。漂洗步骤也可以在工业洗涤机中完成，以消除手动漂洗周期。丝在LiBr溶液中的溶解可在对流烘箱以外的容器，例如搅拌釜反应器中进行。通过一系列水更换进行的丝渗析是手动和时间密集的过程，其可通过改变某些参数加速，例如在渗析前稀释丝溶液。渗析过程可以通过使用半自动设备，例如切向流过滤系统，来规模化制造。
改变提取(即时间和温度)、LiBr(即添加到丝心蛋白提取物中(或反之亦然)时LiBr溶液的温度)和溶解(即时间和温度)参数得到具有不同粘度、均匀性和颜色的溶剂-丝溶液。提高提取温度、延长提取时间、在溶解丝时起初和随时间经过使用更高温度的LiBr溶液和增加在温度下(例如在如此处所示的烘箱或替代热源中)的时间都得到粘度更低和更均匀的溶剂-丝溶液。尽管几乎所有参数都得到可行的丝溶液，但在少于4至6小时内可实现完全溶解的方法对工艺规模化是优选的。
在一个实施方案中，根据以下步骤制备具有选自约6kDa至约17kDa的重均值的丝心蛋白片段的溶液：通过将丝源加入煮沸的(100℃)碳酸钠水溶液中约30分钟至约60分钟的处理时间，使丝源脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约60℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度为约140℃的烘箱中保持至多1小时的时段；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和制备丝蛋白片段的水溶液，所述水溶液包含：具有选自约6kDa至约17kDa的重均分子量和1至约5或约1.5至约3.0的多分散性的片段。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱溴化锂测定法测得的小于300ppm的溴化锂残留物。丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱碳酸钠测定法测得的小于100ppm的碳酸钠残留物。可将丝心蛋白片段的水溶液冻干。在一些实施方案中，丝心蛋白片段溶液可进一步加工成各种形式，包括凝胶、粉末和纳米纤维。
在一个实施方案中，具有选自约17kDa至约39kDa的重均分子量的丝心蛋白片段的溶液根据下列步骤制备：将丝源添加到煮沸(100℃)的碳酸钠水溶液中约30分钟至约60分钟的处理时间以导致脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约80℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度为约60℃至约100℃的干燥烘箱中保持至多1小时的时段；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和制备丝心蛋白片段的水溶液，其中丝心蛋白片段的水溶液包含约10ppm至约300ppm的溴化锂残留物，其中丝蛋白片段的水溶液包含约10ppm至约100ppm的碳酸钠残留物，其中丝心蛋白片段的水溶液包含具有选自约17kDa至约39kDa的重均分子量和1至约5或约1.5至约3.0的多分散性的片段。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱溴化锂测定法测得的小于300ppm的溴化锂残留物。丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱碳酸钠测定法测得的小于100ppm的碳酸钠残留物。
在一些实施方案中，一种制备具有选自约6kDa至约17kDa的平均重均分子量的丝心蛋白片段的水溶液的方法包括以下步骤：通过将丝源添加到煮沸(100℃)的碳酸钠水溶液中约30分钟至约60分钟的处理时间而将丝源脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约60℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度约140℃的烘箱中保持至少1小时；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和制备丝蛋白片段的水溶液，所述水溶液包含：具有选自约6kDa至约17kDa的平均重均分子量和1至约5或约1.5至约3.0的多分散性的片段。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。纯丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱溴化锂测定法测得的小于300ppm的溴化锂残留物。纯丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱碳酸钠测定法测得的小于100ppm的碳酸钠残留物。所述方法可进一步包括将治疗剂添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括将选自抗氧化剂或酶之一的分子添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括将维生素添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。维生素可以是维生素C或其衍生物。可将纯丝心蛋白片段的水溶液冻干。所述方法可进一步包括将α羟基酸添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。α羟基酸可选自乙醇酸、乳酸、酒石酸和柠檬酸。所述方法可进一步加入浓度为0.5％的透明质酸或其盐至约10.0％的纯丝心蛋白片段的水溶液。所述方法可进一步包括加入氧化锌或二氧化钛中的至少一种。可由通过这种方法制成的纯丝心蛋白片段的水溶液制备膜。所述膜可包含约1.0重量％至约50.0重量％的维生素C或其衍生物。所述膜可具有范围为约2.0重量％至约20.0重量％的水含量。所述膜可包含约30.0重量％至约99.5重量％的纯丝心蛋白片段。可由通过这种方法制成的纯丝心蛋白片段的水溶液制备凝胶。所述凝胶可包含约0.5重量％至约20.0重量％的维生素C或其衍生物。所述凝胶可具有至少2％的丝含量和至少20％的维生素含量。
在一些实施方案中，一种制备具有选自约17kDa至约39kDa的平均重均分子量的丝心蛋白片段的水溶液的方法包括以下步骤：将丝源添加到煮沸(100℃)的碳酸钠水溶液中约30分钟至约60分钟的处理时间以导致脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约80℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度为约60℃至约100℃的干燥烘箱中保持至少1小时；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和制备纯丝心蛋白片段的水溶液，其中纯丝心蛋白片段的水溶液包含约10ppm至约300ppm的溴化锂残留物，其中丝蛋白片段的水溶液包含约10ppm至约100ppm的碳酸钠残留物，其中纯丝心蛋白片段的水溶液包含具有选自约17kDa至约39kDa的平均重均分子量和1至约5或约1.5至约3.0的多分散性的片段。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。纯丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱溴化锂测定法测得的小于300ppm的溴化锂残留物。纯丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱碳酸钠测定法测得的小于100ppm的碳酸钠残留物。所述方法可进一步包括将治疗剂添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括将选自抗氧化剂或酶之一的分子添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括将维生素添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。维生素可以是维生素C或其衍生物。可将纯丝心蛋白片段的水溶液冻干。所述方法可进一步包括将α羟基酸添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。α羟基酸可选自乙醇酸、乳酸、酒石酸和柠檬酸。所述方法可进一步包括将透明质酸或其盐形式以约0.5％至约10.0％的浓度添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括加入氧化锌或二氧化钛中的至少一种。可由通过这种方法制成的纯丝心蛋白片段的水溶液制备膜。所述膜可包含约1.0重量％至约50.0重量％的维生素C或其衍生物。所述膜可具有范围为约2.0重量％至约20.0重量％的水含量。所述膜可包含约30.0重量％至约99.5重量％的纯丝心蛋白片段。可由通过这种方法制成的纯丝心蛋白片段的水溶液制备凝胶。所述凝胶可包含约0.5重量％至约20.0重量％的维生素C或其衍生物。所述凝胶可具有至少2％的丝含量和至少20％的维生素含量。
在一个实施方案中，具有选自约39kDa至约80kDa的重均分子量的丝心蛋白片段的溶液根据下列步骤制备：将丝源添加到煮沸(100℃)的碳酸钠水溶液中约30分钟的处理时间以导致脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约80℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度为约60℃至约100℃的干燥烘箱中保持至多1小时的时段；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和制备丝心蛋白片段的水溶液，其中丝心蛋白片段的水溶液包含约10ppm至约300ppm的溴化锂残留物、约10ppm至约100ppm的碳酸钠残留物、具有选自约39kDa至约80kDa的重均分子量和1至约5或约1.5至约3.0的多分散性的片段。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱溴化锂测定法测得的小于300ppm的溴化锂残留物。丝心蛋白片段的水溶液可包含如使用高效液相色谱碳酸钠测定法测得的小于100ppm的碳酸钠残留物。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括将活性剂(例如治疗剂)添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括将选自抗氧化剂或酶之一的活性剂添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括将维生素添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。维生素可以是维生素C或其衍生物。可将纯丝心蛋白片段的水溶液冻干。所述方法可进一步包括将α羟基酸添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。α羟基酸可选自乙醇酸、乳酸、酒石酸和柠檬酸。所述方法可进一步包括将透明质酸或其盐形式以约0.5％至约10.0％的浓度添加到纯丝心蛋白片段的水溶液中。可由通过这种方法制成的纯丝心蛋白片段的水溶液制备膜。所述膜可包含约1.0重量％至约50.0重量％的维生素C或其衍生物。所述膜可具有范围为约2.0重量％至约20.0重量％的水含量。所述膜可包含约30.0重量％至约99.5重量％的纯丝心蛋白片段。可由通过这种方法制成的纯丝心蛋白片段的水溶液制备凝胶。所述凝胶可包含约0.5重量％至约20.0重量％的维生素C或其衍生物。所述凝胶可具有至少2重量％的丝含量和至少20重量％的维生素含量。
丝蛋白片段的分子量可基于在提取步骤的过程中使用的特定参数，包括提取时间和温度；在溶解步骤的过程中使用的特定参数，包括将丝浸入溴化锂时的LiBr温度和溶液保持在特定温度下的时间；和在过滤步骤的过程中使用的特定参数进行控制。通过使用所公开的方法控制工艺参数，可以制成在选自5kDa至200kDa，或10kDa至80kDa的各种不同分子量下具有等于或低于2.5的多分散性的丝心蛋白片段溶液。通过改变工艺参数以获得具有不同分子量的丝溶液，可基于所需性能要求有针对性地获得具有等于或小于2.5的所需多分散性的某一范围的片段混合物最终产物。例如，含有眼科药物的较高分子量丝膜可具有与较低分子量膜相比受控的缓慢释放速率，以使其理想地用于眼部护理产品中的呈递载体。另外，可获得多分散性大于2.5的丝心蛋白片段溶液。此外，可以混合具有不同平均分子量和多分散性的两种溶液以产生组合溶液。或者，从虫中直接取出的液体丝腺(100％无丝胶蛋白的丝蛋白)可与本公开的任何丝心蛋白片段溶液组合使用。使用具有折射率检测器(RID)的高压液相色谱法(HPLC)测定纯丝心蛋白片段组合物的分子量。使用Cirrus GPCOnline GPC/SEC软件3.3版(Agilent)计算多分散性。
加工参数的差异可得到分子量和肽链尺寸分布(多分散性，PD)不同的再生丝心蛋白。这进而影响再生丝心蛋白性能，包括机械强度、水溶性等。
在生丝茧加工成丝溶液的过程中改变参数。改变这些参数影响所得丝溶液的MW。操控的参数包括(i)提取时间和温度、(ii)LiBr的温度、(iii)溶解烘箱的温度、和(iv)溶解时间。进行实验以测定改变提取时间的影响。表1-7汇总结果以下是汇总：
–30分钟的丝胶蛋白提取时间带来比60分钟的丝胶蛋白提取时间大的分子量
–分子量随在烘箱中的时间经过降低
–140℃LiBr和烘箱导致置信区间的下限低于9500Da的分子量
–30分钟提取在1小时和4小时的时间点具有未消化的丝
–30分钟提取在1小时的时间点导致明显高的分子量，置信区间的下限为35,000Da
–在置信区间的上限达到的分子量的范围为18000至216000Da(对提供具有指定上限的溶液而言是重要的)。
/>
进行实验以确定改变提取温度的影响。表7汇总结果。以下是汇总：
–在90℃下的丝胶蛋白提取导致比100℃提取下的丝胶蛋白提取更高的MW
–90℃和100℃都显示随在烘箱中的时间的MW降低。
进行实验以确定当加入丝中时改变溴化锂(LiBr)温度的影响。表8-9汇总结果。以下是汇总：
–对分子量或置信区间没有影响(所有CI～10500-6500Da)
–研究表明，由于大部分物质在室温下是丝，当加入LiBr并开始溶解时，LiBr-丝溶解的温度迅速下降低于原始LiBr温度
进行实验以确定v烘箱/溶解温度的影响。表10-14汇总结果。以下是汇总：
–烘箱温度对60分钟的提取丝的影响小于对30分钟的提取丝的影响。不希望受理论的束缚，据信30分钟的丝在提取过程中降解较少，并且因此烘箱温度对丝的较大MW、降解较少的部分具有更大的影响。
–对于60℃对140℃烘箱，30分钟提取的丝在较高烘箱温度下显示非常显著的较低MW的影响，而60分钟提取的丝具有小得多的影响
–140℃烘箱导致置信区间的下限为～6000Da。
/>
将来自家蚕的生丝茧切成碎片。将生丝茧碎片在Na2CO3的水溶液(约100℃)中煮沸约30分钟至约60分钟的时间以去除丝胶蛋白(脱胶)。所用的水的体积等于约0.4x生丝重量，并且Na2CO3量为约0.848x生丝茧碎片的重量。将所得脱胶丝茧碎片在约60℃下用去离子水漂洗三次(每次漂洗20分钟)。每个周期的漂洗水的体积为0.2L x生丝茧碎片的重量。从脱胶丝茧碎片中去除过量水。在去离子水洗涤步骤后，将湿脱胶丝茧碎片在室温下干燥。将脱胶丝茧碎片与LiBr溶液混合，并将混合物加热至约100℃。将升温的混合物置于干燥烘箱中并在约60℃至约140℃的温度下加热约60分钟以实现天然丝蛋白的完全溶解。将所得溶液冷却到室温，然后使用3,500Da MWCO膜渗析以去除LiBr盐。在去离子水中进行多次交换直至如在Oakton Bromide(Br-)双液接(double-junction)离子选择性电极上读取的在水解丝心蛋白溶液中测定的Br-离子小于1ppm。
所得丝心蛋白水溶液具有约8.0％w/v的浓度，其含有具有选自约6kDa至约16kDa、约17kDa至约39kDa和约39kDa至约80kDa的平均重均分子量和约1.5至约3.0的多分散性的纯丝心蛋白片段。将8.0％w/v用去离子水稀释以提供按涂布溶液计1.0％w/v、2.0％w/v、3.0％w/v、4.0％w/v、5.0％w/v。
通过使用切向流过滤(TFF)制备各种丝浓度百分比(％)。在所有情况下，使用1％丝溶液作为输入进料。使用750-18,000mL范围的1％丝溶液作为起始体积。将溶液在TFF中渗滤以去除溴化锂。一旦低于规定的残余LiBr水平，溶液经受超滤以通过除水提高浓度。参见下列实例。
在标准丝结构中采用六种(6)丝溶液，结果如下：
溶液#1是5.9重量％的丝浓度、19.8kDa的平均MW和2.2PDI(用60分钟煮沸提取、100℃LiBr溶解1小时制备)。
溶液#2是6.4重量％的丝浓度(用30分钟煮沸提取、60℃LiBr溶解4小时制备)。
溶液#3是6.17重量％的丝浓度(用30分钟煮沸提取、100℃LiBr溶解1小时制备)。
溶液#4是7.30重量％的丝浓度：从每批100克丝茧的30分钟提取批次开始生产7.30％丝溶液。然后将提取的丝纤维在100℃烘箱中使用100℃9.3M LiBr溶解1小时。每批溶解100g丝纤维以制成在LiBr中的20％丝。然后将溶解在LiBr中的丝稀释至1％丝，并经5μm过滤器过滤以去除大碎屑。使用15,500mL的1％过滤丝溶液作为TFF的起始体积/渗滤体积。一旦去除LiBr，将该溶液超滤至约1300mL的体积。然后收集1262mL7.30％丝。将水添加到进料中以助于去除剩余溶液，然后收集547mL 3.91％丝。
溶液#5是6.44重量％的丝浓度：从每批25、33、50、75和100g丝茧的混合的60分钟提取批次开始生产6.44重量％丝溶液。然后将提取的丝纤维在100℃烘箱中使用100℃9.3MLiBr溶解1小时。每批溶解35、42、50和71g丝纤维以制成在LiBr中的20％丝并合并。然后将溶解在LiBr中的丝稀释至1％丝，并经5μm过滤器过滤以去除大碎屑。使用17,000mL的1％过滤丝溶液作为TFF的起始体积/渗滤体积。一旦去除LiBr，将该溶液超滤至约3000mL的体积。然后收集1490mL 6.44％丝。将水添加到进料中以助于去除剩余溶液，然后收集1454mL4.88％丝。
溶液#6是2.70重量％的丝浓度：从每批25g丝茧的60分钟提取批次开始生产2.70％丝溶液。然后将提取的丝纤维在100℃烘箱中使用100℃9.3M LiBr溶解1小时。每批溶解35.48g丝纤维以制成在LiBr中的20％丝。然后将溶解在LiBr中的丝稀释至1％丝，并经5μm过滤器过滤以去除大碎屑。使用1000mL的1％过滤丝溶液作为TFF的起始体积/渗滤体积。一旦去除LiBr，将该溶液超滤至约300mL的体积。然后收集312mL 2.7％丝。
在表15中给出具有更高分子量的丝心蛋白溶液的制备。
表15.丝心蛋白溶液的制备和性质。
在下表16和17中给出用于施加到织物的丝水性涂料组合物。
在膜制备中使用三种(3)丝溶液，结果如下：
溶液#1是5.9％的丝浓度、19.8kDa的平均MW和2.2PD(用60分钟煮沸提取、100℃LiBr溶解1小时制备)。
溶液#2是6.4％的丝浓度(用30分钟煮沸提取、60℃LiBr溶解4小时制备)。
溶液#3是6.17％的丝浓度(用30分钟煮沸提取、100℃LiBr溶解1小时制备)。
根据Rockwood等(Nature Protocols；第6卷；第10期；2011年9月22日在线发布；doi:10.1038/nprot.2011.379)制备膜。将4mL 1％或2％(wt/vol)丝的水溶液添加到100mm陪替氏培养皿中(可为更厚或更薄的膜改变丝的体积并且不重要)并使其敞开干燥过夜。真空干燥器的底部装有水。将干膜置于干燥器中并施加真空，以使膜在从皿中取出前进行水退火(water anneal)4小时。由溶液#1流延的膜没有得到结构连续膜；该膜裂成几片。尽管经过水退火处理，这些膜碎片溶解在水中。
可为凝胶应用优化各种分子量和/或分子量组合的丝溶液。下面提供这种方法的一个实例，但在应用或配方中无意构成限制。在凝胶制备中使用三种(3)丝溶液，结果如下：
溶液#1是5.9％的丝浓度、19.8kDa的平均MW和2.2PD(用60分钟煮沸提取、100℃LiBr溶解1小时制备)。
溶液#2是6.4％的丝浓度(用30分钟煮沸提取、60℃LiBr溶解4小时制备)。
溶液#3是6.17％的丝浓度(用30分钟煮沸提取、100℃LiBr溶解1小时制备)。
“Egel”是如Rockwood等描述的电凝胶(electrogelation)法。简言之，将10ml丝的水溶液添加到50ml锥形管中并将一对铂丝电极浸到丝溶液中。向铂电极施加20伏特电位5分钟，切断供电并收集凝胶。溶液#1在施加电流5分钟的过程中没有形成EGEL。
溶液#2和#3根据公开的辣根过氧化物酶(HRP)程序胶凝。特性看起来是所公开的溶液的典型特性。
材料和方法:在丝分子量的测定中使用以下设备和材料：带有chemstation软件；10.01版本的Agilent 1100；折射率检测器(RID)；分析天平；容量瓶(1000mL、10mL和5mL)；HPLC等级水；ACS等级氯化钠；ACS等级七水合磷酸氢二钠；磷酸；葡聚糖MW标样-标称分子量5kDa、11.6kDa、23.8kDa、48.6kDa和148kDa；50mL PET或聚丙烯一次性离心管；带刻度吸管；带有Teflon盖的琥珀色玻璃HPLC小瓶；Phenomenex PolySep GFC P-4000柱(大小：7.8mm×300mm)。
程序步骤:
A)1L流动相(在0.0125M磷酸钠缓冲液中的0.1M氯化钠溶液)的制备取250mL清洁干燥的烧杯，将其放在天平上并去皮重。将约3.3509g七水合磷酸氢二钠添加到烧杯中。记录称重的磷酸氢二钠的精确重量。通过将100mL HPLC水添加到烧杯中，将称入的磷酸钠溶解。小心不要溢出烧杯的任何内容物。将溶液小心转移到清洁干燥的1000mL容量瓶中。漂洗烧杯并将漂洗液转移到容量瓶中。重复漂洗4-5次。在单独的清洁干燥的250mL烧杯中，精确称入约5.8440g氯化钠。将称入的氯化钠溶解在50mL水中并将该溶液转移到容量瓶中的磷酸钠溶液中。漂洗烧杯并将漂洗液转移到容量瓶中。用磷酸调节溶液的pH至7.0±0.2。用HPLC水将容量瓶中的体积补充到1000mL并剧烈摇动以均匀混合溶液。经0.45μm聚酰胺膜过滤器过滤溶液。将溶液转移到清洁干燥的溶剂瓶并为瓶子加标签。可根据要求通过相应改变七水合磷酸氢二钠和氯化钠的量来改变该溶液的体积。
B)葡聚糖分子量标准溶液的制备至少五个不同分子量标样用于运行的每批样品，以使受试样品的预期值被所用标样的值囊括。将六个20mL闪烁玻璃小瓶分别加标签为分子量标样。精确称重约5毫克的各葡聚糖分子量标样并记录重量。将葡聚糖分子量标样溶解在5mL流动相中以制备1mg/mL标样溶液。
C)样品溶液的制备
当制备样品溶液时，如果对可提供多少样品有限制，可对制备进行规模化，只要保持比率即可。根据样品类型和样品中的丝蛋白含量，在分析天平上的50mL一次性离心管中称入足够的样品以制备用于分析的1mg/mL样品溶液。将样品溶解在等体积的流动相中以制备1mg/mL溶液。紧紧盖住这些管并混合样品(在溶液中)。将样品溶液在室温下静置30分钟。再轻轻混合样品溶液1分钟并在4000RPM下离心10分钟。
D)样品的HPLC分析
将1.0mL的所有标样和样品溶液转移到单独HPLC小瓶中。一式两份进样分子量标样(各进样一次)和各样品。使用下列HPLC条件分析所有标样和样品溶液：
柱 PolySep GFC P-4000(7.8×300mm)
柱温 25℃
检测器 折射率检测器(温度在35℃)
注射量 25.0μL
流动相 0.1M氯化钠在0.0125M磷酸钠缓冲液中的溶液
流速 1.0mL/min
运行时间 20.0分钟
E)数据分析和计算-使用Cirrus软件计算平均分子量
将标样和分析样品的色谱数据文件上传到Cirrus SEC数据收集和分子量分析软件中。计算每次进样的样品的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、峰平均分子量(Mp)和多分散性。
蛛丝片段
蛛丝是由三个结构域组成的天然聚合物：在蛋白质链中占主导的重复中间核心结构域和非重复N端和C端结构域。大的核心结构域以类似嵌段共聚物的排布进行组织，其中两个基本序列——结晶多肽[poly(A)或poly(GA)]和较低结晶多肽(GGX或GPGXX)——在核心结构域中交替。拖牵丝(Dragline silk)是由大壶状腺拖牵丝蛋白1(MaSp1)和大壶状腺拖牵丝蛋白2(MaSp2)组成的蛋白质复合体。这两种丝均为约3500个氨基酸长。MaSp1可见于纤维芯和周边，而MaSp2在某些芯区域中形成簇。MaSp1和MaSp2的大的中心结构域以类似嵌段共聚物的排布进行组织，其中两个基本序列——结晶多肽[poly(A)或poly(GA)]和较低结晶多肽(GGX或GPGXX)——在核心结构域中交替。具体的二级结构已归属于poly(A)/(GA)、GGX和GPGXX基序，分别包括β-折叠、α-螺旋和β-螺旋。重复核心结构域的一级序列、组成和二级结构元素决定了蛛丝的机械性质；而非重复N端和C端结构域对于在管腔中储存液体丝原液(liquid silk dope)和在纺丝导管中形成纤维而言至关重要。
MaSp1和MaSp2之间的主要区别是在MaSp2中存在占总氨基酸含量的15％的脯氨酸(P)残基，而MaSp1不含脯氨酸。通过计算络新妇属蜘蛛(N.clavipes)拖牵丝中的脯氨酸残基数，可以估算纤维中的这两种蛋白质的存在；81％ MaSp1和19％ MaSp2。不同蜘蛛具有不同的MaSp1和MaSp2比率。例如，来自园蛛科(orb weaver)黄斑金蛛(Argiope aurantia)的拖牵丝纤维含有41％ MaSp1和59％ MaSp2。大壶状腺丝的比率的这种改变可以决定丝纤维的性能。
对于一个园蛛科物种的蜘蛛，已知至少七种不同类型的丝蛋白。丝在一级序列、物理性质和功能上不同。例如，用于构建框架、放射线(radii)和骨架线(lifelines)的拖牵丝以出色的机械性质，包括强度、韧度和弹性著称。在相等重量基础上，蛛丝的韧度高于钢和Kevlar。存在于捕捉螺旋(capture spirals)中的鞭状腺丝(flageliform silk)具有最高500％的可延展性。存在于圆网(orb-web)的辅助螺旋(auxiliary spirals)和猎物包裹(prey wrapping)中的小壶状腺丝具有与大壶状腺丝几乎类似的高韧度和强度，但在水中不超收缩。
蛛丝以它们的高拉伸强度和韧度著称。重组丝蛋白也赋予化妆品或皮肤病学组合物有利性质，特别是能够改善水合或软化作用、良好的成膜性质和低表面密度。多样化和独特的生物力学性质与生物相容性和缓慢降解速率一起使得蛛丝成为作为用于组织工程、引导组织修复和药物递送、用于化妆品产品(例如指甲和头发强化剂、皮肤护理产品)和工业材料(例如纳米线、纳米纤维、表面涂层)的生物材料的优异候选物。
在一个实施方案中，丝蛋白可包括衍生自天然蛛丝蛋白的多肽。多肽不受特别限制，只要其衍生自天然蛛丝蛋白，并且多肽的实例包括天然蛛丝蛋白和重组蛛丝蛋白，如天然蛛丝蛋白的变异体、类似物、衍生物等。就优异的韧性而言，多肽可衍生自在蜘蛛的大壶状腺中产生的主要拖牵丝蛋白。主要拖牵丝蛋白的实例包括来自络新妇属蜘蛛(Nephilaclavipes)的大壶状腺蛛丝蛋白MaSp1和MaSp2以及来自十字园蛛(Araneus diadematus)的ADF3和ADF4等。衍生自主要拖牵丝蛋白的多肽的实例包括主要拖牵丝蛋白的变异体、类似物、衍生物等。此外，多肽可衍生自在蜘蛛的鞭状腺中生成的鞭状腺丝蛋白。鞭状腺丝蛋白的实例包括衍生自络新妇属蜘蛛的鞭状腺丝蛋白等。
衍生自主要拖牵丝蛋白的多肽的实例包括含有两个或更多个式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元的多肽，优选含有五个或更多个其单元的多肽，更优选含有十个或更多个其单元的多肽。或者，衍生自主要拖牵丝蛋白的多肽可以是含有式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元并且在C端具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:1至3中的任一个所表示的氨基酸序列或与美国专利9,051,453的SEQ ID NO:1至3中的任一个所表示的氨基酸序列具有90％或更高同源性的氨基酸序列的多肽。在衍生自主要拖牵丝蛋白的多肽中，式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元可能彼此相同或可能彼此不同。在使用微生物如大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主产生重组蛋白的情况下，考虑到生产力，衍生自主要拖牵丝蛋白的多肽的分子量为500kDa或更小，或300kDa或更小，或200kDa或更小。
在式(1)中，REP1是指聚丙氨酸。在REP1中，连续排布的丙氨酸残基数优选为2或更大，更优选3或更大，进一步优选4或更大，特别优选5或更大。此外，在REP1中，连续排布的丙氨酸残基数优选为20或更小，更优选16或更小、进一步优选12或更小，特别优选10或更小。在式(1)中，REP2是由10至200个氨基酸残基组成的氨基酸序列。氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸残基的总数为相对于其中所含的氨基酸残基的总数的40％或更大，优选60％或更大，更优选70％或更大。
在主要拖牵丝中，REP1对应于纤维中的晶体区，在其中形成晶体β折叠，并且REP2对应于纤维中的非晶区，其中大多数的部分缺乏规则构型并具有更大的柔性。此外，[REP1-REP2]对应于由晶体区和非晶区组成的重复区(重复序列)，其是拖牵丝蛋白的特征序列。
重组丝片段
在一些实施方案中，重组丝蛋白是指重组蛛丝多肽、重组昆虫丝多肽或重组贝须丝多肽。在一些实施方案中，本文公开的重组丝蛋白片段包括园蛛科(Araneidae)或Araneoids的重组蛛丝多肽，或家蚕(Bombyx mori)的重组昆虫丝多肽。在一些实施方案中，本文公开的重组丝蛋白片段包括园蛛科(Araneidae)或Araneoids的重组蛛丝多肽。在一些实施方案中，本文公开的重组丝蛋白片段包括具有衍生自园蛛科(Araneidae)或Araneoids的天然蛛丝多肽的重复单元的嵌段共聚物。在一些实施方案中，本文公开的重组丝蛋白片段包括具有衍生自园蛛科(Araneidae)或Araneoids的蛛丝多肽的合成重复单元和衍生自园蛛科(Araneidae)或Araneoids的蛛丝多肽的天然重复单元的非重复单元的嵌段共聚物。
基因工程的最新进展已提供生产各种类型的重组丝蛋白的路线。重组DNA技术已用于提供丝蛋白的更实用的来源。本文所用的“重组丝蛋白”是指使用基因工程方法在原核或真核表达系统中异源生产的合成蛋白质。
用于合成重组丝肽的各种方法是已知的并已由Ausubel等,Current Protocolsin Molecular Biology§8(John Wiley&Sons 1987,(1990))描述，其通过引用并入本文。革兰氏阴性的杆形细菌大肠杆菌(E.coli)是已被认可的用于工业规模生产蛋白质的宿主。因此，大多数重组丝已在大肠杆菌中生产。大肠杆菌容易操作，具有短世代时间，相对低成本并可为更大量的蛋白质生产而扩大规模。
重组丝蛋白可通过含有为丝蛋白、为这种蛋白的片段或为这样的蛋白的类似物编码的cDNA的转化真核或原核系统生成。重组DNA途径能够生产具有编程序列、二级结构、构造和精确分子量的重组丝。在该方法中有四个主要步骤：(i)将合成的类丝基因设计和组装到基因“盒”中，(ii)将这种片段插入DNA重组载体，(iii)将这种重组DNA分子转化到宿主细胞中和(iv)所选克隆体的表达和纯化。
本文所用的术语“重组载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体如λ噬菌体、病毒载体如腺病毒或杆状病毒载体，或人工染色体载体，如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包含质粒以及病毒载体并通常含有所需编码序列和在特定宿主生物体(例如细菌、酵母或植物)中或在体外表达系统中表达可操作连接的编码序列(operably linked coding sequence)所必需的适当DNA序列。克隆载体通常用于特定所需DNA片段的工程(engineer)和扩增并可能缺乏表达所需DNA片段所需的功能序列。
原核系统包括革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。原核表达载体可包括宿主生物体可识别的复制起点、在所述宿主中具有功能性的同源或异源启动子、为蛛丝蛋白、为这种蛋白的片段或为类似蛋白编码的DNA序列。原核表达生物体的非限制性实例是大肠杆菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、鱼腥藻属、茎菌属、葡糖杆菌属、红细菌属、假单胞菌属、副球菌属、芽孢杆菌属(例如枯草杆菌)、短杆菌属、棒状杆菌属、根瘤菌属(中华根瘤菌)、黄杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、甲基杆菌属、丙酸杆菌属、葡萄球菌属或链霉菌属细胞。
真核系统包括酵母和昆虫、哺乳动物或植物细胞。在这种情况下，表达载体可包括酵母质粒复制起点或自主复制序列、启动子、为蛛丝蛋白、为片段或为类似蛋白编码的DNA序列、聚腺苷酸化序列、转录终止位点和最后，选择基因。真核表达生物体的非限制性实例包括酵母，如酿酒酵母、毕赤酵母、产担子酵母(basidiosporogenous)、产子囊酵母(ascosporogenous)，丝状真菌，如黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、里氏木霉、顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)、念珠菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母)、裂殖酵母属、毕赤酵母属(例如毕赤酵母)或耶氏酵母属细胞等，哺乳动物细胞，如HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞等，昆虫细胞，如Sf9细胞、MEL细胞等，“昆虫宿主细胞”，如草地贪夜蛾或粉纹夜蛾细胞、SF9细胞、SF-21细胞或High-Five细胞，其中SF-9和SF-21是来自草地贪夜蛾的卵巢细胞，并且High-Five细胞是来自粉纹夜蛾的卵细胞，“植物宿主细胞”，如烟草、马铃薯或豌豆细胞。
各种异源宿主系统已被开发用于生产不同类型的重组丝。已在细菌(大肠杆菌)、酵母(毕赤酵母)、昆虫(家蚕幼虫)、植物(烟草、大豆、马铃薯、拟南芥)、哺乳动物细胞系(BHT/仓鼠)和转基因动物(小鼠、山羊)中克隆和表达重组部分蛛丝蛋白以及工程化丝。制成的大多数丝蛋白具有N端或C端His标签以使纯化简单并生产足量的蛋白质。
在一些实施方案中，适用于使用异源系统表达重组蛛丝蛋白的宿主可包括转基因动物和植物。在一些实施方案中，适用于使用异源系统表达重组蛛丝蛋白的宿主包含细菌、酵母、哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，适用于使用异源系统表达重组蛛丝蛋白的宿主包含大肠杆菌。在一些实施方案中，适用于使用异源系统表达重组蛛丝蛋白的宿主包含使用基因组编辑技术(例如CRISPR)生成的转基因家蚕(B.mori)。
本公开中的重组丝蛋白包含基于天然丝蛋白的重复单元的合成蛋白质。除合成重复丝蛋白序列外，这些可另外包含一个或多个天然非重复丝蛋白序列。
在一些实施方案中，“重组丝蛋白”是指重组蚕丝蛋白或其片段。已经报道了丝心蛋白和丝胶蛋白的重组生产。各种宿主用于该生产，包括大肠杆菌、酿酒酵母、假单胞菌属、红假单胞菌属、芽孢杆菌属和链霉菌属。参见EP 0230702，其通过引用整体并入本文。
本文还提供包含衍生自家蚕丝重链(H链)的重复结构域的GAGAGX六肽(X是A、Y、V或S)的丝心蛋白样多嵌段聚合物的设计和生物合成。
在一些实施方案中，本公开提供衍生自包含GAGAGS六肽重复单元的家蚕丝重链(H链)的重复结构域的丝蛋白样多嵌段聚合物。GAGAGS六肽是H链的核心单元并在结晶结构域的形成中起到重要作用。含有GAGAGS六肽重复单元的丝蛋白样多嵌段聚合物自发聚集成类似于天然丝心蛋白的β-折叠结构，其中在丝蛋白样多嵌段聚合物中具有本文所述的任何重均分子量。
在一些实施方案中，本公开提供由衍生自家蚕丝重链的H链的GAGAGS六肽重复片段和大肠杆菌生成的哺乳动物弹性蛋白VPGVG基序组成的丝肽样多嵌段共聚物。在一些实施方案中，本公开提供由衍生自家蚕丝重链的H链的GAGAGS六肽重复片段和大肠杆菌生成的GVGVP组成的融合丝心蛋白，其中在丝蛋白样多嵌段聚合物中具有本文所述的任何重均分子量。
在一些实施方案中，本公开提供由(GAGAGS)16重复片段组成的家蚕重组蛋白。在一些实施方案中，本公开提供由(GAGAGS)16重复片段和大肠杆菌生成的非重复(GAGAGS)16–F-COOH、(GAGAGS)16–F-F-COOH、(GAGAGS)16–F-F-F-COOH、(GAGAGS)16–F-F-F-F-COOH、(GAGAGS)16–F-F-F-F-F-F-F-F-COOH、(GAGAGS)16–F-F-F-F–F-F-F-F-F-F-F-F-COOH组成的重组蛋白，其中F具有下列氨基酸序列SGFGPVANGGSGEASSESDFGSSGFGPVANASSGEASSESDFAG，并且其中在丝蛋白样多嵌段聚合物中具有本文所述的任何重均分子量。
在一些实施方案中，“重组丝蛋白”是指重组蛛丝蛋白或其片段。已经报道了基于部分cDNA克隆生产重组蛛丝蛋白。如此产生的重组蛛丝蛋白包含来源于蜘蛛棒线蛛丝蛋白Spidroin 1的重复序列的一部分，所述蜘蛛棒线蛛丝蛋白来自蜘蛛络新妇属蜘蛛。参见Xu等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:7120–7124(1990)。编码来自络新妇属蜘蛛的拖丝的第二种丝心蛋白Spidroin 2的重复序列的一部分的cDNA克隆及其重组合成描述于J.Biol.Chem.,1992,volume 267,pp.19320–19324。由转化大肠杆菌重组合成包含的蛋白片段和变体的蛛丝蛋白描述于美国专利5,728,810和5,989,894中。编码小壶状腺蛛丝蛋白的cDNA克隆及其表达描述于美国专利5,733,771和5,756,677中。编码来自orb-webspinning蜘蛛的鞭状腺丝蛋白的cDNA克隆描述于美国专利5,994,099中。美国专利6,268,169描述了通过大肠杆菌、枯草杆菌和毕赤酵母重组表达系统重组合成衍生自络新妇属蜘蛛的天然蜘蛛拖牵丝中存在的重复肽序列的蛛丝样蛋白。WO 03/020916描述了具有源自金色球体蜘蛛Nephila madagascariensis、Nephila senegalensis、Tetragnathakauaiensis、Tetragnatha versicolor、Argiope aurantia、Argiope trifasciata、Gasteracantha mammosa和Latrodectus geometricus的大壶状腺、Argiope trifasciata的鞭状腺、Dolomedes tenebrosus的壶状腺、Plectreurys tristis的两组丝腺和mygalomorph Euagrus chisoseus的丝腺的重复序列的蛛丝蛋白的cDNA克隆编码和重组生产。各上述参考文献通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，重组蛛丝蛋白是蛛丝蛋白和昆虫丝蛋白、蛛丝蛋白和胶原、蛛丝蛋白和节肢弹性蛋白或蛛丝蛋白和角蛋白的杂交蛋白。蛛丝重复单元包含或由下述区域的氨基酸序列组成：所述区域包含或由至少一个在天然存在的大壶状腺多肽，如拖牵丝蛛丝多肽、小壶状腺多肽、鞭状腺多肽、聚状腺(aggregate)蛛丝多肽、葡萄状腺蛛丝多肽或梨状腺(pyriform)蛛丝多肽内重复出现的肽基序组成。
在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白包含衍生自天然蛛丝蛋白的重复单元、共有序列和任选一个或多个天然非重复蛛丝蛋白序列的合成蛛丝蛋白。天然蛛丝多肽的重复单元可包括园蛛科(Araneidae)或Araneoids的拖牵丝蛛丝多肽或鞭状腺蛛丝多肽。
如本文所用，蛛丝“重复单元”包含或由至少一个在天然存在的大壶状腺多肽，如拖牵丝蛛丝多肽、小壶状腺多肽、鞭状腺多肽、聚状腺蛛丝多肽、葡萄状腺蛛丝多肽或梨状腺蛛丝多肽内重复出现的肽基序组成。“重复单元”是指在氨基酸序列上对应于包含或由在天然存在的丝多肽(例如MaSpI、ADF-3、ADF-4或Flag)内重复出现的至少一个肽基序(例如AAAAAA或GPGQQ)组成的区域(即相同氨基酸序列)或对应于与其基本相似的氨基酸序列(即变化氨基酸序列)的区域。具有与天然存在的丝多肽内的相应氨基酸序列(即野生型重复单元)“基本相似”的氨基酸序列的“重复单元”在其性质方面也相似，例如包含“基本相似重复单元”的丝蛋白仍不溶并保持其不溶性。具有与天然存在的丝多肽的氨基酸序列“相同”的氨基酸序列的“重复单元”例如可以是与MaSpI、MaSpII、ADF-3和/或ADF-4的一个或多个肽基序对应的丝多肽的部分。具有与天然存在的丝多肽的氨基酸序列“基本相似”的氨基酸序列的“重复单元”例如可以是与MaSpI、MaSpII、ADF-3和/或ADF-4的一个或多个肽基序对应但在特定氨基酸位置具有一个或多个氨基酸取代的丝多肽的部分。
如本文所用，术语“共有肽序列”是指含有在某位置(例如“G”)频繁出现的氨基酸并且其中没有进一步确定的其他氨基酸被占位符“X”替代的氨基酸序列。在一些实施方案中，共有序列是以下至少一种：(i)GPGXX，其中X是选自A、S、G、Y、P和Q的氨基酸；(ii)GGX，其中X是选自Y、P、R、S、A、T、N和Q，优选Y、P和Q的氨基酸；(iii)Ax，其中x是5至10的整数。
GPGXX和GGX的共有肽序列，即富甘氨酸基序，为丝多肽提供柔性并因此为由含有所述基序的丝蛋白形成的线提供柔性。详细地，迭代的GPGXX基序形成旋转螺旋结构，其赋予丝多肽弹性。大壶状腺和鞭状腺丝都具有GPGXX基序。迭代的GGX基序与每圈具有三个氨基酸的螺旋结构相关联并存在于大多数蛛丝中。GGX基序可为丝提供额外弹性。迭代的聚丙氨酸Ax(肽)基序形成结晶β折叠结构以为丝多肽提供强度，如例如WO 03/057727中所述。
在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白包含两个相同的重复单元，其各自包含至少一个，优选一个选自：衍生自节肢弹性蛋白的GGRPSDTYG和GGRPSSSYG的氨基酸序列。节肢弹性蛋白是在大多数节肢动物中发现的弹性体蛋白，其提供低刚度和高强度。
本文所用的“非重复单元”是指与天然存在的拖牵丝多肽内的相应非重复(羧基末端)氨基酸序列(即野生型非重复(羧基末端)单元)，优选ADF-3(SEQ ID NO:1)、ADF-4(SEQID NO:2)、NR3(SEQ ID NO:41)、NR4(SEQ ID NO:42)、如美国专利8,367,803中所述的蜘蛛十字园蛛的ADF-4、包含序列GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP的16个重复的C16肽(蛛丝蛋白eADF4，分子量47.7kDa，AMSilk)、由来自十字园蛛的ADF4的天然序列改造的氨基酸序列“基本相似”的氨基酸序列。非重复ADF-4及其变体表现出高效组装特性。
在合成蛛丝蛋白中，本公开中的重组丝蛋白在一些实施方案中包含具有如美国专利8288512中所述的多肽序列SEQ ID NO:1的C16蛋白质。除SEQ ID NO:1中所示的多肽序列外，也特别包括这种序列的功能等同物、功能衍生物和盐。
本文所用的“功能等同物”是指在上文提到的氨基酸序列的至少一个序列位置具有与具体提到的氨基酸不同的氨基酸的突变体。
在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白包含有效量的至少一种天然或重组丝蛋白，包括蛛丝蛋白，对应于Xu等,PNAS,USA,87,7120,(1990)描述的Spidroin major 1、Hinman和Lewis,J.Biol.Chem.,267,19320,(1922)描述的Spidroin major 2、如美国专利申请2016/0222174和美国专利9,051,453、9,617,315、9,689,089、8,173,772、8,642,734、8,367,8038,097,583、8,030,024、7,754,851、7,148,039、7,060,260中描述的重组蛛丝蛋白，或专利申请WO 95/25165中描述的小蛛丝蛋白(minor Spidroins)。上文引用的参考文献各自通过引用整体并入本文。适用于本公开的重组RSPF的附加重组蛛丝蛋白包括来自十字园蛛的“大壶状腺”的ADF3和ADF4。
重组丝也描述在通过引用并入本文的其他专利和专利申请中：US 2004590196、US7,754,851、US 2007654470、US 7,951,908、US 2010785960、US 8,034,897、US20090263430、US 2008226854、US 20090123967、US 2005712095、US 2007991037、US20090162896、US 200885266、US 8,372,436、US 2007989907、US 2009267596、US2010319542、US 2009265344、US 2012684607、US 2004583227、US 8,030,024、US2006643569、US 7,868,146、US 2007991916、US 8,097,583、US 2006643200、US 8,729,238、US 8,877,903、US 20190062557、US 20160280960、US 20110201783、US 2008991916、US 2011986662、US 2012697729、US 20150328363、US 9,034,816、US 20130172478、US 9,217,017、US 20170202995、US 8,721,991、US 2008227498、US 9,233,067、US 8,288,512、US 2008161364、US 7,148,039、US 1999247806、US 2001861597、US 2004887100、US 9,481,719、US 8,765,688、US 200880705、US 2010809102、US 8,367,803、US 2010664902、US7,569,660、US 1999138833、US 2000591632、US 20120065126、US 20100278882、US2008161352、US 20100015070、US 2009513709、US 20090194317、US 2004559286、US200589551、US 2008187824、US 20050266242、US 20050227322和US 20044418。
重组丝也描述在通过引用并入本文的其他专利和专利申请中：US 20190062557、US 20150284565、US 20130225476、US 20130172478、US 20130136779、US 20130109762、US20120252294、US 20110230911、US 20110201783、US 20100298877、US 10,478,520、US 10,253,213、US 10,072,152、US 9,233,067、US 9,217,017、US 9,034,816、US 8,877,903、US8,729,238、US 8,721,991、US 8,097,583、US 8,034,897、US 8,030,024、US 7,951,908、US7,868,146和US 7,754,851。
在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白包含或由2至80个重复单元组成，所述重复单元各自独立地选自如本文定义的GPGXX、GGX和Ax。
在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白包含或由重复单元组成，所述重复单元各自独立地选自GPGAS、GPGSG、GPGGY、GPGGP、GPGGA、GPGQQ、GPGGG、GPGQG、GPGGS、GGY、GGP、GGA、GGR、GGS、GGT、GGN、GGQ、AAAAA、AAAAAA、AAAAAAA、AAAAAAAA、AAAAAAAAA、AAAAAAAAAA、GGRPSDTYG和GGRPSSSYG、(i)GPYGPGASAAAAAAGGYGPGSGQQ、(ii)GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP、(iii)GPGQQGPGQQGPGQQGPGQQ:(iv)GPGGAGGPYGPGGAGGPYGPGGAGGPY、(v)GGTTIIEDLDITIDGADGPITISEELTI、(vi)PGSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYG、(vii)SAAAAAAAAGPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSSSYG、(viii)GGAGGAGGAGGSGGAGGS(SEQ ID NO:27)、(ix)GPGGAGPGGYGPGGSGPGGYGPGGSGPGGY、(x)GPYGPGASAAAAAAGGYGPGCGQQ、(xi)GPYGPGASAAAAAAGGYGPGKGQQ、(xii)GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPCGPGGYGPGGP、(xiii)GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPSGPGGYGPGGP、(xiv)GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPSGPGGYGPGGP，或如美国专利8,877,903中描述的其变体，例如在肽链中具有GPGAS、GGY、GPGSG的序列顺序或在肽链中具有AAAAAAAA、GPGGY、GPGGP的序列顺序、在肽链中具有AAAAAAAA、GPGQG、GGR的序列顺序的合成蜘蛛肽。
在一些实施方案中，本公开提供丝蛋白样多嵌段肽，其模仿衍生自天然蛛丝蛋白的氨基酸的重复单元，如Spidroin major 1结构域、Spidroin major 2结构域或Spidroinminor 1结构域和在重复单元之间的变化模式(profile of variation)而不改变它们的三维构象，其中这些丝蛋白样多嵌段肽包含对应于以下序列(I)、(II)、(III)和/或(IV)之一的氨基酸重复单元。
[(XGG)w(XGA)(GXG)x(AGA)y(G)zAG]p式(I)，其中：X对应于酪氨酸或对应于谷氨酰胺，w是等于2或3的整数，x是1至3的整数，y是5至7的整数，z是等于1或2的整数，并且p是整数，并具有本文所述的任何重均分子量，和/或
[(GPG2YGPGQ2)a(X’)2S(A)b]p式(II)，其中：X’对应于氨基酸序列GPS或GPG，a等于2或3，b是7至10的整数，p是整数，并具有本文所述的任何重均分子量，和/或
[(GR)(GA)l(A)m(GGX)n(GA)l(A)m]p式(III)和/或[(GGX)n(GA)m(A)l]p式(IV)，其中：X”对应于酪氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸，L是1至6的整数，m是0至4的整数，n是1至4的整数，并且p是整数。
在一些实施方案中，重组蛛丝蛋白或蛛丝蛋白的类似物包含序列(V)的氨基酸重复单元：
[(Xaa Gly Gly)w(Xaa Gly Ala)(Gly Xaa Gly)x(Ala Gly Ala)y(Gly)zAla Gly]p式(V)，其中Xaa是酪氨酸或谷氨酰胺，w是等于2或3的整数，x是1至3的整数，y是5至7的整数，z是等于1或2的整数，并且p是整数。
在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白选自的ADF-3或其变体、ADF-4或其变体、MaSpI(SEQ ID NO:43)或其变体、MaSpII(SEQ ID NO:44)或其变体，如美国专利8,367,803中所述。
在一些实施方案中，本公开提供在哺乳动物细胞中制成的水溶性重组蛛丝蛋白。在哺乳动物细胞中制成的蛛丝蛋白的可溶性可归因于这些蛋白质中的COOH末端的存在，以使它们更亲水。在微生物宿主中表达的蛛丝蛋白中不存在这些COOH端基氨基酸。
在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白包括用选自氨基酸序列：GCGGGGGG、GKGGGGGG、GCGGSGGGGSGGGG、GKGGGGGGSGGGG和GCGGGGGGSGGGG的氨基或羧基端基改性的水溶性重组蛛丝蛋白C16。在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白包含C16NR4、C32NR4、C16、C32、NR4C16NR4、NR4C32NR4、NR3C16NR3或NR3C32NR3，使得所述蛋白的分子量在本文所述的范围内。
在一些实施方案中，本公开中的重组蛛丝蛋白包括如美国专利8,877,903中所述的具有合成重复肽段和由来自十字园蛛的ADF4的天然序列改造的氨基酸序列的重组蛛丝蛋白。在一些实施方案中，本公开中的RSPF包括所述的具有衍生自天然蛛丝蛋白的重复肽单元，如Spidroin major 1结构域、Spidroin major 2结构域或Spidroin minor 1结构域的重组蛛丝蛋白，其中重复肽序列是GSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYG或SAAAAAAAAGPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSSSYG，如美国专利8,367,803中所述。
在一些实施方案中，本公开提供由GPGGAGPGGYGPGGSGPGGYGPGGSGPGGY重复片段组成并具有如本文中所述的分子量的重组蛛丝蛋白。
如本文所用，术语“重组丝”是指重组蛛丝和/或蚕丝蛋白或其片段。在一个实施方案中，蛛丝蛋白选自包裹丝(swathing silk)(葡萄状(Achniform)腺丝)、卵袋丝(eggsacsilk)(圆筒状(Cylindriform)腺丝)、包卵丝(egg case silk)(管状(Tubuliform)腺丝)、无粘性拖牵丝(壶状(Ampullate)腺丝)、附线丝(attaching thread silk)(梨状腺丝)、粘性丝芯纤维(鞭状(Flagelliform)腺丝)和粘性丝外层纤维(聚状腺丝)。例如，如本文中所述的重组蛛丝蛋白包括美国专利申请2016/0222174和美国专利9,051,453、9,617,315、9,689,089、8,173,772和8,642,734中描述的蛋白质。
一些生物体制造具有独特序列、结构元素和机械性质的多种丝纤维。例如，圆形织网(orb weaving)蜘蛛具有六种独特类型的腺体，以产生不同的丝多肽序列，它们聚合成适应环境或生命周期小生境(lifecycle niche)的纤维。这些纤维以它们来源的腺体命名，并且多肽用腺体缩写(例如“Ma”)和“Sp”，即蛛丝蛋白(蛛丝心蛋白的简写)标记。在圆形织网蛛中，这些类型包括大壶状腺(MaSp，也称为拖牵丝)、小壶状腺(MiSp)、鞭状腺(Flag)、葡萄状腺(AcSp)、管状腺(TuSp)和梨状腺(PySp)。跨越纤维类型、结构域和在不同属和种的生物体之间的变化的多肽序列的这种组合带来一大系列的潜在性质，这可通过重组纤维的商业生产控制。迄今，绝大多数关于重组丝的工作集中于大壶状腺蛛丝蛋白(MaSp)。
葡萄状腺(AcSp)丝倾向于具有高韧度，这是中高强度与中高延展性结合的结果。AcSp丝的特征在于大嵌段(“整体重复”)尺寸，其通常包含聚丝氨酸和GPX的基序。管状腺(TuSp或Cylindrical)丝倾向于具有大直径，以及适中的强度和高延展性。TuSp丝的特征在于它们的聚丝氨酸和聚苏氨酸含量，和聚丙氨酸的短段。大壶状腺(MaSp)丝倾向于具有高强度和适中的延展性。MaSp丝可以是两种亚型之一：MaSp1和MaSp2。MaSp1丝的延展性通常不如MaSp2丝，并且特征在于聚丙氨酸、GX和GGX基序。MaSp2丝的特征在于聚丙氨酸、GGX和GPX基序。小壶状腺(MiSp)丝倾向于具有适中的强度和适中的延展性。MiSp丝的特征在于GGX、GA和poly A基序，并通常含有约100个氨基酸的间隔单元。鞭状腺(Flag)丝倾向于具有极高延展性和适中强度。Flag丝通常以GPG、GGX和短间隔基序为特征。
丝多肽特有地由重复结构域(REP)和在其两侧的非重复区(例如C端和N端结构域)组成。在一个实施方案中，C端和N端结构域在长度上都为75-350个氨基酸。重复结构域表现出分级构造。重复结构域包含一系列嵌段(也称为重复单元)。这些嵌段在丝重复结构域中重复，有时完美，有时不完美(构成准重复结构域)。嵌段的长度和组成在不同丝类型之间和在不同物种之间变化。美国公开申请2016/0222174(其全文并入本文)的表1列举来自所选物种和丝类型的嵌段序列的实例，在Rising,A.等,Spider silk proteins:recentadvances in recombinant production,structure-function relationships andbiomedical applications,Cell Mol.Life Sci.,68:2,pg 169-184(2011)；和Gatesy,J.等，Extreme diversity,conservation,and convergence of spider silk fibroinsequences,Science,291:5513,pg.2603-2605(2001)中给出进一步实例。在一些情况下，嵌段可以规则型式排布，以形成在丝序列的重复结构域中出现多次(通常2-8次)的更大大型重复(macro-repeats)。在重复结构域或大型重复内的重复嵌段和在重复结构域内的重复大型重复可被间隔单元隔开。
在美国公开专利申请2016/0222174中阐述了根据本公开的某些实施方案由这些嵌段和/或大型重复结构域构造某些蛛丝嵌段共聚物多肽。
通过在重组原核或真核系统中的基因表达制成的基于蛛丝序列的重组嵌段共聚物多肽可根据本领域中已知的方法纯化。在一个优选实施方案中，可使用市售表达/分泌系统，由此表达重组多肽，此后从宿主细胞中分泌，以容易地从周围介质中纯化。如果不使用表达/分泌载体，替代性的方法涉及从衍生自表达多肽的原核或真核细胞的细胞裂解液(细胞完整性破坏后的细胞残留物)中纯化重组嵌段共聚物多肽。生成这样的细胞裂解液的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，从细胞培养上清液中分离重组嵌段共聚物多肽。
重组嵌段共聚物多肽可以通过亲和分离纯化，例如通过与特异性结合重组多肽的抗体的免疫相互作用，或通过用于分离在其N端或C端用6-8个组氨酸残基标记的重组多肽的镍柱，备选的标签可以包含FLAG表位或血凝素表位。替代性的标签可包含FLAG表位或血凝素表位。熟练的从业人员常使用这样的方法。
可随后制备这样的多肽(即重组丝蛋白)的溶液并如本文中所述使用。
在另一实施方案中，重组丝蛋白可根据美国专利8,642,734(其通过引用整体并入本文)中描述的方法制备，并如本文中所述使用。
在一个实施方案中，提供重组蛛丝蛋白。该蛛丝蛋白通常由170至760个氨基酸残基，如170至600个氨基酸残基，优选280至600个氨基酸残基，如300至400个氨基酸残基，更优选340至380个氨基酸残基组成。小尺寸是有利的，因为较长的蛛丝蛋白倾向于形成非晶聚集体，这要求使用严苛的溶剂进行溶解和聚合。重组蛛丝蛋白可以包含多于760个残基，特别是在其中所述蛛丝蛋白包含源自蛛丝蛋白的N端部分的多于两个片段的情况下，所述蛛丝蛋白包含由至少一个衍生自蛛丝蛋白的相应部分的片段(NT)组成的N端片段，和衍生自蛛丝蛋白的相应内部片段的重复片段(REP)。任选地，该蛛丝蛋白包含衍生自蛛丝蛋白的相应片段的C端片段(CT)。该蛛丝蛋白通常包含单个衍生自蛛丝蛋白的N端部分的片段(NT)，但在优选实施方案中，N端片段包含至少两个，如两个衍生自蛛丝蛋白的N端部分的片段(NT)。因此，蛛丝蛋白可示意性地由式NTm-REP或者NTm-REP-CT表示，其中m是1或更高，如2或更高，优选在1-2、1-4、1-6、2-4或2-6的范围内的整数。优选的蛛丝蛋白可以用式NT2-REP或NT-REP，或者NT2-REP-CT或NT-REP-CT来示意性地表示。蛋白片段通常经由肽键共价偶联。在一个实施方案中，蛛丝蛋白由偶联到REP片段的一个或多个NT片段组成，所述REP片段任选偶联到CT片段。
在一个实施方案中，生产分离的蛛丝蛋白的聚合物的方法的第一步骤涉及在合适的宿主，如大肠杆菌中表达编码蛛丝蛋白的多核酸分子。使用标准程序分离由此获得的蛋白质。任选地，在此阶段主动去除脂多糖和其他致热原。
在生产分离的蛛丝蛋白的聚合物的方法的第二步骤中，提供蛛丝蛋白在液体介质中的溶液。术语“可溶”和“在溶液中”是指蛋白质在60,000×g下没有明显聚集并且没有从溶剂中沉淀。液体介质可以是任何合适的介质，如水性介质，优选生理介质，通常是缓冲的水性介质，如10-50mM Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。液体介质具有6.4或更高的pH和/或防止蛛丝蛋白聚合的离子组成。也就是说，液体介质具有6.4或更高的pH或防止蛛丝蛋白聚合的离子组成或两者。
技术人员可容易地利用本文公开的方法制备防止蛛丝蛋白聚合的离子组合物。优选的防止蛛丝蛋白聚合的离子组合物具有大于300mM的离子强度。防止蛛丝蛋白聚合的离子组合物的具体实例包含高于300mM NaCl、100mM磷酸盐和对蛛丝蛋白聚合具有所需预防作用的这些离子的组合，例如10mM磷酸盐和300mM NaCl的组合。
NT片段的存在改进溶液的稳定性并防止在这些条件下形成聚合物。当立即聚合可能不理想时，例如在蛋白质纯化过程中、在大批量的制备中或当需要优化其他条件时，这是有利的。优选的是，将液体介质的pH调节到6.7或更高，如7.0或更高，或甚至8.0或更高，如最多10.5，以实现蛛丝蛋白的高溶解度。也有利的是，将液体介质的pH调节到6.4-6.8的范围，这提供蛛丝蛋白的足够溶解度，但有利于随后将pH调节到6.3或更低。
在第三步骤中，将液体介质的性质调节到6.3或更低的pH和允许聚合的离子组成。也就是说，如果溶解蛛丝蛋白的液体介质具有6.4或更高的pH，则将pH降低到6.3或更低。技术人员熟知各种实现其的方式，通常涉及加入强酸或弱酸。如果溶解蛛丝蛋白的液体介质具有防止聚合的离子组成，则改变离子组成以允许聚合。技术人员熟知各种实现其的方式，例如稀释、渗析或凝胶过滤。如果需要，这一步骤涉及将液体介质的pH降低到6.3或更低和改变离子组成以允许聚合。优选的是，将液体介质的pH调节到6.2或更低，如6.0或更低。特别地，从实用的角度看可能有利的是，限制pH从前一步骤中的6.4或6.4-6.8降低到这一步骤中的6.3或6.0-6.3，例如6.2。在一个优选实施方案中，这一步骤的液体介质的pH为3或更高，如4.2或更高。所得pH范围，例如4.2-6.3促进快速聚合。
在第四步骤中，使蛛丝蛋白在具有6.3或更低的pH和允许蛛丝蛋白聚合的离子组成的液体介质中聚合。尽管NT片段的存在改进蛛丝蛋白在6.4或更高的pH和/或防止蛛丝蛋白聚合的离子组成下的可溶性，但其在离子组成允许蛛丝蛋白聚合时在6.3或更低的pH下加速聚合物形成。所得聚合物优选是固体和宏观的(macroscopic)，并且它们在具有6.3或更低的pH和允许蛛丝蛋白聚合的离子组成的液体介质中形成。在一个优选实施方案中，这一步骤的液体介质的pH为3或更高，如4.2或更高。所得pH范围，例如4.2-6.3促进快速聚合，所得聚合物可以本文所述的分子量提供并以溶液形式制备，所述溶液形式在必要时可用于制品涂布。
技术人员可容易地利用本文公开的方法制备允许蛛丝蛋白聚合的离子组合物。优选的允许蛛丝蛋白聚合的离子组合物具有小于300mM的离子强度。允许蛛丝蛋白聚合的离子组合物的具体实例包含150mM NaCl、10mM磷酸盐、20mM磷酸盐和对蛛丝蛋白聚合缺乏预防作用的这些离子的组合，例如10mM磷酸盐或20mM磷酸盐和150mM NaCl的组合。优选将这种液体介质的离子强度调节到1-250mM的范围。
不希望限制于任何特定理论，但认为NT片段具有带相反电荷的两极(oppositelycharged poles)，并且环境pH变化影响该蛋白质表面上的电荷平衡，随后聚合，而盐抑制同一事件。
在中性pH下，埋藏酸性极的过量负电荷的能量支出(energetic cost)预计防止聚合。但是，随着二聚体在较低pH下接近其等电点，吸引性的静电力最终占主导，这解释了观察到的NT和含NT的小蛛丝蛋白(minispidroin)的盐和pH依赖性的聚合特性。据提议，在一些实施方案中，pH诱发的NT聚合和NT-小蛛丝蛋白的提高的纤维组装效率归因于表面静电势变化，并且在NT的一极的酸性残基簇改变其电荷平衡，以致在6.3或更低的pH值下发生聚合过渡。
在第五步骤中，从所述液体介质中分离所得的优选固体的蛛丝蛋白聚合物。任选地，这一步骤涉及从蛛丝蛋白聚合物中主动去除脂多糖和其他致热原。
不希望限制于任何特定理论，但已经观察到，蛛丝蛋白聚合物的形成经由水溶性蛛丝蛋白二聚体的形成进行。本公开因此还提供一种生产分离的蛛丝蛋白的二聚体的方法，其中前两个方法步骤如上所述。蛛丝蛋白作为二聚体存在于具有6.4或更高的pH和/或防止所述蛛丝蛋白聚合的离子组成的液体介质中。第三步骤涉及分离第二步骤中获得的二聚体，和任选去除脂多糖和其他致热原。在一个优选实施方案中，本公开的蛛丝蛋白聚合物由聚合的蛋白质二聚体组成。本公开因此提供蛛丝蛋白，优选本文中公开的那些用于生产蛛丝蛋白的二聚体的新型用途。
根据另一个方面，本公开提供如本文公开的蛛丝蛋白的聚合物。在一个实施方案中，这种蛋白质的聚合物可通过根据本公开的用于其的任何一种方法获得。因此，本公开提供重组蛛丝蛋白，优选本文中公开的那些用于生产作为重组丝基涂层的蛛丝蛋白聚合物的各种用途。根据一个实施方案，本公开提供蛛丝蛋白的二聚体，优选本文中公开的那些用于生产作为重组丝基涂层的分离的蛛丝蛋白聚合物的新型用途。在这些用途中，优选的是，在具有6.3或更低的pH和允许所述蛛丝蛋白聚合的离子组成的液体介质中制成该聚合物。在一个实施方案中，液体介质的pH为3或更高，如4.2或更高。所得pH范围，例如4.2-6.3促进快速聚合。
使用本公开的一种或多种方法，可以控制聚合过程，并且这能够优化参数以获得具有理想性质和形状的丝聚合物。
在一个实施方案中，本文所述的重组丝蛋白包括美国专利8,642,734中描述的那些，其通过引用整体并入本文。
在另一实施方案中，本文所述的重组丝蛋白可根据美国专利9,051,453中描述的方法制备，其通过引用整体并入本文。
美国专利9,051,453的SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列等同于由ADF3的氨基酸序列在C端的50个氨基酸残基组成的氨基酸序列(NCBI登录号:AAC47010，GI:1263287)。美国专利9,051,453的SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列等同于已从C端去除20个残基的美国专利9,051,453的SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列。美国专利9,051,453的SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列等同于已从C端去除29个残基的SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列。
含有式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元并在C端具有SEQ ID NO:1至3的任一个所表示的氨基酸序列或与美国专利9,051,453的SEQ ID NO:1至3的任一个所表示的氨基酸序列具有90％或更大同源性的氨基酸序列的多肽的一个实例是具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:8所表示的氨基酸序列的多肽。具有美国专利9,051,453的SEQ IDNO:8所表示的氨基酸序列的多肽通过以下突变获得：在ADF3的氨基酸序列中(NCBI登录号:AAC47010，GI:1263287)——已向其N端添加由起始密码子、His 10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点组成的氨基酸序列(美国专利9,051,453的SEQ ID NO:5)，将第1至第13个重复区大致翻倍且翻译结束于第1154个氨基酸残基。在具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:8所表示的氨基酸序列的多肽中，C端序列等同于SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列。
此外，含有式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元并在C端具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:1至3的任一个所表示的氨基酸序列或与美国专利9,051,453的SEQID NO:1至3的任一个所表示的氨基酸序列具有90％或更大同源性的氨基酸序列的多肽可以是具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:8所表示的氨基酸序列的蛋白质，其中已取代、删除、插入和/或添加一个或多个氨基酸并具有由晶体区和非晶区组成的重复区。
此外，含有两个或更多个式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元的多肽的实例是具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:15所表示的氨基酸序列的衍生自ADF4的重组蛋白。美国专利9,051,453的SEQ ID NO:15所表示的氨基酸序列是通过将由起始密码子、His 10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点组成的氨基酸序列(美国专利9,051,453的SEQ ID NO:5)添加到获自NCBI数据库的ADF4(NCBI登录号:AAC47011，GI:1263289)的部分氨基酸序列的N端而得的氨基酸序列。此外，含有两个或更多个式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元的多肽可以是具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:15所表示的氨基酸序列的多肽，其中已取代、删除、插入和/或添加一个或多个氨基酸并具有由晶体区和非晶区组成的重复区。此外，含有两个或更多个式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元的多肽的实例是具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:17所表示的氨基酸序列的衍生自MaSp2的重组蛋白。美国专利9,051,453的SEQ ID NO:17所表示的氨基酸序列是通过将由起始密码子、His 10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点组成的氨基酸序列(美国专利9,051,453的SEQ ID NO:5)添加到获自NCBI网络数据库的MaSp2(NCBI登录号:AAT75313，GI:50363147)的部分序列的N端而得的氨基酸序列。此外，含有两个或更多个式1:REP1-REP2(1)所表示的氨基酸序列的单元的多肽可以是具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:17所表示的氨基酸序列的多肽，其中已取代、删除、插入和/或添加一个或多个氨基酸并具有由晶体区和非晶区组成的重复区。
衍生自鞭状腺丝蛋白的多肽的实例包括含有10个或更多个式2:REP3(2)所表示的氨基酸序列的单元的多肽，优选含有20个或更多个其单元的多肽，更优选含有30个或更多个其单元的多肽。在使用微生物如大肠杆菌作为宿主生产重组蛋白的情况下，考虑到生产力，衍生自鞭状腺丝蛋白的多肽的分子量优选为500kDa或更小，更优选300kDa或更小，进一步优选200kDa或更小。
在式(2)中，REP 3是指由Gly-Pro-Gly-Gly-X组成的氨基酸序列，其中X是指选自Ala、Ser、Tyr和Val的氨基酸。
蛛丝的主要特征在于鞭状腺丝没有晶体区，但具有由非晶区组成的重复区。由于主要拖牵丝等具有由晶体区和非晶区组成的重复区，它们预计具有高应力和拉伸性。同时，关于鞭状腺丝，尽管应力不如主要拖牵丝，但拉伸性高。其原因被认为是大多数鞭状腺丝由非晶区组成。
含有10个或更多个式2:REP3(2)所表示的氨基酸序列的单元的多肽的一个实例是具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:19所表示的氨基酸序列的衍生自鞭状腺丝蛋白的重组蛋白。美国专利9,051,453的SEQ ID NO:19所表示的氨基酸序列是通过将获自NCBI数据库的络新妇属蜘蛛的鞭状腺丝蛋白的部分序列(NCBI登录号:AAF36090，GI:7106224)，尤其是其从N端的第1220个残基至1659个残基的氨基酸序列(对应于重复区和基序)(被称为PR1序列)与获自NCBI数据库的络新妇属蜘蛛的鞭状腺丝蛋白的部分序列(NCBI登录号:AAC38847，GI:2833649)，尤其是其从C端的第816个残基至907个残基的C端氨基酸序列组合，此后将由起始密码子、His 10标签和HRV3C蛋白酶识别位点组成的氨基酸序列(美国专利9,051,453的SEQ ID NO:5)添加到该组合序列的N端而得的氨基酸序列。此外，含有10个或更多个式2:REP3(2)所表示的氨基酸序列的单元的多肽可以是具有美国专利9,051,453的SEQ ID NO:19所表示的氨基酸序列的多肽，其中已取代、删除、插入和/或添加一个或多个氨基酸并具有由非晶区组成的重复区。
可使用已通过含有编码多肽的基因的表达载体转化的宿主生产多肽。生产基因的方法不受特别限制，并且其可通过由聚合酶链式反应(PCR)等扩增编码来自源于蜘蛛的细胞的天然蛛丝蛋白的基因并将其克隆制成，或可化学合成。化学合成基因的方法也不受特别限制，并且其可如下合成，例如：基于获自NCBI网络数据库的天然蛛丝蛋白的氨基酸序列的信息等，通过PCR连接已用AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare日本公司)自动合成的寡核苷酸等。此时，为了促进蛋白质的纯化和观察，可以合成编码具有上述氨基酸序列的已向其N端添加由起始密码子和His 10标签组成的氨基酸序列而得的氨基酸序列的蛋白质的基因。
表达载体的实例包括可基于DNA序列表达蛋白质的质粒、噬菌体、病毒等。质粒型表达载体不受特别限制，只要其允许在宿主细胞中表达靶基因并且可将其自身扩增。例如，在使用大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主的情况下，可使用pET22b(+)质粒载体、pCold质粒载体等。在这些中，考虑到蛋白质的生产力，优选使用pET22b(+)质粒载体。宿主的实例包括动物细胞、植物细胞、微生物等。
本公开所用的多肽优选是衍生自ADF3的多肽，ADF3是十字园蛛的两种主要拖牵丝蛋白之一。这种多肽的优点在于基本具有高强度-伸长和韧度并且容易合成。
因此，根据本文所述的实施方案、制品和/或方法使用的重组丝蛋白(例如，基于重组蛛丝的蛋白)可以包括一种或多种上文所述的或美国专利8,173,772、8,278,416、8,618,255、8,642,734、8,691,581、8,729,235、9,115,204、9,157,070、9,309,299、9,644,012、9,708,376、9,051,453、9,617,315、9,968,682、9,689,089、9,732,125、9,856,308、9,926,348、10,065,997、10,316,069和10,329,332；和美国专利公开2009/0226969、2011/0281273、2012/0041177、2013/0065278、2013/0115698、2013/0316376、2014/0058066、2014/0079674、2014/0245923、2015/0087046、2015/0119554、2015/0141618、2015/0291673、2015/0291674、2015/0239587、2015/0344542、2015/0361144、2015/0374833、2015/0376247、2016/0024464、2017/0066804、2017/0066805、2015/0293076、2016/0222174、2017/0283474、2017/0088675、2019/0135880、2015/0329587、2019/0040109、2019/0135881、2019/0177363、2019/0225646、2019/0233481、2019/0031842、2018/0355120、2019/0186050、2019/0002644、2020/0031887、2018/0273590、20191/094403、2019/0031843、2018/0251501、2017/0066805、2018/0127553、2019/0329526、2020/0031886、2018/0080147、2019/0352349、2020/0043085、2019/0144819、2019/0228449、2019/0340666、2020/0000091、2019/0194710、2019/0151505、2018/0265555、2019/0352330、2019/0248847和2019/0378191(它们通过引用整体并入本文)中列举的重组丝蛋白。
丝心蛋白样蛋白片段
本公开中的重组丝蛋白包含基于天然丝蛋白的重复单元的合成蛋白质。除合成重复丝蛋白序列外，这些可另外包含一个或多个天然非重复丝蛋白序列。本文所用的“丝心蛋白样蛋白片段”是指具有如本文定义的分子量和多分散性和与选自天然丝蛋白、丝心蛋白重链、丝心蛋白轻链或包含一个或多个GAGAGS六氨基酸重复单元的任何蛋白质的蛋白质的一定程度同源性的蛋白片段。在一些实施方案中，同源性程度选自约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约89％、约88％、约87％、约86％、约85％、约84％、约83％、约82％、约81％、约80％、约79％、约78％、约77％、约76％、约75％或小于75％。
如本文所述，蛋白质例如天然丝蛋白、丝心蛋白重链、丝心蛋白轻链或包含一个或多个GAGAGS六氨基酸重复单元的任何蛋白质包含约9％至约45％的甘氨酸、或约9％的甘氨酸、或约10％的甘氨酸、约43％的甘氨酸、约44％的甘氨酸、约45％的甘氨酸或约46％的甘氨酸。如本文所述，蛋白质，如天然丝蛋白、丝心蛋白重链、丝心蛋白轻链或包含一个或多个GAGAGS六氨基酸重复单元的任何蛋白质包含约13％至约30％的丙氨酸、或约13％丙氨酸、或约28％丙氨酸、或约29％丙氨酸、或约30％丙氨酸或约31％丙氨酸。如本文所述，蛋白质，如天然丝蛋白、丝心蛋白重链、丝心蛋白轻链或包含一个或多个GAGAGS六氨基酸重复单元的任何蛋白质包含9％至约12％的丝氨酸、或约9％丝氨酸、或约10％丝氨酸、或约11％丝氨酸或约12％丝氨酸。
在一些实施方案中，本文所述的丝心蛋白样蛋白质包含约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％或约55％的甘氨酸。在一些实施方案中，本文所述的丝心蛋白样蛋白质包含约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％或约39％的丙氨酸。在一些实施方案中，本文所述的丝心蛋白样蛋白质包含约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％或约22％的丝氨酸。在一些实施方案中，本文所述的丝心蛋白样蛋白质可独立地包含已知包含在天然丝心蛋白中的任何氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的丝心蛋白样蛋白质可独立地不包含已知包含在天然丝心蛋白中的任何氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的丝心蛋白样蛋白质中的平均2/6的氨基酸、3/6的氨基酸或4/6的氨基酸是甘氨酸。在一些实施方案中，本文所述的丝心蛋白样蛋白质中的平均1/6的氨基酸、2/6的氨基酸或3/6的氨基酸是丙氨酸。在一些实施方案中，本文所述的丝心蛋白样蛋白质中的平均0/6的氨基酸、1/6的氨基酸或2/6的氨基酸是丝氨酸。
SPF的其他性质
本公开的组合物“生物相容”或表现出“生物相容性”，意味着该组合物由于无毒、无害或无生理反应性并且不造成免疫排斥或炎性响应而与活组织或生命系统相容。可通过参与者在他们的皮肤上局部施加本公开的组合物延长的时间段来证明这样的生物相容性。在一个实施方案中，延长的时间段为约3天。在一个实施方案中，延长的时间段为约7天。在一个实施方案中，延长的时间段为约14天。在一个实施方案中，延长的时间段为约21天。在一个实施方案中，延长的时间段为约30天。在一个实施方案中，延长的时间段选自由以下组成的组：约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月和无限期的。例如，在一些实施方案中，本文所述的涂层是生物相容涂层。
在一些实施方案中，可以评估本文所述的组合物(其可以是生物相容组合物)(例如包含丝的生物相容涂层)并符合标题为“Biological evaluation of medical devices–Part 1:Evaluation and testing within a risk management process”的国际标准ISO10993-1。在一些实施方案中，可以根据ISO 106993-1评估本文所述的组合物(其可以是生物相容组合物)的细胞毒性、致敏性、血液相容性、致热原性、植入、基因毒性、致癌性、生殖和发育毒性和降解的一种或多种。
本公开的组合物是“低致敏的”，意味着它们相对不太可能造成过敏反应。可通过参与者在他们的皮肤上局部施加本公开的组合物延长的时间段来证明这样的低致敏性。在一个实施方案中，延长的时间段为约3天。在一个实施方案中，延长的时间段为约7天。在一个实施方案中，延长的时间段为约14天。在一个实施方案中，延长的时间段为约21天。在一个实施方案中，延长的时间段为约30天。在一个实施方案中，延长的时间段选自由以下组成的组：约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月和无限期的。
在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约1天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约2天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约3天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约4天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约5天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约6天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约7天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约8天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约9天。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约10天。
在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天或约30天。
在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为10天至6个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为6个月至12个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为12个月至18个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为18个月至24个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为24个月至30个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为30个月至36个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为36个月至48个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为48个月至60个月。
在一个实施方案中，由于该蛋白质的结晶度，本公开的SPF组合物不溶于水溶液。在一个实施方案中，本公开的SPF组合物可溶于水溶液。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含约2/3的结晶部分和约1/3的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含约一半的结晶部分和约一半的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含99％结晶部分和1％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含95％结晶部分和5％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含90％结晶部分和10％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含85％结晶部分和15％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含80％结晶部分和20％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含75％结晶部分和25％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含70％结晶部分和30％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含65％结晶部分和35％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含60％结晶部分和40％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含50％结晶部分和50％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含40％结晶部分和60％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含35％结晶部分和65％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含30％结晶部分和70％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含25％结晶部分和75％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含20％结晶部分和80％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含15％结晶部分和85％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含10％结晶部分和90％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含5％结晶部分和90％非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含1％结晶部分和99％非晶区。
如本文所用，术语“基本不含无机残留物”是指该组合物表现出0.1％(w/w)或更少的残留物。在一个实施方案中，基本不含无机残留物是指表现出0.05％(w/w)或更少的残留物的组合物。在一个实施方案中，基本不含无机残留物是指表现出0.01％(w/w)或更少的残留物的组合物。在一个实施方案中，无机残留物的量为0ppm(“检测不到”或“ND”)至1000ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约500ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约400ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约300ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约200ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约100ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为10ppm至1000ppm。
如本文所用，术语“基本不含机残留物”是指组合物表现出0.1％(w/w)或更少的残留物，在一个实施方案中，基本上不含机残留物是指组合物表现出0.05％(w/w)或更少的残留物。在一个实施方案中，基本上不含有机残留物是指组合物表现出0.01％(w/w)或更少的残留物。在一个实施方案中，有机残留物的量为0ppm(“检测不到”或“ND”)至1000ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约500ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约400ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约300ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约200ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约100ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为10ppm至1000ppm。
本公开的组合物表现出“生物相容性”，意味着该组合物由于无毒、无害或无生理反应性并且不造成免疫排斥而与活组织或生命系统相容。可通过参与者在他们的皮肤上局部施加本公开的组合物延长的时间段来证明这样的生物相容性。在一个实施方案中，延长的时间段为约3天。在一个实施方案中，延长的时间段为约7天、在一个实施方案中，延长的时间段为约14天、在一个实施方案中，延长的时间段为约21天。在一个实施方案中，延长的时间段为约30天。在一个实施方案中，延长的时间段选自由以下组成的组：约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月和无限期的。
本公开的组合物是“低致敏的”，意味着它们相对不太可能造成过敏反应。可通过参与者在他们的皮肤上局部施加本公开的组合物延长的时间段来证明这样的低致敏性。在一个实施方案中，延长的时间段为约3天。在一个实施方案中，延长的时间段为约7天。在一个实施方案中，延长的时间段为约14天。在一个实施方案中，延长的时间段为约21天。在一个实施方案中，延长的时间段为约30天。在一个实施方案中，延长的时间段选自由以下组成的组：约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月和无限期的。
下面是本公开的丝溶液的制备中和用于该制备的各种参数的合适范围的非限制性实例。本公开的丝溶液可包括这些参数的一个或多个，但不必是全部，并可使用这样的参数的范围的各种组合制备。
在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于30.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于25.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于20.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于19.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于18.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于17.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于16.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于15.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于14.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于13.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于12.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于11.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于10.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于9.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于8.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于7.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于6.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于5.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于4.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于3.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于2.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于1.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.9重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.8重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.7重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.6重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.4重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.3重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.2重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比小于0.1重量％。
在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.1重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.2重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.3重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.4重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.6重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.7重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.8重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于0.9重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于1.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于2.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于3.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于4.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于5.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于6.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于7.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于8.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于9.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于10.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于11.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于12.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于13.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于14.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于15.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于16.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于17.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于18.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于19.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于20.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比大于于25.0重量％。
在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约30.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约25.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约20.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约15.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约10.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约9.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约8.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约7.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约6.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约6.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约5.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约5.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约4.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约4.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约3.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约3.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约2.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约2.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约2.4重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.5重量％至约5.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.5重量％至约4.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.5重量％至约4.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.5重量％至约3.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.5重量％至约3.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.5重量％至约2.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约1.0重量％至约4.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约1.0重量％至约3.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约1.0重量％至约3.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约1.0重量％至约2.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约1.0重量％至约2.4重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约1.0重量％至约2.0重量％。
在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约20.0重量％至约30.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约10.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约1.0重量％至约10.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约2重量％至约10.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约0.1重量％至约6.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约6.0重量％至约10.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约6.0重量％至约8.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约6.0重量％至约9.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约10.0重量％至约20.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约11.0重量％至约19.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约12.0重量％至约18.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约13.0重量％至约17.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比范围为约14.0重量％至约16.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约1.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约1.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约2.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约2.4重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为3.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为3.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约4.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约4.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约5.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约5.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约6.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约6.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约7.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约7.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约8.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约8.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约9.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约9.5重量％。在一个实施方案中，溶液中的SPF百分比为约10.0重量％。
在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为检测不到至25.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为检测不到至5.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为1.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为2.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为3.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为4.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为5.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为10.0重量％。在一个实施方案中，溶液中的丝胶蛋白百分比为25.0重量％。
在一些实施方案中，本公开的丝心蛋白片段贮存稳定(当储存在水溶液中时它们不会缓慢或自发胶凝并且随时间经过没有片段聚集，因此分子量没有增加)10天至3年，取决于储存条件、SPF百分比和装运次数和装运条件。另外，可以改变pH以通过防止丝的过早折叠和聚集而延长贮存寿命和/或支持装运条件。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至1年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至2年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至3年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至4年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至5年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为1至2年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为1至3年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为1至4年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为1至5年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为2至3年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为2至4年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为2至5年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为3至4年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为3至5年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为4至5年。
在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为10天至6个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为6个月至12个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为12个月至18个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为18个月至24个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为24个月至30个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为30个月至36个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为36个月至48个月。在一个实施方案中，本公开的组合物的稳定性为48个月至60个月。
在一个实施方案中，具有SPF的本公开的组合物具有检测不到的水平的水平的LiBr残留物。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为10ppm至1000ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为10ppm至300ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于25ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于50ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于75ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于100ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于200ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于300ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于400ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于500ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于600ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于700ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于800ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于900ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量小于1000ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至500ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至450ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至400ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至350ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至300ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至250ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至200ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至150ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为检测不到至100ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为100ppm至200ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为200ppm至300ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为300ppm至400ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的LiBr残留物的量为400ppm至500ppm。
在一个实施方案中，具有SPF的本公开的组合物具有检测不到的水平的水平的Na2CO3残留物。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于100ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于200ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于300ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于400ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于500ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于600ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于700ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于800ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于900ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量小于1000ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至500ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至450ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至400ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至350ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至300ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至250ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至200ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至150ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至100ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为100ppm至200ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为200ppm至300ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为300ppm至400ppm。在一个实施方案中，本公开的组合物中的Na2CO3残留物的量为400ppm至500ppm。
本公开的SPF组合物的一个独有特征是10天至3年的贮存稳定性(当储存在水溶液中时它们不会缓慢或自发胶凝并且随时间经过没有片段聚集，因此分子量没有增加)，取决于储存条件、丝百分比和装运次数和装运条件。另外，可以改变pH以通过防止丝的过早折叠和聚集而延长贮存寿命和/或支持装运条件。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温(RT)下长达2周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达4周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达6周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达8周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达10周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达12周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下约4周至约52周的贮存稳定性。
下表18显示了本公开的SPF组合物的实施方案的贮存稳定性测试结果。
在一些实施方案中，可通过溶剂退火(水退火或甲醇退火)、化学交联、酶交联和热处理改变衍生自如本文所述的丝心蛋白片段的丝膜的水溶解度。
在一些实施方案中，退火过程可能涉及在用作涂层材料的丝心蛋白片段溶液中引发β折叠形成。已经描述了退火(例如提高结晶度)或以其他方式促进丝心蛋白基片段的“分子堆积”的技术。在一些实施方案中，非晶丝膜在选自水或有机溶剂的溶剂存在下退火以引入β折叠。在一些实施方案中，非晶丝膜在水存在下退火以引入β折叠(水退火法)。在一些实施方案中，非晶丝心蛋白片段膜在甲醇存在下退火以引入β折叠。在一些实施方案中，通过加入有机溶剂引发退火(例如β折叠形成)。合适的有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇或它们的组合。
在一些实施方案中，退火通过所谓的“水退火”或“水蒸气退火”进行，其中使用水蒸气作为中间塑化剂或催化剂以促进β折叠的堆积。在一些实施方案中，水退火法可在真空下进行。合适的此类方法已经描述在Jin H-J等(2005),Water-stable Silk Films withReduced Beta-Sheet Content,Advanced Functional Materials,15:1241-1247；Xiao H等；(2011),Regulation of Silk Material Structure by Temperature-ControlledWater Vapor Annealing,Biomacromolecules,12(5):1686-1696中。
水退火法的重要特征是驱动丝心蛋白片段肽链中的结晶β折叠的形成以使丝心蛋白能够自组装成连续膜。在一些实施方案中，通过控制水蒸气的温度和退火持续时间来控制丝心蛋白片段膜的结晶度。在一些实施方案中，退火在约65℃至约110℃的温度下进行。在一些实施方案中，水的温度保持在约80℃，退火在选自约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、约105℃和约110℃的温度下进行。
在一些实施方案中，在一些实施方案中，退火过程持续选自以下的时间段：约1分钟至约40分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约60分钟、约1分钟至约70分钟、约1分钟至约80分钟、约1分钟至约90分钟、约1分钟至约100分钟、约1分钟至约110分钟、约1分钟至约120分钟、约1分钟至约130分钟、约5分钟至约40分钟、约5分钟至约50分钟、约5分钟至约60分钟、约5分钟至约70分钟、约5分钟至约80分钟、约5分钟至约90分钟、约5分钟至约100分钟、约5分钟至约110分钟、约5分钟至约120分钟、约5分钟至约130分钟、约10分钟至约40分钟、约10分钟至约50分钟、约10分钟至约60分钟、约10分钟至约70分钟、约10分钟至约80分钟、约10分钟至约90分钟、约10分钟至约100分钟、约10分钟至约110分钟、约10分钟至约120分钟、约10分钟至约130分钟、约15分钟至约40分钟、约15分钟至约50分钟、约15分钟至约60分钟、约15分钟至约70分钟、约15分钟至约80分钟、约15分钟至约90分钟、约15分钟至约100分钟、约15分钟至约110分钟、约15分钟至约120分钟、约15分钟至约130分钟、约20分钟至约40分钟、约20分钟至约50分钟、约20分钟至约60分钟、约20分钟至约70分钟、约20分钟至约80分钟、约20分钟至约90分钟、约20分钟至约100分钟、约20分钟至约110分钟、约20分钟至约120分钟、约20分钟至约130分钟、约25分钟至约40分钟、约25分钟至约50分钟、约25分钟至约60分钟、约25分钟至约70分钟、约25分钟至约80分钟、约25分钟至约90分钟、约25分钟至约100分钟、约25分钟至约110分钟、约25分钟至约120分钟、约25分钟至约130分钟、约30分钟至约40分钟、约30分钟至约50分钟、约30分钟至约60分钟、约30分钟至约70分钟、约30分钟至约80分钟、约30分钟至约90分钟、约30分钟至约100分钟、约30分钟至约110分钟、约30分钟至约120分钟、约30分钟至约130分钟、约35分钟至约40分钟、约35分钟至约50分钟、约35分钟至约60分钟、约35分钟至约70分钟、约35分钟至约80分钟、约35分钟至约90分钟、约35分钟至约100分钟、约35分钟至约110分钟、约35分钟至约120分钟、约35分钟至约130分钟、约40分钟至约50分钟、约40分钟至约60分钟、约40分钟至约70分钟、约40分钟至约80分钟、约40分钟至约90分钟、约40分钟至约100分钟、约40分钟至约110分钟、约40分钟至约120分钟、约40分钟至约130分钟、约45分钟至约50分钟、约45分钟至约60分钟、约45分钟至约70分钟、约45分钟至约80分钟、约45分钟至约90分钟、约45分钟至约100分钟、约45分钟至约110分钟、约45分钟至约120分钟和约45分钟至约130分钟。在一些实施方案中，退火过程持续约1分钟至约60分钟的时间段。在一些实施方案中，退火过程持续
约45分钟至约60分钟的时间段。较长的水退火后处理对应于丝心蛋白片段的提高的结晶度。
在一些实施方案中，退火的丝心蛋白片段膜是将湿丝心蛋白片段膜在室温下在100％甲醇中浸渍60分钟。甲醇退火使丝心蛋白片段膜的组成从主要非晶的无规卷曲变成结晶的反平行β折叠结构。
在一些实施方案中，本文所述的SPF可以用来生产SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒。丝微粒已经在例如WO 2016/110873中描述，其通过引用整体并入本文。这可以通过将丝溶液置于适当温度(例如室温)和压力小于约100毫托(mTorr)的冻干机中，直到水和其他挥发物已经蒸发(约1.0重量％至约10重量％的水分含量)，并且保留细SPF粉末来实现。然后将冻干得到的固体丝粉末粉碎成所需粒度的细粉。
在一些实施方案中，SPF溶液可以在基材上流延以在干燥后形成含有丝心蛋白片段的丝膜。然后将丝膜粉碎成细粉。
在一些实施方案中，SPF溶液可以通过进行薄膜蒸发法(也称为Rototherm)接着研磨来干燥。将丝溶液置于薄膜蒸发器中，在减压、温和加热下，并从水溶液中连续去除水，得到粒度可变的固体。通过控制蒸发过程参数，包括压力、温度、圆筒的旋转速度、蒸发器中液膜的厚度，可以改变粒度。由Rototherm蒸发得到的干蛋白质粉含有小于10.0重量％的水分含量。
在一些实施方案中，SPF溶液可用于通过用甲醇沉淀来制备SPF微粒。
可施加替代性的闪蒸干燥、流化床干燥、喷雾干燥或真空干燥来从SPF溶液中去除水。
在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒可以在不冷藏或其他特殊处理程序的情况下储存和处置。
在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒包含低分子量丝心蛋白片段。在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒包含中等分子量丝心蛋白蛋白片段。在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒包含低分子量丝心蛋白片段和中等分子量丝心蛋白片段的混合物。
在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至1000μm的固体颗粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至500μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至300μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至250μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至200μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至100μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至50.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至25.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至10.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为30.0μm至50.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为35.0μm至45.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为35.0μm至55.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为25.0μm至45.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围选自以下的微粒：1.0μm、2.0μm、3.0μm、4.0μm、5.0μm、6.0μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm、10.0μm、11.0μm、12.0μm、13.0μm、14.0μm、15.0μm、16.0μm、17.0μm、18.0μm、19.0μm、20.0μm、21.0μm、22.0μm、23.0μm、24.0μm、25.0μm、26.0μm、27.0μm、28.0μm、29.0μm、30.0μm、31.0μm、32.0μm、33.0μm、34.0μm、35.0μm、36.0μm、37.0μm、38.0μm、39.0μm、40.0μm、41.0μm、42.0μm、43.0μm、44.0μm、45.0μm、46.0μm、47.0μm、48.0μm、49.0μm、50.0μm、51.0μm、52.0μm、53.0μm、54.0μm、55.0μm、56.0μm、57.0μm、58.0μm、59.0μm、60.0μm、61.0μm、62.0μm、63.0μm、64.0μm、65.0μm、66.0μm、67.0μm、68.0μm、69.0μm、70.0μm、71.0μm、72.0μm、73.0μm、74.0μm、75.0μm、76.0μm、77.0μm、78.0μm、79.0μm、80.0μm、81.0μm、82.0μm、83.0μm、84.0μm、85.0μm、86.0μm、87.0μm、88.0μm、89.0μm、90.0μm、91.0μm、92.0μm、93.0μm、94.0μm、95.0μm、96.0μm、97.0μm、98.0μm、99.0μm、100.0μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、950μm、960μm、970μm、980μm、990μm和1000μm。
在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于500μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于325μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于250μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于100μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于50μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于10μm的微粒。
在一些实施方案中，本文所述的SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒可用作治疗活性剂的递送系统，例如用于药物的持续释放的递送系统。
在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒以选自由以下项组成的组的量存在于本文所述的组合物中：约0.001重量％、0.01重量％、约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1.0重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、约2.0重量％、约2.1重量％、约2.2重量％、约2.3重量％、约2.4重量％、约2.5重量％、约2.6重量％、约2.7重量％、约2.8重量％、约2.9重量％、约3.0重量％、约3.1重量％、约3.2重量％、约3.3重量％、约3.4重量％、约3.5重量％、约3.6重量％、约3.7重量％、约3.8重量％、约3.9重量％、约4.0重量％、约4.1重量％、约4.2重量％、约4.3重量％、约4.4重量％、约4.5重量％、约4.6重量％、约4.7重量％、约4.8重量％、约4.9重量％、约5.0重量％、约5.1重量％、约5.2重量％、约5.3重量％、约5.4重量％、约5.5重量％、约5.6重量％、约5.7重量％、约5.8重量％、约5.9重量％、约6.0重量％、约6.1重量％、约6.2重量％、约6.3重量％、约6.4重量％、约6.5重量％、约6.6重量％、约6.7重量％、约6.8重量％、约6.9重量％、约7.0重量％、约7.1重量％、约7.2重量％、约7.3重量％、约7.4重量％、约7.5重量％、约7.6重量％、约7.7重量％、约7.8重量％、约7.9重量％、约8.0重量％、约8.1重量％、约8.2重量％、约8.3重量％、约8.4重量％、约8.5重量％、约8.6重量％、约8.7重量％、约8.8重量％、约8.9重量％、约9.0重量％、约9.1重量％、约9.2重量％、约9.3重量％、约9.4重量％、约9.5重量％、约9.6重量％、约9.7重量％、约9.8重量％、约9.9重量％、约10.0重量％，所述量按照组合物的总重量计。
在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒以选自由以下项组成的组的量存在于本文所述的组合物中：约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL、约1.0mg/mL、约1.1mg/mL、约1.2mg/mL、约1.3mg/mL、约1.4mg/mL、约1.5mg/mL、约1.6mg/mL、约1.7mg/mL、约1.8mg/mL、约1.9mg/mL、约2.0mg/mL、约2.1mg/mL、约2.2mg/mL、约2.3mg/mL、约2.4mg/mL、约2.5mg/mL、约2.6mg/mL、约2.7mg/mL、约2.8mg/mL、约2.9mg/mL，以及约3.0mg/mL。
在一些实施方案中，如本文所述的SPF可用于通过用甲醇沉淀来制备SPF微粒。可施加替代性的闪蒸干燥、流化床干燥、喷雾干燥或真空干燥以从丝溶液中去除水。SPF粉末随后可储存和操作而不用冷藏或其他特殊处理程序。在一些实施方案中，SPF粉末包含低分子量丝心蛋白片段。在一些实施方案中，SPF粉末包含中等分子量丝心蛋白片段。在一些实施方案中，SPF粉末包含低分子量丝心蛋白片段和中等分子量丝心蛋白片段的混合物。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物SPF，包括但不限于软组织填充物，其可用于产生SPF粉末、纳米颗粒，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其包含SPF纳米颗粒或微粒。这可以通过将丝溶液置于适当温度(例如室温)和压力小于约100毫托(mTorr)的冻干机中，直到水和其他挥发物已经蒸发(约1.0重量％至约10重量％的水分含量)，并且保留细SPF粉末来实现。然后将冻干得到的固体丝粉末粉碎成所需粒度的细粉。
在一些实施方案中，颗粒被整合到凝胶中。SPF溶液可以在基材上流延以在干燥后形成含有丝心蛋白片段的丝膜。然后将丝膜粉碎成细粉。
在一些实施方案中，颗粒共价地整合到凝胶中。SPF溶液可以通过进行薄膜蒸发法(也称为Rototherm)接着研磨来干燥。将丝溶液置于薄膜蒸发器中，在减压、温和加热下，并从水溶液中连续去除水，得到粒度可变的固体。通过控制蒸发过程参数，包括压力、温度、圆筒的旋转速度、蒸发器中液膜的厚度，可以改变粒度。由Rototherm蒸发得到的干蛋白质粉含有小于10.0重量％的水分含量。
在一些实施方案中，颗粒非共价地整合到凝胶中。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物包含利多卡因或如本文所述的任何其他麻醉剂。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物不包含如本文所述的麻醉剂。SPF溶液可用于通过用甲醇沉淀来制备SPF微粒。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其还包含本领域已知的任何纳米颗粒和/或微粒。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒包含己内酯。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒包含纤维素。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒被整合到凝胶中。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒共价连接。在一些实施方案中，纳米颗粒和/或微粒非共价连接。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物包含利多卡因或如本文所述的任何其他麻醉剂。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物不包含如本文所述的麻醉剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其还包括整合到凝胶中的纳米纤维或微纤维。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维共价连接。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维非共价连接。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物包含利多卡因或如本文所述的任何其他麻醉剂。在一些实施方案中，所述组合物或组织填充物不包含如本文所述的麻醉剂。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维包含本文所述的SPF。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维包含己内酯。在一些实施方案中，纳米纤维或微纤维包含纤维素。
在一些实施方案中，本公开提供了凝胶，例如但不限于水凝胶，并且不限于用于本文所述的任何使用方法，所述凝胶和/或水凝胶包含SPF纳米颗粒或微粒。在一些实施方案中，凝胶和/或水凝胶可以包含或不包含本文所述的HA。在一些实施方案中，除了包埋在基质中的SPF纳米颗粒或微粒之外，凝胶和/或水凝胶基质不包含本文所述的SPF。在一些实施方案中，凝胶和/或水凝胶是本领域已知的任何凝胶或水凝胶。在一些实施方案中，颗粒被整合到凝胶中。在一些实施方案中，颗粒共价地整合到凝胶中。在一些实施方案中，颗粒非共价地整合到凝胶中。在一些实施方案中，凝胶或水凝胶包含利多卡因或如本文所述的任何其他麻醉剂。在一些实施方案中，凝胶或水凝胶不包含如本文所述的麻醉剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其被配置成递送另一种分子、化合物、药物等。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含如本文所述的游离丝和/或游离SPF。在一些实施方案中，游离丝和/或游离SPF增强胶原蛋白表达。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含视黄醇。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含维生素，包括但不限于维生素C。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含炎性剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含抗炎剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种刺激上皮细胞再生的试剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种刺激伤口愈合的试剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种刺激疼痛控制的试剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种能够提供持续释放的试剂。在一些实施方案中，所述分子、化合物、药物等包含一种或多种润滑剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其还包含显像剂。在一些实施方案中，显像剂选自碘、DOPA和成像纳米颗粒。在一些实施方案中，显像剂选自顺磁性显像剂和超顺磁性显像剂。在一些实施方案中，显像剂选自基于NP的磁共振成像(MRI)造影剂、正电子发射断层扫描(PET)/单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像剂、超声活性颗粒和光学活性(例如发光、荧光、红外)颗粒。在一些实施方案中，显像剂是SPECT显像剂、PET显像剂、光学显像剂、MRI或MRS显像剂、超声显像剂、多模态显像剂、X射线显像剂或CT显像剂。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，用于递送与特定区域相关的药物，包括但不限于注射区域。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其还包含微粒或微胶囊。在一些实施方案中，微粒或微胶囊还包含药物。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，以及本文所述的所有使用方法，其中所述组合物或组织填充物是不透射线的。
在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的组合物或组织填充物，包括但不限于软组织填充物，并且包括但不限于凝胶，和本文所述的所有使用方法，其还包含基本上为固体的丝组合物，所述丝组合物包含本文所述的SPF，其具有选自低分子量、中等分子量和高分子量的平均重均分子量和1至约5的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有1至约1.5的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有约1.5至约2.0的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有约1.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有约2.0至约2.5的多分散性。在一些实施方案中，SPF具有约2.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，所述组合物还包含相对于SPF约0.01％(w/w)至约10％(w/w)的丝胶蛋白。在一些实施方案中，SPF被配制成颗粒。在一些实施方案中，颗粒具有约1μm至约1000μm的尺寸。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物中的SPF从包含SPF片段的前体溶液获得，所述SPF片段具有选自低分子量、中等分子量和高分子量的平均重均分子量和1至约5的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有1至约1.5的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有约1.5至约2.0的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有约1.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有约2.0至约2.5的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液中的SPF具有约2.5至约3.0的多分散性。在一些实施方案中，前体溶液还包含相对于前体溶液中的SPF约0.01％(w/w)至约10％(w/w)的丝胶蛋白。在一些实施方案中，在获得基本上为固体的丝组合物中的丝心蛋白片段之前，前体溶液中的SPF在前体溶液中至少10天时未自发地或逐渐地胶凝并且在颜色或浊度上未明显改变。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物中的SPF是通过选自冷冻干燥法、薄膜蒸发法、盐析法和PVA-辅助法的方法从前体溶液中获得的。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约0.01重量％至约10.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约0.01重量％至约1.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约1.0重量％至约2.0重量％存在于组合物或组织填料中
。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约2.0重量％至约3.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约3.0重量％至约4.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约4.0重量％至约5.0重量％存在于组合物或组织填料中。在一些实施方案中，基本上为固体的丝组合物以相对于总重量的约5.0重量％至约6.0重量％存在于组合物或组织填料中。
可施加替代性的闪蒸干燥、流化床干燥、喷雾干燥或真空干燥来从SPF溶液中去除水。
在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒可以在不冷藏或其他特殊处理程序的情况下储存和处置。
在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒包含低分子量丝心蛋白片段。在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒包含中等分子量丝心蛋白蛋白片段。在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒包含低分子量丝心蛋白片段和中等分子量丝心蛋白片段的混合物。
在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至1000μm的固体颗粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至500μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至300μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至250μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至200μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至100μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至50.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至25.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围为1.0μm至10.0μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度范围选自以下的微粒：1.0μm、2.0μm、3.0μm、4.0μm、5.0μm、6.0μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm、10.0μm、11.0μm、12.0μm、13.0μm、14.0μm、15.0μm、16.0μm、17.0μm、18.0μm、19.0μm、20.0μm、21.0μm、22.0μm、23.0μm、24.0μm、25.0μm、26.0μm、27.0μm、28.0μm、29.0μm、30.0μm、31.0μm、32.0μm、33.0μm、34.0μm、35.0μm、36.0μm、37.0μm、38.0μm、39.0μm、40.0μm、41.0μm、42.0μm、43.0μm、44.0μm、45.0μm、46.0μm、47.0μm、48.0μm、49.0μm、50.0μm、51.0μm、52.0μm、53.0μm、54.0μm、55.0μm、56.0μm、57.0μm、58.0μm、59.0μm、60.0μm、61.0μm、62.0μm、63.0μm、64.0μm、65.0μm、66.0μm、67.0μm、68.0μm、69.0μm、70.0μm、71.0μm、72.0μm、73.0μm、74.0μm、75.0μm、76.0μm、77.0μm、78.0μm、79.0μm、80.0μm、81.0μm、82.0μm、83.0μm、84.0μm、85.0μm、86.0μm、87.0μm、88.0μm、89.0μm、90.0μm、91.0μm、92.0μm、93.0μm、94.0μm、95.0μm、96.0μm、97.0μm、98.0μm、99.0μm、100.0μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、950μm、960μm、970μm、980μm、990μm和1000μm。
在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于500μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于325μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于250μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于100μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于50μm的微粒。在一些实施方案中，SPF粉末是中值粒度小于10μm的微粒。
在一些实施方案中，本文所述的SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒可用作治疗活性剂的递送系统，例如用于药物的持续释放的递送系统。
在一些实施方案中，SPF粉末、纳米颗粒和/或微粒以选自由以下项组成的组的量存在于本文所述的组合物中：约0.001重量％、0.01重量％、约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1.0重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、约2.0重量％、约2.1重量％、约2.2重量％、约2.3重量％、约2.4重量％、约2.5重量％、约2.6重量％、约2.7重量％、约2.8重量％、约2.9重量％、约3.0重量％、约3.1重量％、约3.2重量％、约3.3重量％、约3.4重量％、约3.5重量％、约3.6重量％、约3.7重量％、约3.8重量％、约3.9重量％、约4.0重量％、约4.1重量％、约4.2重量％、约4.3重量％、约4.4重量％、约4.5重量％、约4.6重量％、约4.7重量％、约4.8重量％、约4.9重量％、约5.0重量％、约5.1重量％、约5.2重量％、约5.3重量％、约5.4重量％、约5.5重量％、约5.6重量％、约5.7重量％、约5.8重量％、约5.9重量％、约6.0重量％、约6.1重量％、约6.2重量％、约6.3重量％、约6.4重量％、约6.5重量％、约6.6重量％、约6.7重量％、约6.8重量％、约6.9重量％、约7.0重量％、约7.1重量％、约7.2重量％、约7.3重量％、约7.4重量％、约7.5重量％、约7.6重量％、约7.7重量％、约7.8重量％、约7.9重量％、约8.0重量％、约8.1重量％、约8.2重量％、约8.3重量％、约8.4重量％、约8.5重量％、约8.6重量％、约8.7重量％、约8.8重量％、约8.9重量％、约9.0重量％、约9.1重量％、约9.2重量％、约9.3重量％、约9.4重量％、约9.5重量％、约9.6重量％、约9.7重量％、约9.8重量％、约9.9重量％、约10.0重量％，所述量按照组合物的总重量计。
本文公开了包含丝蛋白片段(SPF)的组织填充物。在一些实施方案中，本公开描述了提供更持久结果同时避免并发症的真皮填充物，其已经聚焦于基于透明质酸的水凝胶的改性。在一些实施方案中，本公开描述了一种活化的丝水凝胶平台，其中丝心蛋白成功地整合至基于透明质酸的水凝胶中，使得能够有效优化水凝胶的机械、光学和寿命特性。在一些实施方案中，本公开描述了使用活化的丝水凝胶平台使用透明质酸、丝心蛋白和聚乙二醇的混合物制备丝-HA水凝胶的方法。
在一些实施方案中，本公开描述了丝心蛋白/透明质酸/聚乙二醇水凝胶系统。在一些实施方案中，本公开描述了表现出适合于作为真皮填充物应用于各种各样美容和医学适应症的物理化学特性(例如，水凝胶的机械强度、弹性、含水量类似于软组织)的丝-HA水凝胶。
在一些实施方案中，组织填充物由本文所述的组合物制备，所述组合物可包含SPF和透明质酸(HA)。在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以是真皮填充物。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法，通过使用MW为约5kDa至约5MDa、约100kDa至约4MDa或约500kDa至约3MDa的HA来制备组织和/或真皮填充物。在一些实施方案中，通过本文所述的方法，通过使用MW为约50kDa、约100kDa、约150kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约350kDa、约400kDa、约450kDa、约500kDa、约550kDa、约600kDa、约650kDa、约700kDa、约750kDa、约800kDa、约850kDa、约900kDa、约950kDa、约1000kDa、约1050kDa、约1100kDa、约1150kDa、约1200kDa、约1250kDa、约1300kDa、约1350kDa、约1400kDa、约1450kDa、约1500kDa、约1550kDa、约1600kDa、约1650kDa、约1700kDa、约1750kDa、约1800kDa、约1850kDa、约1900kDa、约1950kDa、约2000kDa、约2050kDa、约2100kDa、约2150kDa、约2200kDa、约2250kDa、约2300kDa、约2350kDa、约2400kDa、约2450kDa、约2500kDa、约2550kDa、约2600kDa、约2650kDa、约2700kDa、约2750kDa、约2800kDa、约2850kDa、约2900kDa、约2950kDa、约3000kDa、约3050kDa、约3100kDa、约3150kDa、约3200kDa、约3250kDa、约3300kDa、约3350kDa、约3400kDa、约3450kDa、约3500kDa、约3550kDa、约3600kDa、约3650kDa、约3700kDa、约3750kDa、约3800kDa、约3850kDa、约3900kDa、约3950kDa或约4000kDa的HA来制备组织和/或真皮填充物。任何上述MW的HA可以以任何可能的比例与任何其他上述MW的HA混合。在一些实施方案中，通过混合高MW HA(可以与低MW HA混合)制备组织和/或真皮填充物，其中高MW HA的比例为约0.01％、或约0.1％、或约0.2％、或约0.3％、或约0.4％、或约0.5％、或约0.6％、或约0.7％、或约0.8％、或约0.9％、或约1％、或约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约8％、或约9％、或约10％、或约11％、或约12％、或约13％、或约14％、或约15％、或约16％、或约17％、或约18％、或约19％、或约20％、或约21％、或约22％、或约23％、或约24％、或约25％、或约26％、或约27％、或约28％、或约29％、或约30％、或约31％、或约32％、或约33％、或约34％、或约35％、或约36％、或约37％、或约38％、或约39％、或约40％、或约41％、或约42％、或约43％、或约44％、或约45％、或约46％、或约47％、或约48％、或约49％、或约50％、或约51％、或约52％、或约53％、或约54％、或约55％、或约56％、或约57％、或约58％、或约59％、或约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或约99.5％、或约99.9％。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法通过使用MW为约5kDa至约35kDa的丝SPF来制备组织和/或真皮填充物。在一些实施方案中，通过本文所述的方法通过使用MW为约5kDa、或约6kDa、或约7kDa、或约8kDa、或约9kDa、或约10kDa、或约11kDa、或约12kDa、或约13kDa、或约14kDa、或约15kDa、或约16kDa、或约17kDa、或约19kDa、或约19kDa、或约20kDa、或约21kDa、或约22kDa、或约23kDa、或约24kDa、或约25kDa、或约26kDa、或约27kDa、或约28kDa、或约29kDa、或约30kDa的丝SPF来制备组织和/或真皮填充物。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法，通过使用初始浓度为约80mg/ml、或约81mg/ml、或约82mg,ml、或约83mg/ml、或约84mg/ml、或约85mg/ml、或约86mg/ml、或约87mg/ml、或约88mg/ml、或约89mg/ml、或约90mg/ml、或约91mg/ml、或约92mg/ml、或约93mg/ml、或约94mg/ml、或约95mg/ml、或约96mg/ml、或约97mg/ml、或约98mg/ml、或约99mg/ml、或约100mg/ml、或约101mg/ml、或约102mg/ml、或约103mg/ml、或约104mg/ml、或约105mg/ml、或约106mg/ml、或约107mg/ml、或约108mg/ml、或约109mg/ml、或约110mg/ml、或约111mg/ml、或约112mg/ml、或约113mg/ml、或约114mg/ml、或约115mg/ml、或约116mg/ml、或约117mg/ml、或约118mg/ml、或约119mg/ml、或约120mg/ml或更高的HA来制备组织和/或真皮填充物。
在一些实施方案中，本文所述的组织和/或真皮填充物的丝SPF浓度为总HA和丝SPF的约0.1％、或约0.2％、或约0.3％、或约0.4％、或约0.5％、或约0.6％、或约0.7％、或约0.8％、或约0.9％、或约1％、或约1.1％、或约1.2％、或约1.3％、或约1.4％、或约1.5％、或约1.6％、或约1.7％、或约1.8％、或约1.9％、或约2％、或约2.1％、或约2.2％、或约2.3％、或约2.4％、或约2.5％、或约2.6％、或约2.7％、或约2.8％、或约2.9％、或约3％、或约3.1％、或约3.2％、或约3.3％、或约3.4％、或约3.5％、或约3.6％、或约3.7％、或约3.8％、或约3.9％、或约4％、或约4.1％、或约4.2％、或约4.3％、或约4.4％、或约4.5％、或约4.6％、或约4.7％、或约4.8％、或约4.9％、或约5％。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法通过使用Mn为约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100或约1200的PEGDE交联剂来制备组织和/或真皮填充物。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法通过使用包括在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃或约55℃下的交联步骤的反应条件来制备组织和/或真皮填充物。在一些实施方案中，通过本文所述的方法通过使用包括约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约31分钟、约32分钟、约33分钟、约34分钟、约35分钟、约36分钟、约37分钟、约38分钟、约39分钟、约40分钟、约41分钟、约42分钟、约43分钟、约44分钟、约45分钟、约46分钟、约47分钟、约48分钟、约49分钟、约50分钟、约51分钟、约52分钟、约53分钟、约54分钟、约55分钟、约56分钟、约57分钟、约58分钟、约59分钟、约60分钟、约61分钟、约62分钟、约63分钟、约64分钟或约65分钟的交联步骤的反应条件来制备组织和/或真皮填充物。
在一些实施方案中，组织和/或真皮填充物包含游离HA，例如未交联HA。在一些实施方案中，组织和/或真皮填充物包含约0.1％或约0.2％或约0.3％或约0.4％或约0.5％或约0.6％或约0.7％或约0.8％或约0.9％或约1％或约1.1％或约1.2％或约1.3％或约1.4％或约1.5％或约1.6％或约1.7％或约1.8％或约1.9％或约2％或约2.1％或约2.2％或约2.3％或约2.4％或约2.5％或约2.6％或约2.7％或约2.8％或约2.9％或约3％或约3.1％或约3.2％或约3.3％或约3.4％或约3.5％或约3.6％或约3.7％或约3.8％或约3.9％或约4％或约4.1％或约4.2％或约4.3％或约4.4％或约4.5％或约4.6％或约4.7％或约4.8％或约4.9％或约5％、约5.1％或约5.2％或约5.3％或约5.4％或约5.5％或约5.6％或约5.7％或约5.8％或约5.9％或约6％或约6.1％或约6.2％或约6.3％或约6.4％或约6.5％或约6.6％或约6.7％或约6.8％或约6.9％或约7％或约7.1％或约7.2％或约7.3％或约7.4％或约7.5％或约7.6％或约7.7％或约7.8％或约7.9％或约8％或约8.1％或约8.2％或约8.3％或约8.4％或约8.5％或约8.6％或约8.7％或约8.8％或约8.9％或约9％或约9.1％或约9.2％或约9.3％或约9.4％或约9.5％或约9.6％或约9.7％或约9.8％或约9.9％或约10％
of的总HA(交联HA和未交联HA)。在一些实施方案中，组织和/或真皮填充物不包含游离HA。
在一些实施方案中，组织和/或真皮填充物包含约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml、约26/mg/ml、约27mg/ml、约28mg/ml、约29mg/ml或约30mg/ml的HA。
在一些实施方案中，组织和/或真皮填充物的MoD为约10.0％、约10.1％、约10.2％、约10.3％、约10.4％、约10.5％、约10.6％、约10.7％、约10.8％、约10.9％、约11.0％、约11.1％、约11.2％、约11.3％、约11.4％、约11.5％、约11.6％、约11.7％、约11.8％、约11.9％、约12.0％、约12.1％、约12.2％、约12.3％、约12.4％、约12.5％、约12.6％、约12.7％、约12.8％、约12.9％、约13.0％、约13.1％、约13.2％、约13.3％、约13.4％、约13.5％、约13.6％、约13.7％、约13.8％、约13.9％、约14.0％、约14.1％、约14.2％、约14.3％、约14.4％、约14.5％、约14.6％、约14.7％、约14.8％、约14.9％、约15.0％、约15.1％、约15.2％、约15.3％、约15.4％、约15.5％、约15.6％、约15.7％、约15.8％、约15.9％、约16.0％、约16.1％、约16.2％、约16.3％、约16.4％、约16.5％、约16.6％、约16.7％、约16.8％、约16.9％、约17.0％、约17.1％、约17.2％、约17.3％、约17.4％、约17.5％、约17.6％、约17.7％、约17.8％、约17.9％、约18.0％、约18.1％、约18.2％、约18.3％、约18.4％、约18.5％、约18.6％、约18.7％、约18.8％、约18.9％、约19.0％、约19.1％、约19.2％、约19.3％、约19.4％、约19.5％、约19.6％、约19.7％、约19.8％、约19.9％或约20.0％。
在一些实施方案中，组织和/或真皮填充物的注射力为约5N、约6N、约7N、约8N、约9N、约10N、约11N、约12N、约13N、约14N、约15N、约16N、约17N、约18N、约19N、约20N、约21N、约22N、约23N、约24N或约25N。在一些实施方案中，组织和/或真皮填充物的注射力为约26N、约27N、约28N、约29N、约30N、约31N、约32N、约33N、约34N、约35N、约36N、约37N、约38N、约39N、约40N、约41N、约42N、约43N、约44N、约45N、约46N、约47N、约48N、约49N或约50N。在一些实施方案中，注射力涉及通过30G针的注射。
本文提供的组织填充物包含组合物，所述组合物还包含一种或多种组分，例如SPF，例如交联SPF和/或非交联SPF(例如游离SPF)，透明质酸，例如交联HA和/或非交联HA。如本文所用，交联SPF是指与相同或不同的SPF交联的SPF。交联的SPF也可以被称为均聚交联的SPF。如本文所用，交联HA是指与相同或不同的HA交联的HA。交联的HA也可以被称为均聚交联的HA。交联HA也可以称为均交联HA。本文提供的组织填充物还可包含交联至HA的SPF，和/或交联至SPF的HA。交联至HA的SPF和/或交联至SPF的HA也可以被称为交联SPF-HA，或杂交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本发明的组合物是单相的。在一些实施方案中，本发明的组合物是双相的或多相的。在一些实施方案中，本发明的组合物包含非交联的聚合物相，例如非交联SPF和/或非交联HA。在一些实施方案中，本发明的组合物包含交联相，例如交联SPF和/或交联HA。在一些实施方案中，本发明的组合物包含液相，例如水，和/或水溶液。在一些实施方案中，水溶液可以包含SPF。在一些实施方案中，水相可以包含HA。在一些实施方案中，液相可以包含非交联聚合物，例如非交联HA和/或非交联SPF。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含载体相。因此，所公开的组合物可以是单相或多相组合物。如本文所用，术语“载体相”与“载体”同义，并且是指用于增加水凝胶的流动性的材料。载体有利地是生理上可接受的载体，并且可以包括一种或多种用于药物组合物中的常规赋形剂。如本文所用，术语"生理上可接受的载体"是指符合活生物体的正常功能或具有其特征的载体。因此，当施用于哺乳动物时，施用包含水凝胶和载体的组合物基本上没有长期或永久的有害作用。本发明的组织填充物包含载体，其中主要体积是水或盐水。然而，其他有用的载体包括任何生理上可耐受的材料，其改善水凝胶通过针或进入目标宿主环境的可挤出性或可侵入性。潜在的载体可以包括但不限于生理缓冲溶液、血清、其他蛋白溶液、由包括蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖或多糖的聚合物组成的凝胶。任何所述潜在载体可以是天然衍生的、完全合成的或它们的组合。
在一个实施方案中，本文提供的组合物包含改性SPF、交联SPF、非交联SPF、改性HA、交联HA、非交联HA、均交联SPF、均交联HA和杂交联SPF-HA中的一种或多种。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF和非交联SPF。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF和非交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF和交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF和交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含非交联SPF和非交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含非交联SPF和交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含非交联SPF和交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、非交联SPF和非交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、非交联SPF和交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、非交联SPF和交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、交联HA和非交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、交联HA和交联SPF-HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、非交联HA和交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含非交联SPF、交联HA和非交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含非交联SPF、交联HA和交联SPF-HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含非交联SPF、非交联HA和交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、非交联SPF、交联HA和非交联HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、非交联SPF、交联HA和交联SPF-HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、非交联SPF、非交联HA和交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、交联HA、非交联HA和交联SPF-HA。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含非交联SPF、交联HA、非交联HA和交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF、非交联SPF、交联HA、非交联HA和交联SPF-HA。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含交联SPF。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含SPF和透明质酸(HA)。在一个方面，本文所述的基于SPF/HA的组合物包含HA交联部分。在一些实施方案中，组合物包含SPF-HA交联部分。在一些实施方案中，组合物包含非交联HA。在一些实施方案中，组合物可以包含非交联SPF。在一些实施方案中，组合物可以包含至少一种额外的试剂。在一些实施方案中，组合物包含具有可变稳定性的交联SPF-SPF、SPF-HA和/或HA-HA，产生具有不同程度的可生物吸收性和/或生物再吸收性的组合物。
在一些实施方案中，HA交联至基质。在一些实施方案中，HA基质封装或半封装一种或多种SPF。在一些实施方案中，HA与一个或多个SPF交联。
在一些实施方案中，组织填充物或其部分是生物相容性、可生物降解的、可生物吸收的、可生物再吸收的或它们的组合。在一些实施方案中，本文提供的组织填充物包含流体组分，例如单一流体或基本上包含一种或多种流体的溶液。在一些实施方案中，组织填充物包含水或水溶液。在一些实施方案中，组织填充物是可注射的、可植入的或通过本领域已知的任何方式可递送到皮肤下，例如在组织的手术切除之后。在一些实施方案中，所述组合物是组织和/或真皮填充物。在一些实施方案中，组合物是无菌的。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可包含约1％(w/w)SPF和约0.3％(w/w)利多卡因。
本文提供了制备包含丝蛋白片段(SPF)和透明质酸(HA)的组合物的方法，递送包含SPF和HA的组合物的方法，以及使用包含SPF和HA的组合物的治疗方法。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有专利和出版物均通过引用整体并入。
本文使用的百分比符号“％”包括“wt.％”或％w/w、％v/v或％w/v。
如本文所用，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”或“该/所述(the)”通常被解释为涵盖单数和复数形式两者。
如本文所用，术语“约”通常是指如由本领域普通技术人员所确定的在可接受误差范围内的特定数值，这将部分取决于该数值是如何测量或确定的，即，测量系统的局限性。例如，“约”可以意指给定数值的±20％、±10％或±5％的范围。
如本文所用，术语“丝心蛋白”或“丝蛋白”是指由某些产生丝的蜘蛛和昆虫物种产生的一类结构蛋白(参见WIPO Pearl-WIPO’s Multilingual Terminology Portal数据库https://wipopearl.wipo.int/en/linguistic)中提供的定义。丝心蛋白可以包括蚕丝心蛋白、昆虫或蛛丝蛋白(例如，蛛丝蛋白)、重组蜘蛛蛋白、存在于其他蛛丝类型中的丝蛋白，例如管状丝蛋白(TuSP)、鞭毛状丝蛋白、次要壶腹丝蛋白、腺泡状丝蛋白、梨状丝蛋白、聚合丝胶)、由基因修饰的蚕产生的蚕丝心蛋白或重组蚕丝心蛋白。
如本文所用，术语“丝心蛋白”是指蚕纤蛋白、通过遗传修饰的蚕产生的丝心蛋白或重组的蚕纤蛋白(参见(1)Narayan编辑，Encyclopedia of Biomedical Engineering，Vol.2，Elsevier，2019；(2)Kobayashi等编辑，Encyclopedia of PolymericNanomaterials,Springer,2014,https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007％2F978-3-642-36199-9_323-1)。在一个实施方案中，丝心蛋白获自家蚕。
如本文所用，术语“丝心蛋白肽”、“基于丝心蛋白的片段”和“丝心蛋白片段”可互换使用。当分子大小成为重要参数时，定义分子量或氨基酸单元的数量。
如本文所用，术语聚合物“多分散性(PD)”通常用作聚合物的分子量分布宽度的量度，并且由下式多分散性PD＝Mw/Mn定义。
如本文所用，术语“基于低分子量丝心蛋白的片段”(低-MW丝)是指重均分子量(Mw)为约200Da至约25kDa或低于约28kDa或约15kDa和约28kDa之间的丝心蛋白片段。
如本文所用，术语“中等分子量丝心蛋白片段”(中等-MW丝)是指重均分子量范围为约25kDa至约60kDa或约39kDa至约54kDa的丝心蛋白片段。
如本文所用，术语“胶凝”是指涉及粘度连续增加伴随弹性特性逐渐增强的过程。聚合物体系中胶凝的主要原因是溶解的聚合物或其聚集体之间相互作用的增强。与胶束化相反，从半稀释到高浓度的嵌段共聚物溶液发生胶凝，并且由有序胶束的排列导致。
如本文所用，术语“水凝胶”是指由交联的亲水或两亲聚合物制成的三维网络，其在液体中溶胀但不溶解于其中。水凝胶具有吸收大量水的能力。水凝胶是分子、纤维或颗粒的低体积分数3D网络，其具有中等空隙，充满水或水性介质。水凝胶可分为两类：一类是由聚合物链的物理结合导致的物理凝胶，并且另一类是化学凝胶(或不可逆凝胶)，其网络通过共价键连接。将官能团作为悬垂基团或在3D网络的骨架上包含允许合成响应于各种刺激(包括温度、电磁场、化学品和生物分子)而溶胀的水凝胶。在一个实施方案中，本文所述的丝-HA水凝胶的物理形式可以包括微凝胶(水凝胶微粒)和块状水凝胶。
如本文所用，术语"基本上无丝胶蛋白"或"基本上不含丝胶蛋白"是指大部分丝胶蛋白已被去除的丝纤维和/或由大部分丝胶蛋白已被去除的丝纤维制备的SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.01％(w/w)至约10.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.01％(w/w)至约9.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.01％(w/w)至约8.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.01％(w/w)至约7.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.01％(w/w)至约6.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.01％(w/w)至约5.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0％(w/w)至约4.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.05％(w/w)至约4.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.1％(w/w)至约4.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.5％(w/w)至约4.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约1.0％(w/w)至约4.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约1.5％(w/w)至约4.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约2.0％(w/w)至约4.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约2.5％(w/w)至约4.0％(w/w)丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有约0.01％(w/w)至约0.1％(w/w)的丝胶蛋白含量的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有低于约0.1％(w/w)的丝胶蛋白含量的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，基本上不含丝胶蛋白的丝心蛋白和SPF是指具有低于约0.05％(w/w)的丝胶蛋白含量的丝心蛋白和SPF。在一个实施方案中，当将丝源加入到煮沸的(100℃)碳酸钠水溶液中持续约30分钟至约60分钟的处理时间时，获得约26重量％至约31重量％的脱胶损失。
如本文所用，术语"基本上均匀的"可指以关于鉴定的分子量的正态分布进行分布的基于纯丝心蛋白的蛋白片段。如本文所用，术语"基本上均匀的"可指添加剂例如利多卡因在本公开的组合物整体中的均匀分布。
如本文所用，术语“基本不含无机残留物”是指该组合物表现出0.1％(w/w)或更少的残留物。在一个实施方案中，基本不含无机残留物是指表现出0.05％(w/w)或更少的残留物的组合物。在一个实施方案中，基本不含无机残留物是指表现出0.01％(w/w)或更少的残留物的组合物。在一个实施方案中，无机残留物的量为0ppm(“检测不到”或“ND”)至1000ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约500ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约400ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约300ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约200ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为ND至约100ppm。在一个实施方案中，无机残留物的量为10ppm至1000ppm。
如本文所用，术语“基本不含有机残留物”是指该组合物表现出0.1％(w/w)或更少的残留物。在一个实施方案中，基本上不含有机残留物是指组合物表现出0.05％(w/w)或更少的残留物。在一个实施方案中，基本上不含有机残留物是指组合物表现出0.01％(w/w)或更少的残留物。在一个实施方案中，有机残留物的量为0ppm(“检测不到”或“ND”)至1000ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约500ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约400ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约300ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约200ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为ND至约100ppm。在一个实施方案中，有机残留物的量为10ppm至1000ppm。
如本文所用，术语"非交联"是指缺乏连接单独的基质聚合物分子、大分子和/或单体链的分子间键。因此，非交联的基质聚合物不通过分子间键与任何其他基质聚合物连接。
本公开的组织填充物、组合物或其部分表现出"生物相容性"或是"生物相容的"，意味着所述组合物与活体组织或活体系统相容，而没有显著毒性、有害或生理反应性，并且不引起免疫排斥。术语"生物相容的"包括本文定义的术语"可生物吸收的"、"可生物再吸收的"和"可生物降解的"。
本公开的组织填充物、组合物或其部分可以是"可生物吸收的"、"可生物再吸收的"和/或"可生物降解的"。如本文所用，术语"可生物吸收的"是指植入体内后消失(dissipation)的材料或物质，其与可发生消失的机制如溶解、降解、吸收和排出(excretion)无关。如本文所用，术语"可生物再吸收的"是指能够被身体吸收。如本文所用，术语"可生物降解的"是指在生理条件下可分解为副产物的材料。这样的生理条件包括例如水解(通过水解裂解的分解)、酶促催化(酶促降解)、机械相互作用等。如本文所用，术语"可生物降解的"还包括术语"可生物再吸收的"，其描述了在生理条件下分解以分解成产物的材料或物质，所述产物经历生物再吸收进入宿主生物体，即变成宿主生物体的生物化学系统的代谢物。如本文所用，术语"可生物再吸收的"和"生物再吸收"包括诸如可生物再吸收的聚合物的细胞介导的降解、酶促降解和/或水解降解、和/或可生物再吸收的聚合物从活组织中的消除的过程，如本领域技术人员将理解的。在一些实施方案中，本文描述的SPF-HA组合物和材料可以是生物相容性的、可生物再吸收的、可生物吸收的和/或可生物降解的。
当本文所述的组织填充物是可生物降解的或可生物再吸收的时，它们可以抗生物降解或生物再吸收至少约1天、或至少约2天、或至少约3天、或至少约4天、至少约5天、或至少约10天、或至少约15天、或至少约20天、或至少约25天、或至少约30天、或至少约35天、或至少约40天、或至少约45天、或至少约50天、或至少约60天、或至少约70天、或至少约80天、或至少约90天、或至少约100天、或至少约110天、或至少约120天、或至少约130天、或至少约140天、或至少约140天、或至少约150天、或至少约160天、或至少约170天、或至少约180天、或至少约190天、或至少约200天、或至少约250天、或至少约300天、或至少约1年、或至少约2年，或者它们可以抗生物降解少于5天、或至多约10天、或至多约15天、或至多约20天、或至多约25天、或至多约30天、或至多约35天、或至多约40天、或至多约45天、或至多约50天、或至多约60天、或至多约70天、或至多约80天、或至多约90天、或至多约100天、或至多约110天、或至多约120天、或至多约130天、或至多约140天、或至多约140天、或至多约150天、或至多约160天、或至多约170天、或至多约180天、或至多约190天、或至多约200天、或至多约250天、或至多约300天、或至多约1年、或至多约2年。
当本文所述的组织填充物是可生物吸收的时，它们可抗生物吸收至少约1天、或至少约2天、或至少约3天、或至少约4天、至少约5天、或至少约10天、或至少约15天、或至少约20天、或至少约25天、或至少约30天、或至少约35天、或至少约40天、或至少约45天、或至少约50天、或至少约60天、或至少约70天、或至少约80天、或至少约90天、或至少约100天、或至少约110天、或至少约120天、或至少约130天、或至少约140天、或至少约140天、或至少约150天、或至少约160天、或至少约170天、或至少约180天、或至少约190天、或至少约200天、或至少约250天、或至少约300天、或至少约1年、或至少约2年，或者它们可以抗生物吸收少于约5天、或至多约10天、或至多约15天、或至多约20天、或至多约25天、或至多约30天、或至多约35天、或至多约40天、或至多约45天、或至多约50天、或至多约60天、或至多约70天、或至多约80天、或至多约90天、或至多约100天、或至多约110天、或至多约120天、或至多约130天、或至多约140天、或至多约140天、或至多约150天、或至多约160天、或至多约170天、或至多约180天、或至多约190天、或至多约200天、或至多约250天、或至多约300天、或至多约1年、或至多约2年。
如本文所述，生物降解、生物吸收和生物再吸收的程度可通过例如向本文所述的组合物中加入一种或多种延迟生物降解、生物吸收和/或生物再吸收的试剂来改变和/或控制。此外，生物降解、生物吸收和生物再吸收的程度可通过增加或减少本文所述的聚合物材料中存在的聚合物交联的程度来改变和/或控制。例如，本文所述的组合物的生物降解、生物吸收和/或生物再吸收的速率可通过减少本文所述的聚合物材料中的交联量来增加。或者，本文所述的组织填充物和组合物的生物降解、生物吸收和/或生物再吸收的速率可通过增加本文所述的聚合物材料中的交联量来降低。
本公开的组织填充物和组合物是"低过敏性的"，意味着它们相对不太可能引起过敏反应。可通过参与者在他们的皮肤上局部施加本公开的组合物延长的时间段来证明这样的低致敏性。在一个实施方案中，延长的时间段为约3天。在一个实施方案中，延长的时间段为约7天。在一个实施方案中，延长的时间段为约14天。在一个实施方案中，延长的时间段为约21天。在一个实施方案中，延长的时间段为约30天。在一个实施方案中，延长的时间段选自由以下组成的组：约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月和无限期的。
如本文所用，“低分子量”丝是指具有约5kDa至约20kDa或约200Da至约25kDa，或低于约28kDa，或约15kDa至约28kDa的范围内的分子量的丝蛋白片段。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标低分子量可以为约11kDa。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标低分子量可以为约12kDa。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标低分子量可以为约13kDa。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标低分子量可以为约14kDa。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标低分子量可以为约15kDa。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标低分子量可以为约16kDa。
如本文所用，"中等分子量"丝是指具有约20kDa至约55kDa或约25kDa至约60kDa或约39kDa至约54kDa的范围内的分子量的丝蛋白片段。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标低分子量可以为约40kDa。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标中等分子量可以为约48kDa。
如本文所用，"高分子量"丝是指具有约55kDa至约150kDa的范围内的分子量的丝蛋白片段。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标低分子量可以为约100kDa至约145kDa。在一些实施方案中，某些丝蛋白片段的目标高分子量可以为约100kDa。
在一些实施方案中，本文所述的分子量，例如低分子量SPF、中等分子量SPF、高分子量SPF，可以被转化为相应的天然或重组蛋白，例如天然或重组丝蛋白内所含的近似数目的氨基酸，如本领域普通技术人员所理解的。例如，氨基酸的平均重量可以为约110道尔顿，即110g/mol。因此，在一些实施方案中，线性蛋白的分子量除以110道尔顿可以用于近似其中所含的氨基酸残基的数目。
如本文所用，术语"多分散性"是指在给定的聚合物样品中等分子量分布的量度。多分散性可以通过将重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)来计算。如本文所用，术语"重均分子量"(Mw)通常是指取决于聚合物分子根据其尺寸的贡献的分子量测量值。重均分子量可以由下式定义：其中Mi是链的分子量，并且Ni是该分子量的链的数量。如本文所用，术语"数均分子量"(Mn)通常是指通过将样品中所有聚合物分子的总重量除以样品中聚合物分子的总数而计算的分子量测量值。数均分子量可以由下式定义：其中Mi是链的分子量，并且Ni是该分子量的链的数量。例如，其中所有聚合物链相等的单分散聚合物的多分散性(Mw/Mn)为1。通常，可以通过凝胶渗透色谱法(GPC)和尺寸排阻色谱法(SEC)测定分子量平均值。多分散性指数越大，分子量越宽。
如本文所用，术语"组织填充物"广义上是指可提供在软组织中和周围以增加体积、增加支撑或以其他方式治疗软组织缺陷的材料。术语“组织填充物”还包括组织和/或真皮填充物；然而，术语"真皮填充物"不应被解释为对这样的填充物的递送位置和类型施加任何限制。然而，本文所述的真皮填充物通常可以包括在真皮下以多个水平使用和递送此类真皮填充物。如本文所用，术语"软组织"可指连接、支撑或围绕身体的其他结构和器官的那些组织。例如，本文所述的软组织可包括但不限于皮肤、真皮组织、真皮下组织、皮肤组织、皮下组织、硬膜内组织、肌肉、腱、韧带、纤维组织、脂肪、血管和动脉和神经和滑膜(皮内)组织。
如本文所用，"自交联"是指a)两条化学性质相似的聚合物链之间的交联，例如两条透明质酸链之间的交联，或两条SPF链之间的交联，或b)同一聚合物链上的交联基团之间的交联以产生环酯(内酯)、环酰胺、包含交联部分的环状构建体等，例如同一条透明质酸链上的两个基团之间的交联，或同一条SPF链上的两个基团之间的交联。
如本文所用，"零长度交联"和/或"包含键的交联"和/或"使用活化剂的交联"是指在分开的聚合物链或相同的聚合物链上的两个基团之间的交联，其中基团彼此直接反应，并且没有额外的交联部分插入它们之间。在羧酸基团和胺或醇之间的交联是零长度交联的一个实例，其中所述基团之一被活化剂例如碳二亚胺活化。
如本文所用，术语"环氧衍生的交联剂"是指在相同或分开的聚合物链中的两个部分之间的分子桥，其通过使用包含环氧基团的交联前体，例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE或PEGDGE)、或丝心蛋白、或丝心蛋白片段多环氧连接剂获得。不希望受任何特定理论的束缚，通过与聚合物链中(包括聚合物的侧链中)的反应性中心反应，环氧环打开以形成仲醇和新键(方案1)。反应性基团包括但不限于亲核基团，例如羧基、氨基或羟基。
方案1
如本文所用，"丁达尔效应"和/或"丁达尔化(tyndalling)"是在一些用组织填充物施用的患者中发生的不良事件。丁达尔效应的特征在于在注射了组织填充物的皮肤部位出现蓝色变色，这代表通过半透明表皮看到的可见的真皮填充物组合物。当光散射颗粒物质分散在另外的光传输介质中时，当颗粒的横截面在特定范围内时，通常稍微低于或接近可见光波长，可以看到丁达尔效应。在丁达尔效应下，较长波长的光(例如，红色)更大程度地透射通过介质，而较短波长的光(例如，蓝色)经由散射更大程度地反射，从而给出介质着色为蓝色的总体印象。
丝蛋白片段
在一些实施方案中，基于丝蛋白的组合物和丝蛋白片段或其生产方法可以包括在美国专利申请公开2015/00933340、2015/0094269、2016/0193130、2016/0022560、2016/0022561、2016/0022562、2016/0022563和2016/0222579、2016/0281294，以及美国专利9,187,538、9,522,107、9,517,191、9,522,108、9,511,012和9,545,369中描述的那些，这些专利通过引用整体并入本文。
如本文所用，丝蛋白片段(SPF)通常指来源于丝的肽和/或蛋白的混合物、组合物或群体。在一些实施方案中，SPF被生产为基本上纯的和高度可扩展的(scalable)SPF混合物溶液，其可以在多种工业中用于多种应用。所述溶液由原始的纯的完整丝蛋白材料产生，并且被处理以去除任何丝胶蛋白并获得片段混合物的期望重均分子量(MW)和多分散性。可以改变选择的方法参数以实现取决于预期的用途的不同的最终丝蛋白片段特征。所得的最终片段溶液是纯丝蛋白片段和水，具有PPM至检测不到的水平的工艺污染物，该水平在药物、医疗和消费者化妆品市场中是可接受的。可以根据期望的用途和性能要求进一步改变溶液中丝蛋白片段的浓度、大小和多分散性。在一个实施方案中，溶液中的基于纯丝心蛋白的蛋白片段基本上不含丝胶蛋白，具有范围为约1kDa至约250kDa的平均重均分子量，并且具有范围为约1.5至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，溶液中的基于纯丝心蛋白的蛋白片段基本上不含丝胶蛋白，具有范围为约5kDa至约150kDa的平均重均分子量，并且具有范围为约1.5至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，溶液中的基于纯丝心蛋白的蛋白片段基本上不含丝胶蛋白，具有范围为约6kDa至约17kDa的平均重均分子量，并且具有范围为约1.5至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，溶液中的基于纯丝心蛋白的蛋白片段基本上不含丝胶蛋白，具有范围为约17kDa至约39kDa的平均重均分子量，并且具有范围为约1.5至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，溶液中的基于纯丝心蛋白的蛋白片段基本上不含丝胶蛋白，具有范围为约39kDa至约80kDa的平均重均分子量，并且具有范围为约1.5至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，溶液中的基于纯丝心蛋白的蛋白片段基本上不含丝胶蛋白，具有范围为约80kDa至约150kDa的平均重均分子量，并且具有范围为约1.5至约3.0的多分散性。
在一个实施方案中，本文所述的丝蛋白片段可以在溶液中或作为固体制备，其中所述固体悬浮在生理溶液(例如水、盐水等)中或HA的凝胶中，如本文所述。在一些实施方案中，本文所述的丝蛋白片段可以在将其沉积在HA凝胶中之前在脂质体或微球中制备。
在一个实施方案中，本公开的丝溶液可以用于产生本文所述的组织填充物组合物。在一个实施方案中，溶液可用于产生凝胶，凝胶可与HA和额外的试剂一起匀化，以制备本文所述的组织填充物。根据所用的丝溶液和流延(cast)膜或凝胶的方法，获得了各种特性。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物中的SPF百分比含量按重量计为至少0.01％、或至少0.1％、或至少0.2％、或至少0.3％、或至少0.4％、或至少0.5％、或至少0.6％、或至少0.7％、或至少0.8％、或至少0.9％、或至少1％、或至少2％、或至少3％、或至少4％、或至少5％、或至少6％、或至少7％、或至少8％、或至少9％、或至少10％、或至少11％、或至少12％、或至少13％、或至少14％、或至少15％、或至少16％、或至少17％、或至少18％、或至少19％、或至少20％、或至少21％、或至少22％、或至少23％、或至少24％、或至少25％、或至少26％、或至少27％、或至少28％、或至少29％、或至少30％、或至少31％、或至少32％、或至少33％、或至少34％、或至少35％、或至少36％、或至少37％、或至少38％、或至少39％、或至少40％、或至少41％、或至少42％、或至少43％、或至少44％、或至少45％、或至少46％、或至少47％、或至少48％、或至少49％、或至少50％、或至少51％、或至少52％、或至少53％、或至少54％、或至少55％、或至少56％、或至少57％、或至少58％、或至少59％、或至少60％、或至少61％、或至少62％、或至少63％、或至少64％、或至少65％、或至少66％、或至少67％、或至少68％、或至少69％、或至少70％、或至少71％、或至少72％、或至少73％、或至少74％、或至少75％、或至少76％、或至少77％、或至少78％、或至少79％、或至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.5％、或至少99.9％。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物中的SPF百分比含量按重量计为至多0.01％、或至多0.1％、或至多0.2％、或至多0.3％、或至多0.4％、或至多0.5％、或至多0.6％、或至多0.7％、或至多0.8％、或至多0.9％、或至多1％、或至多2％、或至多3％、或至多4％、或至多5％、或至多6％、或至多7％、或至多8％、或至多9％、或至多10％、或至多11％、或至多12％、或至多13％、或至多14％、或至多15％、或至多16％、或至多17％、或至多18％、或至多19％、或至多20％、或至多21％、或至多22％、或至多23％、或至多24％、或至多25％、或至多26％、或至多27％、或至多28％、或至多29％、或至多30％、或至多31％、或至多32％、或至多33％、或至多34％、或至多35％、或至多36％、或至多37％、或至多38％、或至多39％、或至多40％、或至多41％、或至多42％、或至多43％、或至多44％、或至多45％、或至多46％、或至多47％、或至多48％、或至多49％、或至多50％、或至多51％、或至多52％、或至多53％、或至多54％、或至多55％、或至多56％、或至多57％、或至多58％、或至多59％、或至多60％、或至多61％、或至多62％、或至多63％、或至多64％、或至多65％、或至多66％、或至多67％、或至多68％、或至多69％、或至多70％、或至多71％、或至多72％、或至多73％、或至多74％、或至多75％、或至多76％、或至多77％、或至多78％、或至多79％、或至多80％、或至多81％、或至多82％、或至多83％、或至多84％、或至多85％、或至多86％、或至多87％、或至多88％、或至多89％、或至多90％、或至多91％、或至多92％、或至多93％、或至多94％、或至多95％、或至多96％、或至多97％、或至多98％、或至多99％、或至多99.5％、或至多99.9％。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物中的SPF百分比含量按重量计为约0.01％、或约0.1％、或约0.2％、或约0.3％、或约0.4％、或约0.5％、或约0.6％、或约0.7％、或约0.8％、或约0.9％、或约1％、或约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约8％、或约9％、或约10％、或约11％、或约12％、或约13％、或约14％、或约15％、或约16％、或约17％、或约18％、或约19％、或约20％、或约21％、或约22％、或约23％、或约24％、或约25％、或约26％、或约27％、或约28％、或约29％、或约30％、或约31％、或约32％、或约33％、或约34％、或约35％、或约36％、或约37％、或约38％、或约39％、或约40％、或约41％、或约42％、或约43％、或约44％、或约45％、或约46％、或约47％、或约48％、或约49％、或约50％、或约51％、或约52％、或约53％、或约54％、或约55％、或约56％、或约57％、或约58％、或约59％、或约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或约99.5％、或约99.9％。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物中的SPF百分比含量按重量计为约0.01％至约100％、或约0.01％至约99.9％、或约0.01％至约75％；或约0.1％至约95％、或约1％至约95％、或约10％至约95％；或约0.1％至约1％、或约0.1％至约2％、或约0.1％至约3％、或约0.1％至约4％、或约0.1％至约5％、或约0.1％至约6％、或约0.1％至约7％、或约0.1％至约8％、或约0.1％至约9％、或约0.1％至约10％、或约0.1％至约11％、或约0.1％至约12％、或约0.1％至约13％、或约0.1％至约14％、或约0.1％至约15％、或约0.1％至约16％、或约0.1％至约17％、或约0.1％至约18％、或约0.1％至约19％、或约0.1％至约20％、或约0.1％至约21％、或约0.1％至约22％、或约0.1％至约23％、或约0.1％至约24％、或约0.1％至约25％；或约1％至约2％、或约1％至约3％、或约1％至约4％、或约1％至约5％、或约1％至约6％、或约1％至约7％、或约1％至约8％、或约1％至约9％、或约1％至约10％、或约1％至约11％、或约1％至约12％、或约1％至约13％、或约1％至约14％、或约1％至约15％、或约1％至约16％、或约1％至约17％、或约1％至约18％、或约1％至约19％、或约1％至约20％、或约1％至约21％、或约1％至约22％、或约1％至约23％、或约1％至约24％、或约1％至约25％；或约10％至约20％、或约10％至约25％、或约10％至约30％、或约10％至约35％、或约10％至约40％、或约10％至约45％、或约10％至约50％、或约10％至约55％、或约10％至约60％、或约10％至约65％、或约10％至约70％、或约10％至约75％、或约10％至约80％、或约10％至约85％、或约10％至约90％、或约10％至约100％。
根据SPF肽和/或蛋白的结晶度，本文所述的SPF可具有多种机械和物理特性。在一个实施方案中，由于该蛋白质的结晶性，本公开的SPF组合物不溶于水溶液中。在一个实施方案中，本公开的SPF组合物可溶于水溶液中。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含约三分之二的结晶部分和约三分之一的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含约一半的结晶部分和约一半的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含99％的结晶部分和1％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含95％的结晶部分和5％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含90％的结晶部分和10％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含85％的结晶部分和15％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含80％的结晶部分和20％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含75％的结晶部分和25％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含70％的结晶部分和30％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含65％的结晶部分和35％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含60％的结晶部分和40％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含50％的结晶部分和50％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含40％的结晶部分和60％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含35％的结晶部分和65％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含30％的结晶部分和70％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含25％的结晶部分和75％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含20％的结晶部分和80％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含15％的结晶部分和85％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含10％的结晶部分和90％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含5％的结晶部分和90％的非晶区。在一个实施方案中，本公开的组合物的SPF包含1％的结晶部分和99％的非晶区。
在一些实施方案中，SPF的物理和机械特性随SPF组合物中α-螺旋和/或无规卷曲区的存在程度而变化。在一些实施方案中，本文公开的SPF水凝胶具有基本上不含α-螺旋和无规卷曲区的蛋白结构。在这些实施方案的方面，水凝胶具有的蛋白结构包含，例如，约5％的α-螺旋和无规卷曲区、约10％的α-螺旋和无规卷曲区、约15％的α-螺旋和无规卷曲区、约20％的α-螺旋和无规卷曲区、约25％的α-螺旋和无规卷曲区、约30％的α-螺旋和无规卷曲区、约35％的α-螺旋和无规卷曲区、约40％的α-螺旋和无规卷曲区、约45％的α-螺旋和无规卷曲区或约50％的α-螺旋和无规卷曲区。在这些实施方案的其他方面，水凝胶具有的蛋白结构包含，例如，至多5％的α-螺旋和无规卷曲区、至多10％的α-螺旋和无规卷曲区、至多15％的α-螺旋和无规卷曲区、至多20％的α-螺旋和无规卷曲区、至多25％的α-螺旋和无规卷曲区、至多30％的α-螺旋和无规卷曲区、至多35％的α-螺旋和无规卷曲区、至多40％的α-螺旋和无规卷曲区、至多45％的α-螺旋和无规卷曲区、或至多50％的α-螺旋和无规卷曲区。在这些实施方案的其他方面，水凝胶具有的蛋白结构包含，例如，约5％至约10％的α-螺旋和无规卷曲区、约5％至约15％的α-螺旋和无规卷曲区、约5％至约20％的α-螺旋和无规卷曲区、约5％至约25％的α-螺旋和无规卷曲区、约5％至约30％的α-螺旋和无规卷曲区、约5％至约40％的α-螺旋和无规卷曲区、约5％至约50％的α-螺旋和无规卷曲区、约10％至约20％的α-螺旋和无规卷曲区、约10％至约30％的α-螺旋和无规卷曲区、约15％至约25％的α-螺旋和无规卷曲区、约15％至约30％的α-螺旋和无规卷曲区或约15％至约35％的α-螺旋和无规卷曲区。
在一些实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有贮存稳定性，即当在水溶液中储存时，它们将不会缓慢地或自发地胶凝，并且随着时间推移，从10天至3年，取决于储存条件、丝百分比以及装运次数和装运条件，没有片段的明显聚集和/或分子量的增加。另外，可以改变pH以通过防止丝的过早折叠和聚集而延长贮存寿命和/或支持装运条件。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温(RT)下长达2周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达4周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达6周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达8周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达10周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下长达12周的贮存稳定性。在一个实施方案中，本公开的SPF溶液组合物具有在室温下约4周至约52周的贮存稳定性。表1显示了本公开的SPF组合物的实施方案的贮存稳定性测试结果。
可将已知的添加剂例如维生素(例如维生素C)加入本公开的SPF溶液组合物中以产生在室温(RT)下稳定10天至3年的凝胶。两个实例，SPF组合物和具有添加剂的SPF组合物，可以被冻干以增强范围为10天至10年的储存控制，这取决于储存和装运条件。冻干的丝粉末还可用作医药、消费和电子市场的原料。另外，在储存后可以将冻干的丝粉末再悬浮在水、HFIP或有机溶液中以产生不同浓度的丝溶液，包括比最初产生的那些更高浓度的溶液。在另一实施方案中，使用rototherm蒸发器或本领域中已知用于制造含有小于10质量％水的干蛋白质形式的其他方法干燥丝心蛋白基蛋白片段。
本文公开的组织填充物和方法中使用的SPF可以以各种方式操作和掺入，例如以溶液的形式，其可以与其他材料(例如HA)组合以制备本文所述的组织填充物组合物。下面是本公开的丝溶液的制备中和用于该制备的各种参数的合适范围的非限制性实例。本公开的丝溶液可包括这些参数的一个或多个，但不必是全部，并可使用这样的参数的范围的各种组合制备。
在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于30％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于25％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于20％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于19％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于18％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于17％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于16％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于15％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于14％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于13％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于12％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于11％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于10％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于9％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于8％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于7％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于6％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于3％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于2％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于1％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.9％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.8％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.7％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.6％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.3％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.2％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比小于0.1％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.1％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.2％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.3％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.6％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.7％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.8％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于0.9％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于1％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于2％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于3％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于6％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于7％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于8％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于9％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于10％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于11％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于12％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于13％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于14％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于15％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于16％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于17％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于18％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于19％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于20％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比大于25％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至30％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至25％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至20％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至15％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至10％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至9％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至8％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至7％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至6.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至6％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至5.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至4.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至3.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至3％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至2.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至2.0％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至2.4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.5％至5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.5％至4.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.5％至4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.5％至3.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.5％至3％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.5％至2.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为1％至4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为1％至3.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为1％至3％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为1％至2.5％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为1％至2.4％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为1％至2％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为20％至30％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为0.1％至6％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为6％至10％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为6％至8％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为6％至9％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为10％至20％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为11％至19％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为12％至18％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为13％至17％。在一个实施方案中，溶液中的丝百分比为14％至16％。
在一个实施方案中，本文所述的丝组合物可以与HA组合以形成组织填充物组合物。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于30％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于25％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于20％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于19％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于18％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于17％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于16％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于15％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于14％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于13％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于12％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于11％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于10％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.3％。
在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比小于0.1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于0.9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于10％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于11％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于12％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于13％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于14％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于15％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于16％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于17％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于18％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于19％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于20％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比大于25％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至30％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至25％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至20％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至15％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至10％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至6.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至5.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至4.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至3.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至2.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至2.0％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至2.4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.5％至5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.5％至4.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.5％至4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.5％至3.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.5％至3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.5％至2.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为1％至4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为1％至3.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为1％至3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为1％至2.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为1％至2.4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为1％至2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为20％至30％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为0.1％至6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为6％至10％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为6％至8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为6％至9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为10％至20％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为11％至19％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为12％至18％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为13％至17％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的丝的重量百分比为14％至16％。
在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为检测不到至30％。在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为检测不到至5％。在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为1％。在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为2％。在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为3％。在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为4％。在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为5％。在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为10％。在一个实施方案中，溶液或组织填充物组合物中的丝胶蛋白百分比为30％。
在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至1年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至2年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至3年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至4年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为0至5年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为1至2年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为1至3年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为1至4年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为1至5年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为2至3年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为2至4年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为2至5年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为3至4年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为3至5年。在一个实施方案中，LiBr-丝片段溶液的稳定性为4至5年。
在一个实施方案中，可包含在本公开的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段组合物的稳定性为10天至6个月。在一个实施方案中，可包含在本公开的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段组合物的稳定性为6个月至12个月。在一个实施方案中，可包含在本公开的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段组合物的稳定性为12个月至18个月。在一个实施方案中，可包含在本公开的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段组合物的稳定性为18个月至24个月。在一个实施方案中，可包含在本公开的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段组合物的稳定性为24个月至30个月。在一个实施方案中，可包含在本公开的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段组合物的稳定性为30个月至36个月。在一个实施方案中，可包含在本公开的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段组合物的稳定性为36个月至48个月。在一个实施方案中，可包含在本公开的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段组合物的稳定性为48个月至60个月。
在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至250kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为5kDa至150kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至6kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为6kDa至17kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为17kDa至39kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为39kDa至80kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为80kDa至150kDa的平均重均分子量。
在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至250kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至240kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至230kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至220kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至210kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至200kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至190kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至180kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至170kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至160kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至150kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至140kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至130kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至120kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至110kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至100kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至90kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至80kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至70kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至60kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至50kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至40kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至30kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至20kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至10kDa的平均重均分子量。
在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为1kDa至5kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为5kDa至10kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为10kDa至15kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为15kDa至20kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为20kDa至25kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为25kDa至30kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为30kDa至35kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为35kDa至40kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为40kDa至45kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为45kDa至50kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为50kDa至55kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为55kDa至60kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为60kDa至65kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为65kDa至70kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为70kDa至75kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为75kDa至80kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为80kDa至85kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为85kDa至90kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为90kDa至95kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为95kDa至100kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为100kDa至105kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为105kDa至110kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为110kDa至115kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为115kDa至120kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为120kDa至125kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为125kDa至130kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为130kDa至135kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为135kDa至140kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为140kDa至145kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为145kDa至150kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为150kDa至155kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为155kDa至160kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为160kDa至165kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为165kDa至170kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为170kDa至175kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为175kDa至180kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为180kDa至185kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为185kDa至190kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为190kDa至195kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为195kDa至200kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为200kDa至205kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为205kDa至210kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为210kDa至215kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为215kDa至220kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为220kDa至225kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为225kDa至230kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为230kDa至235kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为235kDa至240kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为240kDa至245kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为245kDa至250kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为250kDa至255kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为255kDa至260kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为260kDa至265kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为265kDa至270kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为270kDa至275kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为275kDa至280kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为280kDa至285kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为285kDa至290kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为290kDa至295kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为295kDa至300kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为300kDa至305kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为305kDa至310kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为310kDa至315kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为315kDa至320kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为320kDa至325kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为325kDa至330kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为330kDa至335kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为35kDa至340kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为340kDa至345kDa的平均重均分子量。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为345kDa至350kDa的平均重均分子量。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含低分子量丝、中等分子量丝和高分子量丝中的一种或多种。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含低分子量丝、中等分子量丝和高分子量丝中的一种或多种。在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含低分子量丝和中等分子量丝。在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含低分子量丝和高分子量丝。在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含中等分子量丝和高分子量丝。在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含低分子量丝、中等分子量丝和高分子量丝。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含低分子量丝和中等分子量丝。在一些实施方案中，低分子量丝和中等分子量丝之间的w/w比为约99:1至约1:99、约95:5至约5:95、约90:10至约10:90、约75:25至约25:75、约65:35至约35:65、或约55:45至约45:55。在一些实施方案中，低分子量丝和中等分子量丝之间的w/w比为约99:1至约55:45、约95:5至约45:55、约90:10至约35:65、约75:25至约15:85、约65:35至约10:90、或约55:45至约1:99。在一个实施方案中，低分子量丝与中等分子量丝之间的w/w比为约99:1、约98:2、约97:3、约96:4、约95:5、约94:6、约93:7、约92:8、约91:9、约90:10、约89:11、约88:12、约87:13、约86:14、约85:15、约84:16、约83:17、约82:18、约81:19、约80:20、约79:21、约78:22、约77:23、约76:24、约75:25、约74:26、约73:27、约72:28、约71:29、约70:30、约69:31、约68:32、约67:33、约66:34、约65:35、约64:36、约63:37、约62:38、约61:39、约60:40、约59:41、约58:42、约57:43、约56:44、约55:45、约54:46、约53:47、约52:48、约51:49、约50:50、约49:51、约48:52、约47:53、约46:54、约45:55、约44:56、约43:57、约42:58、约41:59、约40:60、约39:61、约38:62、约37:63、约36:64、约35:65、约34:66、约33:67、约32:68、约31:69、约30:70、约29:71、约28:72、约27:73、约26:74、约25:75、约24:76、约23:77、约22:78、约21:79、约20:80、约19:81、约18:82、约17:83、约16:84、约15:85、约14:86、约13:87、约12:88、约11:89、约10:90、约9:91、约8:92、约7:93、约6:94、约5:95、约4:96、约3:97、约2:98或约1:99。在一个实施方案中，低分子量丝与中等分子量丝之间的w/w比为约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1。在一个实施方案中，低分子量丝与中等分子量丝之间的w/w比为约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2或约1:1。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含低分子量丝和高分子量丝。在一些实施方案中，低分子量丝和高分子量丝之间的w/w比为约99:1至约1:99、约95:5至约5:95、约90:10至约10:90、约75:25至约25:75、约65:35至约35:65、或约55:45至约45:55。在一些实施方案中，低分子量丝和高分子量丝之间的w/w比为约99:1至约55:45、约95:5至约45:55、约90:10至约35:65、约75:25至约15:85、约65:35至约10:90、或约55:45至约1:99。在一个实施方案中，低分子量丝与高分子量丝之间的w/w比为约99:1、约98:2、约97:3、约96:4、约95:5、约94:6、约93:7、约92:8、约91:9、约90:10、约89:11、约88:12、约87:13、约86:14、约85:15、约84:16、约83:17、约82:18、约81:19、约80:20、约79:21、约78:22、约77:23、约76:24、约75:25、约74:26、约73:27、约72:28、约71:29、约70:30、约69:31、约68:32、约67:33、约66:34、约65:35、约64:36、约63:37、约62:38、约61:39、约60:40、约59:41、约58:42、约57:43、约56:44、约55:45、约54:46、约53:47、约52:48、约51:49、约50:50、约49:51、约48:52、约47:53、约46:54、约45:55、约44:56、约43:57、约42:58、约41:59、约40:60、约39:61、约38:62、约37:63、约36:64、约35:65、约34:66、约33:67、约32:68、约31:69、约30:70、约29:71、约28:72、约27:73、约26:74、约25:75、约24:76、约23:77、约22:78、约21:79、约20:80、约19:81、约18:82、约17:83、约16:84、约15:85、约14:86、约13:87、约12:88、约11:89、约10:90、约9:91、约8:92、约7:93、约6:94、约5:95、约4:96、约3:97、约2:98或约1:99。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含中等分子量丝和高分子量丝。在一些实施方案中，中等分子量丝和高分子量丝之间的w/w比为约99:1至约1:99、约95:5至约5:95、约90:10至约10:90、约75:25至约25:75、约65:35至约35:65、或约55:45至约45:55。在一些实施方案中，中等分子量丝和高分子量丝之间的w/w比为约99:1至约55:45、约95:5至约45:55、约90:10至约35:65、约75:25至约15:85、约65:35至约10:90、或约55:45至约1:99。在一个实施方案中，中等分子量丝与高分子量丝之间的w/w比为约99:1、约98:2、约97:3、约96:4、约95:5、约94:6、约93:7、约92:8、约91:9、约90:10、约89:11、约88:12、约87:13、约86:14、约85:15、约84:16、约83:17、约82:18、约81:19、约80:20、约79:21、约78:22、约77:23、约76:24、约75:25、约74:26、约73:27、约72:28、约71:29、约70:30、约69:31、约68:32、约67:33、约66:34、约65:35、约64:36、约63:37、约62:38、约61:39、约60:40、约59:41、约58:42、约57:43、约56:44、约55:45、约54:46、约53:47、约52:48、约51:49、约50:50、约49:51、约48:52、约47:53、约46:54、约45:55、约44:56、约43:57、约42:58、约41:59、约40:60、约39:61、约38:62、约37:63、约36:64、约35:65、约34:66、约33:67、约32:68、约31:69、约30:70、约29:71、约28:72、约27:73、约26:74、约25:75、约24:76、约23:77、约22:78、约21:79、约20:80、约19:81、约18:82、约17:83、约16:84、约15:85、约14:86、约13:87、约12:88、约11:89、约10:90、约9:91、约8:92、约7:93、约6:94、约5:95、约4:96、约3:97、约2:98或约1:99。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含丝蛋白，所述丝蛋白包含低分子量丝、中等分子量丝和高分子量丝。在一个实施方案中，低分子量丝、中等分子量丝和高分子量丝之间的w/w比为约1:1:8、1:2:7、1:3:6、1:4:5、1:5:4、1:6:3、1:7:2、1:8:1、2:1:7、2:2:6、2:3:5、2:4:4、2:5:3、2:6:2、2:7:1、3:1:6、3:2:5、3:3:4、3:4:3、3:5:2、3:6:1、4:1:5、4:2:4、4:3:3、4:4:2、4:5:1、5:1:4、5:2:3、5:3:2、5:4:1、6:1:3、6:2:2、6:3:1、7:1:2、7:2:1或8:1:1。在一个实施方案中，低分子量丝、中等分子量丝和高分子量丝之间的w/w比为约3:0.1:0.9、3:0.2:0.8、3:0.3:0.7、3:0.4:0.6、3:0.5:0.5、3:0.6:0.4,3:0.7:0.3,3:0.8:0.2或3:0.9:0.1。
在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为约1至约5.0的多分散性。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为约1.5至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为约1至约1.5的多分散性。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为约1.5至约2.0的多分散性。在一个实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的基于丝心蛋白的蛋白片段具有范围为约2.0至约2.5的多分散性。在一个实施方案中，具有基于纯丝心蛋白的蛋白片段的本公开的组合物具有范围为2.0至约3.0的多分散性。在一个实施方案中，具有基于纯丝心蛋白的蛋白片段的本公开的组合物具有范围为2.5至约3.0的多分散性。
在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物具有检测不到的水平的水平的LiBr残留物。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为10ppm至1000ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为10ppm至300ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于25ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于50ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于75ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于100ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于200ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于300ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于400ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于500ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于600ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于700ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于800ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于900ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量小于1000ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至500ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至450ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至400ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至350ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至300ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至250ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至200ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至150ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为检测不到至100ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为100ppm至200ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为200ppm至300ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为300ppm至400ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中LiBr残留物的量为400ppm至500ppm。
在一个实施方案中，本文所述的包含具有基于纯丝心蛋白的蛋白片段的SPF的组织填充物具有检测不到的水平的Na2CO3残留物水平。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于100ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于200ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于300ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于400ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于500ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于600ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于700ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于800ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于900ppm。在一个实施方案中，在本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量小于1000ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至500ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至450ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至400ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至350ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至300ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至250ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至200ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至150ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为检测不到至100ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为100ppm至200ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为200ppm至300ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为300ppm至400ppm。在一个实施方案中，本文所述的包含SPF的组织填充物中的Na2CO3残留物的量为400ppm至500ppm。
在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶解度为50％至100％。在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶解度为60％至100％。在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶解度为70％至100％。在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶解度为80％至100％。在一个实施方案中，水溶解度为90％至100％。在一个实施方案中，本公开的基于丝心蛋白的片段不溶于水溶液。
在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段在有机溶液中的溶解度为50％至100％。在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段在有机溶液中的溶解度为60％至100％。在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段在有机溶液中的溶解度为70％至100％。在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段在有机溶液中的溶解度为80％至100％。在一个实施方案中，本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段在有机溶液中的溶解度为90％至100％。在一个实施方案中，本公开的丝心蛋白基片段不溶于有机溶液。
制备用于本公开的组合物中的丝蛋白片段的方法在美国专利申请公开2015/00933340、2015/0094269、2016/0193130、2016/0022560、2016/0022561、2016/0022562、2016/0022563和2016/0222579、2016/0281294以及美国专利号9,187,538、9,522,107、9,517,191、9,522,108、9,511,012和9,545,369中进行了说明，其通过引用整体并入本文。然而，示例性方法在图1中显示，其是显示用于产生本公开的基于纯丝心蛋白的蛋白片段(SPF)的各个实施方案的流程图。应该理解的是，并非所有图示步骤都是制备本公开的所有丝溶液所必需的。如图1步骤A所示，茧(热处理或非热处理的)、丝纤维、丝粉末或蛛丝可以用作丝源。如果由来自家蚕的生丝茧开始，可将茧切成小碎片，例如尺寸大致相等的碎片，步骤B1。然后在步骤C1a中，生丝被提取和漂洗以去除任何丝胶蛋白。这产生基本无丝胶蛋白的生丝。在一个实施方案中，将水加热至84℃至100℃(理想地为沸腾)的温度，然后将Na2CO3(碳酸钠)加入沸水中，直到Na2CO3完全溶解。将生丝添加到沸水/Na2CO3(100℃)中并浸没约15-90分钟，在此煮沸较长时间产生较小的丝蛋白片段。在一个实施方案中，水体积等于约0.4x生丝重量，并且Na2CO3体积等于约0.848x生丝重量。在一个实施方案中，水体积等于0.1x生丝重量，Na2CO3体积保持在2.12g/L。这在图6和图7中得到证实：在相同体积的提取溶液(即相同体积的水和相同浓度的Na2CO3)中改变丝质量(x轴)，实现丝胶蛋白去除(基本上不含丝胶蛋白)，如由26％-31％的总丝质量损失(y轴)所证实的。随后，排干水溶解的Na2CO3溶液，并从丝心蛋白纤维中去除过量的水/Na2CO3(例如，用手使丝心蛋白提取物成环，使用机器的旋转循环等)。将所得丝心蛋白提取物用通常在约40℃至约80℃的温度范围内的温至热水漂洗以去除任何残留的吸附丝胶蛋白或污染物，更换水的体积至少一次(视需要重复多次)。所得丝心蛋白提取物是基本脱除丝胶蛋白的丝心蛋白。在一个实施方案中，在约60℃的温度下用水漂洗所得的丝心蛋白提取物。在一个实施方案中，每个循环的漂洗水的体积等于0.1L至0.2L×生丝重量。可能有利的是搅拌、翻转或循环漂洗水以使漂洗效果最大化。在漂洗后，从提取的丝心蛋白纤维中去除过量的水(例如用手或用机器挤丝心蛋白提取物)。或者，本领域技术人员已知的方法，如压力、温度或其他试剂或它们的组合可用于丝胶蛋白提取。或者，可以从虫中直接取出丝腺(100％无丝胶蛋白的丝蛋白)。这将得到无丝胶蛋白的液体丝蛋白，蛋白结构没有任何改变。
然后将提取的丝心蛋白纤维完全干燥。一旦干燥，使用环境温度至沸点的温度下添加到丝心蛋白中的溶剂溶解提取的丝心蛋白，步骤C1b。在一个实施方案中，溶剂是溴化锂(LiBr)溶液(LiBr的沸点为140℃)。或者，提取的丝心蛋白纤维未干燥，而是湿的并置于溶剂中；随之可以改变溶剂浓度以实现与将干燥丝加入溶剂时类似的浓度。LiBr溶剂的最终浓度范围可以是0.1M至9.3M。图8是汇总了由不同浓度的溴化锂(LiBr)和不同提取和溶解尺寸溶解的丝的分子量的表。可通过改变处理时间和温度以及溶解溶剂的浓度实现提取的丝心蛋白纤维的完全溶解。可以使用其他溶剂，包括但不限于磷酸盐磷酸、硝酸钙、氯化钙溶液或其他浓无机盐水溶液。为了确保完全溶解，应该将丝纤维完全浸在已加热的溶剂溶液中，然后保持在约60℃至约140℃的温度下1-168小时。在一个实施方案中，应该将丝纤维完全浸在溶剂溶液中，然后置于温度约100℃的干燥烘箱中约1小时。
将丝心蛋白提取物添加到LiBr溶液中(反之亦然)时的温度对完全溶解丝心蛋白所需的时间和最终SPF混合物溶液的所得分子量和多分散性具有影响。在一个实施方案中，丝溶剂溶液浓度小于或等于20％w/v，此外，在引入或溶解过程中的搅拌可以用于促进在不同温度和浓度下的溶解。LiBr溶液的温度提供对制成的丝蛋白片段混合物的分子量和多分散性的控制。在一个实施方案中，较高温度更快地溶解丝，以提供增强的工艺可扩展性和丝溶液的大规模生产。在一个实施方案中，使用加热到80℃-140℃的温度的LiBr溶液减少了在烘箱中为了实现完全溶解所需的时间。改变时间和溶解溶剂在60℃或以上的温度将改变和控制由原始分子量的天然丝心蛋白形成的SPF混合物溶液的MW和多分散性。
或者，可以绕过提取将整个茧直接置于溶剂，如LiBr中，步骤B2。这要求随后从丝和溶剂溶液中滤出蚕颗粒并使用本领域中已知的用于分离疏水和亲水蛋白的方法(如柱分离和/或色谱法、离子交换、用盐和/或pH化学沉淀，和/或酶消化和过滤或提取)去除丝胶蛋白，所有方法都是标准蛋白质分离方法的常见实例而非限制，步骤C2。或者，可以绕过提取将已去除蚕的未经热处理的茧置于溶剂，如LiBr中。上述方法可用于丝胶蛋白分离，优点在于未经热处理的茧含有明显更少的虫碎屑。
可以使用渗析通过相对于一定体积的水渗析该溶液而从所得溶解的丝心蛋白片段溶液中去除溶解溶剂，步骤E1。渗析之前的预过滤有助于从丝和LiBr溶液中去除任何碎片(即，蚕残留物)，步骤D。在一个实例中，在渗析和视需要的可能浓缩之前，使用3μm或5μm过滤器以200-300mL/min的流速过滤0.1％至1.0％的丝-LiBr溶液。如上所述的本文所公开的方法利用时间和/或温度将浓度从9.3M LiBr降至0.1M至9.3M的范围以促进过滤和下游渗析，特别是在考虑建立可规模化的工艺方法时。或者，不使用额外的时间或温度，可用水稀释9.3M LiBr-丝蛋白片段溶液以促进碎屑过滤和渗析。在所需的时间和温度过滤下的溶解结果是半透明无粒子的、室温贮存稳定的、具有已知MW和多分散性的丝蛋白片段-LiBr溶液。定期更换渗析水直到溶剂被去除是有利的(例如，在1小时、4小时后更换水，然后每12小时更换一次，总共更换6次水)。可基于用于丝蛋白溶解和片段化的溶剂的所得浓度变化水体积更换的总次数。渗析后，可以进一步过滤最终的丝溶液以去除任何残留的碎片(即，蚕残留物)。
或者，切向流过滤(TFF)，其是一种用于分离和纯化生物分子的快速有效的方法，可用于从所得溶解的丝心蛋白溶液中去除溶剂，步骤E2。TFF提供高纯丝蛋白片段水溶液，并确保该方法可规模化，从而以受控和可重复的方式生产大量溶液。可在TFF之前稀释丝-LiBr溶液(在水或LiBr中从20％降至0.1％丝)。在TFF处理之前的如上所述的预过滤可保持过滤效率并有可能避免由于存在碎屑颗粒而在过滤器表面上产生丝凝胶边界层。在TFF之前的预过滤也有助于从丝和LiBr溶液中除去任何残留的碎片(即，蚕残留物)，所述残留的碎片可能导致所得的仅含水的溶液的自发或长期胶凝，步骤D。再循环的或单程的TFF可用于产生0.1％丝至30.0％丝(更优选地，0.1％-6.0％丝)的水-丝蛋白片段溶液。基于溶液中的丝蛋白片段混合物的所需浓度、分子量和多分散性，可能需要不同截留尺寸的TFF膜。对于例如通过改变提取煮沸时间的长度或在溶解溶剂(例如LiBr)中的时间和温度制成的不同分子量的丝溶液，可能需要1-100kDa的膜。在一个实施方案中，使用TFF 5或10kDa膜来纯化丝蛋白片段混合物溶液并产生最终期望的丝水比率。在去除溶解溶剂(例如LiBr)之后也可以使用单程TFF、TFF和本领域中已知的其他方法，如降膜蒸发器浓缩该溶液(所得到的所需浓度为0.1％至30％丝)。这可用作本领域中已知用于制备水基溶液的标准HFIP浓缩方法的替代。也可以使用较大孔的膜滤出小丝蛋白片段并产生具有和/或没有较窄的多分散性值的较高分子量丝的溶液。图5是汇总本公开的丝蛋白溶液的一些实施方案的分子量的表。丝蛋白溶液的处理条件如下：100℃提取20分钟，室温漂洗，LiBr在60℃烘箱中放置4-6小时。水溶性膜的TFF处理条件如下：100℃提取60分钟，60℃漂洗，100℃LiBr在100℃烘箱中60分钟。图12至图23进一步显示了提取时间、LiBr溶解条件以及TFF处理和所得示例性分子量和多分散性的操纵。这些实例不是为了限制，而是为了证明指定特定分子量丝片段溶液的参数的潜力。
使用配备蒸发光散射检测器(ELSD)的HPLC系统进行用于检测LiBr和Na2CO3的测定法。通过相对于浓度绘制的被分析物的所得峰面积的线性回归进行计算。本公开的许多制剂的多于一个样品用于样品制备和分析。通常，将不同制剂的四个样品直接称入10mL容量瓶中。将样品悬浮在5mL的20mM甲酸铵(pH 3.0)中，并在2至8℃下保持2小时，偶尔摇动以从膜中提取分析物。在2小时后，将该溶液用20mM甲酸铵(pH 3.0)稀释。将来自容量瓶的样品溶液转移到HPLC小瓶中并进样到HPLC-ELSD系统中以估算碳酸钠和溴化锂。
发现为丝蛋白制剂中的Na2CO3和LiBr的量化开发的分析方法在10-165μg/mL的范围内是线性的，RSD对于注射精度为2％，对于面积为1％，对于碳酸钠和溴化锂的保留时间分别为0.38％和0.19％。该分析方法可用于丝蛋白制剂中的碳酸钠和溴化锂的定量测定。
最终的丝蛋白片段溶液是纯丝蛋白片段和水，含有PPM至检测不到水平的颗粒碎片和/或处理污染物，包括LiBr和Na2CO3。图3和图4是汇总本公开的溶液中LiBr和Na2CO3浓度的表。在图3中，处理条件包括100℃提取60分钟，60℃漂洗，100℃LiBr在100℃烘箱中60分钟。改变TFF条件，包括压差和渗滤体积的数目。在图4中，处理条件包括100℃煮沸60分钟，60℃漂洗，LiBr在60℃烘箱中4-6小时。
可以按照本领域的标准方法，不限于过滤、加热、放射或电子束，将所述丝片段-水溶液、冻干的丝蛋白片段混合物或任何其他包含SPF的组合物灭菌。预期所述丝蛋白片段混合物由于其较短的蛋白聚合物长度而将比本领域所述的完整丝蛋白溶液更好地耐受灭菌。另外，由本文所述SPF混合物产生的丝制品可以根据应用的需要进行灭菌。例如，加载有分子以用于具有开放性伤口/切口的医疗应用中的SPF组织和/或真皮填充物可以用标准方法，例如通过辐射或电子束灭菌。
图2是显示在提取和溶解步骤期间在产生本公开的丝蛋白片段溶液的过程期间可以修改的各种参数的流程图。可改变所选方法参数以根据预期用途实现不同的最终溶液特性，例如分子量和多分散性。应该理解的是，并非所有图示步骤都是制备本公开的所有丝溶液所必需的。
在一个实施方案中，用于产生本公开的丝蛋白片段溶液的方法包括由Bombyxmori家蚕形成丝茧的片；在水和Na2CO3的溶液中在约100℃下提取所述片约60分钟，其中所述水的体积等于约0.4x生丝重量，并且Na2CO3的量为约0.848x所述片的重量，以形成丝心蛋白提取物；在一定体积的漂洗水中在约60℃下漂洗丝心蛋白提取物三次，每次漂洗约20分钟，其中每个周期的漂洗水等于约0.2L×碎片重量；从丝心蛋白提取物中去除过量水；干燥丝心蛋白提取物；将干燥的丝心蛋白提取物溶解在LiBr溶液中，其中将LiBr溶液首先加热至约100℃以产生丝-LiBr溶液并保持；将丝-LiBr溶液置于约100℃的干燥烘箱中约60分钟以实现天然丝蛋白结构的完全溶解和进一步片段化成具有所需分子量和多分散性的混合物；过滤溶液以去除来自蚕的任何残留碎屑；用水稀释该溶液以得到1％的丝溶液；和使用切向流过滤(TFF)从溶液中去除溶剂。在一个实施方案中，使用10kDa的膜来纯化丝溶液并产生最终期望的丝水比率。然后TFF可以用于进一步浓缩纯丝溶液至丝比水的浓度为2％。
从原茧到渗析的每个工艺步骤是可扩展的，以提高制造效率。目前购买完整的茧作为原料，但是也已经使用了预清洁的茧或非热处理的茧，其中虫的去除留下了极少的碎片。切割和清洁茧是手工过程，然而，为了可扩展性，可以通过例如使用自动化机器结合压缩空气来去除虫和任何微粒，或者使用切割研磨机将茧切割成更小的片，来使得该过程劳动强度更小。目前以小批量进行的提取步骤可以在较大的容器中完成，例如工业洗衣机，其中可以保持60℃至100℃或之间的温度。漂洗步骤也可以在工业洗涤机中完成，以消除手动漂洗周期。丝在LiBr溶液中的溶解可在对流烘箱以外的容器，例如搅拌釜反应器中进行。通过一系列水更换进行的丝渗析是手动和时间密集的过程，其可通过改变某些参数加速，例如在渗析前稀释丝溶液。渗析过程可以通过使用半自动设备，例如切向流过滤系统，来规模化制造。
改变提取(即时间和温度)、LiBr(即添加到丝心蛋白提取物中(或反之亦然)时LiBr溶液的温度)和溶解(即时间和温度)参数得到具有不同粘度、均匀性和颜色的溶剂-丝溶液。提高提取温度、延长提取时间、在溶解丝时起初和随时间经过使用更高温度的LiBr溶液和增加在温度下(例如在如此处所示的烘箱或替代热源中)的时间都得到粘度更低和更均匀的溶剂-丝溶液。尽管几乎所有参数都得到可行的丝溶液，但在少于4至6小时内可实现完全溶解的方法对工艺规模化是优选的。
丝蛋白片段的分子量可基于在提取步骤的过程中使用的特定参数，包括提取时间和温度；在溶解步骤的过程中使用的特定参数，包括将丝浸入溴化锂时的LiBr温度和溶液保持在特定温度下的时间；和在过滤步骤的过程中使用的特定参数进行控制。通过使用公开的方法控制工艺参数，可以产生具有等于或低于2.5的多分散性的SPF混合物溶液，其具有范围为1kDa至250kDa、5kDa至200kDa、5kDa至150kDa、10kDa至150kDa或10kDa至80kDa的多种不同分子量。通过改变工艺参数以获得具有不同分子量的丝溶液，可基于所需性能要求有针对性地获得具有等于或小于2.5的所需多分散性的某一范围的片段混合物最终产物。例如，与较高分子量的SPF制剂相比，含有药物的较低分子量的丝膜可以具有更快的释放速率。另外，可以获得多分散性大于2.5的SPF混合物溶液。此外，可以将具有不同平均分子量和多分散性的两种溶液混合以产生组合溶液。或者，已经直接从虫中去除的液体丝腺(100％不含丝胶蛋白的丝蛋白)可以与本公开的任何SPF混合物溶液组合使用。使用具有折射率检测器(RID)的高压液相色谱法(HPLC)测定基于纯丝心蛋白的蛋白片段组合物的分子量。使用Cirrus GPC Online GPC/SEC软件3.3版(Agilent)计算多分散性。
在将生丝茧加工成丝溶液的过程中改变参数。改变这些参数影响所得丝溶液的MW。操控的参数包括(i)提取时间和温度、(ii)LiBr的温度、(iii)溶解烘箱的温度、和(iv)溶解时间。如图9至图25所示用质谱测定分子量。
进行实验以测定改变提取时间的影响。图9至图15是显示这些结果的图，并且表2-8汇总了结果。以下是汇总：
–30分钟的丝胶蛋白提取时间导致比60分钟的丝胶蛋白提取时间更大的MW
–MW随在烘箱中的时间而降低
–140℃LiBr和烘箱导致置信区间的下限低于9500Da的MW
–30分钟提取在1小时和4小时的时间点具有未消化的丝
–30分钟提取在1小时的时间点导致明显高的分子量，置信区间的下限为35,000Da
–置信区间的上限所达到的MW范围为18000Da至216000Da(对于提供具有指定上限的解决方案是重要的)。
/>
进行实验以确定改变提取温度的影响。图16是显示这些结果的图，并且表9汇总结果。以下是汇总：
–在90℃下的丝胶蛋白提取导致比100℃提取下的丝胶蛋白提取更高的MW
–90℃和100℃都显示随在烘箱中的时间的MW降低
进行实验以确定当加入丝中时改变溴化锂(LiBr)温度的影响。图17至图18是显示这些结果的图，并且表10-11汇总了结果。以下是汇总：
–对MW或置信区间没有影响(所有CI～10500-6500Da)
–研究表明，由于大部分物质在室温下是丝，当加入LiBr并开始溶解时，LiBr-丝溶解的温度迅速下降低于原始LiBr温度
/>
进行实验以确定烘箱/溶解温度的影响。图19至图23是显示这些结果的图，并且表12-16汇总了结果。以下是汇总：
–烘箱温度对60分钟的提取丝的影响小于对30分钟的提取丝的影响。不希望受理论的束缚，据信30分钟的丝在提取过程中降解较少，并且因此烘箱温度对丝的较大MW、降解较少的部分具有更大的影响。
–对于60℃对140℃烘箱，30分钟提取的丝在较高烘箱温度下显示非常显著的较低MW的影响，而60分钟提取的丝具有小得多的影响
–140℃烘箱导致置信区间的下限为～6000Da。
/>
在一个实施方案中，本文公开的方法产生具有可在制造期间控制的特征的溶液，所述特征包括但不限于：MW-可以通过改变提取和/或溶解时间和温度(例如LiBr温度)、压力和过滤(例如尺寸排阻色谱法)来改变；结构-去除或裂解丝心蛋白聚合物的重链或轻链；纯度-用于改善丝胶蛋白去除的热水漂洗温度或用于改善颗粒去除的过滤能力，所述颗粒去除不利地影响所述丝片段蛋白混合物溶液的贮存稳定性；颜色-溶液的颜色可以用例如LiBr温度和时间来控制；粘度；透明度；和溶液的稳定性。溶液的所得pH通常为约7，并且可以根据储存要求使用酸或碱来改变。
如本文所述，上述SPF混合物溶液可用于产生含有SPF的组织填充物。
一种用于制备具有范围为约1kDa至约250kDa的平均重均分子量的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液的方法，包括以下步骤：通过将丝源加入煮沸的(100℃)碳酸钠水溶液中约30分钟至约60分钟的处理时间，使丝源脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约60℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度约140℃的烘箱中保持至少1小时；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和产生丝蛋白片段的水溶液，所述水溶液包含：具有范围为约1kDa至约250kDa的平均重均分子量的片段，并且其中所述基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液具有约1.5至约3.0的多分散性。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。如使用高效液相色谱溴化锂测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于300ppm的溴化锂残留物。如使用高效液相色谱碳酸钠测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于100ppm的碳酸钠残留物。所述方法可还包括将治疗剂加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将选自抗氧化剂或酶之一的分子加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将维生素加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。维生素可以是维生素C或其衍生物。可将基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液冻干。所述方法可还包括将α羟基酸加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。α羟基酸可选自乙醇酸、乳酸、酒石酸和柠檬酸。所述方法可还包括将浓度为约0.5％至约10.0％的透明质酸或其盐形式加入至基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括加入氧化锌或二氧化钛中的至少一种。可由通过所述方法产生的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液制造膜。所述膜可包含约1.0重量％至约50.0重量％的维生素C或其衍生物。所述膜可具有范围为约2.0重量％至约20.0重量％的水含量。所述膜可包含约30.0重量％至约99.5重量％的基于纯丝心蛋白的蛋白片段。可由通过所述方法产生的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液制备凝胶。所述凝胶可包含约0.5重量％至约20.0重量％的维生素C或其衍生物。所述凝胶可具有至少2％的丝含量和至少20％的维生素含量。
一种用于制备具有范围为约5kDa至约150kDa的平均重均分子量的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液的方法，包括以下步骤：通过将丝源加入煮沸的(100℃)碳酸钠水溶液中约30分钟至约60分钟的处理时间，使丝源脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约60℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度约140℃的烘箱中保持至少1小时；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和产生丝蛋白片段的水溶液，所述水溶液包含：具有范围为约5kDa至约150kDa的平均重均分子量的片段，并且其中所述基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液具有约1.5至约3.0的多分散性。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。如使用高效液相色谱溴化锂测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于300ppm的溴化锂残留物。如使用高效液相色谱碳酸钠测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于100ppm的碳酸钠残留物。所述方法可还包括将治疗剂加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将选自抗氧化剂或酶之一的分子加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将维生素加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。维生素可以是维生素C或其衍生物。可将基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液冻干。所述方法可还包括将α羟基酸加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。α羟基酸可选自乙醇酸、乳酸、酒石酸和柠檬酸。所述方法可还包括将浓度为约0.5％至约10.0％的透明质酸或其盐形式加入至基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括加入氧化锌或二氧化钛中的至少一种。可由通过所述方法产生的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液制造膜。所述膜可包含约1.0重量％至约50.0重量％的维生素C或其衍生物。所述膜可具有范围为约2.0重量％至约20.0重量％的水含量。所述膜可包含约30.0重量％至约99.5重量％的基于纯丝心蛋白的蛋白片段。可由通过所述方法产生的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液制备凝胶。所述凝胶可包含约0.5重量％至约20.0重量％的维生素C或其衍生物。所述凝胶可具有至少2％的丝含量和至少20％的维生素含量。
一种用于制备具有范围为约6kDa至约17kDa的平均重均分子量的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液的方法，包括以下步骤：通过将丝源加入煮沸的(100℃)碳酸钠水溶液中约30分钟至约60分钟的处理时间，使丝源脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约60℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度约140℃的烘箱中保持至少1小时；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和产生丝蛋白片段的水溶液，所述水溶液包含：具有范围为约6kDa至约17kDa的平均重均分子量的片段，并且其中所述基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液具有约1.5至约3.0的多分散性。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。如使用高效液相色谱溴化锂测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于300ppm的溴化锂残留物。如使用高效液相色谱碳酸钠测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于100ppm的碳酸钠残留物。所述方法可还包括将治疗剂加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将选自抗氧化剂或酶之一的分子加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将维生素加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。维生素可以是维生素C或其衍生物。可将基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液冻干。所述方法可还包括将α羟基酸加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。α羟基酸可选自乙醇酸、乳酸、酒石酸和柠檬酸。所述方法可还包括将浓度为约0.5％至约10.0％的透明质酸或其盐形式加入至基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括加入氧化锌或二氧化钛中的至少一种。可由通过所述方法产生的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液制造膜。所述膜可包含约1.0重量％至约50.0重量％的维生素C或其衍生物。所述膜可具有范围为约2.0重量％至约20.0重量％的水含量。所述膜可包含约30.0重量％至约99.5重量％的基于纯丝心蛋白的蛋白片段。可由通过所述方法产生的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液制备凝胶。所述凝胶可包含约0.5重量％至约20.0重量％的维生素C或其衍生物。所述凝胶可具有至少2％的丝含量和至少20％的维生素含量。
一种用于制备具有范围为约17kDa至约39kDa的平均重均分子量的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液的方法，包括以下步骤：将丝源加入煮沸的(100℃)碳酸钠水溶液中约30分钟至约60分钟的处理时间以导致脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约80℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度为约60℃至约100℃的干燥烘箱中保持至少1小时；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和产生基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液，其中所述基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液包含约10ppm至约300ppm的溴化锂残留物，其中所述丝蛋白片段的水溶液包含约10ppm至约100ppm的碳酸钠残留物，其中所述基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液包含具有范围为约17kDa至约39kDa的平均重均分子量的片段，并且其中所述基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液具有约1.5至约3.0的多分散性。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。如使用高效液相色谱溴化锂测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于300ppm的溴化锂残留物。如使用高效液相色谱碳酸钠测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于100ppm的碳酸钠残留物。所述方法可还包括将治疗剂加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将选自抗氧化剂或酶之一的分子加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将维生素加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。维生素可以是维生素C或其衍生物。可将基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液冻干。所述方法可还包括将α羟基酸加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。α羟基酸可选自乙醇酸、乳酸、酒石酸和柠檬酸。所述方法可还包括将浓度为约0.5％至约10.0％的透明质酸或其盐形式加入至基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括加入氧化锌或二氧化钛中的至少一种。
可由通过所述方法产生的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液制备凝胶。所述凝胶可包含约0.5重量％至约20.0重量％的维生素C或其衍生物。所述凝胶可具有至少2％的丝含量和至少20％的维生素含量。
根据本文说明的方面，公开了一种用于制备具有范围为约39kDa至约80kDa的平均重均分子量的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液的方法，所述方法包括以下步骤：将丝源加入煮沸的(100℃)碳酸钠水溶液中约30分钟的处理时间以导致脱胶；从溶液中去除丝胶蛋白以产生包含检测不到的水平的丝胶蛋白含量的丝心蛋白提取物；从丝心蛋白提取物中排出溶液；将丝心蛋白提取物溶解在溴化锂溶液中，所述溴化锂溶液具有约80℃至约140℃的在将丝心蛋白提取物置于溴化锂溶液中时的起始温度；将丝心蛋白-溴化锂溶液在温度为约60℃至约100℃的干燥烘箱中保持至少1小时；从丝心蛋白提取物中去除溴化锂；和产生基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液，其中所述基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液包含约10ppm至约300ppm的溴化锂残留物，约10ppm至约100ppm的碳酸钠残留物，具有范围为约40kDa至约65kDa的平均重均分子量的片段，并且其中所述基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液具有约1.5至约3.0的多分散性。所述方法可进一步包括在溶解步骤之前干燥丝心蛋白提取物。如使用高效液相色谱溴化锂测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于300ppm的溴化锂残留物。如使用高效液相色谱碳酸钠测定所测量的，基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液可包含小于100ppm的碳酸钠残留物。所述方法可还包括将治疗剂加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将选自抗氧化剂或酶之一的分子加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可还包括将维生素加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。维生素可以是维生素C或其衍生物。可将基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液冻干。所述方法可还包括将α羟基酸加入基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。α羟基酸可选自乙醇酸、乳酸、酒石酸和柠檬酸。所述方法可还包括将浓度为约0.5％至约10.0％的透明质酸或其盐形式加入至基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液中。所述方法可进一步包括加入氧化锌或二氧化钛中的至少一种。
可由通过所述方法产生的基于纯丝心蛋白的蛋白片段的水溶液制备凝胶。所述凝胶可包含约0.5重量％至约20.0重量％的维生素C或其衍生物。所述凝胶可具有至少2％的丝含量和至少20％的维生素含量。
透明质酸和透明质酸凝胶
本发明的可生物降解的聚合物组分是透明质酸盐，也称为透明质酸(HA)。HA由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的交替残基组成。这种水溶性聚合物天然存在于几乎所有组织中，尤其是在细胞外基质、眼睛和关节的滑液中。HA可以以纯的形式商购。小凝胶颗粒HA填充物可用于刺激天然胶原的产生，其被认为是由真皮的机械拉伸和真皮成纤维细胞的活化诱导的。
本发明的所得组织和/或真皮填充物中的HA浓度有助于组织和/或真皮填充物的硬度和寿命。在一些实施方案中，与具有相对较低浓度的HA的组织和/或真皮填充物相比，本文所述的所得组织和/或真皮填充物中的增加的HA浓度可增加所得组织和/或真皮填充物的硬度和/或寿命。
在一些实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的HA具有100,000道尔顿或更大、150,000道尔顿或更大、1百万道尔顿或更大、或2百万道尔顿或更大的分子量。在一些实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的HA具有100,000道尔顿或更小、150,000道尔顿或更小、1百万道尔顿或更小、或2百万道尔顿或更小的分子量。在一些实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的HA具有高分子量(例如，HA分子量为约1MDa至约4MDa)。在一些实施方案中，掺入本文所述的组织填充物中的HA具有低分子量(例如，HA分子量小于约1MDa)。
在一些实施方案中，HA源可以是透明质酸盐，例如透明质酸钠。在一些实施方案中，HA是交联的。交联HA可以配制成各种形状，如膜、凝胶、半凝胶、海绵或微球。在一些实施方案中，交联HA是流体凝胶形式，即它采取其容器的形状。HA凝胶或半凝胶的粘度可以通过加入未缀合的HA和/或透明质酸盐来改变。粘度也可以通过改变SPF-SPF、SPF-HA和/或HA-HA交联的程度来调节，如本文所述。在一些实施方案中，约4％至约12％的HA可被交联为HA-HA或HA-SPF。
在一个实施方案中，本文所述的SPF组合物可以与HA组合以形成组织填充物组合物。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于99％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于98％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于97％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于96％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于95％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于94％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于93％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于92％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于91％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于90％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于85％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于80％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于75％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于70％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于65％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于60％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于55％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于50％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于45％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于40％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于35％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于30％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于25％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于20％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于19％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于18％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于17％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于16％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于15％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于14％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于13％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于12％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于11％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于10％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比小于0.1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于0.9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA
的重量百分比大于1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于10％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于11％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于12％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于13％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于14％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于15％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于16％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于17％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于18％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于19％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于20％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于25％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于30％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于35％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于40％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于45％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于50％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于55％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于60％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于65％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于70％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于75％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于80％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于85％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于90％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于91％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于92％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于93％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于94％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于95％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于96％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于97％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比大于98％。
在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约0.1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约0.2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约0.3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
0.4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
0.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
0.6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
0.7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
0.8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
0.9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
2％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
3％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
4％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
10％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
11％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
12％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
13％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
14％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
15％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
16％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
17％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
18％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
19％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
20％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
25％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
30％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
35％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
40％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
45％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
50％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
55％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
60％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
65％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
70％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
75％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约
80％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约85％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约90％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约91％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约92％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约93％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约94％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约95％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约96％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约97％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约98％。
在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约0.1％至约1％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约0.5％至约1.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约1％至约5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约1.5％至约5.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约2％至约6％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约2.5％至约6.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约3％至约7％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约3.5％至约7.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约4％至约8％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约4.5％至约8.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约5％至约9％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约5.5％至约9.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约6％至约10％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约6.5％至约10.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约7％至约11％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约7.5％至约11.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约8％至约12％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约8.5％至约12.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约9％至约13％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约9.5％至约13.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约10％至约14％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约10.5％至约14.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约11％至约15％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约11.5％至约15.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约12％至约16％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约12.5％至约16.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约13％至约17％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约13.5％至约17.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约14％至约18％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约14.5％至约18.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约15％至约19％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约15.5％至约19.5％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约16％至约20％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约20％至约30％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约30％至约40％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约40％至约50％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约50％至约60％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约60％至约70％。在一个实施方案中，组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约80％至约90％。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物组合物中的HA的重量百分比为约1％至约2％、或约1％至约3％、或约1％至约4％、或约1％至约5％、或约1％至约6％、或约1％至约7％、或约1％至约8％、或约1％至约9％、或约1％至约10％、或约1％至约11％、或约1％至约12％、或约1％至约13％、或约1％至约14％、或约1％至约15％、或约1％至约16％、或约1％至约17％、或约1％至约18％、或约1％至约19％、或约1％至约20％、或约1％至约21％、或约1％至约22％、或约1％至约23％、或约1％至约24％、或约1％至约25％、或约1％至约30％、或约1％至约40％、或约1％至约50％、或约1％至约60％、或约1％至约70％、或约1％至约80％、或约1％至约95％；或约10％至约20％、或约10％至约25％、或约10％至约30％、或约10％至约35％、或约10％至约40％、或约10％至约45％、或约10％至约50％、或约10％至约55％、或约10％至约60％、或约10％至约65％、或约10％至约70％、或约10％至约75％、或约10％至约80％、或约10％至约85％、或约10％至约90％、或约10％至约95％。
在一些实施方案中，本文所述的HA可从商业来源获得或可由马链球菌细菌产生。
本文所述的包含HA的组织填充物可表征为它们的体外生物活性和体内生物活性。例如，可以对本文所述的组织填充物的一部分进行体外测定，用于细胞毒性、对酶降解的抗性、可注射性(例如，溶液粘度、注射流速、注射器/针直径)和/或颗粒形态分析。参见，例如，Park等Acad.Dermatol.Venerol.(2014)28:565-568。可以进行体内测定以确定初始形态学模式、存在的总的剩余填充物、组织学评估，并且可以包括肉芽肿形成或皮肤不良反应的检查。参见，例如，Park等Acad.Dermatol.Venerol.(2014)28:565-568；和Ramot等，Toxicology Pathology(2015)43:267-271。
胶凝
在一个实施方案中，可以向丝凝胶提供胶凝助剂。在一些实施方案中，胶凝助剂可以是酸、电、混合和/或超声处理。
在一个实施方案中，当产生丝凝胶时，可以将酸加入到本文所述的丝溶液中以帮助促进胶凝。在一个实施方案中，当产生包含中性或碱性分子和/或治疗剂的丝凝胶时，可以添加酸以促进胶凝。在一个实施方案中，当产生丝凝胶时，提高pH(使凝胶更具碱性)增加凝胶的贮存稳定性。在一个实施方案中，当产生丝凝胶时，提高pH(使凝胶更具碱性)使得更大量的酸性分子被加载到凝胶中。
在一个实施方案中，当产生丝凝胶时，可以使电通过本文所述的丝溶液以帮助促进胶凝。
在一个实施方案中，当产生丝凝胶时，可以使用本文所述的丝溶液的混合来帮助促进胶凝。
在一个实施方案中，当产生丝凝胶时，可以使用本文所述的丝溶液的超声处理来帮助促进胶凝。
在一个实施方案中，可以将天然添加剂加入所述丝凝胶中以进一步稳定添加剂。例如，可以使用微量元素如硒或镁或L-甲硫氨酸。此外，可以添加阻光剂以进一步增加稳定性。
在一些实施方案中，可以使用胶凝促进剂来加速SPF胶凝。在一些实施方案中，SPF溶液可以与纯醇或醇的水溶液以不同的体积比混合，同时通过搅拌、摇动或任何其他形式的搅拌来混合。在一些实施方案中，醇溶液促进剂可具有一定量的两亲性肽，其作为最终凝胶结果的进一步促进剂加入。通过向体系中添加更多或更少的促进剂组分，加速的程度可以适当地提高或降低。
在一些实施方案中，胶凝速率可通过增加用于制备凝胶的溶液中SPF的浓度来提高。为此目的，可以使用各种方法，包括但不限于：用掺入吸湿性物质如聚乙二醇的缓冲液渗析中间SPF溶液、冻干步骤和/或蒸发步骤。升高的温度也可用作胶凝过程的促进剂。此外，通过包括但不限于直接滴定和气体交换的方法来操纵中间丝溶液的pH可以用于促进胶凝过程。也可以引入选择的离子物质，尤其包括钙和钾，以加速胶凝速率。
在一些实施方案中，通过使用成核剂可以有助于胶凝，所述成核剂包括在SPF中间体中可溶和不溶的有机和无机物质。成核剂可以包括但不限于结合丝分子的肽序列、预先胶凝的丝和难溶性的富含β-折叠的结构。在一些实施方案中，加速胶凝过程的另一种方式是通过引入机械激发，其可以通过剪切装置、超声装置或机械混合器施加。
完成丝溶液胶凝所必需的时间可以从数秒到数小时或数天变化，这取决于上述参数的值以及SPF溶液中发现的聚集和组织的初始状态。所添加的促进剂的体积分数可以从总系统体积的约0％至约99％变化(即，任一组分可以被加入大大过量的另一组分或在该间隔内以任何相对浓度添加)。所用SPF溶液的浓度可以范围为约1％(w/v)至约20％(w/v)，以及任何其他合适的范围。可将促进剂加入SPF溶液中或将SPF溶液加入促进剂中。形成的SPF水凝胶可进一步化学或物理交联以获得改变的机械特性。
在一些实施方案中，将促进剂溶液加入SPF溶液中或反之亦然，SPF溶液的SPF浓度为约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、约10％(w/v)、约12％(w/v)、约15％(w/v)、约18％(w/v)、约20％(w/v)、约25％(w/v)或约30％(w/v)。在一些实施方案中，将促进剂溶液加入SPF溶液中，或反之亦然，SPF溶液具有至少1％(w/v)、至少2％(w/v)、至少3％(w/v)、至少4％(w/v)、至少5％(w/v)、至少6％(w/v)、至少7％(w/v)、至少8％(w/v)、至少9％(w/v)、至少10％(w/v)、至少12％(w/v)、至少15％(w/v)、至少18％(w/v)、至少20％(w/v)、至少25％(w/v)、或至少30％(w/v)的SPF浓度。在一些实施方案中，将促进剂溶液加入SPF溶液中或反之亦然，SPF溶液的SPF浓度为约1％(w/v)至约5％(w/v)、约1％(w/v)至约10％(w/v)、约1％(w/v)至约15％(w/v)、约1％(w/v)至约20％(w/v)、约1％(w/v)至约25％(w/v)、约1％(w/v)至约30％(w/v)、约5％(w/v)至约10％(w/v)、约5％(w/v)至约15％(w/v)、约5％(w/v)至约20％(w/v)、约5％(w/v)至约25％(w/v)、约5％(w/v)至约30％(w/v)、约10％(w/v)至约15％(w/v)、约10％(w/v)至约20％(w/v)、约10％(w/v)至约25％(w/v)或约10％(w/v)至约30％(w/v)。
凝胶和水凝胶-改性和交联
在一些实施方案中，本发明提供包含一种或多种水凝胶的组合物，所述水凝胶包含一种或多种交联的基质聚合物。如本文所用，术语"交联"是指将各个聚合物分子、大分子和/或单体链连接成更稳定的结构如凝胶的分子间键。因此，交联的基质聚合物具有至少一个分子间键，其将至少一个单独的聚合物分子连接到另一个聚合物分子，其中第一个单独的聚合物分子可以具有与另一个相似或不同的化学性质。本文公开的基质聚合物可以使用二醛和二硫化物交联剂交联，所述交联剂包括但不限于多官能的基于PEG的交联剂、二乙烯基砜、二缩水甘油醚和双环氧化物。SPF和/或HA交联剂的非限制性实例包括二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、UV光、戊二醛、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCD)、季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、己二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷或它们的组合。在一些实施方案中，HA交联剂可包括BDDE或DVS。在一些实施方案中，HA和/或SPF交联剂可以是BDDE、DVS、UV光、戊二醛或碳二亚胺，如本文所述。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可包含残留交联剂。在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可仅包含痕量的交联剂，例如不大于约2ppm、或不大于约1.9ppm、或不大于约1.8ppm、或不大于约1.7ppm、或不大于约1.6ppm、或不大于约1.5ppm、或不大于约1.4ppm、或不大于约1.3ppm、或不大于约1.2ppm、或不大于约1.1ppm、或不大于约1.0ppm、或不大于约0.9ppm、或不大于约0.8ppm、或不大于约0.7ppm、或不大于约O.6ppm、或不大于约0.5ppm、或不大于约0.4ppm、或不大于约0.3ppm、或不大于约0.2ppm、或不大于约0.1ppm。在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以含有痕量BDDE，但其浓度不大于约2ppm、或不大于约1.9ppm、或不大于约1.8ppm、或不大于约1.7ppm、或不大于约1.6ppm、或不大于约1.5ppm、或不大于约1.4ppm、或不大于约1.3ppm、或不大于约1.2ppm、或不大于约1.1ppm、或不大于约1.0ppm、或不大于约0.9ppm、或不大于约0.8ppm、或不大于约0.7ppm、或不大于约0.6ppm、或不大于约0.5ppm、或不大于约0.4ppm、或不大于约0.3ppm、或不大于约0.2ppm、或不大于约0.1ppm。如本领域普通技术人员所理解的，存在于特定组织填充物样品中的残留交联剂的量可以通过气相色谱-质谱测定。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可包含基质，该基质可包含SPF基质部分和HA基质部分，其中SPF基质部分包含交联和非交联SPF的混合物，并且HA基质部分包含交联和非交联HA的混合物。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物包含连接剂改性的HA。在一些实施方案中，本发明的组织填充物包含连接剂改性的SPF。双官能交联剂可以在两端反应以连接两个不同的HA分子、两个不同的SPF分子或一个HA分子与一个SPF分子。在一些实施方案中，交联剂仅在一端与HA分子键合，留下另一端为侧基。在一些实施方案中，交联剂仅在一端与SPF分子键合，留下另一端为侧基。
如本文所用，改性度(MoD)可定义为(参见例如J.Kablik等，Dermatol Surg，2009(35)：302-312)：
总改性度％＝％交联+％侧基
为了测定MoD，它也可以定义为(参见例如L.Kenne等，Carbohydrate Polymers，2013(91)：410-418)：
其中nlinked crosslinkers是连接的交联剂分子的数目，nHA disaccharides是HA中二糖的数目，并且nSPF repeating units是SPF中重复单元的数目。这些数值可以通过NMR使用交联剂、HA和SPF的特征化学位移测定(参见“Chemical Characterization of Hydrogels Crosslinkedwith Polyethylene Glycol for Soft Tissue Augmentation”，Monticelli等,OpenAccess Maced J Med Sci.2019Apr 15；7(7):1077-1081)。
在一些实施方案中，MoD为约1％至25％、约2％至约20％、或约3.5％至约17.5％。在一些实施方案中，MoD为约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、约3.0％、约3.1％、约3.2％、约3.3％、约3.4％、约3.5％、约3.6％、约3.7％、约3.8％、约3.9％、约4.0％、约4.1％、约4.2％、约4.3％、约4.4％、约4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约4.9％、约5.0％、约5.1％、约5.2％、约5.3％、约5.4％、约5.5％、约5.6％、约5.7％、约5.8％、约5.9％、约6.0％、约6.1％、约6.2％、约6.3％、约6.4％、约6.5％、约6.6％、约6.7％、约6.8％、约6.9％、约7.0％、约7.1％、约7.2％、约7.3％、约7.4％、约7.5％、约7.6％、约7.7％、约7.8％、约7.9％、约8.0％、约8.1％、约8.2％、约8.3％、约8.4％、约8.5％、约8.6％、约8.7％、约8.8％、约8.9％、约9.0％、约9.1％、约9.2％、约9.3％、约9.4％、约9.5％、约9.6％、约9.7％、约9.8％、约9.9％、约10.0％、约10.1％、约10.2％、约10.3％、约10.4％、约10.5％、约10.6％、约10.7％、约10.8％、约10.9％、约11.0％、约11.1％、约11.2％、约11.3％、约11.4％、约11.5％、约11.6％、约11.7％、约11.8％、约11.9％、约12.0％、约12.1％、约12.2％、约12.3％、约12.4％、约12.5％、约12.6％、约12.7％、约12.8％、约12.9％、约13.0％、约13.1％、约13.2％、约13.3％、约13.4％、约13.5％、约13.6％、约13.7％、约13.8％、约13.9％、约14.0％、约14.1％、约14.2％、约14.3％、约14.4％、约14.5％、约14.6％、约14.7％、约14.8％、约14.9％、约15.0％、约15.1％、约15.2％、约15.3％、约15.4％、约15.5％、约15.6％、约15.7％、约15.8％、约15.9％、约16.0％、约16.1％、约16.2％、约16.3％、约16.4％、约16.5％、约16.6％、约16.7％、约16.8％、约16.9％、约17.0％、约17.1％、约17.2％、约17.3％、约17.4％、约17.5％、约17.6％、约17.7％、约17.8％、约17.9％、约18.0％、约18.1％、约18.2％、约18.3％、约18.4％、约18.5％、约18.6％、约18.7％、约18.8％、约18.9％、约19.0％、约19.1％、约19.2％、约19.3％、约19.4％、约19.5％、约19.6％、约19.7％、约19.8％、约19.9％或约20.0％。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物包含交联SPF。在一些实施方案中，本发明的组织填充物包含交联HA。SPF片段可以交联至另一个SPF片段或HA。SPF-SPF、SPF-HA和HA-HA交联物质可以通过使用各种长度，包括零长度的交联剂获得。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以具有交联HA和/或交联SPF的水凝胶形式提供。交联HA和/或交联SPF(或SPF-HA交联物质)可以具有可测量的交联度。如本文所用，术语"交联度"是指相对于交联的聚合物大分子中单体单元的数目，交联单元(或分子或残基)的数目。在一些实施方案中，单体单元是SPF中的氨基酸。在一些实施方案中，单体单元是HA的二糖单体单元。因此，具有交联度为4％的交联基质聚合物的组合物是指平均每100个单体单元有四个交联分子。每个其他参数相等，交联度越大，凝胶变得越硬。不限于本发明的任何一种理论，HA和/或SPF中的交联度可导致所得材料或由其制备的组合物更硬。例如，交联度越高，这样的材料可能在体内存留的时间越长。实际上，不限于任何一种理论，包含交联材料的生物相容性材料将具有不同的生物再吸收、生物吸收和/或生物降解速率，这取决于交联度，其中交联度与生物再吸收、生物吸收和/或生物降解速率成反比。此外，本文所述的组织填充物中的更大的交联可降低此类组织填充物的亲水性和提升能力。
在一个非限制性的实例中，交联度为约5％的交联SPF对于每100个单体单元，例如交联SPF中的氨基酸，具有约5个交联部分。
交联度的非限制性实例包括约1％至约15％、或约2％至约14％、或约1％至约2％、约1.5％至约2.5％、或约2％至约3％、或约2.5％至约3.5％、或约3％至约4％、或约3.5％至约4.5％、或约4％至约5％、或约4.5％至约5.5％、或约5％至约6％、或约5.5％至约6.5％、或约6％至约7％、或约6.5％或约7.5％、或约7％至约8％、或约7.5％或约8.5％、或约8％至约9％、或约8.5％至约9.5％、或约9％至约10％、或约9.5％至约10.5％、或约10％至约11％、或约10.5％至约11.5％、或约11％至约12％、或约11.5％至约12.5％、或约12％至约13％、或约12.5％至约13.5％、或约13％至约14％、或约13.5％至约14.5％、或约14％至约15％。
在一些实施方案中，交联度为至少1％。在一些实施方案中，交联度为至少2％。在一些实施方案中，交联度为至少3％。在一些实施方案中，交联度为至少4％。在一些实施方案中，交联度为至少5％。在一些实施方案中，交联度为至少6％。在一些实施方案中，交联度为至少7％。在一些实施方案中，交联度为至少8％。在一些实施方案中，交联度为至少9％。在一些实施方案中，交联度为至少10％。在一些实施方案中，交联度为至少11％。在一些实施方案中，交联度为至少12％。在一些实施方案中，交联度为至少13％。在一些实施方案中，交联度为至少14％。在一些实施方案中，交联度为至少15％。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含交联SPF，其中交联度为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、或至少15％。在一些实施方案中，组合物包含交联SPF，其中交联度为至多1％、至多2％、至多3％、至多4％、至多5％、至多6％、至多7％、至多8％、至多9％、至多10％、至多11％、至多12％、至多13％、至多14％、或至多15％。在一些实施方案中，组合物包含交联SPF，其中交联度为约1％至约15％、约2％至约11％、约3％至约10％、约1％至约5％、约10％至约15％、约11％至约15％、约6％至约10％、或约6％至约8％、或约1％至约2％、约1.5％至约2.5％、或约2％至约3％、或约2.5％至约3.5％、或约3％至约4％、或约3.5％至约4.5％、或约4％至约5％、或约4.5％至约5.5％、或约5％至约6％、或约5.5％至约6.5％、或约6％至约7％、或约6.5％、或约7.5％、或约7％至约8％、或约7.5％、或约8.5％、或约8％至约9％、或约8.5％至约9.5％、或约9％至约10％、或约9.5％至约10.5％、或约10％至约11％、或约10.5％至约11.5％、或约11％至约12％、或约11.5％至约12.5％、或约12％至约13％、或约12.5％至约13.5％、或约13％至约14％、或约13.5％至约14.5％或约14％至约15％。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含交联HA，其中交联度为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、或至少15％。在一些实施方案中，组合物包含交联HA，其中交联度为至多1％、至多2％、至多3％、至多4％、至多5％、至多6％、至多7％、至多8％、至多9％、至多10％、至多11％、至多12％、至多13％、至多14％、或至多15％。在一些实施方案中，组合物包含交联HA，其中交联度为约1％至约15％、约2％至约11％、约3％至约10％、约1％至约5％、约10％至约15％、约11％至约15％、约6％至约10％、或约6％至约8％、或约1％至约2％、约1.5％至约2.5％、或约2％至约3％、或约2.5％至约3.5％、或约3％至约4％、或约3.5％至约4.5％、或约4％至约5％、或约4.5％至约5.5％、或约5％至约6％、或约5.5％至约6.5％、或约6％至约7％、或约6.5％、或约7.5％、或约7％至约8％、或约7.5％、或约8.5％、或约8％至约9％、或约8.5％至约9.5％、或约9％至约10％、或约9.5％至约10.5％、或约10％至约11％、或约10.5％至约11.5％、或约11％至约12％、或约11.5％至约12.5％、或约12％至约13％、或约12.5％至约13.5％、或约13％至约14％、或约13.5％至约14.5％或约14％至约15％。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含交联SPF-HA，其中交联度为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、或至少15％。在一些实施方案中，组合物包含交联SPF-HA，其中交联度为至多1％、至多2％、至多3％、至多4％、至多5％、至多6％、至多7％、至多8％、至多9％、至多10％、至多11％、至多12％、至多13％、至多14％、或至多15％。在一些实施方案中，组合物包含交联SPF-HA，其中交联度为约1％至约15％、约2％至约11％、约3％至约10％、约1％至约5％、约10％至约15％、约11％至约15％、约6％至约10％、或约6％至约8％、或约1％至约2％、约1.5％至约2.5％、或约2％至约3％、或约2.5％至约3.5％、或约3％至约4％、或约3.5％至约4.5％、或约4％至约5％、或约4.5％至约5.5％、或约5％至约6％、或约5.5％至约6.5％、或约6％至约7％、或约6.5％、或约7.5％、或约7％至约8％、或约7.5％、或约8.5％、或约8％至约9％、或约8.5％至约9.5％、或约9％至约10％、或约9.5％至约10.5％、或约10％至约11％、或约10.5％至约11.5％、或约11％至约12％、或约11.5％至约12.5％、或约12％至约13％、或约12.5％至约13.5％、或约13％至约14％、或约13.5％至约14.5％或约14％至约15％。
例如，1摩尔SPF与1摩尔HA可以交联，其中该摩尔HA的分子量可以为约1kDa至约2MkDa。在一些实施方案中，1摩尔SPF与1百万摩尔HA可以交联，或反之亦然，其中SPF可以是100Da至350kDa，由此每摩尔的任何百分比可以是交联的或游离的。将SPF交联至其他SPF的方法可以包括一个或多个步骤。在第一步中，将环氧化物如BDDE过量加入SPF溶液中，并使反应进行。环氧化物可以与SPF大分子上的各种基团，例如羧基、胺、醇、硫醇等反应，产生键，例如酯、仲胺或叔胺、醚、硫醚等。当BDDE的两个环氧化物都与一个或多个SPF大分子中的官能团反应时，SPF变成交联的。在一个实施方案中，HA的交联可以通过在碱性条件下与BDDE的反应进行，以产生HA和交联剂之间的共价键来进行，如等，CarbohydratePolymers(2011)85:469-489中所述。改性或交联的程度可根据本领域已知的方法(例如Edsman等,Dermatol.Surg.(2012)38:1170-1179)通过NMR测定。
连接肽的方法是本领域已知的。如本文所述，将单个分离的SPF连接到低聚和/或交联SPF肽中可以通过本领域公知的化学缀合方法来实现，例如通过产生肽键、使用缩合剂和通过使用公知的双官能交联试剂。缀合可以是直接的，其包括不涉及任何插入基团的连接，例如直接肽键，或者是间接的，其中连接含有插入部分，例如蛋白或肽，例如血浆白蛋白或其他间隔分子。例如，连接可以通过异双官能或同双官能交联剂，例如碳二亚胺、戊二醛、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)及其衍生物、双-马来酰亚胺、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯等。
交联也可在没有外源交联剂的情况下通过利用被缀合分子上的反应性基团来完成。化学交联肽分子的方法通常是本领域已知的，并且许多异双官能试剂和同双官能试剂描述于例如美国专利4,355,023、4,657,853、4,676,980、4,925,921和4,970,156，以及Immuno Technology Catalogue and Handbook,Pierce Chemical Co.(1989)中，其中每篇专利通过引用并入本文。应当进行这样的缀合，包括交联，以便基本上不影响与其缀合的肽低聚物或实体的期望功能，所述肽低聚物或实体包括治疗剂和能够结合目标物质的部分。
本领域技术人员应当理解，可以使用替代连接剂连接SPF肽，例如使用化学蛋白交联剂。例如同双官能交联剂，如二琥珀酰亚胺基-辛二酰亚胺-二盐酸盐；己二亚胺酸二甲酯-二盐酸盐；1,5,-2,4-二硝基苯或异双官能交联剂如N-羟基琥珀酰亚胺基2,3-二溴丙酸酯；1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐；和琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]-环己烷-1-甲酸酯。
本发明还提供了包含交联至HA的SPF的组合物。SPF至HA的交联可以通过各种方法实现，例如通过环氧化物方法、高碘酸盐方法和/或三氟乙基磺酰氯方法。在一些实施方案中，使用环氧化物，例如多官能环氧化物将SPF交联至HA。例如，可以使用双官能环氧化物如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。其他多官能环氧化物包括但不限于聚甘油多缩水甘油醚(PGPGE)、季戊四醇多缩水甘油醚(PEPGE)和二甘油多缩水甘油醚(DGPGE)。还提供了SPF和HA之间使用活化剂的零长度交联。
SPF与其他大分子，例如HA的交联方法可以包括一个或多个步骤。在第一步中，将环氧化物如BDDE过量加入SPF溶液中，并使反应进行。环氧化物可以与SPF大分子上的各种基团，例如羧基、胺、醇、硫醇等反应，产生键，例如酯、仲胺或叔胺、醚、硫醚等。当仅一种环氧化物与SPF反应时，仍有游离的连接至SPF的环氧化物，其可与另一SPF或不同的大分子如HA等交联。试剂的加入顺序可以变化。例如，BDDE可以首先加入HA中，然后加入SPF以形成交联SPF-HA。在一些实施方案中，SPF和HA可以首先混合，然后将BDDE加入到混合物中。在一些实施方案中，将BDDE加入SPF和HA的混合物中得到包含与SPF交联的SPF、与HA交联的HA和与HA交联的SPF的组合物。
在一些实施方案中，交联SPF-HA可以使用三氟乙基磺酰氯方法制备，包括一个或多个步骤。在一个步骤中，可以用三氟乙基磺酰氯，即2,2,2-三氟乙基磺酰氯，或任何其他合适的酰基氯活化交联HA和/或非交联HA。例如将三氟乙基磺酰氯逐滴加入到含有交联和/或非交联HA的碱/溶剂溶液中，例如吡啶/丙酮溶液。在一些实施方案中，该三氟乙基磺酰氯与交联和/或非交联HA的糖环上的所有四个羟基反应。在任选的步骤中，洗涤所得的HA-三氟乙磺酸酯。在一个步骤中，加入SPF片段，其将与HA-三氟乙磺酸酯反应。
在一些实施方案中，三氟乙基磺酰氯方法可以用于将SPF直接连接至交联和/或非交联HA。在其他实施方案中，三氟乙基磺酰氯方法可以用来通过间隔物，例如6-氨基-1-己醇将SPF连接至交联和/或非交联HA。在一些实施方案中，可首先通过三氟乙磺酰基活化和偶联将间隔物偶联到交联或非交联HA。为了将SPF偶联至间隔物，此后重复三氟乙磺酰基活化和偶联。可以使用任何合适的间隔物，即具有至少一些类似于6-氨基-1-己醇的特征，即，用于偶联至HA-三氟乙磺酸酯的伯胺，和用于活化和偶联SPF的反应性基团，例如羟基的间隔物。
在一些实施方案中，三氟乙基磺酰氯不与HA交联。然而，用于三氟乙基磺酰氯方法中的HA基质可以是交联的以获得额外的稳定性。交联可以例如通过使用多官能环氧化物如BDDE来实现，如上所述。交联可以在肽偶联之前或之后进行。
三氟乙基磺酰氯方法优于其他固定方法，包括在非常温和的条件下有效偶联，在活化和偶联过程中没有副反应，并且RGD肽可以直接结合至HA载体的碳原子。
在各个实施方案中，本文所述的组织填充物可包含基于HA的凝胶和水凝胶。如本文所用的基于HA是指包含交联HA的组合物或材料和包含交联HA加一种或多种其他交联聚合物的组合物。此外，HA可以指透明质酸和任何其透明质酸盐，包括但不限于透明质酸钠(NaHA)、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙以及它们的组合。本说明书中不特别排除使用多于一种生物相容性聚合物。本文所述的组织填充物(其可以是凝胶和水凝胶的形式)可以包含多于一种生物相容性聚合物，例如，除了HA和/或SPF之外的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种生物相容性聚合物。合适的生物相容性聚合物包括多糖(例如HA、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐、羧甲基纤维素)、聚(乙二醇)、聚(乳酸)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、除SPF以外的蛋白(例如弹性蛋白和胶原)。
本文所述的HA可以是分子间交联的。在一些实施方案中，交联稳定了HA的物理特性。在一些实施方案中，本发明提供了使用多官能环氧化物形成稳定的交联HA。如本文所用，术语"多官能"环氧化物是指存在两个或更多个环氧化物的化学试剂，例如低级脂族环氧化物或它们相应的表卤代醇。多官能环氧化物的实例包括但不限于二环氧化物1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、聚甘油多缩水甘油醚(PGPGE)、季戊四醇多缩水甘油醚(PEPGE)和二甘油多缩水甘油醚(DGPGE)。在一个优选的实施方案中，使用二环氧化物BDDE作为交联剂。HA的糖部分通过BDDE的两个环氧化物交联。在其他实施方案中，交联剂包括烷基二环氧化物如1,3-丁二烯二环氧化物、1,2,7,8-二环氧辛烷、1,5-己二烯二环氧化物等,二缩水甘油醚物质如乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双酚A二缩水甘油醚等、二乙烯基砜和表氯醇。其中，特别地，可以合适地使用二乙烯基砜、1,4-丁二醇二缩水甘油醚和乙二醇二缩水甘油醚。在本发明中，可以通过适当地组合两种或更多种交联剂使用它们。
在一些实施方案中，HA交联至HA。将HA交联至HA的方法可以包括一个或多个步骤。在第一步中，将环氧化物如BDDE过量加入HA溶液中，并使反应进行。环氧化物可以与HA的糖环上的一至四个羟基反应以形成一至四个醚键。替代地，或除了与羟基反应外，环氧化物可与多糖的羧酸反应以形成酯键。当BDDE的两种环氧化物都与一个或多个HA大分子的糖环中的官能团反应时，HA变得交联。
在一些实施方案中，交联剂可以是零长度交联剂，例如通过使用活化剂如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或BCDI获得的化学键。在一些实施方案中，在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基-NHS(或磺酰基-NHS)或4-二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下，使零长度交联活化剂与HA反应。在一些实施方案中，本文所述的凝胶和水凝胶通过使至少一种可交联的生物相容性聚合物，例如HA和/或蛋白，例如SPF蛋白，或任何其他另外的蛋白与至少一种交联活化剂反应而形成。
在一些实施方案中，交联SPF-SPF、交联SPF-HA和/或交联HA-HA在施用后，例如在作为组织填充物、皮内、皮下或通常作为真皮填充物注射后，可以具有可变的停留时间。在一些实施方案中，在高碘酸钠方法中，停留时间可以受到影响，这取决于SPF中可用于连接至另一个SPF大分子或HA的反应性基团的数目。SPF中可以连接至HA的反应性基团的实例是伯胺。含有两个反应性基团，例如两个伯胺的SPF本身可以在高碘酸盐方法中交联HA，从而产生更稳定的缀合物。在其他实施方案中，当SPF中只存在一个反应性基团，例如只有一个伯胺，例如在氨基末端时，SPF-HA交联减少，产生更可生物降解的基质。
在一些实施方案中，BDDE交联HA在应用后，例如在作为组织填充物、皮内、皮下或通常的真皮填充物注射后，可以具有可变的停留时间。在一些实施方案中，BDDE交联HA可以在组织和/或真皮组织中任何地方持续一到至少三十天，取决于交联的量。交联HA的可变停留时间可以通过在环氧化物交联过程中引入可水解的键来调节。在一些实施方案中，在较低pH下用环氧化物交联的材料具有较大量的酯键形成，并且因此可更迅速地水解。
在一个实施方案中，交联剂是零长度交联活化剂。通常，零长度交联活化剂偶联聚合物而不添加任何额外的间隔臂原子，并且因此零长度交联活化剂不被掺入交联的聚合物基质中。合适的零长度交联剂包括碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和BCDI。非水溶性碳二亚胺类包括二环己基碳二亚胺(DCC)和二异丙基碳二亚胺(DIC)，它们也是合适的。
羧酸酯与醇或胺官能团之间的碳二亚胺介导的偶联在环境温度、中性pH和水性条件下容易进行。中性pH可以是例如约6.0至约8.0，如约6.5至约7.5，如约7.0。通常在水中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)可用于介导羧酸酯和醇之间的酯化或羧酸酯和胺之间的酰胺化。因此，通过利用HA上存在的反应性基团(例如，羧酸酯和醇)形成交联HA。此外，通过利用蛋白例如SPF蛋白上的胺基的高反应性，实现蛋白的赖氨酸侧链与HA的羧酸酯基团之间的酰胺化以形成HA-蛋白交联的水凝胶。交联剂和未反应的聚合物可以通过渗析去除。
在一些实施方案中，EDC与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺酰基-NHS(磺基-NHS)(本文统称为“NHS”)联合使用。NHS稳定通过EDC形成的反应性中间体；因此，NHS的添加可以增加EDC的偶联效率。或者，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)可以用于催化偶联反应。
在一些实施方案中，本发明的基于HA的组织填充物包含基于交联HA的组合物和基于至少部分交联HA的组合物。本文所用的未交联HA是指真正未交联(例如"游离")的HA链以及轻度交联的链和其片段，它们通常为可溶的液体形式。
在一些实施方案中，本发明的水凝胶组合物包含HA和SPF之间的至少一些交联。
非限制性的示例性实施方案
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约1kDa至约250kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约5kDa至约150kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约6kDa至约17kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约17kDa至约39kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约39kDa至约80kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性的低分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性的中等分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性的低分子量的丝蛋白片段(SPF)、具有约1.5至约3.0的多分散性的中等分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，交联度最高达15％；其中低分子量SPF和中等分子量SPF之间的w/w比为约3:1。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性的高分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联由于使用环氧衍生交联剂，例如BDDE而发生，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约1kDa至约250kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约5kDa至约150kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约6kDa至约17kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约17kDa至约39kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性和范围为约39kDa至约80kDa的平均重均分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性的低分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性的中等分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性的低分子量的丝蛋白片段(SPF)、具有约1.5至约3.0的多分散性的中等分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％；其中低分子量SPF和中等分子量SPF之间的w/w比为约3:1。
在一个实施方案中，本发明涉及生物相容性组织和/或真皮填充物，其包含具有约1.5至约3.0的多分散性的高分子量的丝蛋白片段(SPF)、透明质酸(HA)、水和约0.05％至约0.5％的利多卡因，例如约0.3％的利多卡因；其中一部分最高达100％w/w的SPF是交联的，并且一部分最高达100％w/w的HA是交联的，所述交联发生在SPF至SPF、SPF至HA和HA至HA中的一种或多种之间；交联包括由于使用活化剂如BCDI而发生的零长度交联，并且交联度最高达15％。
在一个实施方案中，本发明涉及表16-B中描述的生物相容性组织和/或真皮填充物制剂。
表16-B
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
额外的试剂
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物包含活性剂，例如药物。在一些实施方案中，活性剂可以是酶抑制剂、麻醉剂、药用神经毒素、抗氧化剂、抗感染剂、抗炎剂、血管扩张剂、紫外(UV)光阻挡剂、染料(例如纹身染料、墨水或颜料)、反射剂、激素、免疫抑制剂以及它们的组合中的一种或多种。本文所述的组织填充物可包含活性剂，所述活性剂选自酶抑制剂、麻醉剂、药用神经毒素(例如肉毒杆菌毒素和梭状芽孢杆菌毒素)、抗氧化剂、抗感染剂(例如抗生素)、血管扩张剂、染料(例如纹身墨水或颜料)、反射剂、抗炎剂、紫外(UV)光阻挡剂、染料、激素、免疫抑制剂、以及它们的组合。
在一些实施方案中，免疫抑制剂是雷帕霉素或雷帕霉素样化合物。
在一些实施方案中，活性剂可以是选自青霉素(例如青霉素V、阿莫西林)、红霉素(例如红霉素硬脂酸酯)、林可酰胺(例如克林霉素)和头孢菌素(例如头孢氨苄)以及它们的组合的抗生素。
在一些实施方案中，活性剂可以是血管扩张剂，其选自硝酸甘油、拉贝洛尔、thrazide、二硝酸异山梨酯、四硝酸季戊四醇酯、洋地黄、肼屈嗪、二氮嗪、氨力农、L-精氨酸、硫酸巴美汀、富马酸苄环烷、半琥珀酸苄呋地尔、烟酸苄酯、盐酸丁咯地尔、盐酸布比林、盐酸丁胺、柠檬酸西替地尔、烟酸三甲环己酯、马来酸桂哌齐特、环扁桃酯、二氯乙酸二异丙铵、烟酸乙酯、己酮酸酯、烟酸己酯、酒石酸艾芬地尔、烟酸肌醇酯、盐酸异舒普林、血管舒缓素、烟酸甲酯、草酸萘呋胺酯、柠檬酸烟胺乙酯、尼麦特罗、尼波非尼、尼可呋糖、烟酰醇、酒石酸烟酰醇、一氧化氮、诺利胺、己酮可可碱(oxpentiflutine)、罂粟碱、帕帕非林(paveryloline)、己基可可碱、过氧亚硝酸盐、吡那地尔、哌拉替考、丙戊茶碱(propentofyltine)、萝巴新、舒洛地尔、teasuprine、盐酸莫西赛利、生育酚烟酸酯、妥拉唑啉、烟酸占替诺、二氮嗪、肼屈嗪、米诺地尔和硝普钠以及它们的组合。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含浓度为按重量计至少0.01％、或至少0.02％、或至少0.03％、或至少0.04％、或至少0.05％、或至少0.06％、或至少0.07％、或至少0.08％、或至少0.09％、或至少0.1％、或至少0.2％、或至少0.3％、或至少0.4％、或至少0.5％、或至少0.6％、或至少0.7％、或至少0.8％、或至少0.9％、或至少1.0％、或至少1.5％、或至少2.0％、或至少2.5％、或至少3.0％、或至少3.5％、或至少4.0％、或至少4.5％、或至少5.0％、或至少5.5％、或至少6.0％、或至少6.5％、或至少7.0％、或至少7.5％、或至少8.0％、或至少8.5％、或至少9.0％、或至少9.5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％的活性剂。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含浓度为按重量计至多0.01％、或至多0.02％、或至多0.03％、或至多0.04％、或至多0.05％、或至多0.06％、或至多0.07％、或至多0.08％、或至多0.09％、或至多0.1％、或至多0.2％、或至多0.3％、或至多0.4％、或至多0.5％、或至多0.6％、或至多0.7％、或至多0.8％、或至多0.9％、或至多1.0％、或至多1.5％、或至多2.0％、或至多2.5％、或至多3.0％、或至多3.5％、或至多4.0％、或至多4.5％、或至多5.0％、或至多5.5％、或至多6.0％、或至多6.5％、或至多7.0％、或至多7.5％、或至多8.0％、或至多8.5％、或至多9.0％、或至多9.5％、或至多10％、或至多15％、或至多20％、或至多25％、或至多30％、或至多35％、或至多40％、或至多45％、或至多50％的活性剂。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含浓度为按重量计约0.01％至约0.1％、或约0.05％至约0.15％、或约0.1％至约0.2％、或约0.15％至约0.25％、或约0.2％至约0.3％、或约0.25％至约0.35％、或约0.3％至约0.4％、或约0.35％至约0.45％、或约0.4％至约0.5％、或约0.45％至约0.55％、或约0.5％至约0.6％、或约0.55％至约0.65％、或约0.6％至约0.7％、或约0.65％至约0.75％、或约0.7％至约0.8％、或约0.75％至约0.85％、或约0.8％至约0.9％、或约0.85％至约0.95％、或约1％至约2％、或约1.5％至约2.5％、或约2％至约3％、或约2.5％至约3.5％、或约3％至约4％、或约3.5％至约4.5％、或约4％至约5％、或约4.5％至约5.5％、或约5％至约6％、或约5.5％至约6.5％、或约6％至约7％、或约6.5％至约7.5％、或约7％至约8％、或约7.5％至约8.5％、或约8％至约9％、或约8.5％至约9.5％、或约9％至约10％、或约10％至约15％、或约15％至约20％、或约20％至约25％、或约25％至约30％、或约30％至约35％、或约35％至约40％、或约40％至约45％、或约45％至约50％的活性剂。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含浓度为按重量计约0.01％、或约0.02％、或约0.03％、或约0.04％、或约0.05％、或约0.06％、或约0.07％、或约0.08％、或约0.09％、或约0.1％、或约0.2％、或约0.3％、或约0.4％、或约0.5％、或约0.6％、或约0.7％、或约0.8％、或约0.9％、或约1.0％、或约1.5％、或约2.0％、或约2.5％、或约3.0％、或约3.5％、或约4.0％、或约4.5％、或约5.0％、或约5.5％、或约6.0％、或约6.5％、或约7.0％、或约7.5％、或约8.0％、或约8.5％、或约9.0％、或约9.5％、或约10％、或约11％、或约12％、或约13％、或约14％、或约15％、或约16％、或约17％、或约18％、或约19％、或约20％、或约21％、或约22％、或约23％、或约24％、或约25％、或约26％、或约27％、或约28％、或约29％、或约30％、或约31％、或约32％、或约33％、或约34％、或约35％、或约36％、或约37％、或约38％、或约39％、或约40％、或约41％、或约42％、或约43％、或约44％、或约45％、或约46％、或约47％、或约48％、或约49％、或约50％的活性剂。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物包含纤维化抑制剂。在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可还包含对治疗部位中或周围的病理过程起抑制作用的化合物。在某些方面，活性剂可以选自以下类别的化合物中的一种：抗炎剂(例如地塞米松、可的松、氟氢可的松、泼尼松、泼尼松龙、6α-甲泼尼龙、曲安西龙、倍他米松和阿司匹林)。
在一些实施方案中，活性剂可以但不限于，抗氧化剂和酶。在一个实施方案中，活性剂可包括但不限于硒、泛醌衍生物、基于硫醇的抗氧化剂、含糖的抗氧化剂、多酚、植物提取物、咖啡酸、芹菜素、碧萝芷、白藜芦醇、叶酸、维生素B12、维生素B6、维生素B3、维生素E、维生素C及其衍生物、维生素D、维生素A、虾青素(astaxathin)、叶黄素、番茄红素、必需脂肪酸(ω3和6)、铁、锌、镁、类黄酮(大豆、姜黄素、水飞蓟素、碧萝芷(pycnogenol))、生长因子、芦荟、透明质酸、细胞外基质蛋白、细胞、核酸、生物标志物、生物试剂、氧化锌、过氧化苯甲酰、类视黄醇、钛、已知剂量的变应原(用于致敏处理)、精油包括但不限于柠檬草或迷迭香油、和香料。更广泛地考虑活性剂，活性剂可以包括治疗剂，例如小分子、药物、蛋白、肽和核酸。
在某些实施方案中，本文所述的组织填充物可包含一种或多种麻醉剂，其量有效地改善或减轻组织填充物注射部位的疼痛或不适。局部麻醉药可以选自安布卡因、阿米兰酮、阿米卡林、丁氧普鲁卡因、苯佐卡因、贝氧卡因、联苯胺、布比卡因、丁卡因、氨苯丁烷、丁苯胺、布他乙胺、丁氧卡因、卡他卡因、氯普鲁卡因、可卡乙烯(cocaethylene)、可卡因、环甲卡因、地布卡因、地美喹、二甲氧卡因、地哌冬、双环胺、芽子定(ecgonidine)、芽子碱(ecgonine)、氯乙烷、依替卡因、β-优卡因、尤普罗辛、非那可明、formocaine、己卡因、羟丁卡因、对氨基苯甲酸异丁酯、甲磺酸亮氨卡因、levoxadrol、利多卡因、甲哌卡因、甲丙卡因、偏丁卡因、氯甲烷、桃卡因、纳依卡因、奥他卡因、奥索卡因、奥昔卡因、对乙氧卡因、芬那卡因、苯酚、哌罗卡因、匹多卡因、聚多卡醇、丙吗卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮卡因、丙对卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、pseudococaine、吡咯卡因、罗哌卡因、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏、以及它们的盐。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含浓度为按重量计至少0.01％、或至少0.02％、或至少0.03％、或至少0.04％、或至少0.05％、或至少0.06％、或至少0.07％、或至少0.08％、或至少0.09％、或至少0.1％、或至少0.2％、或至少0.3％、或至少0.4％、或至少0.5％、或至少0.6％、或至少0.7％、或至少0.8％、或至少0.9％、或至少1.0％、或至少1.5％、或至少2.0％、或至少2.5％、或至少3.0％、或至少3.5％、或至少4.0％、或至少4.5％、或至少5.0％、或至少5.5％、或至少6.0％、或至少6.5％、或至少7.0％、或至少7.5％、或至少8.0％、或至少8.5％、或至少9.0％、或至少9.5％、或至少10％的利多卡因或上述其他麻醉剂。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含浓度为按重量计至多0.01％、或至多0.02％、或至多0.03％、或至多0.04％、或至多0.05％、或至多0.06％、或至多0.07％、或至多0.08％、或至多0.09％、或至多0.1％、或至多0.2％、或至多0.3％、或至多0.4％、或至多0.5％、或至多0.6％、或至多0.7％、或至多0.8％、或至多0.9％、或至多1.0％、或至多1.5％、或至多2.0％、或至多2.5％、或至多3.0％、或至多3.5％、或至多4.0％、或至多4.5％、或至多5.0％、或至多5.5％、或至多6.0％、或至多6.5％、或至多7.0％、或至多7.5％、或至多8.0％、或至多8.5％、或至多9.0％、或至多9.5％、或至多10％的利多卡因或上述其他麻醉剂。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含浓度为按重量计约0.01％、或约0.02％、或约0.03％、或约0.04％、或约0.05％、或约0.06％、或约0.07％、或约0.08％、或约0.09％、或约0.1％、或约0.2％、或约0.3％、或约0.4％、或约0.5％、或约0.6％、或约0.7％、或约0.8％、或约0.9％、或约1.0％、或约1.5％、或约2.0％、或约2.5％、或约3.0％、或约3.5％、或约4.0％、或约4.5％、或约5.0％、或约5.5％、或约6.0％、或约6.5％、或约7.0％、或约7.5％、或约8.0％、或约8.5％、或约9.0％、或约9.5％、或约10％的利多卡因或上述其他麻醉剂。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可以包含浓度为按重量计约0.01％至约0.02％、或约0.03％至约0.04％、或约0.05％至约0.06％至约0.07％、或约0.08％至约0.09％、或约0.1％至约0.2％、或约0.3％至约0.4％、或约0.5％至约0.6％、或约0.7％至约0.8％、或约0.9％至约1.0％、或约1％至约1.5％、或约1.5％至约2.0％、或约2.0％至约2.5％、或约2.5％至约3.0％、或约3.0％至约3.5％、或约3.5％至约4.0％、或约4.0％至约4.5％、或约4.5％至约5.0％、或约5.0％至约5.5％、或约5.5％至约6.0％、或约6.0％至约6.5％、或约6.5％至约7.0％、或约7.5％至约8.0％、或约8.0％至约8.5％、或约8.5％至约9.0％、或约9.5％至约10％的利多卡因或上述其他麻醉剂。
在一个实施方案中，麻醉剂是利多卡因，例如盐酸利多卡因的形式。本文所述的组织填充物可具有浓度为组合物的约0.1重量％至约5重量％，例如组织填充物的约0.2重量％至约1.0重量％的利多卡因或其他麻醉剂。在一个实施方案中，组织填充物具有组织填充物的约0.3重量％(w/w％)的利多卡因浓度。本文所述的组织填充物中利多卡因的浓度可以是治疗有效的，意味着浓度足以提供治疗益处，例如，改善或减轻组织填充物注射部位的疼痛或不适。
光学特性
当光遇到材料时，它可以以几种方式与材料相互作用。这些相互作用取决于光的性质，即其波长、频率、能量等，以及材料的性质。光通过反射和透射与折射的一定组合与物体相互作用。光学透明材料允许落在其上的很多光被透射，而极少的光被反射。不允许光透射的材料被称为光学不透明，或简单地称为不透明。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的具有透明性和/或半透明性的组织填充物。透明性(也称为透明性(pellucidity)或透明性(diaphaneity))是允许光穿过材料的物理特性，而半透明性(也称为半透明性(translucence)或半透明性(translucidity))仅允许光漫射地穿过。相反的特性是不透明性。透明材料是清澈的，而半透明材料不能清楚地看透。本文公开的组织填充物可以或可以不表现出光学特性，诸如透明性和/或半透明性。在一些实施方案中，包括用于浅表线(superficial line)填充的方法，具有不透明的水凝胶将是有利的。用于控制组织填充物的光学特性的因素包括但不限于SPF浓度、结晶度和/或水凝胶均匀性。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物是不透明的。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物是光学透明的。在该实施方案的方面，本文所述的组织填充物透射例如约75％的光、约80％的光、约85％的光、约90％的光、约95％的光或约100％的光。在该实施方案的其他方面中，本文所述的组织填充物透射例如至少75％的光、至少80％的光、至少85％的光、至少90％的光、或至少95％的光。在该实施方案的其他方面，本文所述的组织填充物透射例如约75％至约100％的光、约80％至约100％的光、约85％至约100％的光、约90％至约100％的光或约95％至约100％的光。
在另一个实施方案中，本文所述的组织填充物是光学不透明的。在该实施方案的方面，本文所述的组织填充物透射例如约0.1％的光、约1％的光、约10％的光、约15％的光、约20％的光、约25％的光、约30％的光、约35％的光、约40％的光、约45％的光、约50％的光、约55％的光、约60％的光、约65％的光、约70％的光、约75％的光、约80％的光、约85％的光、约90％的光、约95％的光或约100％的光。在该实施方案的其他方面中，本文所述的组织填充物透射例如至多0.1％的光、至多1％的光、至多10％的光、至多15％的光、至多20％的光、至多25％的光、至多30％的光、至多35％的光、至多40％的光、至多45％的光、至多50％的光、至多55％的光、至多60％的光、至多65％的光、至多70％的光、或至多75％的光。在该实施方案的其他方面中，本文所述的组织填充物透射例如至少0.1％的光、至少1％的光、至少10％的光、至少15％的光、至少20％的光、至少25％的光、至少30％的光、至少35％的光、至少40％的光、至少45％的光、至少50％的光、至少55％的光、至少60％的光、至少65％的光、至少70％的光、或至少75％的光。在该实施方案的其他方面，本文所述的组织填充物透射例如约0.1％至约15％、约0.1％至约20％、约0.1％至约25％、约0.1％至约30％、约0.1％至约35％、约0.1％至约40％、约0.1％至约45％、约0.1％至约50％、约0.1％至约55％、约0.1％至约60％、约0.1％至约65％、约0.1％至约70％、约0.1％至约75％、约1％至约15％、约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约30％、约1％至约35％、约1％至约40％、约1％至约45％、约1％至约50％、约1％至约55％、约1％至约60％、约1％至约65％、约1％至约70％、约1％至约75％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约30％、约10％至约35％、约10％至约40％、约10％至约45％、约10％至约50％、约10％至约55％、约10％至约60％、约10％至约65％、约10％至约70％、约10％至约75％、约25％至约35％、约25％至约40％、约25％至约45％、约25％至约50％、约25％至约55％、约25％至约60％、约25％至约65％、约25％至约70％或约25％至约75％的光。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物是光学半透明的。在该实施方案的方面，本文所述的组织填充物漫透射例如约75％的光、约80％的光、约85％的光、约90％的光、约95％的光或约100％的光。在这些实施方案的其他方面中，组织填充物漫透射例如至少0.1％的光、至少1％的光、至少5％的光、至少10％的光、至少15％的光、至少20％的光、至少25％的光、至少30％的光、至少35％的光、至少40％的光、至少45％的光、至少50％的光、至少55％的光、至少60％的光、至少65％的光、至少70％的光、75％的光、至少80％的光、至少85％的光、至少90％的光、或至少95％的光。在这些实施方案的其他方面中，组织填充物漫透射例如至多0.1％的光、至多1％的光、至多5％的光、至多10％的光、至多15％的光、至多20％的光、至多25％的光、至多30％的光、至多35％的光、至多40％的光、至多45％的光、至多50％的光、至多55％的光、至多60％的光、至多65％的光、至多70％的光、75％的光、至多80％的光、至多85％的光、至多90％的光、至多95％的光、或至多100％的光。在这些实施方案的其他方面，组织填充物漫透射例如约0.1％至约100％的光、约1％至约100％的光、约5％至约100％的光、约10％至约100％的光、约15％至约100％的光、约20％至约100％的光、约25％至约100％的光、约30％至约100％的光、约35％至约100％的光、约45％至约100％的光、约50％至约100％的光、约55％至约100％的光、约60％至约100％的光、约65％至约100％的光、约70％至约100％的光、约75％至约100％的光、约80％至约100％的光、约85％至约100％的光、约90％至约100％的光或约95％至约100％的光。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可通过其衰减系数来描述，所述衰减系数被定义为材料散射或吸收光的能力的描述。
组织填充物和皮肤特性可影响在递送本领域已知的某些组织填充物后皮肤中不良丁达尔效应事件的表现。具有高硬度和弹性的填充物可以用于矫正面部区域，如鼻唇沟、面颊和下巴，而不用担心面部变色，因为材料被注射到真皮中部和深部区域。然而，当填充物用于更浅的应用，例如用于矫正细纹皱纹，或错误地将填充物过浅地应用于真皮的上部区域时，经常观察到皮肤的蓝色变色。这种现象被认为是丁达尔效应的结果，其导致施用部位的半永久性变色。在一些实施方案中，在施用酶例如透明质酸酶以降解填充物材料之后，该效应消失。因此，丁达尔效应在处理浅表细纹皱纹的患者中更常见。丁达尔效应的延长表现，通常只要填充物在皮肤中持续，是不期望的副作用并且是患者关注的原因。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物由于其均匀性和所得不透明性而减轻丁达尔效应。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物不导致丁达尔效应，或不导致由丁达尔效应引起的任何视觉上可感知的蓝色变色。在一些实施方案中，本文所述的组织填充物不导致丁达尔效应，或不导致由丁达尔效应引起的任何视觉上可感知的蓝色变色。在一些实施方案中，本发明涉及用于改善美学外观的组织填充物和方法，包括向患者的真皮区域施用不显示或显示不显著的丁达尔效应的基本上光学透明的真皮填充物组合物。在注射组织填充物的皮肤部位出现蓝色变色(丁达尔效应)是一些真皮填充物患者经历的显著不良事件。丁达尔效应在治疗浅表细纹皱纹的患者中更常见。本发明的实施方案已经被开发，其提供了长效的半透明填充物，其可以被浅表注射以处理细纹和皱纹，甚至在相对薄的皮肤区域中，而没有任何由丁达尔效应导致的蓝色变色。细纹或浅表皱纹通常被理解为通常在皮肤最薄(即，皮肤具有小于1mm的真皮厚度)的面部区域(前额、外眦、唇红缘/口周线)中发现的皮肤中的那些皱纹或皱褶。在前额上，正常皮肤的平均真皮厚度为约0.95mm，并且有皱纹的皮肤的平均真皮厚度为约0.81mm。外眦周围的真皮甚至更薄(例如，正常皮肤约0.61mm，并且有皱纹的皮肤约0.41mm)。30或32号针(通常用于细线凝胶施用的针)的平均外径为约0.30至约0.24mm。在一些实施方案中，本文所述的组织填充物不导致丁达尔效应，或不导致由丁达尔效应引起的任何视觉上可感知的蓝色变色。
在一个实施方案中，本文公开的组织填充物是光学不透明的。在该实施方案的方面，本文公开的组织填充物透射例如约5％的光、约10％的光、约15％的光、约20％的光、约25％的光、约30％的光、约35％的光、约40％的光、约45％的光、约50％的光、约55％的光、约60％的光、约65％的光或约70％的光。在该实施方案的其他方面中，本文公开的组织填充物透射例如至多5％的光、至多10％的光、至多15％的光、至多20％的光、至多25％的光、至多30％的光、至多35％的光、至多40％的光、至多45％的光、至多50％的光、至多55％的光、至多60％的光、至多65％的光、至多70％的光、或至多75％的光。在该实施方案的其他方面，本文公开的组织填充物透射例如约5％至约15％、约5％至约20％、约5％至约25％、约5％至约30％、约5％至约35％、约5％至约40％、约5％至约45％、约5％至约50％、约5％至约55％、约5％至约60％、约5％至约65％、约5％至约70％、约5％至约75％、约15％至约20％、约15％至约25％、约15％至约30％、约15％至约35％、约15％至约40％、约15％至约45％、约15％至约50％、约15％至约55％、约15％至约60％、约15％至约65％、约15％至约70％、约15％至约75％、约25％至约35％、约25％至约40％、约25％至约45％、约25％至约50％、约25％至约55％、约25％至约60％、约25％至约65％、约25％至约70％或约25％至约75％的光。
在一些实施方案中，本文公开的组织填充物表现出例如约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％的丁达尔化降低。在这些实施方案的其他方面，本文公开的组织填充物表现出例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的丁达尔化降低。在这些实施方案的其他方面，本文公开的组织填充物表现出例如约20％至约100％、约50％至约100％、约70％至约100％、约15％至约35％、约20％至约40％、约25％至约45％、约30％至约50％、约35％至约55％、约40％至约60％、约45％至约65％、约50％至约70％、约55％至约75％、约60％至约80％、约65％至约85％、约70％至约90％、约75％至约95％或约80％至约100％的丁达尔化降低。
水含量
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可包含水。例如，本文所述的一些组织填充物可以是凝胶，例如水凝胶，并且可以包含吸收、截留或以其他方式设置在其中的水。
在一些实施方案中，交联的丝-HA水凝胶是低溶胀水凝胶。在一些实施方案中，交联的丝-HA水凝胶是高溶胀水凝胶。在一些实施方案中，本公开的水凝胶制剂的溶胀度可以通过控制交联度或通过改变HA含量来调节。水凝胶中存在的交联度越高，由于更紧密的水凝胶结构，水凝胶的溶胀度越低。水凝胶中存在的HA含量越多，由于HA结构中存在更多的羟基(-OH)，溶胀程度越高。
在一个实施方案中，本公开的组织填充物中的水含量重量百分比为1％至95％。在一个实施方案中，本文所述的组织填充物中的水含量重量百分比为至少1％、或至少2％、或至少3％、或至少4％、或至少5％、或至少6％、或至少7％、或至少8％、或至少9％、或至少10％、或至少11％、或至少12％、或至少13％、或至少14％、或至少15％、或至少16％、或至少17％、或至少18％、或至少19％、或至少20％、或至少21％、或至少22％、或至少23％、或至少24％、或至少25％、或至少26％、或至少27％、或至少28％、或至少29％、或至少30％、或至少31％、或至少32％、或至少33％、或至少34％、或至少35％、或至少36％、或至少37％、或至少38％、或至少39％、或至少40％、或至少41％、或至少42％、或至少43％、或至少44％、或至少45％、或至少46％、或至少47％、或至少48％、或至少49％、或至少50％、或至少51％、或至少52％、或至少53％、或至少54％、或至少55％、或至少56％、或至少57％、或至少58％、或至少59％、或至少60％、或至少61％、或至少62％、或至少63％、或至少64％、或至少65％、或至少66％、或至少67％、或至少68％、或至少69％、或至少70％、或至少71％、或至少72％、或至少73％、或至少74％、或至少75％、或至少76％、或至少77％、或至少78％、或至少79％、或至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物中的水含量重量百分比为至多1％、或至多2％、或至多3％、或至多4％、或至多5％、或至多6％、或至多7％、或至多8％、或至多9％、或至多10％、或至多11％、或至多12％、或至多13％、或至多14％、或至多15％、或至多16％、或至多17％、或至多18％、或至多19％、或至多20％、或至多21％、或至多22％、或至多23％、或至多24％、或至多25％、或至多26％、或至多27％、或至多28％、或至多29％、或至多30％、或至多31％、或至多32％、或至多33％、或至多34％、或至多35％、或至多36％、或至多37％、或至多38％、或至多39％、或至多40％、或至多41％、或至多42％、或至多43％、或至多44％、或至多45％、或至多46％、或至多47％、或至多48％、或至多49％、或至多50％、或至多51％、或至多52％、或至多53％、或至多54％、或至多55％、或至多56％、或至多57％、或至多58％、或至多59％、或至多60％、或至多61％、或至多62％、或至多63％、或至多64％、或至多65％、或至多66％、或至多67％、或至多68％、或至多69％、或至多70％、或至多71％、或至多72％、或至多73％、或至多74％、或至多75％、或至多76％、或至多77％、或至多78％、或至多79％、或至多80％、或至多81％、或至多82％、或至多83％、或至多84％、或至多85％、或至多86％、或至多87％、或至多88％、或至多89％、或至多90％、或至多91％、或至多92％、或至多93％、或至多94％、或至多95％。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物中的水含量重量百分比为1％至2％、或2％至3％、或3％至4％、或4％至5％、或5％至6％、或6％至7％、或7％至8％、或8％至9％、或9％至10％、或10％至11％、或11％至12％、或12％至13％、或13％至14％、或14％至15％、或15％至16％、或16％或17％、或17％至18％、或18％至19％、或19％至20％、或20％至21％、或21％至22％、或22％至23％、或23％至24％、或24％至25％、或25％至26％、或26％至27％、或27％至28％、或28％至29％、或30％至31％、或31％至32％、或32％至33％、或33％至34％、或34％至35％、或35％至36％、或36％至37％、或37％至38％、或38％至39％、或39％至40％、或40％至41％、或41％至42％、或42％至43％、或43％至44％、或44％至45％、或45％至46％、或46％至47％、或47％至48％、或48％至49％、或49％至50％、或50％至51％、或51％至52％、或52％至53％、或53％至54％、或54％至55％、或55％至56％、或56％至57％、或57％至58％、或58％至59％、或59％至60％、或60％至61％、或61％至62％、或62％至63％、或63％至64％、或64％至65％、或65％至66％、或66％至67％、或67％至68％、或68％至69％、或69％至70％、或70％至71％、或71％至72％、或72％至73％、或73％至74％、或74％至75％、或75％至76％、或76％至77％、或77％至78％、或78％至79％、或79％至80％、或80％至81％、或81％至82％、或82％至83％、或83％至84％、或84％至85％、或85％至86％、或86％至87％、或87％至88％、或88％至89％、或89％至90％、或90％至91％、或91％至92％、或92％至93％、或93％至94％、或94％至95％、或95％至96％、或96％至97％、或97％至98％。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物中的水含量重量百分比为约1％、或约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约8％、或约9％、或约10％、或约11％、或约12％、或约13％、或约14％、或约15％、或约16％、或约17％、或约18％、或约19％、或约20％、或约21％、或约22％、或约23％、或约24％、或约25％、或约26％、或约27％、或约28％、或约29％、或约30％、或约31％、或约32％、或约33％、或约34％、或约35％、或约36％、或约37％、或约38％、或约39％、或约40％、或约41％、或约42％、或约43％、或约44％、或约45％、或约46％、或约47％、或约48％、或约49％、或约50％、或约51％、或约52％、或约53％、或约54％、或约55％、或约56％、或约57％、或约58％、或约59％、或约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％。
机械特性
本文所述的组织填充物或其组分可以以多种物理状态提供，这取决于所选择的治疗和递送模式。在一些实施方案中，本发明的组织填充物是流体，例如液体。在一些实施方案中，本发明的组织填充物是粘性流体。在一些实施方案中，本发明的组织填充物是固体。在一些实施方案中，本发明的组织填充物是弹性固体。
当检查本文所述的组织填充物时，可以评估多种流变性质，如表17中所示：
表17
在一些实施方案中，本发明的组织填充物是粘弹性材料，其表现出弹性和粘性材料的机械特性。在一些实施方案中，本发明的组织填充物可描述为凝胶。用于评估材料的机械或流变性质(例如粘弹性)的方法是本领域已知的，例如描述于美国专利申请公开号2006/0105022和Stocks等，JDrugs.Dermatol.(2011)10:974-980中，其通过引用整体并入本文。材料的粘弹性可以通过使用动态力学分析来表征，例如通过向样品施加振荡应力并测量所得应变。弹性材料通常表现出同相应力和应变，即，施加应力导致立即的应变。在粘性材料中，应变与施加的应力有90度的相位差。在粘弹性材料中，应变和应力之间的相位差大于0度，但小于90度。在一些实施方案中，本发明的SPF材料的粘弹性可通过复数动态模量G来表征，所述复数动态模量G包括储能模量G’(也称为弹性模量)和损耗模量G”(也称为粘性模量)：
G＝G′+iG"
其中i2＝-1，并且/>σ0是应力的幅度，ε0是应变的幅度，并且δ是相移。
弹性模量G’和损耗模量G”通过使SPF凝胶样品在旋转或剪切流变仪中经受振荡应力测量。将样品置于两个板之间，一个板是固定的，并且另一个板能够旋转，或者以给定频率振荡。弹性模量G’和损耗模量G”的值是频率依赖性的。用于测量弹性模量G’和损耗模量G”的频率范围通常为但不限于0.1至10Hz。在一些实施方案中，弹性模量G’和损耗模量G”在1Hz的振荡频率下测量。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物的流变性质，例如G'和G"，可用振荡平行板流变仪测量。可以在各种距离，例如1mm的板之间的间隙高度处使用各种直径，例如25mm的板。测量可以在各种温度下进行。在一些实施方案中，在25℃的恒定温度下执行测量。在一些实施方案中，测量包括在特定应变值下，例如在2％的恒定应变下，在两个频率值之间，例如从1Hz至10Hz的频率扫描。在一些实施方案中，测量包括频率的对数增加，随后是应变扫描，其可以例如在恒定频率下，例如在应变对数增加的情况下为5Hz，在1％至300％之间。在一些实施方案中，储能模量G'和损耗模量G"可从在特定百分比应变值下，例如在1％应变下的应变扫描获得。
在一些实施方案中，复数模量(即G'和iG”的总和)提供了对本文所述的特定组织填充物的总抗变形性的综合量度。复数模量可以使用流变仪测试，其中可以在两个平行的圆板之间挤压特定的组织填充物(例如凝胶)，并且通过以变化的频率旋转一个板来提供可变的旋转应变。
在一些实施方案中，特定组织填充物的特征可通过该组织填充物的弹性百分比来检查，其中弹性百分比等于100×G’/(G’+G”)。
在一些实施方案中，特定组织填充物的特征可通过该组织填充物的恢复系数来检查:
其中：约1的恢复系数是指尽管施加力，但特定组织填充物(例如凝胶)仍保持其结构；大于1的恢复系数是指特定组织填充物(例如凝胶)经历结构破坏；并且小于1的恢复系数的凝胶经历增加的结构性能。
不受本发明的任何理论的限制，增加G'导致材料更好地抵抗形状改变的能力的相对增加，并且材料可以被描述为比具有较低G'的材料(例如，凝胶组织填充物)更坚固、更硬或更有弹性。因此，增加G'可以导致材料提供结构支撑和/或体积化的能力的相应增加。
不受本发明任何一种理论的限制，与具有较低G"的材料相比，增加G"导致更粘的材料(例如凝胶)。此外，对于具有较高G”的材料，存在较大的能量损失(作为耗散热)。在一些实施方案中，G’随着交联度的增加而增加。在一些实施方案中，G”随着交联度的增加而增加。在一些实施方案中，G’和G”都随着交联度的增加而增加。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约小于50Pa至约大于15000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约50Pa至约500,000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约100Pa至约500,000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约75Pa至约150Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约100Pa至约250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约150Pa至约275Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约150Pa至约500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约250Pa至约750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约375Pa至约675Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约425Pa至约850Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约500Pa至约1000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约650Pa至约1050Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约750Pa至约1250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约950Pa至约1500Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少50Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少100Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少150Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少200Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少225Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少275Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少300Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少325Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少350Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少375Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少400Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少425Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少450Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少475Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少500Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少525Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少550Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少575Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约至少Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约625Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少650Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少675Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少700Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少725Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少775Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少800Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少825Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少850Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少875Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少900Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少925Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少950Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少975Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1050Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1100Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1150Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1200Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1300Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1350Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1400Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1450Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少1500Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多50Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多100Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多150Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多200Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多225Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多275Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多300Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多325Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多350Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多375Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多400Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多425Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多450Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多475Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多500Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多525Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多550Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多575Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约625Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多650Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多675Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多700Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多725Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多775Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多800Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多825Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多850Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多875Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多900Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多925Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多950Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多975Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1050Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1100Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1150Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1200Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1300Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1350Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1400Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1450Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多1500Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约50Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约100Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约150Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约200Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约225Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约275Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约300Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约325Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约350Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约375Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约400Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约425Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约450Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约475Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约500Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约525Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约550Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约575Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约600Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约625Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约650Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约675Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约700Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约725Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约775Pa的G’。在一些在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约800Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约825Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约850Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约875Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约900Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约925Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约950Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约975Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1050Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1100Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1150Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1200Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1300Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1350Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1400Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1450Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1500Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少2000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少2250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少2500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少2750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少3000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少3250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少3500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少3750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少4000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少4250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少4500Pa的G’。在一实施方案中，本发明的组织填充物具有至少4750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少5000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少5250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少5500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少5750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约至少6000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约6250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少6500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少6750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少7000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少7250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少7500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少7750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少8000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少8250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少8500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少8750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少9000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少9250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少9500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少9750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少10000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少10500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少11000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少11500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少12000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少12500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少13000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少13500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少14000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少14500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少15000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多2000Pa的G'。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多2250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多2500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多2750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多3000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多3250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多3500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多3750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多4000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多4250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多4500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多4750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多5000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多5250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多5500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多5750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多6000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约6250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多6500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多6750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多7000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多7250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多7500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多7750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多8000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多8250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多8500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多8750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多9000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多9250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多9500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多9750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多10000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多10500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多11000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多11500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多12000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多12500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多13000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多13500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多14000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多14500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多15000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约2000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约2250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约2500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约2750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约3000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约3250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约3500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约3750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约4000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约4250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约4500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约4750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约5000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约5250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约5500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约5750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约6000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约6250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约6500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约6750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约7000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约7250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约7500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约7750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约8000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约8250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约8500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约8750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约9000Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约9250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约9500Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约9750Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约10000Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1050Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1100Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1150Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1200Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1250Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1300Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1350Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1400Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1450Pa的G’。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约1500Pa的G’。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约小于5Pa至约大于200Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约5Pa至约200Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约5Pa至约25Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约15Pa至约35Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约10Pa至约50Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约15Pa至约75Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约20Pa至约85Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约25Pa至约100Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约35Pa至约125Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约45Pa至约115Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约75Pa至约150Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约100Pa至约175Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约115Pa至约200Pa的G”。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少5Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少10Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少15Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少20Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少25Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少30Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少35Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少40Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少45Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少50Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少55Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少60Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少65Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少70Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少75Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少80Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少85Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少90Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少95Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少100Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少105Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少110Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少115Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少120Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少125Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少130Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少135Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少140Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少145Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少150Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少155Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少160Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少165Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少170Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少175Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少180Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少185Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少190Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少195Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至少200Pa的G”。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多5Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多10Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多15Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多20Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多25Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多30Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多35Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多40Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多45Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多50Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多55Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多60Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多65Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多70Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多75Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多80Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多85Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多90Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多95Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多100Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多105Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多110Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多115Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多120Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多125Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多130Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多135Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多140Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多145Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多150Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多155Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多160Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多165Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多170Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多175Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多180Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多185Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多190Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多195Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有至多200Pa的G”。
在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约5Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约10Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约15Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约20Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约25Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约30Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约35Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约40Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约45Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约50Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约55Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约60Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约65Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约70Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约75Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约80Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约85Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约90Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约95Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约100Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约105Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约110Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约115Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约120Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约125Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约130Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约135Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约140Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约145Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约150Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约155Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约160Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约165Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约170Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约175Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约180Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约185Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约190Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约195Pa的G”。在一些实施方案中，本发明的组织填充物具有约200Pa的G”。
在一些实施方案中，本文公开的组织填充物表现出动态粘度。粘度是流体对由剪切应力或拉伸应力引起的剪切或流动的阻力。粘度是流体对由剪切应力或拉伸应力引起的剪切或流动的阻力。粘度描述了当流体层试图彼此滑动时由施加的分子间摩擦引起的流体的流动内部阻力，并且可以被认为是流体摩擦的量度。流体越不粘稠，其运动的容易程度(流动性)越大。
粘度可以以两种方式定义；动态粘度(μ；有时使用η)或运动粘度(v)。动态粘度，也称为绝对或复数粘度，是当通过流体保持分开单位距离时，以单位速度相对于一个水平面移动另一个水平面所需的每单位面积的切向力。动态粘度的SI物理单位是帕斯卡-秒(Pas)，其与Nm-2s相同。动态粘度可以表示为τ＝μdvx/dz，其中τ＝剪切应力，μ＝动态粘度，并且dvx/dz是随时间的速度梯度。例如，如果将粘度为一Pa·s的流体置于两个板之间，并且以一帕斯卡的剪切应力侧向推动一个板，则它在一秒内移动等于板之间的层厚度的距离。运动粘度(v)是动态粘度与密度的比率，其为其中不涉及力的量并且定义如下：v＝μ/ρ，其中μ是动态粘度，并且ρ是密度(kg/m3)。运动粘度通常通过玻璃毛细管粘度计测量，SI单位为m2/s。流体的粘度是温度依赖性的，并且因此动态粘度和运动粘度是参照温度报告的。
在一些实施方案中，本文公开的组织填充物表现出例如至少10Pa·s、至少20Pa·s、至少30Pa·s、至少40Pa·s、至少50Pa·s、至少60Pa·s、至少70Pa·s、至少80Pa·s、至少90Pa·s、至少100Pa·s、至少125Pa·s、至少150Pa·s、至少175Pa·s、至少200Pas、至少225Pa·s、至少250Pa·s、至少275Pa·s、至少300Pa·s、至少400Pa·s、至少500Pa·s、至少600Pa·s、至少700Pa·s、至少750Pa·s、至少800Pa·s、至少900Pa·s、至少1,000Pa·s、至少1,100Pa·s或至少1,200Pa·s的动态粘度。在一些实施方案中，本文公开的组织填充物表现出例如至多10Pa·s、至多20Pa·s、至多30Pa·s、至多40Pa·s、至多50Pa·s、至多60Pa·s、至多70Pa·s、至多80Pa·s、至多90Pa·s、至多100Pa·s、至多125Pa·s、至多150Pa·s、至多175Pa·s、至多200Pa·s、至多225Pa·s、至多250Pa·s、至多275Pa·s、至多300Pa·s、至多400Pa·s、至多500Pa·s、至多600Pa·s、至多700Pa·s、至多750Pa·s、至多800Pa·s、至多900Pa·s或至多1000Pa·s的动态粘度。在一些实施方案中，本文公开的组织填充物表现出例如约10Pa·s至约100Pa·s、约10Pa·s至约150Pa·s、约10Pa·s至约250Pa·s、约50Pa·s至约100Pa·s、约50Pa·s至约150Pa·s、约50Pa·s至约250Pa·s、约100Pa·s至约500Pa·s、约100Pa·s至约750Pa·s、约100Pa·s至约1,000Pa·s、约100Pa·s至约1,200Pa·s、约300Pa·s至约500Pa·s、约300Pa·s至约750Pa·s、约300Pa·s至约1,000Pa·s或约300Pa·s至约1,200Pa·s的动态粘度。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其G’和/或G”至少1天、或至少2天、或至少3天、或至少4天、或至少5天、或至少6天、或至少1周、或至少2周、或至少3周、或至少1个月、或至少2个月、或至少3个月、或至少4个月、或至少5个月、或至少6个月、或至少7个月、或至少8个月、或至少9个月、或至少10个月、或至少11个月、或至少1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其G’和/或G”至多1天、或至多2天、或至多3天、或至多4天、或至多5天、或至多6天、或至多1周、或至多2周、或至多3周、或至多1个月、或至多2个月、或至多3个月、或至多4个月、或至多5个月、或至多6个月、或至多7个月、或至多8个月、或至多9个月、或至多10个月、或至多11个月、或至多1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其G’和/或G”约1天、或约2天、或约3天、或约4天、或约5天、或约6天、或约1周、或约2周、或约3周、或约1个月、或约2个月、或约3个月、或约4个月、或约5个月、或约6个月、或约7个月、或约8个月、或约9个月、或约10个月、或约11个月、或约1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其弹性至少1天、或至少2天、或至少3天、或至少4天、或至少5天、或至少6天、或至少1周、或至少2周、或至少3周、或至少1个月、或至少2个月、或至少3个月、或至少4个月、或至少5个月、或至少6个月、或至少7个月、或至少8个月、或至少9个月、或至少10个月、或至少11个月、或至少1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其弹性至多1天、或至多2天、或至多3天、或至多4天、或至多5天、或至多6天、或至多1周、或至多2周、或至多3周、或至多1个月、或至多2个月、或至多3个月、或至多4个月、或至多5个月、或至多6个月、或至多7个月、或至多8个月、或至多9个月、或至多10个月、或至多11个月、或至多1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其弹性约1天、或约2天、或约3天、或约4天、或约5天、或约6天、或约1周、或约2周、或约3周、或约1个月、或约2个月、或约3个月、或约4个月、或约5个月、或约6个月、或约7个月、或约8个月、或约9个月、或约10个月、或约11个月、或约1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其粘度至少1天、或至少2天、或至少3天、或至少4天、或至少5天、或至少6天、或至少1周、或至少2周、或至少3周、或至少1个月、或至少2个月、或至少3个月、或至少4个月、或至少5个月、或至少6个月、或至少7个月、或至少8个月、或至少9个月、或至少10个月、或至少11个月、或至少1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其粘度至多1天、或至多2天、或至多3天、或至多4天、或至多5天、或至多6天、或至多1周、或至多2周、或至多3周、或至多1个月、或至多2个月、或至多3个月、或至多4个月、或至多5个月、或至多6个月、或至多7个月、或至多8个月、或至多9个月、或至多10个月、或至多11个月、或至多1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其粘度约1天、或约2天、或约3天、或约4天、或约5天、或约6天、或约1周、或约2周、或约3周、或约1个月、或约2个月、或约3个月、或约4个月、或约5个月、或约6个月、或约7个月、或约8个月、或约9个月、或约10个月、或约11个月、或约1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其体积至少1天、或至少2天、或至少3天、或至少4天、或至少5天、或至少6天、或至少1周、或至少2周、或至少3周、或至少1个月、或至少2个月、或至少3个月、或至少4个月、或至少5个月、或至少6个月、或至少7个月、或至少8个月、或至少9个月、或至少10个月、或至少11个月、或至少1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其体积至多1天、或至多2天、或至多3天、或至多4天、或至多5天、或至多6天、或至多1周、或至多2周、或至多3周、或至多1个月、或至多2个月、或至多3个月、或至多4个月、或至多5个月、或至多6个月、或至多7个月、或至多8个月、或至多9个月、或至多10个月、或至多11个月、或至多1年。
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可基本上在体内保持其体积约1天、或约2天、或约3天、或约4天、或约5天、或约6天、或约1周、或约2周、或约3周、或约1个月、或约2个月、或约3个月、或约4个月、或约5个月、或约6个月、或约7个月、或约8个月、或约9个月、或约10个月、或约11个月、或约1年。
制造方法
本文提供的组织填充物可通过将基于SPF的组分与基于HA的组分在有或没有任何额外试剂的情况下组合来制备。在某些实施方案中，SPF和HA中的一者或两者可以在组合之前交联。在一些实施方案中，SPF和HA可以组合，然后用本文所述的交联剂交联。在一些实施方案中，SPF可以用交联剂交联，然后加入到HA中，HA可以是交联的或未交联的，然后其组合可以进行额外的交联。在一些实施方案中，HA可以用交联剂交联，然后加入到SPF中，HA可以是交联的或未交联的，然后其组合可以进行额外的交联。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可通过将基于SPF的组分和基于HA的组分和如上文所述额外的试剂组合来制备。在这样的实施方案中，SPF和HA中的一者或两者可以在组合之前交联。在一些实施方案中，SPF和HA可以与额外的试剂组合，然后用本文所述的交联剂交联。在一些实施方案中，可以在组合SPF和HA后加入额外的试剂。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可包含重量比(SPF:HA)为0.1:1至0.1:10、或0.1:1至0.1:100、或0.1:1000；1:1至1:10、或1:1至1:100、或1:1至1:1000的SPF和HA。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可包含重量比(HA:SPF)为0.1:1至0.1:10、或0.1:1至0.1:100、或0.1:1000；1:1至1:10、或1:1至1:100、或1:1至1:1000的SPF和HA。
在一些实施方案中，所得HA/SPF组合(无论交联的还是未交联的)可以被均化，例如通过初始交联HA和/或SPF的机械共混。
在一些实施方案中，可以提供SPF溶液，并用交联剂交联以产生交联SPF，可以向其中加入交联形式、非交联形式或其混合物的HA。然后可将所得混合物均化，并可加入任何额外的试剂(例如可加入利多卡因)。
在一些实施方案中，可以提供SPF溶液，并在HA的存在下用交联剂交联，以产生交联SPF-HA组合物，可以向其中加入或不加入非交联形式的HA。然后可将所得混合物均化，并可加入任何额外的试剂(例如可加入利多卡因)。
在一些实施方案中，本文提供的特定SPF制剂可以与HA组合，或者可以利用交联程序，使用美国专利号8,288,347或8,450,475或美国专利申请公开号2006/0105022、2016/0376382或2017/0315828中所述的制剂，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的方法可包括灭菌步骤，其中组织填充物或其一部分暴露于例如120℃至约130℃的温度和约12至约20磅/平方英寸的压力下约1至约15分钟的时间。
在一些实施方案中，本文所述的方法可包括脱气步骤，其中对本文所述的用于制备所得组织填充物的SPF、HA或SPF/HA溶液进行脱气。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可根据实施例5至20中所述的一般方法制备。在其中描述的方法中，丝可以在水溶液、水/醇溶液中制备，其中醇可以是例如乙醇或甲醇。在其中描述的方法中，如本领域普通技术人员所理解的，本文描述的任何交联剂可在适用时用于SPF至SPF、SPF至HA或HA至HA的交联。
治疗方法
在一个实施方案中，本文所述的组织填充物可在治疗有需要的患者中的一种或多种病况的方法中提供。在一些实施方案中，可将治疗有效量的组织填充物递送到有需要的患者的组织中以处理病况或其他组织缺陷。
如本文所用，术语"治疗或处理"是指减少或消除患者中的病况如软组织病况的美容或临床症状，或延迟或预防个体中的病况的美容或临床症状的发作。
在一些实施方案中，由本文所述的组织填充物治疗的病况可包括软组织病况。软组织病况包括但不限于身体部分、区域或部位的增大、重建、疾病、病症、缺陷或瑕疵。在一个方面，由所公开的组织填充物治疗的软组织病况包括但不限于面部增大、面部重建、面部疾病、面部病症、面部缺陷或面部瑕疵。在一些实施方案中，由本文所述的组织填充物治疗的软组织病况包括但不限于皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹或皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、脸颊凹陷、太阳穴凹陷、薄唇、尿道缺损、皮肤缺损、乳房缺损、后眼窝缺陷、面部褶皱或皱纹。在一些实施方案中，由本文所述的组织填充物治疗的软组织病况包括但不限于乳房缺陷、缺损、疾病和/或病症，例如隆乳、乳房重建、乳房固定、微乳、胸发育不全、Poland综合征、由于植入物并发症如囊收缩和/或破裂引起的缺陷；面部缺陷、缺损、疾病或病症，例如面部增大、面部重建、Parry-Romberg综合征、深部红斑狼疮、真皮起皮、脸颊凹陷、太阳穴凹陷、唇薄、鼻部缺陷或缺损、后眼窝缺陷或缺损、面部褶皱、线条和/或皱纹如眉间皱纹、鼻唇线、口周线和/或木偶纹，和/或面部的其他轮廓畸形或缺陷；颈部缺陷、缺损、疾病或病症；皮肤缺陷、缺损、疾病和/或病症；其他软组织缺陷、缺损、疾病和/或病症，例如上臂、下臂、手、肩、背、躯干包括腹部、臀部、大腿、小腿包括小腿、足包括足底脂肪垫、眼、生殖器或其他身体部分、区域或部位的增大或重建，或影响这些身体部分、区域或部位的疾病或病症；尿失禁、大便失禁、其他形式的失禁；和胃食管反流病(GERD)。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可递送至软组织，包括但不限于皮肤、真皮组织、皮下组织、皮肤组织、皮下组织、硬膜内组织、肌肉、腱、韧带、纤维组织、脂肪、血管和动脉、神经和滑膜(皮内)组织。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可直接置于伤口中，通过提供人造可生物降解的基质以及细胞附着、迁移和增殖信号来帮助愈合。在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可涂覆在可生物降解的网状物或其他植入材料上，或者其本身可形成片材或其他结构，或者可保持为水合形式。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法所用的组合物的量将基于期望的改变和/或改善、期望的病况症状的减轻和/或消除、个体和/或医师期望的临床和/或美容效果以及待处理的身体部分或区域来确定。组合物施用的有效性可以通过以下临床和/或美容措施中的一种或多种来表现：改变和/或改善的软组织形状、改变和/或改善的软组织大小、改变和/或改善的软组织轮廓、改变和/或改善的组织功能、组织向内生长支持和/或新胶原沉积、组织填充物的持续植入、改善的患者满意度和/或生活质量、以及减少的可植入外来材料的使用。例如，对于隆乳手术，组合物和方法的有效性可以通过以下临床和/或美容措施中的一种或多种来表现：乳房尺寸增加、乳房形状改变、乳房轮廓改变、持续植入、囊收缩风险降低、脂肪坏死囊肿形成速率降低、患者满意度和/或生活质量改善以及乳房植入物的使用减少。
在一些实施方案中，组织填充物和方法在治疗面部软组织中的有效性可通过以下临床和/或美容措施中的一种或多种来表现：面部特征的尺寸、形状和/或轮廓增加，如唇、脸颊、太阳穴或眼部区域的尺寸、形状和/或轮廓增加；面部特征的尺寸、形状和/或轮廓改变，如唇、脸颊、太阳穴或眼部形状的尺寸、形状和/或轮廓改变；减少或消除皮肤中的皱纹、褶皱或纹路；皮肤抗皱、抗褶皱或抗起纹；皮肤的再水化；增加皮肤的弹性；皮肤粗糙的减少或消除；增加和/或改善的皮肤紧致度；减少或消除拉伸纹或拉伸痕；增加和/或改善的肤色、光泽、亮度和/或光彩；增加和/或改善肤色，减少或消除皮肤苍白；组合物的持续植入；副作用降低；改善的患者满意度和/或生活质量。
在一些实施方案中，本发明提供了组织填充物和涉及真皮区域的处理方法。如本文所用，术语"真皮区域"是指包括表皮-真皮接点的皮肤区域和包括浅层真皮(乳头区)和深层真皮(网状区)的真皮。皮肤由三个主要层组成：表皮，其提供防水并且充当针对感染的屏障；真皮，其用作皮肤的附属物的位置；和下皮(皮下脂肪层)。表皮不含血管，并且通过从真皮扩散而被滋养。构成表皮的细胞的主要类型是角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)和梅克尔斯细胞(Merkels cell)。
真皮是表皮下的皮肤层，其由结缔组织组成并缓冲身体免受应力和应变。真皮通过基材膜与表皮紧密连接。它还具有许多提供触觉和热感的机械性刺激感受器/神经末梢。它含有毛囊、汗腺、皮脂腺、顶泌腺、淋巴管和血管。真皮中的血管提供营养，并从其自身细胞以及表皮的基材层中去除废物。真皮在结构上被分成两个区域：与表皮相邻的浅表区域，称为乳头区，和称为网状区的较厚的深区域。
乳头区由疏松的蜂窝结缔组织组成。其由于其向表皮延伸的称为乳突的指状突起而命名。乳头为真皮提供与表皮交错的“凹凸”表面，从而加强两层皮肤之间的连接。网状区位于乳头区域深处，并且通常厚得多。它由致密的不规则结缔组织组成，并且由编织贯穿它的胶原、弹性和网状纤维的致密集中而命名。这些蛋白纤维赋予真皮其强度、延展性和弹性的特性。位于网状区域内的还有毛发的根、皮脂腺、汗腺、受体、指甲和血管。妊娠纹例如位于真皮中。
下皮位于真皮下方。其目的是将皮肤的真皮区域附着到下面的骨骼和肌肉上，并为其提供血管和神经。它由疏松结缔组织和弹性蛋白组成。主要的细胞类型是成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞(下皮含有身体脂肪的50％)。脂肪用作身体的衬垫和隔离物。
在一些实施方案中，本文公开的组织填充物通过注射到真皮区域或皮下区域中而施用于个体的皮肤区域。在一些实施方案中，本文公开的组织填充物通过注射至例如表皮-真皮接点区、乳头区、网状区或它们的任何组合中而施用于个体的真皮区域。
在一些实施方案中，本发明提供治疗个体的软组织病况的方法，包括将本文公开的一种或多种组织填充物施用于个体的软组织病况的部位，其中组合物的施用改善软组织病况，从而治疗软组织病况。在一些实施方案中，软组织病况是乳房组织病况、面部组织病况、颈部病况、皮肤病况、上臂病况、下臂病况、手病况、肩部病况、背部病况、躯干包括腹部病况、臀部病况、大腿病况、小腿病况包括小腿病况、足部病况包括足底脂肪垫病况、眼睛病况、生殖器病况、或影响另一身体部分、区域或部位的病况。
在一些实施方案中，本发明提供治疗皮肤病况的方法，包括向患有皮肤病况的个体施用本文公开的一种或多种组织填充物，其中组织填充物的施用改善皮肤病况，从而治疗皮肤病况。在一些实施方案中，皮肤病况包括皮肤脱水，并且治疗方法包括向患有皮肤脱水的个体施用本文公开的一种或多种组织填充物，其中施用组织填充物使皮肤再水合，从而治疗皮肤脱水。在这些实施方案的另一方面，治疗皮肤缺乏弹性的方法包括对患有皮肤缺乏弹性的个体施用本文公开的组织填充物，其中组织填充物的施用增加皮肤的弹性，从而治疗皮肤缺乏弹性。在这些实施方案的另一方面，治疗皮肤粗糙的方法包括向患有皮肤粗糙的个体施用本文公开的组合物，其中所述组合物的施用降低皮肤粗糙，从而治疗皮肤粗糙。在一些实施方案中，治疗皮肤缺乏紧致度的方法包括向患有皮肤缺乏紧致度的个体施用本文公开的组织填充物，其中组织填充物的施用使皮肤紧致，从而治疗皮肤缺乏紧致度。
在一些实施方案中，本发明提供治疗皮肤拉伸纹或皮肤拉伸痕的方法，包括向患有皮肤拉伸纹或皮肤拉伸痕的个体施用本文公开的一种或多种组织填充物，其中所述一种或多种组织填充物的施用减少或消除所述皮肤拉伸纹或皮肤拉伸痕，从而治疗皮肤拉伸纹或皮肤拉伸痕。在一些实施方案中，治疗皮肤苍白的方法包括向患有皮肤苍白的个体施用本文公开的组织填充物，其中所述组织填充物的施用增加肤色或光泽，从而治疗皮肤苍白。在一些实施方案中，治疗皮肤皱纹的方法包括向患有皮肤皱纹的个体施用本文公开的组织填充物，其中组织填充物的施用减少或消除皮肤皱纹，从而治疗皮肤皱纹。在这些实施方案的另一方面，治疗皮肤皱纹的方法包括向个体施用本文公开的组织填充物，其中组织填充物的施用使得皮肤抵抗皮肤皱纹，从而治疗皮肤皱纹。
在一些实施方案中，本发明提供了本文公开的组合物的施用，其中这样的施用促进新胶原沉积或形成。本文所述的组织填充物可支持组织向内生长和胶原的新沉积或形成。
不受本发明的任何一种理论的限制，可以调节本文所述的组织填充物制备中所用SPF的分子量以在所选组织处提供温和的炎症应答，以便通过初始炎症应答之后所产生的组织增殖和成熟应答来触发胶原的沉积或形成。实际上，较高分子量的SPF可导致增加的炎症应答，而较低分子量的SPF可导致很少的炎症应答或不导致炎症应答。
不受本发明的任何一种理论的限制，本文所述的组织填充物提供了出乎意料的属性，即，由于本文所用的SPF溶液具有窄而非宽的多分散性，因此可以调节所产生的炎症应答，并由此调节通过增殖和成熟组织应答的胶原形成。在一个实施方案中，施用本文公开的组织填充物增加了新胶原沉积。
在一些实施方案中，相对于含有HA但缺少SPF的相同或相似的组织填充物，施用本文公开的组织填充物使新胶原沉积或形成增加约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
在一些实施方案中，相对于含有HA但缺少SPF的相同或相似的组织填充物，施用本文公开的组织填充物使新胶原沉积或形成增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、或至少300％。
在一些实施方案中，相对于含有HA但缺少SPF的相同或相似的组织填充物，施用本文公开的组织填充物使新胶原沉积或形成增加至多1％、至多2％、至多3％、至多4％、至多5％、至多6％、至多7％、至多8％、至多9％、至多10％、至多11％、至多12％、至多13％、至多14％、至多15％、至多16％、至多17％、至多18％、至多19％、至多20％、至多21％、至多22％、至多23％、至多24％、至多25％、至多26％、至多27％、至多28％、至多29％、至多30％、至多31％、至多32％、至多33％、至多34％、至多35％、至多36％、至多37％、至多38％、至多39％、至多40％、至多41％、至多42％、至多43％、至多44％、至多45％、至多46％、至多47％、至多48％、至多49％、至多50％、至多51％、至多52％、至多53％、至多54％、至多55％、至多56％、至多57％、至多58％、至多59％、至多60％、至多61％、至多62％、至多63％、至多64％、至多65％、至多66％、至多67％、至多68％、至多69％、至多70％、至多71％、至多72％、至多73％、至多74％、至多75％、至多76％、至多77％、至多78％、至多79％、至多80％、至多81％、至多82％、至多83％、至多84％、至多85％、至多86％、至多87％、至多88％、至多89％、至多90％、至多91％、至多92％、至多93％、至多94％、至多95％、至多96％、至多97％、至多98％、至多99％、至多100％、至多125％、至多150％、至多175％、至多200％、至多225％、至多250％、至多275％、或至多300％。
在一些实施方案中，相对于含有HA但缺少SPF的相同或相似的组织填充物，施用本文公开的组织填充物使新胶原沉积或形成增加约1％至约10％、约10％至约50％、约10％至约100％、约50％至约150％、约100％至约200％、约150％至约250％、约200％至约300％、约350％至约450％、约400％至约500％、约550％至约650％、约600％至约700％。
在一些实施方案中，用于本文公开的任何方法的组织填充物的量通常将是治疗有效量。如本文所用，术语"治疗有效量"与"有效量"、"治疗有效剂量"和/或"有效剂量"同义，并且是指将在有需要的患者中引起预期的生物、美容或临床应答的组织填充物的量。作为非限制性实例，有效量是足以实现本文公开的一种或多种临床和/或美容措施的量。对于所公开方法的特定应用，施用的适当有效量可由本领域技术人员使用本文提供的指导来确定。例如，有效量可以从本文所述的任何和所有体外和体内测定推断。本领域技术人员将认识到，可以在整个治疗过程中监测个体的病况，并且可以相应地调整施用的本文公开的组合物的有效量。
在一些实施方案中，施用的组织填充物的量为至少0.001g、或至少0.002g、或至少0.003g、或至少0.004g、或至少0.005g、或至少0.006g、或至少0.007g、或至少0.008g、或至少0.009g、或至少0.01g、或至少0.02g、或至少0.03g、或至少0.04g、或至少0.05g、或至少0.06g、或至少0.07g、或至少0.08g、或至少0.09g、或至少0.1g、或至少0.2g、或至少0.3g、或至少0.4g、或至少0.5g、或至少0.6g、或至少0.7g、或至少0.8g、或至少0.9g、或至少1g、或至少2g、或至少3g、或至少4g、或至少5g、或至少6g、或至少7g、或至少8g、或至少9g、或至少10g、或至少11g、或至少12g、或至少13g、或至少14g、或至少15g、或至少20g、或至少25g、或至少30g、或至少35g、或至少40g、或至少45g、或至少50g、或至少55g、或至少60g、或至少65g、或至少70g、或至少75g、或至少80g、或至少85g、或至少90g、或至少95g、或至少100g。
在一些实施方案中，施用的组织填充物的量为至多0.001g、或至多0.002g、或至多0.003g、或至多0.004g、或至多0.005g、或至多0.006g、或至多0.007g、或至多0.008g、或至多0.009g、或至多0.01g、或至多0.02g、或至多0.03g、或至多0.04g、或至多0.05g、或至多0.06g、或至多0.07g、或至多0.08g、或至多0.09g、或至多0.1g、或至多0.2g、或至多0.3g、或至多0.4g、或至多0.5g、或至多0.6g、或至多0.7g、或至多0.8g、或至多0.9g、或至多1g、或至多2g、或至多3g、或至多4g、或至多5g、或至多6g、或至多7g、或至多8g、或至多9g、或至多10g、或至多11g、或至多12g、或至多13g、或至多14g、或至多15g、或至多20g、或至多25g、或至多30g、或至多35g、或至多40g、或至多45g、或至多50g、或至多55g、或至多60g、或至多65g、或至多70g、或至多75g、或至多80g、或至多85g、或至多90g、或至多95g、或至多100g。
在一些实施方案中，施用的组织填充物的量为约0.001g、或约0.002g、或约0.003g、或约0.004g、或约0.005g、或约0.006g、或约0.007g、或约0.008g、或约0.009g、或约0.01g、或约0.02g、或约0.03g、或约0.04g、或约0.05g、或约0.06g、或约0.07g、或约0.08g、或约0.09g、或约0.1g、或约0.2g、或约0.3g、或约0.4g、或约0.5g、或约0.6g、或约0.7g、或约0.8g、或约0.9g、或约1g、或约2g、或约3g、或约4g、或约5g、或约6g、或约7g、或约8g、或约9g、或约10g、或约11g、或约12g、或约13g、或约14g、或约15g、或约20g、或约25g、或约30g、或约35g、或约40g、或约45g、或约50g、或约55g、或约60g、或约65g、或约70g、或约75g、或约80g、或约85g、或约90g、或约95g、或约100g。
在一些实施方案中，施用的组织填充物的量为0.001g至0.01g、或0.01g至0.1g、或0.1g至1g、或1g至10g、或10g至20g、或20g至30g、或30g至40g、或40g至50g、或50g至60g、或60g至70g、或70g至80g、或80g至90g、或90g至100g。
在一些实施方案中，施用的组织填充物的体积为至少0.01mL、或至少0.02mL、或至少0.03mL、或至少0.04mL、或至少0.05mL、或至少0.06mL、或至少0.07mL、或至少0.08mL、或至少0.09mL、或至少0.10mL、或至少0.15mL、或至少0.20mL、或至少0.25mL、或至少0.30mL、或至少0.35mL、或至少0.40mL、或至少0.45mL、或至少0.50mL、或至少0.55mL、或至少0.60mL、或至少0.65mL、或至少0.70mL、或至少0.75mL、或至少0.80mL、或至少0.85mL、或至少0.90mL、或至少0.95mL、或至少1mL、或至少2mL、或至少3mL、或至少4mL、或至少5mL、或至少6mL、或至少7mL、或至少8mL、或至少9mL、或至少10mL、或至少15mL、或至少20mL、或至少25mL、或至少30mL、或至少35mL、或至少40mL、或至少45mL、或至少50mL、或至少55mL、或至少60mL、或至少65mL、或至少70mL、或至少75mL、或至少80mL、或至少85mL、或至少90mL、或至少95mL、或至少100mL、或至少110mL、或至少120mL、或至少130mL、或至少140mL、或至少150mL、或至少160mL、或至少170mL、或至少180mL、或至少190mL、或至少200mL、或至少210mL、或至少220mL、或至少230mL、或至少240mL、或至少250mL、或至少260mL、或至少270mL、或至少280mL、或至少290mL、或至少300mL、或至少325,350mL、或至少375mL、或至少400mL、或至少425mL、或至少450mL、或至少475mL、或至少500mL、或至少525mL、或至少550mL、或至少575mL、或至少600mL、或至少625mL、或至少650mL、或至少675mL、或至少700mL、或至少725mL、或至少750mL、或至少775mL、或至少800mL、或至少825mL、或至少850mL、或至少875mL、或至少900mL、或至少925mL、或至少950mL、或至少975mL、或至少1000mL。
在一些实施方案中，施用的组织填充物的体积为至多0.01mL、或至多0.02mL、或至多0.03mL、或至多0.04mL、或至多0.05mL、或至多0.06mL、或至多0.07mL、或至多0.08mL、或至多0.09mL、或至多0.10mL、或至多0.15mL、或至多0.20mL、或至多0.25mL、或至多0.30mL、或至多0.35mL、或至多0.40mL、或至多0.45mL、或至多0.50mL、或至多0.55mL、或至多0.60mL、或至多0.65mL、或至多0.70mL、或至多0.75mL、或至多0.80mL、或至多0.85mL、或至多0.90mL、或至多0.95mL、或至多1mL、或至多2mL、或至多3mL、或至多4mL、或至多5mL、或至多6mL、或至多7mL,or at most,8mL、或至多9mL、或至多10mL、或至多15mL、或至多20mL、或至多25mL、或至多30mL、或至多35mL、或至多40mL、或至多45mL、或至多50mL、或至多55mL、或至多60mL、或至多65mL、或至多70mL、或至多75mL、或至多80mL、或至多85mL、或至多90mL、或至多95mL、或至多100mL、或至多110mL、或至多120mL、或至多130mL、或至多140mL、或至多150mL、或至多160mL、或至多170mL、或至多180mL、或至多190mL、或至多200mL、或至多210mL、或至多220mL、或至多230mL、或至多240mL、或至多250mL、或至多260mL、或至多270mL、或至多280mL、或至多290mL、或至多300mL、或至多325,350mL、或至多375mL、或至多400mL、或至多425mL、或至多450mL、或至多475mL、或至多500mL、或至多525mL、或至多550mL、或至多575mL、或至多600mL、或至多625mL、或至多650mL、或至多675mL、或至多700mL、或至多725mL、或至多750mL、或至多775mL、或至多800mL、或至多825mL、或至多850mL、或至多875mL、或至多900mL、或至多925mL、或至多950mL、或至多975mL、或至多1000mL。
在一些实施方案中，施用的组织填充物的体积为约0.01mL、或约0.02mL、或约0.03mL、或约0.04mL、或约0.05mL、或约0.06mL、或约0.07mL、或约0.08mL、或约0.09mL、或约0.10mL、或约0.15mL、或约0.20mL、或约0.25mL、或约0.30mL、或约0.35mL、或约0.40mL、或约0.45mL、或约0.50mL、或约0.55mL、或约0.60mL、或约0.65mL、或约0.70mL、或约0.75mL、或约0.80mL、或约0.85mL、或约0.90mL、或约0.95mL、或约1mL、或约2mL、或约3mL、或约4mL、或约5mL、或约6mL、或约7mL、或约8mL、或约9mL、或约10mL、或约11mL、或约12mL、或约13mL、或约14mL、或约15mL、或约16mL、或约17mL、或约18mL、或约19mL、或约20mL、或约21mL、或约22mL、或约23mL、或约24mL、或约25mL、或约26mL、或约27mL、或约28mL、或约30mL、或约35mL、或约36mL、或约37mL、或约38mL、或约39mL、或约40mL、或约41mL、或约42mL、或约43mL、或约44mL、或约45mL、或约46mL、或约47mL、或约48mL、或约49mL、或约50mL、或约51mL、或约52mL、或约53mL、或约54mL、或约55mL、或约56mL、或约57mL、或约58mL、或约59mL、或约60mL、或约61mL、或约62mL、或约63mL、或约64mL、或约65mL、或约66mL、或约67mL、或约68mL、或约69mL、或约70mL、或约71mL、或约72mL、或约73mL、或约74mL、或约75mL、或约76mL、或约77mL、或约78mL、或约79mL、或约80mL、或约81mL、或约82mL、或约83mL、或约84mL、或约85mL、或约86mL、或约87mL、或约88mL、或约89mL、或约90mL、或约91mL、或约92mL、或约93mL、或约94mL、或约95mL、或约96mL、或约97mL、或约98mL、或约99mL、或约100mL、或约110mL、或约120mL、或约130mL、或约140mL、或约150mL、或约160mL、或约170mL、或约180mL、或约190mL、或约200mL、或约210mL、或约220mL、或约230mL、或约240mL、或约250mL、或约260mL、或约270mL、或约280mL、或约290mL、或约300mL、或约310mL、或约320mL、或约330mL、或约340mL、或约350mL、或约360mL、或约370mL、或约380mL、或约390mL、或约400mL、或约410mL、或约420mL、或约430mL、或约440mL、或约450mL、或约460mL、或约470mL、或约480mL、或约490mL、或约500mL、或约510mL、或约520mL、或约530mL、或约540mL、或约550mL、或约560mL、或约570mL、或约580mL、或约590mL、或约600mL、或约610mL、或约620mL、或约630mL、或约640mL、或约650mL、或约660mL、或约670mL、或约680mL、或约690mL、或约700mL、或约710mL、或约720mL、或约730mL、或约740mL、或约750mL、或约760mL、或约770mL、或约780mL、或约790mL、或约800mL、或约810mL、或约820mL、或约830mL、或约840mL、或约850mL、或约860mL、或约870mL、或约880mL、或约890mL、或约900mL、或约910mL、或约920mL、或约930mL、或约940mL、或约950mL、或约960mL、或约970mL、或约980mL、或约990mL、或约1000mL。
在一些实施方案中，施用的组织填充物的体积为0.01mL至0.10mL、或0.10mL至1mL、或1mL至10mL、或10mL至100mL、或50mL至100mL、或100mL至150mL、或150mL至200mL、或200mL至250mL、或250mL至300mL、或300mL至350mL、或350mL至400mL、或400mL至450mL、或450mL至500mL、或500mL至550mL、或550mL至600mL、或600mL至650mL、或650mL至700mL、或700mL至750mL、或750mL至800mL、或800mL至850mL、或850mL至900mL、或900mL至950mL、或950mL至1000mL、或1mL至25mL、或1mL至50mL、或1mL至75mL、或1mL至100mL、或10mL至25mL、或10mL 50mL、或10mL至75mL、或100mL至250mL、或100mL至500mL、或100mL至750mL、或100mL至1000mL。
在一些实施方案中，本发明提供了施用本文公开的组织填充物。如本文所用，术语“施用”是指向个体提供本文公开的组织填充物的任何递送机制，其潜在地导致临床、治疗或实验上有益的结果。用于将组织填充物施用于个体的实际递送机制可由本领域普通技术人员通过考虑以下因素来确定，所述因素包括但不限于病况类型、病况位置、病况原因、病况严重性、期望的缓解程度、期望的缓解持续时间、所用特定组织填充物、所用特定组织填充物的可生物降解性速率、生物吸收性速率、生物再吸收性速率等、所用特定组织填充物中所包含的组分的性质、特定施用途径、患者的特定特征、历史和风险因素，例如年龄、体重、总体健康状况等或它们的任何组合。在该实施方案的一个方面，本文公开的组织填充物通过注射施用于患者的区域，其中该区域可以在皮肤、真皮组织、皮下组织、皮肤组织、皮下组织、硬膜内组织、肌肉、腱、韧带、纤维组织、脂肪、血管和动脉、神经或滑膜(皮内)组织中。
在一些实施方案中，施用于患者的组织填充物的施用途径将基于患者和/或医师以及所治疗的身体部位或区域期望的美容和/或临床效果来确定。本文公开的组织填充物可通过本领域普通技术人员已知的任何方式施用，包括但不限于带针注射器、导管、局部施用或通过直接手术植入。本文公开的组织填充物可施用于皮肤区域，例如真皮区域或皮下区域。此外，本文公开的组织填充物可根据具体治疗的需要施用一次、两次、三次或多次。
在一些实施方案中，本文公开的组织填充物是可注射的。如本文所用，术语“可注射的”是指具有使用具有针例如细针的注射装置将组织填充物施用于个体的皮肤区域中所必需的特性的组织材料。如本文所用，术语“细针”是指27号或更小的针。在一些实施方案中，细针可以是27号至30号针。本文公开的组织填充物的可注射性可通过改变本文公开的组织填充物的某些参数来实现，例如通过调节交联度，或者改变G'和/或G"参数，加入非交联聚合物(例如SPF或HA)等。
在一些实施方案中，本文公开的组织填充物可通过细针注射。在一些实施方案中，本文公开的组织填充物可通过例如20号、或21号、或22号、或23号、或24号、或25号、或26号、或27号、或28号、或29号、或30号、或31号、或32号、或33号、或34号的针注射。在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可通过20号、或21号、或22号、或23号、或24号、或25号、或26号、或27号、或28号、或29号、或30号针注射。
在一些实施方案中，本文公开的组织填充物可用体积为约0.8mL至约1.0mL的注射器注射。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可递送至软组织中或周围的空隙空间，以用于例如组织增大(例如，乳房或臀部增大)的目的。当将本文所述的组织填充物递送至此类空隙空间时，可使用较大的注射器和针(例如，27号或更大的针)。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可在不使用针的情况下施用于伤口，以便涂覆伤口或邻近伤口的医疗装置。
在一些实施方案中，本文所述的组织填充物可应用于医疗装置的表面。
在一个方面，本公开包括治疗或预防通过向有需要的受试者施用治疗而缓解的病症、疾病或病况的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用本公开的组合物。在一些实施方案中，将组合物注射到组织中。在一些实施方案中，所述组合物包含本发明的组织填充物。在一些实施方案中，所述组合物通过如本文所述的注射施用。
在一些实施方案中，组织与可通过施用而缓解的病症、疾病或病况相关，如本领域普通技术人员将理解的。例如，当将本公开的组合物施用于组织中实现对病症、疾病或病况的缓解、治疗、预防或改善时，接受诸如放射、冷冻治疗或药物治疗的治疗的组织可能与病症、疾病或病况相关。
本公开考虑了任何类型的组织。组织是广义的术语，其涵盖身体的一部分：例如肿瘤组织、细胞群、细胞群、间质、器官的一部分或身体的解剖部分，例如直肠、卵巢、前列腺等。疾病、病症、病况的非限制性实例包括宫颈癌、直肠癌、肺肿瘤、纵隔淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、胰腺癌、头颈癌、肺癌、肝癌、阴道癌、良性前列腺增生(BPH)、月经过多、子宫肌瘤腺癌。热/热消融(射频或微波)；和药物治疗(局部)如酒精组织消融使用NaCl晶体或高渗性溶液或高渗性消融、神经、软骨、骨、脑或其部分。参见例如US 8257723，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，组织是器官。在一些实施方案中，组织是器官的一部分。组织的非限制性实例包括尿道、尿道括约肌、食管下端括约肌、膈、直肠、声带和喉。
在一些实施方案中，将组合物施用于直肠壁的一定区域中。在一些实施方案中，该直肠壁区域在肛门括约肌附近。在一些实施方案中，将组合物施用于内括约肌壁中。在一些实施方案中，将组合物施用于内括约肌中。
本公开考虑了可以使用本公开的组合物来缓解、治疗、预防或改善的任何病症、疾病或病况。在一些实施方案中，病症、疾病或病况是妇科相关的、泌尿相关的、胃肠相关的或癌症相关的。病症、疾病或病况的非限制性实例包括尿失禁、胃食管反流病(GERD)、膀胱输尿管反流、大便失禁、牙组织缺陷、声带组织缺陷、喉缺陷和其他非真皮软组织缺陷。
在一些实施方案中，在将组合物引入体内后，组合物可在原位保持一天至十二个月。在一些实施方案中，所述组合物可在原位保持其他时间段，包括从一周至三个月以及两周至八周。在一些实施方案中，本文所述的组合物可在植入后少于约两个月内生物降解。在一些实施方案中，通过生物降解在受试者中去除组合物。
在一个方面，本公开描述了组织减积的方法。在一个非限制性实例中，用本公开的可生物降解的组合物膨胀的组织可以通过使组合物降解来减小体积。在一个方面，本文所述的方法还包括组织减积步骤。在一些实施方案中，减积步骤包括向受试者施用引起生物降解的组合物。在一些实施方案中，所述组合物引起水解、蛋白水解、酶降解、体内细胞作用或它们的组合。在一些实施方案中，减积步骤包括向受试者施用包含酶的组合物。在一些实施方案中，酶是透明质酸酶。
在本公开的一个方面，本文所述的组合物是不透射线的。如本文所用，术语“不透射线的”用于描述对X射线或其他形式的辐射不透明的材料。在一些实施方案中，所述组合物对组织的保护是通过阻断对另一组织施用的辐射来实现。在一些实施方案中，组合物阻断约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的辐射。在一些实施方案中，组织接受比其在不存在本文所述的组合物的情况下将接受的辐射少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的辐射。
本领域普通技术人员可以理解，在本文所述方法中施用的组合物体积取决于待治疗组织和待相互分离组织的构型。在许多情况下，约20立方厘米(cc's或mls)的体积是合适的。
在一些实施方案中，是用于将本文所述的组合物引入体内的试剂盒。该试剂盒可以包括组合物和用于将填充物递送至身体的装置。实施方案包括试剂盒，其中递送装置是注射器，并且其他实施方案包括用于注射器的针，并且可以包括用于施用组合物和/或麻醉剂的针。
以下条款描述了某些实施方案。
条款1a.一种生物相容性组织填充物，其包含丝心蛋白或丝心蛋白片段、透明质酸(HA)以及聚乙二醇(PEG)和/或聚丙二醇(PPG)，其中所述HA的一部分通过一个或多个连接剂部分而被改性或交联，所述一个或多个连接剂部分包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和仲醇中的一种或多种。条款1b.一种生物相容性组合物，其包含丝心蛋白或丝心蛋白片段、透明质酸(HA)以及聚乙二醇(PEG)和/或聚丙二醇(PPG)，其中所述HA的一部分通过一个或多个连接剂部分而被改性或交联，所述一个或多个连接剂部分包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和仲醇中的一种或多种，并且其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分是游离的和/或未交联的。
条款2.根据条款1所述的填充物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分被改性或交联。
条款3.根据条款1或2中任一项所述的组合物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分交联至HA。
条款4.根据条款1至3中任一项所述的组合物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分交联至丝心蛋白或丝心蛋白片段。
条款5.根据条款1至4中任一项所述的组织填充物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段基本上不含丝胶蛋白。
条款6a.根据条款1至5中任一项所述的组合物，其中丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分具有选自低分子量、中等分子量和高分子量的平均重均分子量。条款6b.根据条款1至5中任一项所述的组合物，其中丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分具有选自以下的平均重均分子量：约1kDa至约5kDa、约5kDa至约10kDa、约6kDa至约17kDa、约10kDa至约15kDa、约14kDa至约30kDa、约15kDa至约20kDa、约17kDa至约39kDa、约20kDa至约25kDa、约25kDa至约30kDa、约30kDa至约35kDa、约35kDa至约40kDa、约39kDa至约54kDa、约39kDa至约80kDa、约40kDa至约45kDa、约45kDa至约50kDa、约50kDa至约55kDa、约55kDa至约60kDa、约60kDa至约100kDa或约80kDa至约144kDa。
条款7a.根据条款1至6中任一项所述的组合物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的多分散性为1至约5.0。条款7b.根据条款1至6中任一项所述的组合物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的多分散性为1至约1.5、约1.5至约2.0、约2.0至约2.5、约2.5至约3.0、约3.0至约3.5、约3.5至约4.0、约4.0至约4.5或约4.5至约5.0。
条款8.根据条款1至6中任一项所述的组合物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的多分散性为约1.5至约3.0。
条款9a.根据条款1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％的改性度(MoD)。条款9b.根据条款1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％的改性度(MoD)。
条款10.根据条款1至9中任一项所述的组合物，其中使用单环氧-或二环氧-PEG、单缩水甘油基-、二缩水甘油基-或多缩水甘油基-PEG、单缩水甘油基-或二缩水甘油基-PEG、单环氧-或二环氧-PPG、单缩水甘油基-、二缩水甘油基-或多缩水甘油基-PPG、单缩水甘油基-或二缩水甘油基-PPG或它们的任何组合作为交联剂获得改性或交联。
条款11a.根据条款1至10任一项所述的组合物，其还包含利多卡因。条款11b.根据条款1至10中任一项所述的组合物，其还包含浓度为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％的利多卡因。
条款12.根据条款1至11中任一项所述的组合物，其中所述组合物为凝胶或水凝胶。
条款13.根据条款1至12中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL、约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL、约30mg/mL、约31mg/mL、约32mg/mL、约33mg/mL、约34mg/mL、约35mg/mL、约36mg/mL、约37mg/mL、约38mg/mL、约39mg/mL或约40mg/mL。
条款14.根据条款1至13中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA与丝心蛋白或丝心蛋白片段的比率为约91/9、约92/8、约93/7、约94/6、约95/5、约96/4、约97/3、约18/12、约27/3、约29.4/0.6、约99/1、约92.5/7.5、约90/10、约80/20、约70/30、约60/40或约50/50。
条款15.根据条款1至13中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA与丝心蛋白或丝心蛋白片段的比率为约50/50、约51/49、约52/48、约53/47、约54/46、约55/45、约56/44、约57/43、约58/42、约59/41、约60/40、约61/39、约62/38、约63/37、约64/36、约65/35、约66/34、约67/33、约68/32、约69/31、约70/30、约71/29、约72/28、约73/27、约74/26、约75/25、约76/24、约77/23、约78/22、约79/21、约80/20、约81/19、约82/18、约83/17、约84/16、约85/15、约86/14、约87/13、约88/12、约89/11、约90/10、约91/9、约92/8、约93/7、约94/6、约95/5、约96/4、约97/3、约98/2或约99/1。
条款16.根据条款1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的游离和/或未交联丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL或约8mg/mL。
条款17.根据条款1至16中任一项所述的组合物，其中所述游离和/或未交联丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分包含中值粒度为1.0μm至50.0μm、1.0μm至25.0μm、1.0μm至10.0μm、30.0μm至50.0μm、35.0μm至45.0μm、35.0μm至55.0μm或25.0μm至45.0μm的丝微粒。
条款18.根据条款1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够通过30G或27G针注射，并且通过30G针的注射力为约10N至约80N。
条款19.根据条款1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够通过30G针以以下的注射力注射：约1N、约2N、约3N、约4N、约5N、约6N、约7N、约8N、约9N、约10N、约11N、约12N、约13N、约14N、约15N、约16N、约17N、约18N、约19N、约20N、约21N、约22N、约23N、约24N、约25N、约26N、约27N、约28N、约29N、约30N、约31N、约32N、约33N、约34N、约35N、约36N、约37N、约38N、约39N、约40N、约41N、约42N、约43N、约44N、约45N、约46N、约47N、约48N、约49N、约50N、约51N、约52N、约53N、约54N、约55N、约56N、约57N、约58N、约59N、约60N、约61N、约62N、约63N、约64N、约65N、约66N、约67N、约68N、约69N、约70N、约71N、约72N、约73N、约74N、约75N、约76N、约77N、约78N、约79N、约80N、约81N、约82N、约83N、约84N、约85N、约86N、约87N、约88N、约89N、约90N、约91N、约92N、约93N、约94N、约95N、约96N、约97N、约98N、约99N或约100N。
条款20.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约5Pa至约500Pa、约15Pa至约50Pa、约50Pa至约100Pa、约100Pa至约200Pa、约200Pa至约300Pa、约300Pa至约350Pa、约350Pa至约400Pa、约400Pa至约450Pa或约450Pa至约500Pa。
条款21.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约5Pa至约500Pa、约15Pa至约50Pa、约50Pa至约100Pa、约100Pa至约200Pa、约200Pa至约300Pa、约300Pa至约350Pa、约350Pa至约400Pa、约400Pa至约450Pa或约450Pa至约500Pa。
条款22.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的Tan(δ)(G”/G’)为0至约0.2、约0.2至约0.4、约0.4至约0.6、约0.6至约0.8、约0.8至约1.0或约1.0至约1.2。
条款23.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为0至约5Pa·s、约5Pa·s至约10Pa·s、约10Pa·s至约15Pa·s、约15Pa·s至约20Pa·s或约20Pa·s至约25Pa·s。
条款24a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约400Pa，并且注射力(27G)为约10N至约70N。条款24b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约100Pa至约150Pa，并且注射力(27G)为约40N至约60N。条款24c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约150Pa，并且注射力(27G)为约10N至约40N。条款24d.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约250Pa至约350Pa，并且注射力(27G)为约10N至约30N。
条款25a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约10Pa至约350Pa，并且注射力(30G)为约5N至约70N。条款25b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约200Pa，并且注射力(30G)为约40N至约60N。条款25c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约200Pa至约350Pa，并且注射力(30G)为约40N至约70N。条款25d.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约10Pa至约100Pa，并且注射力(30G)为约5N至约35N。
条款26a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约25Pa至约350Pa，并且注射力(27G)为约10N至约70N。条款26b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约25Pa至约100Pa，并且注射力(27G)为约40N至约70N。条款26c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约25Pa至约100Pa，并且注射力(27G)为约10N至约35N。条款26d.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约150Pa至约350Pa，并且注射力(27G)为约10N至约60N。
条款27a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约10Pa至约400Pa，并且注射力(30G)为约5N至约70N。条款27b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约50Pa至约100Pa，并且注射力(30G)为约40N至约60N。条款27c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约10Pa至约75Pa，并且注射力(30G)为约5N至约35N。条款27d.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约150Pa至约300Pa，并且注射力(30G)为约40N至约70N。
条款28a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约25Pa至约400Pa，并且Tan(δ)(G”/G’)为0至约1.2。条款28b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约200Pa，并且Tan(δ)(G”/G’)为0.2至约0.6。条款28c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约200Pa至约400Pa，并且Tan(δ)(G”/G’)为0至约0.2。条款28d.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约25Pa至约400Pa，并且Tan(δ)(G”/G’)为0.8至约1.2。
条款29a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约2.5至约25Pa·s，并且注射力(27G)为约10N至约70N。条款29b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约2.5至约15Pa·s，并且注射力(27G)为约10N至约35N。条款29c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约2.5至约15Pa·s，并且注射力(27G)为约40N至约70N。条款29d.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约15至约25Pa·s，并且注射力(27G)为约25N至约70N。
条款30a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约1至约20Pa·s，并且注射力(30G)为约5N至约75N。条款30b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约1至约5Pa·s，并且注射力(30G)为约5N至约50N。条款30c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约5至约17Pa·s，并且注射力(30G)为约40N至约75N。
条款31a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约5Pa至约400Pa，并且储能模量(G’)为约1Pa至约400Pa。条款31b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约5Pa至约150Pa，并且储能模量(G’)为约1Pa至约250Pa。条款31c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约5Pa至约150Pa，并且储能模量(G’)为约250Pa至约400Pa。条款31d.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约150Pa至约200Pa，并且储能模量(G’)为约250Pa至约350Pa。条款31e.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约250Pa至约375Pa，并且储能模量(G’)为约250Pa至约350Pa。
条款32a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约15mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约1Pa至约350Pa。条款32b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约15mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约1Pa至约200Pa。条款32c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约15mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约200Pa至约350Pa。
条款33a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约18mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约350Pa。条款33b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约18mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约150Pa。条款33c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约18mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约150Pa至约350Pa。
条款34a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约20mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约20Pa至约400Pa。条款34b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约20mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约20Pa至约200Pa。条款34c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约20mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约200Pa至约400Pa。
条款35a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约22mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约25Pa至约200Pa。条款35b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约22mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约25Pa至约100Pa。条款35c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约22mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约100Pa至约200Pa。
条款36a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约24mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约350Pa。条款36b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约24mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约250Pa。条款36c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约24mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约250Pa至约350Pa。
条款37a.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约26mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约400Pa。条款37b.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约26mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约200Pa。条款37c.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约26mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约200Pa至约400Pa。
条款38.根据条款1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约28mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约150Pa至约300Pa。
条款39.根据条款1至38中任一项所述的组合物，其还包含显像剂。
条款40.根据条款39所述的组合物，其中所述显像剂选自碘、DOPA和成像纳米颗粒。
条款41.根据条款39所述的组合物，其中所述显像剂选自顺磁性显像剂和超顺磁性显像剂。
条款42.根据条款39所述的组合物，其中所述显像剂选自基于NP的磁共振成像(MRI)造影剂、正电子发射断层扫描(PET)/单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像剂、超声活性颗粒和光学活性(例如发光、荧光、红外)颗粒。
条款43.根据条款39所述的组合物，其中所述显像剂是SPECT显像剂、PET显像剂、光学显像剂、MRI或MRS显像剂、超声显像剂、多模态显像剂、X射线显像剂或CT显像剂。
条款44.一种治疗或预防有需要的受试者的病症、疾病或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条款1至43中任一项所述的组合物。
条款45.根据条款44的方法，其中所述皮肤病况选自皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹、皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、面颊凹陷、薄唇、后眼窝缺陷、面部褶皱和皱纹。
条款46.根据条款44或条款45所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者的真皮区域中。
条款47.根据条款44至46中任一项所述的方法，其中所述方法是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。
条款48.根据条款44至47中任一项所述的方法，其中所述方法是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。
条款49.根据条款44至48中任一项所述的方法，其中所述方法包括深层皮下和/或深层骨膜上施用。
条款50.根据条款44至49中任一项所述的方法，其中所述方法包括脸颊增大、嘴唇增大、真皮植入、口周皱纹矫正和/或鼻唇沟褶皱矫正。
条款51.根据条款44所述的方法，其中将所述组合物注射到组织中。
条款52.根据条款51所述的方法，其中所述组织与所述病症、疾病或病况相关。
条款53.根据条款51或条款52所述的方法，其中将所述组合物施用于所述组织的壁中。
条款54.根据条款51至53中任一项所述的方法，其中所述组织包括内脏器官的壁的一部分。
条款55.根据条款51至54中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用引起所述组织的膨胀。
条款56.根据条款55所述的方法，其中所述病症、疾病或病况通过所述组织的膨胀来治疗或预防。
条款57.根据条款51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况选自尿失禁、胃食管反流病(GERD)、膀胱输尿管反流、大便失禁、牙齿组织缺陷、声带组织缺陷、喉缺陷和其他非真皮软组织缺陷。
条款58.根据条款51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是尿失禁。
条款59.根据条款58所述的方法，其中所述尿失禁是压力性尿失禁、固有括约肌缺陷(ISD)、压力性尿失禁、固有括约肌缺陷(ISD)、充溢性尿失禁或遗尿。
条款60.根据条款58或59所述的方法，其中所述组织是尿道或尿道括约肌的一部分。
条款61.根据条款51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是胃食管反流病(GERD)。
条款62.根据条款61所述的方法，其中所述组织是食管下端括约肌或膈的一部分。
条款63.根据条款51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是膀胱输尿管反流。
条款64.根据条款63所述的方法，其中所述组织是尿道括约肌的一部分。
条款65.根据条款51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是大便失禁。
条款66.根据条款65所述的方法，其中所述组织是直肠的一部分。
条款67.根据条款65或条款66所述的方法，其中将所述组合物施用于直肠壁的一定区域中。
条款68.根据条款67所述的方法，其中所述直肠壁的区域在肛门括约肌附近。
条款69.根据条款68所述的方法，其中将所述组合物施用于内括约肌中。
条款70.根据条款51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是声带组织缺陷或喉缺陷。
条款71.根据条款70所述的方法，其中所述声带组织缺陷或喉缺陷选自声门闭合不全、单侧声带麻痹、双侧声带麻痹、麻痹性发声障碍、非麻痹性发声障碍、痉挛性发声障碍、声带不全麻痹(“轻瘫”)、声带整体弱化、声带瘢痕化以及它们的任何组合。
条款72.根据条款70或条款71所述的方法，其中所述组织是声带或喉的一部分。
条款73.根据条款44所述的方法，还包括施用抗癌治疗，其中所述病症、疾病或病况选自宫颈癌、直肠癌、肺肿瘤、纵隔淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、胰腺癌、头颈癌、肺癌、肝癌、阴道癌、良性前列腺增生(BPH)、月经过多、子宫肌瘤、前列腺腺癌、胰腺癌、头颈癌、肺癌、肝癌和阴道癌。
条款74.根据条款73所述的方法，其中所述抗癌治疗包括施用放射治疗(RT)、冷冻治疗、药物治疗、热和/或热消融、射频和/或微波或冷冻治疗中的一种或多种。
条款75.根据条款74所述的方法，其中放射治疗包括外射束放射治疗、3D适形调强放射治疗、调强放射治疗、间质前列腺近距离治疗、使用永久性种子的间质前列腺近距离治疗、使用临时性种子的间质前列腺近距离治疗、使用高剂量率遥控后装的间质前列腺近距离治疗、使用伽马照射的外部放射治疗、高能光子射束治疗、质子射束治疗、中子射束治疗、重粒子射束治疗、近距离治疗、热辐射中的一种或多种或它们的任何组合。
条款76.根据条款73至75中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述第一组织与所述第二组织之间，或施用于所述第一组织与所述第二组织之间的空间或虚拟空间中。
条款77.根据条款76所述的方法，其中在施用所述组合物时，所述第一组织相对于所述第二组织移位。
条款78.根据条款76或条款77所述的方法，其中所述空间或虚拟空间是迪氏空间或与迪氏筋膜(Denonvilliers’fascia)相邻的空间或虚拟空间。
条款79.根据条款76至78中任一项所述的方法，其中所述第一组织在施用所述组合物之后接受所述抗癌治疗。
条款80.根据条款79所述的方法，其中所述第一组织接受与所述第一组织在不存在所述组合物的情况下将接受的抗癌治疗剂量相比基本上相同的抗癌治疗剂量。
条款81.根据条款76至80中任一项所述的方法，其中所述第二组织接受所述抗癌治疗。
条款82.根据条款81所述的方法，其中所述第二组织接受与所述第二组织在不存在所述组合物的情况下将接受的抗癌治疗剂量相比较低的抗癌治疗剂量。
条款83.根据条款76至82中任一项所述的方法，其中所述第二组织基本上不接受抗癌治疗剂量。
条款84.根据条款76至83中任一项所述的方法，其中所述第一组织和所述第二组织各自独立地包括肿瘤组织、细胞群、细胞群和间质、器官、器官的一部分或身体的解剖部分。
条款85.根据条款76至83中任一项所述的方法，其中所述第一组织包括肿瘤组织，并且所述第二组织包括器官。
条款86.根据条款76至83中任一项所述的方法，其中所述第一组织包括器官，并且所述第二组织包括器官。
条款86.根据条款86所述的方法，其中所述第一组织包括前列腺的一部分，并且所述第二组织包括直肠的一部分。
条款87.根据条款44至86中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用麻醉剂。
条款88.根据条款44至87任一项所述的方法，其还包括使所述组合物在所述受试者中生物降解。
条款89.根据条款88所述的方法，其中所述生物降解是水解、蛋白水解、酶降解、体内细胞作用或它们的组合。
条款90.根据条款88所述的方法，其中所述组合物通过透明质酸酶酶促降解而生物降解。
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用所述实施方案的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人所认为的其发明的范围，也不旨在表示以下实验是所进行的所有或唯一实验。已经努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
实施例
材料和方法
材料
透明质酸(HA)钠盐(分子量750kDa–1000kDa)获取自Lifecore Biomedical(Chaska,MN)。以商标Ultra Plus XC销售的可注射HA凝胶(一种含有少量局部麻醉剂(利多卡因)的无色透明质酸凝胶)获取自Allergan(Irvine,CA)。丝心蛋白是现场(Medford,MA)处理的。聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEGDE)和透明质酸酶(HylenexTM)获取自Sigma-Aldrich(St Louis,MO)。盐酸利多卡因获取自Spectrum Chemical(New Brunswick,NJ)。根据上述方法制备各种浓度的丝溶液。所有其他化学品和试剂均购自VWR(Radnor,PA)并按原样使用。
丝-HA水凝胶制备的一般方法
将透明质酸溶解于含有基于丝心蛋白的片段和交联剂(其量因不同的水凝胶制剂而不同)的0.1N氢氧化钠溶液中。将混合物在55℃下维持75分钟以允许交联反应达到完全。然后将所得水凝胶冷却至室温，用浓盐酸调节至pH 7.4，然后中和并用1x PBS稀释过夜。然后将水凝胶针对1xPBS渗析3天以去除残留的游离交联剂。将盐酸利多卡因加入纯化的水凝胶中至0.3％w/w。对于每种水凝胶，基于丝心蛋白的片段和HA的最终总浓度用1xPBS调节至26mg/ml。将制备的丝-HA水凝胶等分至1-mL注射器中，准备用于灭菌和表征。
实施例1：凝胶的丁达尔评价
为了进一步支持视觉观察和进行组织和/或真皮填充物的比较性能分析，进行丁达尔效应的定量分析。基于对光散射和光与皮肤的相互作用的现有科学理解，采用基于(a)比色法和(b)光谱法的两种不同方法来定量皮肤中的丁达尔效应。基于这些技术，定义了三种不同的定量参数(下文概述)以测量体内丁达尔效应。
丁达尔效应视觉评分：
标度具有1至5的范围，增量为0.5。注射部位的正常肤色和没有蓝色变色的评分为1。厚的和明显的蓝色变色给出最大评分5。在进行盲试验测试样品评分之前，三个独立的观察者进行标度训练。
皮肤颜色的蓝色组分—“b”：使用色度计来定量从注射有各种填充物的皮肤部位发出的光的蓝色组分。这通过使用L-a-b颜色标度的“b”组分来实现。
从皮肤发出的"％蓝光"：使用便携式分光光度计来定量在总的可见光范围内从皮肤发出的蓝光的百分比。这是通过积分400-490nm之间的可见光谱下的面积并通过光谱(400-700nm)下的总面积将其归一化来实现的。
使用线性穿线技术通过适当的针将本公开的凝胶和市售凝胶皮内注射到两月龄无毛大鼠的大腿中。将凝胶浅表植入以模拟临床细线程序。在凝胶植入后48小时进行丁达尔测试。在进行丁达尔测试之前，将动物人道地安乐死以提高丁达尔效应的对比度。
用1-5的视觉评分和0.5的增量对注射部位评分。评分为1的注射部位显示没有皮肤变色，而评分为5的注射部位显示皮肤严重的蓝色变色。也在色度计的帮助下在注射部位进行光谱分析。独立地测量肤色的蓝色组分“b”和从皮肤发出的蓝光的％(400-700nm)。
实施例2：体内组织填充物测试
根据前述描述制备的组织填充物可在皮内植入、肌肉植入和皮下注射后测试。
例如，一定剂量的组织填充物可被装载在注射器中，并使用允许组织填充物通过针流到注射部位的适当尺寸的注射器皮内注射、肌内注射或皮下注射。
在最初注射相对于对照物(例如水和/或市售的基于HA的组织填充物，如Juvederm)后，可以1周或2周的间隔监测注射部位，在此观察患者的生物相容性问题，包括细胞毒性、致热原性、内毒素形成、急性系统毒性、亚慢性毒性、皮内反应性、基因毒性和皮肤致敏。
此外，组织填充物的物理属性可以通过检查在注射部位处丁达尔化的存在或体积、弹性或硬度的损失来监测。
实施例3：组织填充物流变学的检查
可使用振荡平行板流变仪(Anton Paar Physica MCR 301)测量本文所述的组织填充物的流变性质。在间隙高度为1mm时，可使用25mm的板直径。测量可以在25℃的恒定温度下进行，每次测量由以下组成：在2％的恒定应变和频率对数增加下从1至10Hz的频率扫描，随后是在5Hz的恒定频率下从1至300％的应变扫描，其中应变对数增加。这种分析的结果将提供每个测试的组织填充物的储能模量G'和损耗模量G'。
实施例4：丝/HA溶液不透明度的检查
根据表18在水或磷酸盐缓冲盐水中制备HA和丝的溶液。
表18
/>
/>
低MW＝高于0至约25kDa或者如本文另外定义的丝分子量；
中等MW＝约25kDa至约60kDa或者如本文另外定义的丝分子量；
上表中描述的溶液的结果显示于图26和图27中。图26和图27中的对照物(图26中未标记的烧瓶和图27中的对照注射器)是HA(22mg/mL)的水溶液。如图26和图27中图示说明，与单独的HA相比，丝/HA溶液是均匀的并且在视觉上是不透明的。
实施例5：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸溶解在NaOH溶液中并加入到如本文所述的丝溶液中；
步骤b：将溶解于NaOH中的BDDE加入丝/HA/NaOH溶液中；
步骤c：通过加热混合交联；
步骤d：通过金属筛并允许在水中溶胀；
步骤e：将溶胀的凝胶在乙醇中沉淀；
步骤f：用乙醇、水、和NaOH溶液洗涤；
步骤g：在乙醇/NaOH溶液中加热(50℃)完成交联约2小时；
步骤h：中和溶液pH至7；
步骤i：将沉淀物洗涤和干燥；
步骤j：使所得干粉末在0.9％ NaCl缓冲溶液中溶胀成凝胶；和
步骤k：将凝胶填充到注射器中并压热处理，提供所得的组织填充物。
实施例6：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸溶解于NaOH溶液中；
步骤b：将丝的NaOH溶液加入到丝的溶液中，然后将溶解在NaOH中的BDDE加入到丝/HA/NaOH溶液中；
步骤c：通过加热混合交联；
步骤d：通过金属筛并允许在水中溶胀；
步骤e：将溶胀的凝胶在乙醇中沉淀；
步骤f：用乙醇、水、和NaOH溶液洗涤；
步骤g：在乙醇/NaOH溶液中加热(50℃)完成交联约2小时；
步骤h：中和溶液pH至7；
步骤i：将沉淀物洗涤和干燥；
步骤j：使所得干粉末在0.9％ NaCl缓冲溶液中溶胀成凝胶；和
步骤k：将凝胶填充到注射器中并压热处理，提供所得的组织填充物。
实施例7：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸溶解于NaOH溶液中；
步骤b：将溶解于NaOH中的BDDE加入到HA/NaOH溶液中；
步骤c：将丝溶液加入到步骤b的溶液中并通过加热混合交联；
步骤d：通过金属筛并允许在水中溶胀；
步骤e：将溶胀的凝胶在乙醇中沉淀；
步骤f：用乙醇、水、和NaOH溶液洗涤；
步骤g：在乙醇/NaOH溶液中加热(50℃)完成交联约2小时；
步骤h：中和溶液pH至7；
步骤i：将沉淀物洗涤和干燥；
步骤j：使所得干粉末在0.9％ NaCl缓冲溶液中溶胀成凝胶；和
步骤k：将凝胶填充到注射器中并压热处理，提供所得的组织填充物。
实施例8：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸溶解于NaOH溶液中；
步骤b：将溶解于NaOH中的BDDE加入到HA/NaOH溶液中；
步骤c：通过加热混合交联；
步骤d：将丝溶液加入到交联HA/NaOH溶液中，并通过金属筛，并允许在水中溶胀；
步骤e：将溶胀的凝胶在乙醇中沉淀；
步骤f：用乙醇、水、和NaOH溶液洗涤；
步骤g：在乙醇/NaOH溶液中加热(50℃)完成交联约2小时；
步骤h：中和溶液pH至7；
步骤i：将沉淀物洗涤和干燥；
步骤j：使所得干粉末在0.9％ NaCl缓冲溶液中溶胀成凝胶；和
步骤k：将凝胶填充到注射器中并压热处理，提供所得的组织填充物。
实施例9：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸溶解于NaOH溶液中；
步骤b：将溶解于NaOH中的BDDE加入到HA/NaOH溶液中；
步骤c：通过加热混合交联；
步骤d：通过金属筛并允许在水中溶胀；
步骤e：将溶胀的凝胶在乙醇中沉淀；
步骤f：用乙醇、水、和NaOH溶液洗涤；
步骤g：将丝溶液加入到步骤f中制备的材料中，并在加热(50℃)下在乙醇/NaOH溶液中完成交联约2小时；
步骤h：中和溶液pH至7；
步骤i：将沉淀物洗涤和干燥；
步骤j：使所得干粉末在0.9％ NaCl缓冲溶液中溶胀成凝胶；
步骤k：将凝胶填充到注射器中并压热处理，提供所得的组织填充物。
实施例10：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸钠与NaOH溶液和本文所述的丝溶液混合；
步骤b：可以将BDDE加入到步骤a的溶液中；
步骤c：使步骤b的产物反应；
步骤d：将氨加入步骤c的经渗析的混合物中，并将混合物倒入培养皿中；
步骤e：使步骤d的产物干燥成膜；
步骤f：将步骤e的膜分成颗粒并在盐水中溶胀；
步骤g；将步骤f的产物加入注射器中并压热处理；
步骤h(任选)：步骤f的产物可以用BDDE溶液或本文所述的其他交联剂进行第二最终交联程序，并洗涤。
实施例11：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸钠与NaOH溶液混合；
步骤b：可以将丝溶液加入到步骤a的溶液中，并且可以加入BDDE；
步骤c：使步骤b的产物反应；
步骤d：将氨加入步骤c的经渗析的混合物中，并将混合物倒入培养皿中；
步骤e：使步骤d的产物干燥成膜；
步骤f：将步骤e的膜分成颗粒并在盐水中溶胀；
步骤g；将步骤f的产物加入注射器中并压热处理；
步骤h(任选)：步骤f的产物可以用BDDE溶液或本文所述的其他交联剂进行第二最终交联程序，并洗涤。
实施例12：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸钠与NaOH溶液混合；
步骤b：可以将BDDE加入到步骤a的溶液中；
步骤c：将步骤b的产物加入丝溶液中并使其反应；
步骤d：将氨加入步骤c的经渗析的混合物中，并将混合物倒入培养皿中；
步骤e：使步骤d的产物干燥成膜；
步骤f：将步骤e的膜分成颗粒并在盐水中溶胀；
步骤g；将步骤f的产物加入注射器中并压热处理；
步骤h(任选)：步骤f的产物可以用BDDE溶液或本文所述的其他交联剂进行第二最终交联程序，并洗涤。
实施例13：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将透明质酸钠与NaOH溶液混合；
步骤b：可以将BDDE加入到步骤a的溶液中；
步骤c：使步骤b的产物反应；
步骤d：将步骤c的产物加入丝溶液中，然后将氨加入其经渗析的混合物中，并将混合物倒入培养皿中；
步骤e：使步骤d的产物干燥成膜；
步骤f：将步骤e的膜分成颗粒并在盐水中溶胀；
步骤g；将步骤f的产物加入注射器中并压热处理；
步骤h(任选)：步骤f的产物可以用BDDE溶液或本文所述的其他交联剂进行第二最终交联程序，并洗涤。
实施例14：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以如本文所述制备丝溶液，可以向其加入BDDE的水溶液；
步骤b：可以将HA加入到步骤a的溶液中；
步骤c：可以搅拌步骤b的混合物(例如，5分钟)并使其静置约1天；
步骤d：可以将步骤c所得的凝胶在盐水中静置1周以提供所得组织填充物。
实施例15：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将BDDE加入到水中；
步骤b：可以将丝溶液加入到步骤a的溶液中，然后可以向其中加入HA；
步骤c：可以搅拌步骤b的混合物(例如，5分钟)并使其静置约1天；
步骤d：可以将步骤c所得的凝胶在盐水中静置1周以提供所得组织填充物。
实施例16：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将BDDE加入到水中；
步骤b：可以将HA加入到步骤a的溶液中；
步骤c：可以将丝溶液加入到步骤b的混合物中，并且可以搅拌所得混合物(例如5分钟)并使其静置约1天；
步骤d：可以将步骤c所得的凝胶在盐水中静置1周以提供所得组织填充物。
实施例17：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以向本文所述的丝溶液中加入溶解于NaOH溶液中的HA(在400rpm下混合约12小时)；
步骤b：可以将步骤a的溶液脱气；
步骤c：可以将步骤b的溶液与本文所述的交联剂(例如BDDE)在50℃下混合约10-20分钟；
步骤d：将交联凝胶与盐酸利多卡因混合；
步骤e：调节的交联溶液的渗析可以进行3天，然后用PBS渗析2天，然后用水渗析1天；
步骤f：然后将过滤的所得产物冻干以获得固体；
步骤g：将固体溶于PBS中，然后孵育；
步骤h(任选)：可以将游离HA加入到步骤g的产物中；
步骤i：步骤g或h的所得产物可以通过蒸汽压热处理灭菌。
实施例18：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将HA溶解(在400rpm下混合约12小时)在NaOH溶液中；
步骤b：可以将丝溶液加入到步骤a的溶液中，并可以将所得混合物脱气；
步骤c：可以将步骤b的溶液与本文所述的交联剂(例如BDDE)在50℃下混合约10-20分钟；
步骤d：将交联凝胶与盐酸利多卡因混合；
步骤e：调节的交联溶液的渗析可以进行3天，然后用PBS渗析2天，然后用水渗析1天；
步骤f：然后将过滤的所得产物冻干以获得固体；
步骤g：将固体溶于PBS中，然后孵育；
步骤h(任选)：可以将游离HA加入到步骤g的产物中；
步骤i：步骤g或h的所得产物可以通过蒸汽压热处理灭菌。
实施例19：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将HA溶解(在400rpm下混合约12小时)在NaOH溶液中；
步骤b：可以将步骤a的溶液脱气；
步骤c：可以将丝溶液加入到步骤b的溶液中，并且可以将所得混合物与本文所述的交联剂(例如BDDE)在50℃下混合约10-20分钟；
步骤d：将交联凝胶与盐酸利多卡因混合；
步骤e：调节的交联溶液的渗析可以进行3天，然后用PBS渗析2天，然后用水渗析1天；
步骤f：然后将过滤的所得产物冻干以获得固体；
步骤g：将固体溶于PBS中，然后孵育；
步骤h(任选)：可以将游离HA加入到步骤g的产物中；
步骤i：步骤g或h的所得产物可以通过蒸汽压热处理灭菌。
实施例20：组织填充物的制备方法
本文所述的丝/HA组织填充物可根据以下一般方法制备：
步骤a：可以将HA溶解(在400rpm下混合约12小时)在NaOH溶液中；
步骤b：可以将步骤a的溶液脱气；
步骤c：可以将步骤b的溶液与本文所述的交联剂(例如BDDE)在50℃下混合约10-20分钟；
步骤d：可以将丝溶液加入到步骤c的产物中，并且可以将混合物与盐酸利多卡因混合；
步骤e：调节的交联溶液的渗析可以进行3天，然后用PBS渗析2天，然后用水渗析1天；
步骤f：然后将过滤的所得产物冻干以获得固体；
步骤g：将固体溶于PBS中，然后孵育；
步骤h(任选)：可以将游离HA加入到步骤g的产物中；
步骤i：步骤g或h的所得产物可以通过蒸汽压热处理灭菌。
实施例21：由用BDDE交联的丝和透明质酸组成的组织和/或真皮填充物制剂
材料：1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE；Sigma-Aldrich)；透明质酸钠(HA；Lifecore)；丝，6％溶液(Silk Therapeutics)；氢氧化钠，0.1N溶液(BDH)；盐酸，5N(RiccaChemical)；磷酸盐缓冲盐水(PBS；20x；VWR Life Science)。
制剂变量：丝分子量：中等MW和低MW丝溶液(6％)；HA分子量：1.5MDa和2.2MDa；丝浓度：1％v/v(0.6mg/ml)、2％v/v(6mg/ml)5％v/v(3mg/ml)和20％v/v(12mg/ml)。
水凝胶交联：(a)将6％丝溶液加入到0.1N氢氧化钠中；(b)根据丝含量，在200-400rpm的速度的置顶搅拌下，将HA粉末逐渐加入到上述制备的溶液中；轻轻搅拌以避免产生过多的气泡；继续搅拌直至HA完全溶解；(c)向上述溶液中加入1％w/w BDDE；(d)加热至50℃并保持以100-200rpm搅拌30分钟；(e)使交联的凝胶冷却至低于30℃；(f)加入5N盐酸以调节pH至7.0-7.4。
水凝胶渗析：(a)使渗析盒水合2分钟；擦去过量的水并测量空盒的总质量；(b)将近似18g水凝胶制剂加入渗析盒中；测量加载凝胶后盒的总质量；(c)将渗析盒悬浮于2L的1x PBS缓冲液中并设定以200rpm磁力搅拌；记录渗析开始的时间，并在渗析4小时、24小时和48小时后更换PBS缓冲液；72小时后收集凝胶。
表征：剪切储能模量(G')和粘度；酶促降解；BDDE残留；交联密度；30天动物研究；细胞毒性；细菌内毒素；浊度。
粘弹特性：使用Discovery HR-1混合流变仪(TA Instruments)测定组织和/或真皮填充物制剂的储能模量(G')和复数粘度(η)。通过以每十进制间隔10个数据点从0.1Hz到10Hz的扫描振荡频率测试样品。记录数据并在5Hz剪切速率下比较。γ具有恒定HA浓度和可变丝浓度的水凝胶制剂(渗析后)的G'和γ数据显示于表19。在该批次中，使用1.5MDa分子量HA。
表19：具有恒定HA浓度的水凝胶的粘弹特性
*:渗析后水凝胶吸收PBS缓冲液，导致体积增加。HA和丝的浓度根据稀释因子重新 计算。
HA和丝的恒定总浓度为30mg/ml的水凝胶制剂(渗析后)的G'和γ数据汇总在表20中。γ
表20：具有恒定总浓度的水凝胶的粘弹特性
*:渗析后水凝胶吸收PBS缓冲液，导致体积增加。HA和丝的浓度根据稀释因子重新计算。
水凝胶可逆性：制备含有和不含丝蛋白的水凝胶并渗析。最终的组成分别对于丝-HA水凝胶为33.3mg/ml HA+8mg/ml丝，并且对于HA水凝胶为33.3mg/ml HA。将1g±100g上面制备的水凝胶加入20ml玻璃小瓶中，然后加入3ml的16U/ml透明质酸酶的1x PBS溶液。样品在37℃下培养3天。对照样品也使用HA水凝胶制备，没有加入透明质酸酶。图28中显示了降解曲线。在3天孵育过程中，没有透明质酸酶的对照样品没有降解。在孵育的前6小时内，水凝胶吸收缓冲液并溶胀，导致质量百分比的增加。丝-HA水凝胶和HA水凝胶在3天孵育后完全降解。在丝存在的情况下，水凝胶比纯HA水凝胶消化更快。孵育12小时后，近似90％的丝-HA水凝胶被酶消化。
交联剂(BDDE)残留物：使用Millennium Research Laboratories,Inc.(MRL)的GC-FID测试表19中列出的样品的BDDE残留物。MRL测试报告MRL18JAN06表明，在所有样品中都没有检测到BDDE残留物，满足等于或小于2ppm的接受标准。
交联密度：表19中所列的样品进一步被透明质酸酶完全消化，并使用NMR分析以确定交联密度，以改性百分比表示。测试结果列于表21(MRL测试报告MRL18JAN07)。
表21：各种制剂的改性度百分比(交联密度)
样品ID MoD(％)
XHA15M00SX17110202(C2) 2.87
XHA15M20SM17103002(A) 4.68
XHA15M01SL17103002(B) 2.58
XHA15M10SM17103002(C) 3.02
XHA15M01SM17103002(D) 2.54
XHA15M05SL17110202(E) 3.76
动物研究：在WuXi AppTec Minneapolis,MN facility进行使用豚鼠模型的30天动物研究，以解决产品安全问题。在该研究中有2个终止时间点，7天和30天，以评估组织应答。该研究汇总在WuXi AppTec报告D28195(项目C19879)中。两个对照样品(JuvedermUltra Plus和表19中的样品C2)和6种制剂(表19中的样品A-F)用于皮内注射。样品A-F和对照样品C2在注射前在Nelson Laboratories，LLC蒸汽灭菌(方案201707289)。研究程序简述如下：在本研究中使用二十四只动物，每次持续时间十二只。每只动物接受使用穿线技术的六个背部皮内注射(注射线而不是推注)：一个对照点在脊柱的一侧，第二个对照点在对侧(两侧由动物交替指定)和四个测试点，其中多于一次注射给定的测试制品(右侧和左侧在动物中交替指定)。在整个研究中每天观察动物以评价总体健康。在安排的终止日期对动物进行人道安乐死。从所有动物切除植入部位和周围组织，放入福尔马林中，并处理成石蜡块，随后进行组织病理学评估。代表性的组织学图像和病理学发现汇总在表22中。总之，没有提示在任何植入部位中的脓毒症或免疫应答。
细菌内毒素：从用于细菌内毒素测试的动物研究(列于表19)中使用的7种制剂中选择三种灭菌后样品(样品A、样品E和样品C2)。使用动力学比浊法测定内毒素水平。测试结果列于表23中，并且低于20EU/ml的接受标准(Nelson Labs研究报告1006775-S01)。
表23：内毒素测试结果
样品ID 检测到的内毒素
XHA15M20SM17103002(A) 0.498(EU/ml)
XHA15M00SX17110202(C2) <0.400(EU/ml)
XHA15M05SL17110202(E) 1.56(EU/ml)
生物相容性-细胞毒性：从动物研究(列于表19)中使用的7种制剂中选择四种灭菌后样品(样品A、样品B、样品D和样品E)用于ISO-10993-5细胞毒性测试(使用L-929小鼠成纤维细胞的ISO MEM洗脱)。这些样品代表在测试的组织和/或真皮填充物制剂中的中等分子量丝和低分子量丝的最高和最低丝含量。测试报告表明所有测试样品评分为0级，意味着无细胞毒性(Wuxi AppTec报告D28287-1、D28287-2、D28287-3、D28287-4)。
浊度：纯HA水凝胶在自然光下澄清。当HA与丝蛋白交联时，水凝胶变得略微混浊(混浊)，并且浊度取决于制剂中的总丝浓度。浊度通过配备有InGaAs积分球的Lambda X50SUV-Vis分光光度计(PerkinElmer)测量，该积分球除了收集标准透射光之外，还具有收集前向散射光的能力。丝-HA水凝胶的浊度测量值显示于图35中。黑色曲线是标准透射率，并且红色曲线由显示显著前向散射的球体收集。将不含丝的纯HA水凝胶用作对照样品。图36中的曲线几乎相同，表明纯HA凝胶的非常少的散射。浊度测量值表明丝-HA水凝胶具有散射光的能力，当用作填充物时，这可以消除丁达尔效应。
结论：基于具有各种丝含量和恒定总浓度的恒定HA浓度开发填充物制剂。这些制剂提供了宽范围的储能模量、粘度和交联密度，这可以导致各种应用。丝-HA水凝胶是酶促可逆的。水凝胶制剂渗析后的交联剂残留物符合接受标准。细胞毒性测试表明，丝含量范围为0.48mg/ml至9.6mg/ml的丝-HA水凝胶没有细胞毒性和生物相容性。30天的动物研究证明所有丝含量最高达9.6mg/ml的制剂都不会引起脓毒症并且没有免疫应答。
实施例22：由丝和与PEGDE(PEGDGE)交联的透明质酸组成的组织和/或真皮填充物制剂
交联剂：聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEGDE)，平均分子量Mn＝500。反应条件：与BDDE交联(实施例21)相同。PEGDE的总量等于BDDE的摩尔数。
表24:PEGDE交联制剂和测试结果
*:渗析后水凝胶吸收PBS缓冲液，导致体积增加。HA和丝的浓度根据稀释因子重新计算。
实施例23：动物研究C20419
用于动物研究C20419的样品的制剂和表征如表25中所示：
表25：用于动物研究C20419的样品的制剂和表征
图37至图46显示了研究结果。图37是注射了对照真皮填充物的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。图38是注射了本发明的HA真皮填充物(24mg/ml HA，PEGDE交联，样品C4-表25)的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。图39是注射有本发明的丝-HA真皮填充物(22.8mg/ml HA，1.2mg/ml丝，PEGDE交联，样品L-表25)的豚鼠中皮内区域的代表性组织学图片。图40是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(23.76mg/ml HA，0.24mg/ml丝，PEGDE交联，样品M-表25)的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。图41是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(22.8mg/ml HA，1.2mg/ml丝，PEGDE交联，样品N-表25)的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。图42是注射了本发明的丝-HA真皮填充物(22.8mg/ml HA，1.2mg/ml丝，PEGDE交联，样品O-表25)的豚鼠中的皮内区域的代表性组织学图片。
图43至图46为表25制剂移植7天后的组织学结果的图表(评分：0-正常；1-极少；2-轻度；3-中度；和4-重度)。图43是显示植入后7天凝胶降解的组织学结果的图；BDDE交联的制剂大部分被降解。图44是显示植入7天后凝胶迁移的组织学结果的图。图45是显示植入7天后炎症组织学结果的图；没有观察到组织坏死，没有观察到血液凝固，并且在对照制剂和一些测试制剂上观察到极少的胶原沉积。图46是显示植入后7天巨噬细胞的组织学结果的图。
实施例24：PEGDE交联的丝-HA水凝胶的特性：1)剪切储能模量(G')，和2)渗析过程中的溶胀比
填充物制备，材料：聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEGDE)，Mn＝500，Sigma-Aldrich；透明质酸钠(HA)，Lifecore；丝，6％溶液，Silk Inc.；氢氧化钠，0.1N溶液，BDH；盐酸，5N，Ricca Chemical；磷酸盐缓冲盐水(PBS)，20x，VWR Life Science。
填充物制剂变量：丝分子量：中等MW和低MW丝溶液(6％)；HA分子量：700KDa和1.5MDa；丝浓度(初始)：0-15mg/ml。
高浓度水凝胶交联：将6％丝溶液加入到0.1N氢氧化钠中；在温和搅拌下向上述制备的溶液中逐渐加入100mg/ml混合分子量HA(700KDa/1.5MDa＝90/10)直至HA完全溶解；将PEGDE加入上述溶液中；将水浴加热至40℃，并在水浴中保持交联45分钟；使交联的凝胶冷却至低于30℃；将5N盐酸加入1x PBS中，将凝胶稀释至40mg/ml，并调节最终pH至7.0-7.4。
低浓度水凝胶交联：将6％丝溶液加入到0.1N氢氧化钠中；在温和搅拌下向上述制备的溶液中逐渐加入25mg/ml的1.5MDa HA，直至HA完全溶解；将PEGDE加入上述溶液中；将水浴加热至40℃，并在水浴中保持交联45分钟；使交联的凝胶冷却至低于30℃；并向交联的凝胶中加入5N盐酸，并调节最终pH至7.0-7.4。
水凝胶渗析：使渗析盒(20KDa MWCO)水合2分钟；擦去过量的水并测量空盒的总质量；将近似18g水凝胶加入渗析盒中；测量加载凝胶后盒的总质量；将渗析盒悬浮于2L的1xPBS缓冲液中并设定以200rpm磁力搅拌；渗析72小时后收集凝胶。
粘弹特性
使用Discovery HR-1混合流变仪(TA Instruments)测定水凝胶制剂的储能模量(G')。通过以每十进制间隔10个数据点从0.1Hz到10Hz的扫描振荡频率测试样品。记录数据并在5Hz剪切速率下比较。在具有恒定HA浓度和可变丝浓度的渗析之前和之后的水凝胶制剂的G'显示于图47A和图47B中。对于在高初始HA浓度下通过PEGDE交联的水凝胶，由于丝与总HA的相对低的比率，丝浓度对G'的影响是最小的。它也可以有助于含有90％的低分子量(700KDa)的混合HA，其对丝浓度的变化不敏感。对于在低初始HA浓度下通过PEGDE交联的水凝胶，当向制剂中加入更多的丝时，G'增加。当初始HA浓度低时，丝浓度的变化对G'有更大的影响，并且对高分子量HA(1.5MDa)也有更大的影响。对于两种交联程序，没有观察到丝分子量对G'的显著影响。
渗析期间的溶胀率：没有明显的趋势显示，对于两种交联程序，在渗析过程中，加入到水凝胶制剂中的丝的量对凝胶溶胀有任何影响，并且在中等分子量和低分子量的丝之间没有显著的差异(图48A和图48B)。
如果混合HA在高初始HA浓度下通过PEGDE交联，则水凝胶制剂中的丝浓度对G'具有最小的影响，但是如果单一高MW HA在低初始HA浓度下交联，则与G'成比例。当比较HA被PEGDE交联时对G'和溶胀的贡献时，凝胶制剂中的丝的分子量没有显著差异。
实施例25：丝-HA组织和/或真皮填充物制剂中的丝浓度
材料：丝，6％溶液，Silk,Inc.；磷酸盐缓冲盐水(PBS)，20x，VWR Life Science；交联透明质酸(HA)凝胶。
设备：水分分析仪HE53，Mettler Toledo；Cary 100UV/Vis分光光度计。
校准标准曲线：测量中等分子量和低分子量6％丝溶液的干含量以确定所述丝溶液的实际干含量(mg/ml)；通过使用1X PBS稀释6％丝溶液来产生一系列标准丝溶液(例如，1mg/ml丝、0.75mg/ml丝、0.5mg/ml丝、0.25mg/ml丝和0mg/ml丝)；在石英比色皿中测量每种标准溶液在275nm的吸光度-吸光度测量可以用200-800nm的扫描、5nm的数据间隔和0.1秒的平均收集来进行；将275nm的吸光度对丝浓度(mg/ml)作图以产生标准曲线。
丝浓度的测定：用1X PBS稀释HA凝胶样品，使得在275nm的吸光度在0和1.0之间(例如，样品可以用1:12的凝胶与1X PBS的比率稀释，即1200％稀释)；在200nm-800nm之间扫描丝-HA凝胶样品相对于1XPBS参考的吸光度，测量每个凝胶样品在275nm处的吸光度峰；通过无丝样品的吸收信号与校准曲线的截距之间的差异校正凝胶样品的吸收信号，将无丝样品设定为具有0mg/ml的丝浓度；可以从校准曲线和稀释因子计算丝-HA凝胶样品中的丝浓度。
通过测量一系列具有范围为0mg/ml至1mg/ml的不同丝浓度的标准样品在275nm处的吸收来建立校准曲线。中等分子量和低分子量丝溶液的校准曲线显示于图49A和图49B中。中等分子量丝的R2值0.99947和低分子量丝的R2值0.99949表明在0-1mg/ml丝浓度的工作范围内校准曲线是线性的。这些曲线可以用于测定凝胶样品中的丝浓度。
HA-丝水凝胶的丝浓度的测定：如图50A和图50B中所示，测量每种样品在275nm的稀释的丝-HA水凝胶的吸收。用校准曲线和稀释因子计算每个样品的丝浓度，汇总于表26中。
表26-由校准曲线计算的具有未知丝浓度的丝-HA凝胶的丝浓度
实施例26：丝-HA组织和/或真皮填充物制剂：凝胶不透明度
材料：交联透明质酸(HA)凝胶；磷酸盐缓冲盐水(PBS)，20x，VWR Life Science。
设备：Cary 100UV/Vis分光光度计。
样品制备：将约2mL HA凝胶注入干净的石英比色皿中，使得样品中存在最小量的气泡；使用18G针的注射可帮助减少样品中的气泡量；可以将1X PBS的空白参考样品加入到第二个干净的石英比色皿中(注意：对于不透明度测量，可以使用塑料比色皿，因为塑料比色皿在400nm-800nm的可见光范围内没有吸收)。
凝胶不透明度的测量：设定X-扫描范围为200nm-800nm，数据间隔为5nm，平均时间为0.1秒；选择Y模式作为％T用于透射光的测量(注意：也可以测量吸收并且％T可以从吸收值计算)；相对于1X PBS参考标准对凝胶样品进行扫描；数据可保存为csv文件且可绘制光谱。
凝胶不透明度可以使用UV/Vis分光光度计对标准透射光进行测量。光学透明的样品将透射100％的光，而稍微混浊或浑浊的样品可能仅透射该光的一部分。图51显示了含有丝和不含有丝的HA水凝胶的浊度测量值。蓝色曲线显示了含有3mg/mL丝和26mg/ml HA的丝-HA凝胶样品的透射光的％透射率。红色曲线显示了没有丝和有20mg/ml HA的样品的透射光，并且显示了比有丝的样品透射更多的光。浊度测量值表明，与没有丝的HA凝胶相比，丝-HA凝胶具有更多散射可见光的能力。
实施例27：通过NMR测定的HA水凝胶的改性度(MoD)
改性度(MoD)定义为所有连接的交联剂分子与HA重复单元的摩尔数的化学计量比。MoD中包括交联和单连接的连接剂。MoD通过对来自2.1ppm HA和1.7ppm BDDE交联剂或3.0-4.5ppm PEGDE交联剂的N-乙酰基的信号积分由1H NMR谱测定。
在酶促降解之前，HA水凝胶首先再次针对PBS(1X，2L x 5)溶液渗析以去除游离的交联剂。使用Slide-A-Lyzer渗析盒(MWCO 3.5K,Thermo Scientific,Rockford,IL)，并将PBS溶液在室温下搅拌72小时。渗析后，取出1mL HA水凝胶溶液，并用Labconco FreeZone冻干机(2.5L)冻干，以获得干燥粉末。
为了制备NMR样品，将10mg干粉末放入NMR管(5mm，Wilmad-LabGlass)中，并加入0.6mL透明质酸酶(MP Biomedicals，Solon，OH)的氧化氘(D2O，Alfa Aesar，Ward Hill，MA)溶液。透明质酸酶的量为5U/1mg HA。将NMR管在37℃孵育过夜，以使所有HA降解。在VarianMR 400MHz自动NMR系统上记录NMR谱。弛豫延迟时间是1秒，并且扫描数是256。所有数据都使用MestReNova软件(12.0.2版)处理。
实施例28：丝-HA两步交联工艺
丝-HA水凝胶可以用2步交联工艺形成以提高丝结合至HA的效率。对于给定的制剂，在第一步，将所有丝蛋白和小部分低分子量HA加入到pH为10的NaOH溶液中，然后与一部分交联剂反应。不希望受任何特定理论的束缚，据信在该步骤期间，尽可能多的丝与交联剂反应。在第二步中，加入NaOH溶液以稀释步骤1的产物并将pH提高到13。然后将剩余的低分子量HA、所有的高分子量HA和剩余的交联剂加入到溶液中，并且交联反应完成。
实施例29：HA水凝胶的合成
通过使用不同的HA分子量、交联剂、反应时间、反应温度、HA浓度、交联剂比率、混合方法和搅拌方法合成HA水凝胶。表27和表28显示了所采用的各种反应条件和获得的各种水凝胶。
表27
HA MW 700k、1.5M、2.2M、3M或具有任意比率的不同MW的混合物
交联剂 PEG500DE和BDDE
反应时间 30分钟、60分钟、90分钟、120分钟或240分钟
反应温度 40℃或50℃
HA浓度 30mg/ml、90mg/ml、100mg/ml和140mg/ml
交联剂比率 7重量％或10重量％
混合方法 将HA和交联剂预混合在一起，或将交联剂逐份加入HA溶液中
搅拌 有或没有机械搅拌
表28
/>
实施例29：丝/HA水凝胶合成
丝填充物由交联的透明质酸(HA)和与HA共价结合的丝心蛋白片段构成。交联剂是生物相容性和生物可吸收的官能化聚(乙二醇)(PEG)。交联剂在HA分子和丝心蛋白之间连接至HA分子，以形成可注射的水凝胶。还向制剂中添加利多卡因以减少注射期间的不适。将填充物装入1mL注射器中，其可灭菌，并且能够在临床研究中通过30G或27G针注射。
HA诱导最小的局部组织应答，这不促进胶原沉积。由于植入，丝蛋白可以诱导短暂和轻微的炎症应答，导致局部植入物周围巨噬细胞和成纤维细胞的募集和活化。这些短暂的事件最终导致胶原沉积和新的内源性组织。在填充物中，该过程有可能改善皮肤的轮廓并减少由于疤痕、损伤或细纹导致的皮肤凹陷。
丝心蛋白片段可能影响丁达尔效应。丁达尔效应是指胶体或悬浮液中的细颗粒对光的散射。散射光的强度与波长的四次方成反比。由于蓝光具有较短波长，以较高强度散射，并且因此散射光看起来是蓝色的。在应用一些真皮填充物后，有时在人体中观察到丁达尔效应。当注射至浅表皮肤中或皮肤颜色苍白时，丁达尔效应甚至更显著。HA的水凝胶颗粒悬浮液没有UV和可见光吸收。丝真皮填充物含有丝心蛋白片段和丝纤维，其具有275nm左右的UV吸收带和可见光范围内的宽吸收。这些可以帮助减轻或最终消除丁达尔效应。
不希望受任何特定理论的束缚，据信丝的组织和/或真皮填充物的粘弹特性还可以通过共价结合的丝心蛋白片段来控制。现有的HA真皮填充物产品控制粘弹特性(储能模量和损耗模量)的方法有限，例如通过改变交联的HA的浓度。添加游离HA可能降低注射期间的力，但无助于控制粘弹特性，因为游离HA将在体内快速降解。丝组织和/或真皮填充物含有与HA共价结合的丝心蛋白片段。缀合的丝心蛋白片段形成更复杂的结构，其改变规则的交联HA 3D网络。它可以通过交联具有不同分子量(分子链长)或不同丝心蛋白片段百分比的丝心蛋白片段来控制。
丝组织和/或真皮填充物的粘弹特性和体内寿命也可以通过改变交联剂的分子量(重复单位)来控制。现有的真皮填充物产品使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)作为交联剂。BDDE是一种小分子二环氧化物，其缺乏控制真皮填充物的粘弹特性的灵活性，以及控制真皮填充物在体内寿命的改性度(MoD)。丝填充物使用生物相容性聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEGDE)作为交联剂。PEGDE是一种二环氧官能化的线性寡聚物。它具有比BDDE更长的分子链，并且可通过改变EO重复单元的数量进行调节，这通过改变HA分子和HA之间至丝心蛋白片段的距离来提供控制水凝胶结构的灵活性。环氧乙烷(EO)重复单元的不同数量改变环氧基团接近并与HA和丝心蛋白片段反应的能力，其使得能够控制MoD。
丝填充物是一种可注射的水凝胶。它由HA和丝心蛋白片段以95:5的恒定质量比构成。HA的分子量为约850KDa，并且丝心蛋白片段的分子量为约14kDa。水凝胶通过PEGDE交联。PEGDE的分子量为约500Da。最终产品含有约26mg/mL的总HA和丝心蛋白片段，以及1xPBS中的0.3％利多卡因。
在丝填充物制剂中，HA分子是交联的，并且丝心蛋白片段也通过PEG桥共价结合至HA分子的羟基上。通过LC MS/MS方法证明丝心蛋白片段与PEGDE桥的共价缀合。例如，分析本文所述的填充物的组成以确定凝胶中交联丝的存在。凝胶中的HA首先使用透明质酸酶消化，随后使用蛋白酶的组合(胰蛋白酶/Lys-C、糜蛋白酶、Glu-C)消化。然后在Ultimate3000HPLC系统上使用C18反相(RP)柱分析混合物，其中在QExactive质谱仪上进行MS/MS分析。
如图52中所示，PEG交联剂具有m/z为89.06、133.08和177.11的初级离子，而丝片段的初级离子为136.07和182.08。不希望受任何特定理论的束缚，据信，至少在一些实施方案中，LC光谱不能清楚地显示游离PEG片段和/或游离丝心蛋白片段。也不希望受任何特定理论的束缚，据信，至少在一些实施方案中，凝胶中的丝可能全部与PEG共价缀合。也不希望受任何特定理论的束缚，据信，至少在一些实施方案中，保留时间为23.22分钟(m/z435.64，突出)的峰的MS/MS光谱显示PEG和丝心蛋白片段两者的强信号，这进一步证明丝与PEG交联。
将如本文所述制备的水凝胶装入1-mL注射器中，用过热水灭菌，并表征其机械特性。使用配备有锥板几何结构的TA Instruments Discovery HR-1流变仪测量储能模量(G')。加载约0.8mL水凝胶样品以覆盖整个样品板。在5Hz的振荡频率下测量的G'为约150Pa。MoD被定义为连接的交联剂分子的数量占HA二糖单元的总数的百分比。它可以通过NMR使用交联剂和HA的特征性化学位移来确定。上述制备的水凝胶的MoD为约9％。使用Brookfield Engineering质构分析仪测量注射力(IF)。将样品注射器筒安装在固定装置上。柱塞杆由活塞驱动，以0.2mm/s的速度通过30G针挤出水凝胶，持续10mm行进距离。连续记录应用至活塞的力。上述制备的水凝胶的平均注射力为约39N。
使用豚鼠模型实施12个月的动物研究(WuXi AppTec,Minneapolis,MN)以解决产品安全问题。本研究中存在5个终止时间点，7天、30天、90天、180天和365天，以评估组织对上述制备的丝真皮填充物的应答。Juvederm Ultra Plus XC用作对照。简要的研究程序：本研究中每个持续时间使用四只动物。每只动物使用穿线技术(注射线而不是推注)接受六次背部、皮内注射：三个对照部位在脊柱的一侧上，并且三个测试样品部位在对侧上。在整个研究中每天观察动物以评价总体健康。在安排的终止日期对动物进行人道安乐死。从所有动物切除植入部位和周围组织，放入福尔马林中，并处理成石蜡块，随后进行组织病理学评估。7-天组织病理学数据在本文中描述(图53A中的组织学图像)。半定量评估(评分越低越好)显示对照组的总评分为6.9，并且测试组的总评分为3.8。
病理学发现表明，在植入后7-天，测试植入材料表明比对照植入材料更少的反应。这包括在测试材料中未观察到的对照材料的溃疡和通过肌肉层的弥散迁移。在测试材料中的2-3个部位，进入或通过肌肉层的迁移最小，与对照相比，迁移显著更低。用测试材料未鉴定到溃疡。外来体巨噬细胞应答和胶原分离在不存在溃疡的对照和测试植入物之间是相似的。
在一些实施方案中，纯HA水凝胶在自然光下是透明的。在一些实施方案中，当HA与丝心蛋白片段交联时，凝胶表现出非常微弱的淡黄色并且可以视觉观察到丝蛋白纤维(参见图54A)。该凝胶表现出可见光范围内的宽吸光度和明显的散射。这通过配备有InGaAs积分球的Lambda X50SUV-Vis分光光度计(PerkinElmer)测量，所述InGaAs积分球除了标准透射光外，还具有收集前向散射光的能力。浊度测量值表明，丝-HA水凝胶具有散射光的能力，其一旦用作真皮填充物，就有可能消除丁达尔效应。
为了理解丝分子量对水凝胶的粘弹特性(储能模量G'和复数粘度η)的影响，制备两种具有各种分子量的丝心蛋白片段的样品。制备样品，HA和丝的总浓度为24mg/ml且恒定HA/丝比率为95:5。将约48kDa的中等分子量的丝加入样品A中，将约14kDa的低分子量的丝加入样品B中，将两个样品在50℃交联30分钟，然后用1X PBS渗析72小时。渗析后分析样品。数据显示于表29中。与中等分子量丝交联的样品A具有较低的G'和η，这表明，不希望受任何特定理论的束缚，较长的丝心蛋白片段对HA凝胶结构的影响更大。还评估制剂中丝心蛋白片段的百分比的影响。制备三种具有各种丝含量的样品。HA和丝的总浓度保持在30mg/ml。样品在50℃下交联30分钟，随后针对1x PBS渗析72小时。在渗析后分析样品的G'和η(表30)。结果表现出，随着水凝胶中丝浓度增加，G'和η降低。因此，不希望受任何特定理论的束缚，据信可以通过在交联过程期间改变制剂中丝心蛋白片段的分子量和百分比来控制水凝胶的粘弹特性。
表29：具有不同丝分子量的水凝胶的粘弹特性
表30：制剂中具有不同丝含量的水凝胶的粘弹特性
丝填充物可以通过以下程序制备。
(1)对于10-mL批次大小，将1.167ml的6％低分子量丝溶液和385mg的PEGDE加入含有8.833mL的0.1N氢氧化钠溶液的烧杯中。在40分钟内将1330mg的HA一部分接一部分加入上述制备的溶液中。使用抹刀轻轻搅拌，同时加入HA以促进HA水合和溶解。将烧杯放入55℃水批次中75分钟以允许交联。使交联水凝胶冷却至＜28℃。将145μl的6N盐酸加入5mL的1xPBS中。将PBS溶液倒入水凝胶中，密封烧杯并放置在4℃冰箱中，以允许水凝胶中和和稀释过夜。在PBS被水凝胶完全吸收后，将另外10mL的1x PBS加入稀释的水凝胶中，并放置在4℃冰箱中以允许进一步稀释过夜。将稀释的水凝胶填充至20kDa MWCO渗析管中，并经72小时在室温下针对1x PBS(4L)进行渗析。在6小时、24小时和48小时更换PBS。渗析后，加入利多卡因和额外的1x PBS，以便用0.3％利多卡因将最终浓度调整至26mg/mL。将水凝胶装入1-mL注射器中，并使用过热水进行灭菌。或者，在制造程序中可以使用0.15N氢氧化钠溶液代替0.1N氢氧化钠。或者，在制造程序中可以使用0.25N氢氧化钠溶液代替0.1N氢氧化钠。
(2)对于10-mL批次大小，将1.167ml的6％低分子量丝溶液和96mg的PEGDE加入含有8.833mL的0.1N氢氧化钠溶液的烧杯中。将266mg of HA加入上述制备的溶液。使用抹刀轻轻搅拌，直至HA完全溶解。将烧杯放入55℃水批次中60分钟以允许第一步交联。让烧杯冷却至室温。将289mg的PEGDE加入烧杯并搅拌，直至完全溶解。然后在30分钟内一部分接一部分添加1064mg的HA。使用抹刀轻轻搅拌，同时加入HA以促进HA水合和溶解。将烧杯放入55℃水批次中60分钟以允许第二步交联。将145μL的6N盐酸加入5mL的1x PBS中。将PBS溶液倒入水凝胶中，密封烧杯并放置在4℃冰箱中，以允许水凝胶中和和稀释过夜。在PBS被水凝胶完全吸收后，将另外10mL的1x PBS加入稀释的水凝胶中，并放置在4℃冰箱中以允许进一步稀释过夜。将稀释的水凝胶填充至20kDa MWCO渗析管中，并经72小时在室温下针对1x PBS(4L)进行渗析。在6小时、24小时和48小时更换PBS。渗析后，加入利多卡因和额外的1xPBS，以便用0.3％利多卡因将最终浓度调整至26mg/mL。将水凝胶装入1-mL注射器中，并使用过热水进行灭菌。或者，在制造程序中可以使用0.15N氢氧化钠溶液代替0.1N氢氧化钠。或者，在制造程序中可以使用0.25N氢氧化钠溶液代替0.1N氢氧化钠。
本文引用的所有专利、专利申请和公开的参考文献都通过引用整体并入本文。虽然已经结合本公开的具体实施方案描述了本公开的方法，但是将理解，其能够进一步修改。此外，本申请旨在涵盖本公开的方法的任何变化、用途或修改，包括本公开的方法所属领域的已知或惯例实践内的与本公开的此类偏离。
实施例30.丝-HA水凝胶的物理化学特性G’、IF和MoD的表征方法
在透明质酸水凝胶中掺入丝心蛋白，结合使用聚乙二醇交联剂，代表了一种用于配制填充物的新型平台。通过改变HA浓度、丝的百分比和PEGDE:HA比率以及配制反应条件，经由该平台制备超过一百种填充物候选物用于筛选。对生成的丝-HA水凝胶的物理化学和机械特性的测试聚焦于确定每种水凝胶的储能模量(G')、交联或改性程度(MoD)、注射力(IF)和光谱吸收，因为这些特性在生成具有期望特征的真皮填充物产品中尤其重要。
实施例30a.储能模量
每种水凝胶的储能模量(G')使用Discovery HR-1Rheometer(TA Instruments,New Castle,DE)测定。使用锥板几何结构以5Hz的振荡频率进行测量(每种水凝胶制剂三次)。
实施例30b.改性度
NMR系统操作程序
设备：Varian INOVA 500MHz NMR；移液器，1000μl、200μl和20μl(Eppendorf,Research Plus)；移液器控制器(VWR,Powerpette Plus,613-4442)；NMR管(Wilmad,WG-1235-7)；NMR管盖(Kimble,897095-0081)；水浴培养箱(Benchmark Scientific,B2000-4)；20mL玻璃小瓶(VWR,VW74515-20)；称重船(VWR目录号10770-440)；烤箱(Quincy Lab，12-140AE)；冻干机(LabConco,目录号700201000)；Kimwipes(Kimberly-ClarkProfessional)；Parafilm M(Bemis,PM 996)；分析天平(Mettler Toledo,XS204DeltaRange)。
材料：氘水(Alfa Aesar,14764)；氯仿-D(Alfa Aesar,41389)；丝，6％溶液(SilkMedical Aesthetics,Inc.)；聚(乙二醇)二缩水甘油醚，(SinoPEG，技术/医疗级)；透明质酸钠，850KDa(HTL Biotechnology，医药级)；透明质酸酶(MP Biomedicals，目录号100740)；PBS 20x(VWR,E703-1L)；水(RICCA，目录号9150-5)；盐酸利多卡因(Spectrum，LI103)
方法：为了确定每种水凝胶的MoD，将600–800mg水凝胶与0.8mL约275IU/mL或约340IU/ml透明质酸酶在1x PBS中混合。将混合物在37℃下孵育16小时至24小时，以允许完全消化交联的水凝胶。将600μl消化水凝胶溶液样品在50℃下风干2小时至4小时，并将10mg干燥样品溶解在NMR管中的600μL氘水中，并在Varian INOVA 500MHz NMR仪器(Palo Alto,CA)上记录质子NMR光谱。
NMR样品的制备
PEGDE样品的制备：从冰箱中取出PEGDE样品，并将样品在室温下放置近似30分钟至1小时。PEGDE将熔化并变成液体。使用移液器测量5μl PEGDE并加入NMR管中。向NMR管中加入600μl的氘水或氯仿-D。样品必须在2小时内进行NMR扫描。
HA样品的制备：从冰箱中取出HA样品，并将样品在室温下放置近似30分钟至1小时。在20ml玻璃瓶中称取20mg HA。通过将1份20xPBS加入19份水中，将20x PBS稀释为1xPBS。在单独的20ml玻璃小瓶中称出340IU的透明质酸酶。向小瓶中加入1.1ml 1x PBS以溶解透明质酸酶。确保透明质酸酶在继续之前溶解。向HA小瓶中加入1ml透明质酸酶/PBS溶液。将HA小瓶放入37℃水浴培养箱中，并孵育16-24小时。使用移液器来测量600μl的HA PBS溶液并放入称重船中。将称重船放入50℃烘箱中2-4小时。一旦溶剂已经干燥，样品变成白色薄片并粘至称量船的底部。称取10mg干燥的HA样品并将样品放入NMR管中。向NMR管中加入600μl氘水。将NMR管储存在室温下。样品必须在1周内进行NMR扫描。
丝样品的制备：用移液管来测量1ml丝溶液并加入20ml玻璃小瓶中。用一块Kimwipe盖住玻璃小瓶，并用Parafilm密封Kimwipe。确保玻璃小瓶的顶部没有被Parafilm覆盖。将小瓶放入冰箱中4-6小时。从冰箱中取出小瓶并放入冻干机的腔室中。将样品冻干24-48小时。从冻干机中取出干燥的样品，并称出10mg干燥丝。将10mg干燥丝放入NMR管中。向NMR管中加入600μl氘水。将NMR管储存在室温下。样品必须在1周内进行NMR扫描。
利多卡因样品的制备：称出5mg盐酸利多卡因样品并加入NMR管中。向NMR管中加入600μl氘水。将NMR管储存在室温下。样品必须在1周内进行NMR扫描。
凝胶样品的制备：在20ml玻璃小瓶中称出600-800mg凝胶。通过将1份20x PBS加入19份水中，将20x PBS稀释为1x PBS。在20ml玻璃小瓶中称出340IU透明质酸酶。向小瓶中加入1ml 1xPBS以溶解透明质酸酶。确保透明质酸酶在继续之前溶解。向凝胶小瓶中加入0.8ml透明质酸酶/PBS溶液。将凝胶小瓶放入37℃水浴培养箱中，并孵育16-24小时。使用移液器来测量600μl的凝胶/PBS溶液并放入称量船中。将称重船放入50℃烘箱中2-4小时。一旦溶剂已经干燥，样品变成白色薄片并粘至称量船的底部。称出10mg干燥的HA样品并将样品放入NMR管中。向NMR管中加入600μl氘水。将NMR管储存在室温下。样品必须在1周内进行NMR扫描。
运行NMR测试：对给定样品运行NMR质子测试并选择扫描次数。对于利多卡因和PEGDE，选择64次扫描。对于所有其他样品，选择256次扫描。确保考虑到正确的溶剂类型。根据需要重复多次样品测试。
处理NMR数据：MestReNova软件或等效的NMR软件用于加载和处理.fid文件。对每个样品进行以下校正：基线校正：为了校正基线，应用多项式值3。相位校正：对于相位校正，所有峰都应当是对称的。溶剂峰校正：为了校正溶剂峰的化学位移，氘水为4.79ppm，并且氯仿-d为7.27ppm。积分：在先前的校正之后，对每种化学品进行以下积分：对于PEGDE，将以下化学位移处的峰积分：2.77-2.81ppm、2.96-2.99ppm、3.33-3.38ppm、3.38-3.44ppm、3.68-3.80ppm和3.95-3.40ppm。对于利多卡因，将以下化学位移处的峰进行积分：1.35-1.46ppm、2.21-2.27ppm、3.34-3.48ppm、4.32-4.39ppm和7.21-7.33ppm。对于丝，将以下化学位移处的峰进行积分：1.32-1.5ppm和3.77-4.09ppm。对于HA，将以下化学位移处的峰进行积分：2.0-2.1ppm和3.30-4.05ppm。对于最终凝胶，将以下化学位移处的峰进行积分：1.20-1.28ppm、1.35-1.48ppm、2.0-2.1ppm和3.30-4.05ppm。每个峰都必须显示化学位移范围。积分值必须在该线之下。
积分归一化：需要对每个光谱的积分值进行归一化来计算MoD。为了对峰的积分值进行归一化：对于PEGDE，将2.77-2.81ppm的积分归一化为2。对于利多卡因，将1.35-1.46ppm的积分归一化为6。对于丝，将1.32-1.5ppm的积分归一化为2。对于HA，将2.0-2.1ppm的积分归一化为3。对于最终凝胶，将2.0-2.1ppm的积分归一化为3。
水凝胶的改性度(MoD)被定义为以下任一者：
或
这取决于几个变量，诸如水凝胶合成期间使用的SPF和/或交联剂的浓度，其中n是分子数，其可以通过NMR使用交联剂、HA、SPF和/或任何其他任选组分、诸如局部麻醉剂的特征性化学位移来确定。
水凝胶样品的MoD使用以下方程从NMR光谱(参见例如图64和图65)计算(还参见“Chemical Characterization of Hydrogels Crosslinked with Polyethylene Glycolfor Soft Tissue Augmentation”，Monticelli等,Open Access Maced J MedSci.2019Apr 15；7(7):1077-1081):
使用以下方程从NMR光谱计算每条PEG链中的平均质子数(NPEG-H)：NPEG-H＝(δ3.68-3.80×取代％)+10，其中δ3.68-3.80是将2.77-2.81ppm的积分归一化为2后的积分值；“取代％”是每个连接剂PEGDE连接剂的缩水甘油基的平均数的量度，例如100％取代意味着每个PEGDE连接剂具有两个末端缩水甘油基，而小于100％的数量意味着平均而言，不是样品中的每个单个PEGDE连接剂被两个缩水甘油基完全取代；并且对于两个缩水甘油基中的质子加“10”。
不希望受任何特定理论的束缚，据信凝胶NMR光谱中的以下化学位移对应于以下各自的质子：
3.30-4.05：来自HA残基、PEG连接剂、丝(SPF)和利多卡因的质子的混合物；
1.20-1.28：利多卡因中的两个末端甲基；和
1.35-1.48：丝心蛋白片段(SPF)中的质子的混合物。
MoD方程的分子中的“11”值代表在光谱的3.30-4.05区域中的HA质子的积分。
实施例30c.注射力(IF)
使用Brookfield CT3 10K质构分析仪(AMETEK Brookfield,Middleboro,MA)测量从配备有30G针的1-mL注射器分配每种水凝胶所需的注射力。每个样品注射器都固定在固定装置中。注射器柱塞通过活塞以0.2mm/sec的速度压缩，持续1cm的总行进距离。每0.05秒(或0.01mm)记录应用至活塞的力。记录每个样品的平均力和峰值力，并报告3个样品的总体平均值。
物理化学特性表征的结果和丝浓度对丝-HA水凝胶的G'、IF和MoD的影响汇总如下。测量以相同的HA浓度和PEG交联剂与HA的比率(约30％w/w)、但不同的丝心蛋白浓度配制的多种水凝胶的G'、IF和MoD。结果表明，随着制剂中丝浓度的增加，水凝胶的G’和IF两者均降低，而MoD保持相对不变(图55A-C)。重要的是，这些结果表明可以通过改变丝浓度来调节G'而不改变MoD，使得能够优化这两个关键的凝胶特征。也就是说，丝-HA凝胶配制平台允许生成储能模量(G')不同的水凝胶-这对于开发用于不同适应症的产品是重要的-同时维持促进产品寿命(高MoD)和可用性(可操作IF)的特征。
基于所评估的各种丝-HA水凝胶制剂的不同机械特性，选择使用5.0％基于丝心蛋白的片段和PEG交联剂的丝-HA凝胶制剂作为潜在的填充物候选物，并在进一步研究(包括ISO 10993生物相容性测试)中进行评估。被选择为领先候选物的水凝胶制剂AS-V1表现出在G'(144±24Pa)的高MoD(8.9±0.2％)、使用30号针的可操作IF(39.2±3.4N)和生理质量摩尔渗透压浓度(osmolality)(264mOsmol/kg)。它由重量比为95:5(26mg/mL)的透明质酸和丝心蛋白组成，其中PEG交联剂占丝-HA水凝胶的总重量的约30％w/w，并且利多卡因占0.3％w/w。使用低分子丝(<28kDa)和850kDa的HA。
在此类产品中，表现出适当的粘弹特性和变形抗性(具有较高G'的“更硬”材料)、注射期间易于流动(低IF)以及体内寿命或降解抗性(通常用较高的MoD实现)的凝胶材料用于选择水凝胶产品候选物。水凝胶候选物的最终浓度范围为15mg/mL至26mg/mL(丝加HA)。水凝胶候选物表现出机械特性，包括范围为40–700Pa的G'和范围为10N至>100N的IF(图56)。这些水凝胶的MoD都与商业的基于HA的真皮填充物相比相似或更高。
实施例31.光学特性
使用配备有UMS积分球的Cary 7000UV-vis-NIR(Agilent Technologies,SantaClara,CA)表征丝-HA水凝胶的光学特性。测量每种水凝胶的三种样品。
已知用市售的真皮填充物产品注射导致一些患者中的皮肤变蓝，被描述为丁达尔效应。丝心蛋白对基于HA的水凝胶的光学特性的影响及其抵消丁达尔效应的潜力以两种方式进行测量。
首先，将有和没有丝的情况下生成的基于HA的水凝胶的折射率与彼此进行比较，并与市售的真皮填充物产品(Ultra Plus XC)的折射率进行比较。发现所有测试的水凝胶制剂具有1.34的折射率，表明光与各种凝胶及其表面相互作用时类似的传播。
其次，评估丝-整合的真皮填充物候选物(AS-V1)的吸光度，并将其与基于HA的水凝胶(不含丝)以及商业真皮填充物进行比较。AS-V1表明比没有丝的水凝胶和商业真皮填充物更高的UV和蓝色波长的可见光的吸光度(图57)。
AS-V1所表明的UV对蓝光的吸光度增加表明在患者中引起发蓝效应的可能性较低，并且因此表明其在苍白皮肤中的相对浅表美学矫正中的潜在效用。
实施例32.根据ISO 10993在动物中的GLP生物相容性测试
使用豚鼠进行基于ISO 10993的GLP动物研究用于评估局部组织应答。
在这些研究中使用白化豚鼠(Cavia porcellus)、Hartley品系(无特定病原体)。所有程序均由机构动物护理和使用委员会批准。根据如“实验室动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)”中报告的NIH指南治疗动物。
根据国际标准化组织为医疗装置的生物评估制定的ISO 10993标准，以及根据FDA指南，在用于永久性植入、组织/骨骼接触的III类医疗装置的类别下，对选择作为潜在真皮填充物产品进一步开发的水凝胶制剂(Activated Silk Hydrogel-V1,AS-V1)针对生物相容性进行测试。领先候选水凝胶制剂AS-V1表明生物相容性测试中优异的特征，这可能导致患者群体中的安全问题的风险低和不良事件发生率低。
生物相容性测试结果证实在表明的所有三种凝胶组分用于体内使用的安全性上建立的预期：(1)作为皮肤的粘弹特性细胞内基质的天然组分的HA；(2)贯穿历史已经用于许多不同生物医学应用中(包括用于真皮组织重建)的丝；和(3)作为生物相容性聚合物的PEG。对AS-V1的ISO 10993生物相容性测定满足所有接受标准。
实施例33.体外和体内可逆性测试
实施例33a.丝-HA水凝胶的体外降解测试
将近似1g的每种水凝胶(AS-V1或Ultra Plus XC)与1ml含有150U/ml透明质酸酶的PBS(0.2M,pH 6.2)一起放入三个小瓶各自中，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，完全去除上清液并测量凝胶的剩余重量。在120分钟内对总共4ml(600U)透明质酸酶再重复所述过程三次。水凝胶降解的程度由剩余水凝胶与原始水凝胶的重量比(％)表示。
实施例33b.体内可逆性测试
本研究中使用十二只动物。每只动物背部接受六次皮内注射，其中如上所述在脊柱的每侧有三个部位。在注射丝-HA水凝胶(测试制品)或Ultra Plus XC(对照制品)后60±30分钟内，在整形外科医生的指导下，通过用透明质酸酶的酶促降解尝试测试和对照材料的逆转。以15个单位开始，透明质酸酶(HylenexTM,150U/ml)在沿着每个测试或对照材料轨迹的多个位置以少量皮内和/或皮下注射，并轻轻按摩至该部位中。以近似30分钟间隔在每个测试或对照部位注射最多达0.4ml透明质酸酶。通过肉眼观察和触诊评价测试或对照材料的溶解/降解。
持续一个月每天观察动物以评价总体健康和残留材料的存在或不存在。在最后一次酶处理后的四个时间点中的每一个对三只动物进行安乐死：最后一次酶处理后65±5分钟、24±2小时、7±0.5天和30±1天。将植入部位和周围组织切除，福尔马林固定和石蜡包埋，切片，用苏木精和伊红染色。切片由不知情的病理学家评估多形核细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、巨细胞、组织坏死、总体炎症、新血管形成、纤维化、脂肪浸润、血液凝固、胶原沉积以及凝胶降解和迁移的存在。
实施例33c.体内可逆性测试
将约1g的每种水凝胶(AS-V1或Ultra Plus XC)的三份重复用150U透明质酸酶在37℃下消化30分钟。孵育后，测量凝胶的剩余重量。在120分钟内对总共600U的透明质酸酶再重复所述过程三次。体外水凝胶降解的程度表示为剩余水凝胶与原始水凝胶的重量比(％)。
对于体内可逆性测试，12只动物中的每只接受6次背部皮内注射，其中如上所述在脊柱的每侧有3个部位。在注射水凝胶后一小时内，在整形外科医生的指导下，通过用透明质酸酶的酶促降解尝试测试和对照材料的逆转。以15个单位开始，将最多达60U的透明质酸酶沿着每个测试或对照材料轨迹皮内和/或皮下注射，并以约30分钟间隔轻轻按摩至该部位中。通过肉眼观察和触诊评价测试或对照材料的溶解/降解。
持续一个月每天观察动物以评价总体健康，并且在最后一次酶处理后65±5分钟、24±2小时、7±0.5天和30±1天对三只动物进行安乐死。将植入部位和周围组织切除，福尔马林固定和石蜡包埋，切片，用苏木精和伊红染色。切片由不知情的病理学家评估多形核细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、巨细胞、组织坏死、总体炎症、新血管形成、纤维化、脂肪浸润、血液凝固、胶原沉积以及凝胶降解和迁移的存在。
评价AS-V1被透明质酸酶降解的能力，其方式类似于用其他商业的基于HA的凝胶所见的方式。基于HA的凝胶被透明质酸酶降解的能力是基于HA的真皮填充物产品的关键优势，允许整形外科医生在结果不佳或不良事件的情况下快速逆转注射。体外和体内测试两者均表明，透明质酸酶酶促降解AS-V1的能力未受损。因此，如果需要，“逆转”AS-V1真皮注射的能力在丝存在的情况下得以维持。体外测试显示，尽管在与透明质酸酶单一孵育30分钟后，AS-V1的降解少于Ultra Plus XC凝胶，但在与酶孵育60分钟或更长时间后，AS-V1的降解相等(图58A)。
对于体内测试，取自透明质酸酶注射部位的组织切片显示，在注射后一小时单次注射1:1体积的透明质酸酶后，水凝胶材料几乎完全降解(“逆转”)，AS-V1注射部位为61％且Ultra Plus XC注射部位为47％(图58B)。此外，与/>Ultra Plus XC相比，AS-V1需要更少的透明质酸酶注射来实现完全逆转(图58B)。因此，体外和体内测试均表明，如果需要，透明质酸酶“逆转”AS-V1真皮注射的能力在丝存在的情况下得以维持。
体外结果与从体内可逆性研究获得的数据非常相关。在此，三只动物如前处理，其各自接受在背侧真皮中分开1cm间隔的0.1mL AS-V1的3次皮内注射和UltraPlus XC的3次注射。在取自透明质酸酶注射部位的组织切片中，在用AS-V1和Plus XC两者注射后60±30分钟在单次1:1体积注射透明质酸酶后证实水凝胶材料几乎完全降解(“逆转”)(数据未显示)；然而，一些部位需要最多达3次额外的逆转注射来达到水凝胶的完全去除。总体而言，AS-V1具有与/>Ultra Plus XC相似的可逆性概况，如体内豚鼠研究和体外测试环境中所表明。
丝-HA水凝胶制剂AS-V1表明在以下中的优异特征：(1)耐久性测试，这可能导致更长持久的处理；和(2)可逆性测试，这应当在使用期间为相似的提供者和患者提供保证。
当将AS-V1水凝胶制剂与商业产品进行比较时，本实施例中描述的水凝胶降解、迁移和可逆性的体内评价的结果也是相似的，表明候选丝-HA水凝胶真皮填充物AS-V1具有与市售产品的那些相似的寿命和性能特征，并且在需要时表现出类似的体内完全可逆性的能力。
实施例34.对AS-V1的短期局部组织应答的评估
为了探索AS-V1水凝胶制剂在与其作为可注射真皮填充物产品的潜力直接相关的条件下的安全性和对其的局部组织应答，进行一系列全面的测试，其表明皮内注射后AS-V1水凝胶的安全性和效力。
根据ISO 10993-6要求，在注射后延伸最长达6个月的时间点评估向豚鼠背部皮内注射(植入)后对真皮填充物的局部组织应答。在每个时间点评估六只动物。去除每只动物背部(背侧)的毛皮，将动物麻醉，并无菌准备注射部位。每只动物接受六次皮内注射(植入物)：脊柱的一侧上三次AS-V1丝-HA水凝胶和对侧上三次Ultra Plus XC。每次注射每个部位递送0.1mL的体积，其中每个注射部位之间有至少1cm。注射部位用外科皮肤记号笔标识。注射前将注射部位针对红斑和水肿进行评分；注射后持续7天每天观察动物的Draize评分(真皮刺激)，并在注射后第3天和第4天观察瘀伤。在注射后第7、30、90±1和180±2天和365±3天对动物进行人道安乐死用于组织检查。将植入部位和周围组织切除，福尔马林固定和石蜡包埋，切片，用苏木精和伊红染色。对研究条件不知情的病理学家评估载片的局部组织反应(包括炎症应答、凝胶降解、凝胶迁移和胶原沉积)的证据。
所有测定都在向豚鼠的背部真皮注射0.1mL AS-V1后进行，并将结果与用Ultra Plus XC(FDA-批准的由1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联的HA凝胶构成的真皮填充物)注射后获得的结果进行比较。在范围为注射后1天至6个月的时间点，AS-V1在所有测试中的表现与/>Ultra Plus XC相比相似或更好。
在注射后第1天至第5天进行Draize皮肤刺激测试(急性刺激)。观察到的刺激可以忽略不计，其中对于AS-V1(测试制品)和Ultra Plus XC(FDA-批准的比较物)两者，在所有时间点观察到的评分为3或更低(满分为8)(图60A-D)，表明注射后不需要的组织应答最小。事实上，丝-HA水凝胶在Draize测试中的评分与/>Ultra Plus XC相似，表明它在豚鼠模型中注射后最长达5天引起的即时刺激与用FDA-批准的不含丝组分的产品看到的即时刺激相似。进一步支持AS-V1引起比/>Ultra Plus XC更少的刺激的结论是用AS-V1看到的注射后瘀伤最少；这种瘀伤小于或等于在相同动物中在注射后3天和4天用/>Ultra Plus XC看到的瘀伤(图60A-B)。
本实施例中的测试结果表明，AS-V1水凝胶引起即时和中期注射后刺激、瘀伤和炎症，其水平与用商业产品Ultra Plus XC看到的那些相比相似或更低。
此外，由独立委员会认证的毒理学家进行AS-V1的汇总毒理学评价。
实施例35.长期炎症和凝胶性能的评估
豚鼠中的额外组织学评价将AS-V1的生物相容性和性能的支持扩展直至注射后12个月。这些评价检查对皮内注射后凝胶的炎症应答以及皮内注射后凝胶在原位的降解和迁移。
观察到的炎症最少，其中对于AS-V1和比较物(Ultra Plus XC)凝胶两者，在所有时间点观察到的评分为近似4或更低(满分为28)，表明注射后对产品的有害组织应答最小(图61A)。对于AS-V1和/>Ultra Plus XC，对于皮肤组织基质中的水凝胶降解(图61B和图61D)和迁移(图61C和图61E)两者，也看到类似的概况。此处，较高的评分(最大值为4)表明凝胶的降解或迁移更多；两者对于真皮填充物都是不期望的。对于降解，AS-V1评分保持低于1.5，表明期望地低的降解水平和良好的组织内凝胶寿命概况。对于迁移，AS-V1评分保持低于2，表明期望地低的凝胶迁移水平和良好的组织内放置/位置稳定性概况。此外，这些结果表明，从凝胶迁移/降解和组织应答的角度来看，AS-V1在豚鼠中的真皮内研究中的表现与/>Ultra Plus XC相当。
考虑到AS-V1和Ultra Plus XC的相当的短期性能概况，评价长期概况。这些评价检查皮内注射后凝胶在原位的耐久性、炎症应答以及降解和迁移。关于耐久性，在注射后12个月，清楚地观察到凝胶(浅蓝色/灰色)仍然整合在胶原基质(粉红色)周围(图62A-J)，证实AS-V1和Juvéderm Ultra Plus XC在豚鼠模型中持续最多达一年的耐久性。/>
在注射后3个月和6个月，组织学检查表明填充物凝胶期望地整合至代表性背部真皮组织切片中。事实上，AS-V1产品在两个时间点都与皮肤的胶原基质顺利整合，相比之下，在用Ultra Plus XC注射的组织中看到与胶原结构掺入得不太好的植入物块(图63A-D)。没有观察到炎性或其他不期望的组织应答病理表明有利的生物相容性和刺激AS-V1整合胶原的能力。在这些评价中，与/>Ultra Plus XC相比，AS-V1的相似或更好的性能支持进一步开发AS-V1作为一种有希望的真皮填充物产品。
此外，在一年研究中，对于AS-V1和Ultra Plus XC看到皮肤组织基质中凝胶降解(图61D)和迁移(图61E)两者的相似概况。对于降解，AS-V1评分仍然低，表明良好的组织内凝胶寿命概况。对于迁移，AS-V1评分与Juvéderm Ultra Plus XC保持一致，表明期望低的凝胶迁移水平和良好的组织内放置/位置稳定性概况。在注射后3、6和12个月，组织学检查表明填充物凝胶期望地整合至代表性背部真皮组织切片中(图63A-D)。
事实上，AS-V1产品在所有三个时间点都与皮肤的胶原基质顺利整合，相比之下，在用Ultra Plus XC注射的组织中看到掺入不那么好的植入物块(图63A-D)。最后，没有观察到炎性或其他不期望的组织应答病理表明有利的生物相容性和与AS-V1的胶原整合的能力(图62A-J和图63A-D)。
这在图61F中得到证实，其显示对于AS-V1和比较物(Ultra Plus XC)凝胶两者，在所有时间点都观察到的炎症最小，表明注射后对产品的有害组织应答最小(图61F)。
关于某些常见的不良反应，存在多个区域，对于所述区域，将丝心蛋白包含至基于HA的真皮填充物中可能导致比当前市售的填充物产品更好的产品性能。预计AS-V1水凝胶表明的低水平的刺激、瘀伤和炎症与低水平的注射后即时和早期的不良反应(诸如疼痛、过敏、肿胀、红斑和坏死)相关。此外，对于一些填充物产品已经观察到形成病变/结节，这可能由于高度交联或使用多种尺寸(分子量)的HA，诸如发生在VyCrossTM技术中。用本文所述的含丝水凝胶可能避免这种情况，因为使用单一尺寸的HA，并且可以容易地调节MoD。最后，结果表明在真皮填充物中掺入丝蛋白也可能帮助避免用其他真皮填充物产品经常发生的不期望的丁达尔效应。
AS-V1表明在所有ISO 10993测试中的良好的概况，并且表明用该产品未观察到细胞毒性、敏化、刺激性、热原性、基因毒性(Ames和MLA)、中期局部组织炎症应答或急性或亚慢性全身毒性。
ISO 10993测试以及进一步的安全性和效力结果显示，对于迄今为止测试的所有方面，AS-V1的性能与当前的市场领导者Ultra Plus XC相比等效或更好。此外，上述测试表明，丝-HA凝胶比/>Ultra Plus XC更顺利地掺入皮肤的胶原基质中。目前，这些结果已经用使用豚鼠模型的注射后6个月数据进行证实。
实施例35.示例性丝-透明质酸组织填充物
将HA和丝与PEGDE以90-140mg/ml的总HA和丝的初始浓度以95:5的HA:丝比率在0.1-1.0N氢氧化钠溶液中混合。HA的分子量为850kDa。丝的分子量为低-MW(MW<28kDa)。对于产品1，交联反应在55℃下实施75分钟。对于产物2和3，交联反应在环境温度(20℃)下实施8-24小时。交联后，将水凝胶中和并稀释至40-56mg/ml，并针对1x PBS渗析3-4天。将0.3％w/w盐酸利多卡因加入渗析的水凝胶中。将产物中总HA和丝的最终浓度进一步稀释至15-28mg/ml(表31)。更具体地，下表是产品1和产品2和3(非设计冷冻)的当前标称设置
表31
在一些实施方案中，深层产品被指示用于深层(皮下和/或骨膜上)注射或组织间隔应用。在一些实施方案中，注射区域经12个月时段维持比基线改善的外观。在一些实施方案中，产品是可逆产品，并且所述产品可以用透明质酸酶溶解。
在一些实施方案中，浅表产品指示用于浅表注射。在一些实施方案中，注射区域经12个月时段维持比基线改善的外观。在一些实施方案中，产品是可逆产品，并且所述产品可以用透明质酸酶溶解。
实施例36.丝心蛋白片段粉末(SPF粉末)的制备
实施例36a.冷冻干燥法
将如上制备的650mL低MW和中MW丝心蛋白片段的水溶液中的每一种加入到1L圆底玻璃瓶中。将装有丝溶液的两个瓶子置于冰箱内，并在冰箱内放置过夜，以提供完全冷冻的丝溶液。将装有冷冻丝溶液的两个瓶子从冰箱中移出。将瓶保持敞开，用Kimwipe薄绵纸覆盖开口，并置于冻干机内。将冻干机内的压力降低至0.02mbar。在24小时冷冻干燥后，收集器温度设定在-65℃，从冻干机中取出两个瓶子并立即加盖以避免干燥的丝固体与水分接触。将冻干后的粗粉立即用研钵和研杵研磨，以产生具有均匀的侧分布的丝心蛋白片段的细粉。可以进行进一步的研磨/加工以产生具有所需粒度的丝固体颗粒。
使用研钵和研杵，低MW丝的粗固体非常容易破碎，从而得到非常细的粉末。随着它变得更小，冻干的丝显示层状外观(长度和宽度大约几毫米，但是极薄，几乎透明)。这些小颗粒在某种程度上类似于云母，在这个意义上它们是在光中闪烁的非常薄的片(见图66A-66C)。
随着固体丝被研磨得更多并且颗粒尺寸减小，粉末失去其闪烁。基于外观和其在最轻微的空气运动下飞行的方式，粒度可以在几微米和几百微米之间。
中MW丝的固体在研磨时不会立即破碎(如低MW固体丝的情况)。可以使用的其他丝干燥方法包括但不限于喷雾干燥、极性干燥和薄膜蒸发。
实施例36b.薄膜蒸发法
将本文制备的低MW或中MW丝心蛋白蛋白片段的水溶液置于薄膜蒸发器内。在减压下，使用温和加热，在薄膜蒸发器内从丝溶液中连续去除水，得到可变粒度的固体。可以通过改变工艺参数，例如但不限于压力、温度、圆筒的旋转速度、蒸发器中液膜的厚度来调节粒度。
实施例36c.通过水溶液沉淀法制备的微粒
盐析方法：制备1.0m磷酸盐缓冲溶液，并将pH值调节至8。向温和搅拌的5.0mg/ml浓度的丝溶液中，以1:5的比例(v/v)加入磷酸盐缓冲液。使样品反应5分钟，然后置于冰箱内以促进丝颗粒的沉淀。然后将得到的丝固体悬浮液离心以收集固体颗粒。用去离子水洗涤丝颗粒三次并干燥，得到丝心蛋白片段的固体颗粒(SPF粉末)。
PVA-辅助法：将3.0重量％的原料丝溶液与5.0重量％的聚乙烯醇(PVA)溶液以1:4(v/v)的比例混合。将所得溶液混合物温和搅拌2小时。然后将溶液混合物超声处理，随后流延到基材上以使得形成膜。将所述膜在最少量的去离子水中重构并离心。去除上清液，加入补充的去离子水。重复所述过程两次。两次洗涤后，从烧瓶中去除液体以提供湿丝微粒。然后将少量甲醇加入烧瓶中的湿微粒中(甲醇退火)。将烧瓶内的颗粒悬浮液旋动。然后将颗粒悬浮液倾倒在大的布滤器上以分离微粒(参见图68)。
实施例37：示例性丝-透明质酸组合物及其制备方法
SMA-002程序：
1.将PEGDE加入干净的烧杯中。
2.在室温下，将NaOH溶液(0.25N)、相同体积的丝溶液和NaOH溶液(0.5N)加入烧杯中，并用刮刀混合30秒。
3.将HA纤维加入到混合罐中。
4.将步骤2中制备的丝/NaOH溶液加入到含有HA纤维的混合罐中，并在20℃下搅拌1小时
5.将混合物在20℃下放置23小时。
6.将适量的HCl和PBS(1x)溶液加入到混合罐中以中和并稀释交联的凝胶。将混合物在4℃下搅拌3小时，然后在4℃下放置过夜。
7.将稀释的凝胶在4℃下搅拌1小时，然后装入渗析管中，并用PBS(1x)在室温下渗析3天。
8.将渗析后的凝胶转移至混合罐中。将适量的盐酸利多卡因/PBS溶液加入到混合罐中以将凝胶稀释至20mg/mL。用NaOH溶液调节pH。
9.将加入盐酸利多卡因的凝胶在4℃下搅拌1小时，然后在4℃下放置过夜。
10.凝胶准备用于注射器填充。
不希望受任何特定理论的束缚，据信SMA-002方法产生平滑的IF曲线，原因在于：使用比SMA-001方法(0.1N)更高浓度的NaOH(0.25N)；使用比SMA-001方法(140mg/mL)低的初始HA浓度(75mg/mL)。结果，不希望受任何特定理论的束缚，认为HA在SMA-002过程中溶解更快，并在步骤4结束时产生均匀溶液。与SMA-001方法相比，SMA-002方法在步骤4和步骤6中均采用更长的时间或更高的混合速度。
SMA-002水凝胶与SMP(丝微粒)程序：
除了步骤8之外，所述程序与用丝溶液制造的SMA-002相同：
8.将渗析后的凝胶转移至混合罐中。将合适量的利多卡因HCl/丝微粒/PBS溶液加入到混合罐中以将凝胶稀释至20mg/mL。用NaOH溶液调节pH。
注意：SMP的大小为30-50μm，水凝胶中SMP的终浓度为1mg/mL。
SMA-002(浅表填充物)
/>
示例性SMA-003(深)
用于Gen 1凝胶的Gen 2法
实施例38：SMA真皮填充物的流变性质
真皮填充物产品的指示主要基于它们的流变性质。产品性能，例如抗变形能力、流动能力、保持其完整性的能力等。也通过产品的每个相应流变参数来评估。利用丝蛋白的突出特征，SMA技术能够将丝和HA并入到混合真皮填充物平台中，并且递送具有覆盖宽范围的流变性质的多种原型。更重要的是，一些性质可以通过改变水凝胶配方和工艺而潜在地分离。以下各图汇总了来自多于90种不同原型的流变性质，并且提供了这种独特技术平台的能力和其可以提供的多样性的概述。评价了包括在这些水凝胶原型中的两种不同的丝分子并汇总在此报告中。
储能模量(G')是弹性或储能能力的量度。对于典型的真皮填充物产品，注射力(IF)通常与G'成比例。SMA水凝胶在窄的IF(10-30N)范围内具有宽的G'(30-300Pa)，这归因于含丝的制剂和方法。图71中的数据通过针的尺寸分组，或者30G x1/2”(绿色)或者27Gx1/2”(红色)。这些数据基于填充在玻璃注射器中的样品，而不是使用可将IF降低～50％的COC注射器的当前SMA设计。图71：SMA真皮填充物注射力(IF)相对于储能模量(G')。
损耗模量(G”)是粘度或损耗能量能力的量度。与G'相似，不同SMA水凝胶制剂的G”在30-300Pa的宽范围内变化，在10-30N的窄注射力范围内，图72中的数据根据针尺寸分组，或者30G x1/2”(绿色)或者27G x1/2”(红色)。这些数据基于储存在玻璃注射器中的样品，而不是使用可将IF降低～50％的COC注射器的当前SMA设计。图72：SMA真皮填充物注射力(IF)相对于损耗模量(G”)。
Tan(δ)定义为G”/G'的比率，并且是阻尼性质的量度。在给定的G'范围内，例如100-150Pa，不同的SMA水凝胶制剂显示了0.15-0.55的宽范围的Tan(δ)。在Tan(δ)的一定范围内，例如0.5-0.6，SMA水凝胶的G'可以低至50Pa和高至350Pa。图73中的数据证明了SMA水凝胶中G'和Tan(δ)的分离性质。图73：SMA真皮填充物储能模量(G’)相对于Tan(δ)。
复数粘度(η*)是流动阻力的量度。通常，粘度越高，注射力越高。由于含有丝配方，即使当一些SMA水凝胶的复数粘度高于10Pa·s时，注射力也可以保持在可接受的水平。图74中的数据通过针的尺寸分组，或者30G x 1/2”(绿色)或者27G x1/2”(红色)。这些数据基于填充在玻璃注射器中的样品，而不是使用可将IF降低～50％的COC注射器的当前SMA设计。图74：SMA真皮填充物注射力(IF)相对于复数粘度(η*)。
G”通常随着G'而变化。由于水凝胶制剂中的丝，SMA水凝胶的G'可以高达大于350Pa，而G”可以低至小于50Pa。在一些其他情况下，在G'范围为250-300Pa时，G”在30Pa至300Pa之间变化。图75中的数据证明了SMA水凝胶中G'和G”的分离性质。图75：SMA真皮填充物储能模量(G')相对于损耗模量(G”)。
许多真皮填充物制造商通过调节产品中HA的浓度来控制G'。简单稀释HA水凝胶可降低G'。SMA的丝-HA平台使得产物G'不依赖于总的丝和HA浓度。对于每种给定的浓度，G'可以低至50Pa或高至350Pa。SMA能够开发在低浓度下具有高G'或在相对高浓度下具有低G'的真皮填充物产品。图76：SMA真皮填充物储能模量(G')相对于丝+HA浓度。
SMA的独特的真皮填充物平台将丝技术结合到真皮填充物产品中，提供了设计和开发具有期望的机械和流变性质的新的真皮填充物产品的通用工具，并且极大地扩展了产品的组合。
参考文献
1.Goldberg DJ.Breakthroughs in US dermal fillers for facial soft-tissue augmentation.J Cosmet Laser Ther.2009；11(4):240-7.
2.Bray D,Hopkins C,Roberts DN.A review of dermal fillers in facialplastic surgery.Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg.2010；18(4):295-302.
3.Liu MH,Beynet DP,Gharavi NM.Overview of Deep Dermal Fillers.FacialPlast Surg.2019；35(3):224-9.
4.Kopera D,Ivezic-Schoenfeld Z,Federspiel IG,Grablowitz D,Gehl B,Prinz M.Treatment of facial lipoatrophy,morphological asymmetry,ordebilitating scars with the hyaluronic acid dermal filler Princess((R))FILLER.Clin Cosmet Investig Dermatol.2018；11:621-8.
5.Cheng LY,Sun XM,Tang MY,Jin R,Cui WG,Zhang YG.An update review onrecent skin fillers.Plastic and Aesthetic Research.2016；3:92-9.
6.Fallacara A,Manfredini S,Durini E,Vertuani S.Hyaluronic AcidFillers in Soft Tissue Regeneration.Facial Plast Surg.2017；33(1):87-96.
7.Lee DY,Cheon C,Son S,Kim YZ,Kim JT,Jang JW,et al.Influence ofMolecular Weight on Swelling and Elastic Modulus of Hyaluronic Acid DermalFillers.Polymer(Korea).2015；39(6):976-80.
8.Kablik J,Monheit GD,Yu L,Chang G,Gershkovich J.Comparative physicalproperties of hyaluronic acid dermal fillers.Dermatol Surg.2009；35Suppl 1:302-12.
9.Perez-Perez L,Garcia-Gavin J,Wortsman X,Santos-BrizA.DelayedAdverse Subcutaneous Reaction to a New Family of Hyaluronic AcidDermalFillers With Clinical,Ultrasound,and Histologic Correlation.DermatolSurg.2017；43(4):605-8.
10.Altman GHD,Frank.Jakuba,Caroline.Calabro,Tara.Horan,RebeccaL.Chen,Jingsong.Lu,Helen.Richmond,John.Kaplan,David L.Silk-basedbiomaterials.Biomaterials 2003；24:401-16.
11.Chen J,Altman GH,Karageorgiou V,Horan R,Collette A,Volloch V,etal.Human bone marrow stromal cell and ligament fibroblastresponses on RGD-modified silk fibers.J Biomed Mater Res A.2003；67(2):559-70.
12.Li ABK,Jonathan A.Guziewicz,Nicholas A.Omenetto,FiorenzoG.Kaplan,David L..Silk-based stabilization of biomacromolecules.2015.
13.Chen FM,Liu X.Advancing biomaterials of human origin fortissueengineering.Prog Polym Sci.2016；53:86-168.
14.Rahme K,Dagher N.Chemistry Routes for CopolymerSynthesisContaining PEG for Targeting,Imaging,and Drug DeliveryPurposes.Pharmaceutics.2019；11(7).
15.Standardization IOf.ISO 10993-6:2016.Biological evaluationofmedical devices—Part 6:Tests for local effects after implantation.Geneva,Switzerland:ISO；2016.p.29.
16.Standardization IOf.ISO 10993-1:2018.Biological evaluationofmedical devices—Part 1:Evaluation and testing within a riskmanagementprocess.Geneva,Switzerland:ISO；2018.p.41.
17.Administration USFaD.Biological evaluation of medical devices-Part1:Evaluation and testing within a risk management process.2016.
18.Raia NR,Partlow BP,McGill M,Kimmerling EP,Ghezzi CE,KaplanDL.Enzymatically crosslinked silk-hyaluronic acidhydrogels.Biomaterials.2017；131:58-67.
19.Yan S,Zhang Q,Wang J,Liu Y,Lu S,Li M,et al.Silkfibroin/chondroitinsulfate/hyaluronic acid ternary scaffolds for dermaltissuereconstruction.Acta Biomater.2013；9(6):6771-82.
20.Yan S,Wang Q,Tariq Z,You R,Li X,Li M,et al.Facilepreparation ofbioactive silk fibroin/hyaluronic acid hydrogels.Int J BiolMacromol.2018；118(Pt A):775-82.
21.Park SH,Cho H,Gil ES,Mandal BB,Min BH,Kaplan DL.Silk-fibrin/hyaluronic acid composite gels for nucleus pulposus tissueregeneration.Tissue Eng Part A.2011；17(23-24):2999-3009.
22.Li AB,Kluge JA,Guziewicz NA,Omenetto FG,et al.Silk-basedstabilization of biomacromolecules.J Control Release 2015；219:416-430.
23.Altman GH,Diaz F,Jakuba C,Calabro T,et al.Silk-basedbiomaterials.Biomaterials 2003；24:401-16.

Claims (91)

1.一种生物相容性组合物，其包含丝心蛋白或丝心蛋白片段、透明质酸(HA)以及聚乙二醇(PEG)和/或聚丙二醇(PPG)，
其中所述HA的一部分通过一个或多个连接剂部分而被改性或交联，所述一个或多个连接剂部分包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和仲醇中的一种或多种，并且
其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分是
游离的和/或未交联的。
2.根据权利要求1所述的组织填充物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分被改性或交联。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的组织填充物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分交联至HA。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分交联至丝心蛋白或丝心蛋白片段。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组织填充物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段基本上不含丝胶蛋白。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分具有选自低分子量、中等分子量和高分子量的平均重均分子量。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的多分散性为1至约5.0。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述丝心蛋白或丝心蛋白片段的多分散性为约1.5至约3.0。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％的改性度(MoD)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中使用单环氧-或二环氧-PEG、单缩水甘油基-、二缩水甘油基-或多缩水甘油基-PEG、单缩水甘油基-或二缩水甘油基-PEG、单环氧-或二环氧-PPG、单缩水甘油基-、二缩水甘油基-或多缩水甘油基-PPG、单缩水甘油基-或二缩水甘油基-PPG或它们的任何组合作为交联剂获得改性或交联。
11.根据权利要求1至10任一项所述的组合物，其还包含利多卡因。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述组合物为凝胶或水凝胶。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL、约30mg/mL、约31mg/mL、约32mg/mL、约33mg/mL、约34mg/mL、约35mg/mL、约36mg/mL、约37mg/mL、约38mg/mL、约39mg/mL或约40mg/mL。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA与丝心蛋白或丝心蛋白片段的比率为约91/9、约92/8、约93/7、约94/6、约95/5、约96/4、约97/3、约18/12、约27/3、约29.4/0.6、约99/1、约92.5/7.5、约90/10、约80/20、约70/30、约60/40或约50/50。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA与丝心蛋白或丝心蛋白片段的比率为约50/50、约51/49、约52/48、约53/47、约54/46、约55/45、约56/44、约57/43、约58/42、约59/41、约60/40、约61/39、约62/38、约63/37、约64/36、约65/35、约66/34、约67/33、约68/32、约69/31、约70/30、约71/29、约72/28、约73/27、约74/26、约75/25、约76/24、约77/23、约78/22、约79/21、约80/20、约81/19、约82/18、约83/17、约84/16、约85/15、约86/14、约87/13、约88/12、约89/11、约90/10、约91/9、约92/8、约93/7、约94/6、约95/5、约96/4、约97/3、约98/2或约99/1。
16.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的游离和/或未交联丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL或约8mg/mL。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述游离和/或未交联丝心蛋白或丝心蛋白片段的一部分包含中值粒度为1.0μm至50.0μm、1.0μm至25.0μm、1.0μm至10.0μm、30.0μm至50.0μm、35.0μm至45.0μm、35.0μm至55.0μm或25.0μm至45.0μm的丝微粒。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够通过30G或27G针注射，并且通过30G针的注射力为约10N至约80N。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够通过30G针以以下的注射力注射：约1N、约2N、约3N、约4N、约5N、约6N、约7N、约8N、约9N、约10N、约11N、约12N、约13N、约14N、约15N、约16N、约17N、约18N、约19N、约20N、约21N、约22N、约23N、约24N、约25N、约26N、约27N、约28N、约29N、约30N、约31N、约32N、约33N、约34N、约35N、约36N、约37N、约38N、约39N、约40N、约41N、约42N、约43N、约44N、约45N、约46N、约47N、约48N、约49N、约50N、约51N、约52N、约53N、约54N、约55N、约56N、约57N、约58N、约59N、约60N、约61N、约62N、约63N、约64N、约65N、约66N、约67N、约68N、约69N、约70N、约71N、约72N、约73N、约74N、约75N、约76N、约77N、约78N、约79N、约80N、约81N、约82N、约83N、约84N、约85N、约86N、约87N、约88N、约89N、约90N、约91N、约92N、约93N、约94N、约95N、约96N、约97N、约98N、约99N或约100N。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约5Pa至约500Pa、约15Pa至约50Pa、约50Pa至约100Pa、约100Pa至约200Pa、约200Pa至约300Pa、约300Pa至约350Pa、约350Pa至约400Pa、约400Pa至约450Pa或约450Pa至约500Pa。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约5Pa至约500Pa、约15Pa至约50Pa、约50Pa至约100Pa、约100Pa至约200Pa、约200Pa至约300Pa、约300Pa至约350Pa、约350Pa至约400Pa、约400Pa至约450Pa或约450Pa至约500Pa。
22.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的Tan(δ)(G”/G’)为0至约0.2、约0.2至约0.4、约0.4至约0.6、约0.6至约0.8、约0.8至约1.0或约1.0至约1.2。
23.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为0至约5Pa·s、约5Pa·s至约10Pa·s、约10Pa·s至约15Pa·s、约15Pa·s至约20Pa·s或约20Pa·s至约25Pa·s。
24.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约400Pa，并且注射力(27G)为约10N至约70N。
25.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约10Pa至约350Pa，并且注射力(30G)为约5N至约70N。
26.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约25Pa至约350Pa，并且注射力(27G)为约10N至约70N。
27.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约10Pa至约400Pa，并且注射力(30G)为约10N至约70N。
28.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的储能模量(G’)为约25Pa至约400Pa，并且Tan(δ)(G”/G’)为0至约1.2。
29.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约2.5至约25Pa·s，并且注射力(27G)为约10N至约70N。
30.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的复数粘度(η*)为约1至约20Pa·s，并且注射力(30G)为约5N至约75N。
31.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物的损耗模量(G”)为约5Pa至约400Pa，并且储能模量(G’)为约1Pa至约400Pa。
32.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约15mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约1Pa至约350Pa。
33.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约18mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约350Pa。
34.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约20mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约20Pa至约400Pa。
35.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约22mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约25Pa至约200Pa。
36.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约24mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约350Pa。
37.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约26mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约50Pa至约400Pa。
38.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的HA和丝心蛋白或丝心蛋白片段的总浓度为约28mg/mL，其中所述组合物的储能模量(G’)为约150Pa至约300Pa。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的组合物，其还包含显像剂。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述显像剂选自碘、DOPA和成像纳米颗粒。
41.根据权利要求39所述的组合物，其中所述显像剂选自顺磁性显像剂和超顺磁性显像剂。
42.根据权利要求39所述的组合物，其中所述显像剂选自基于NP的磁共振成像(MRI)造影剂、正电子发射断层扫描(PET)/单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像剂、超声活性颗粒和光学活性(例如发光、荧光、红外)颗粒。
43.根据权利要求39所述的组合物，其中所述显像剂是SPECT显像剂、PET显像剂、光学显像剂、MRI或MRS显像剂、超声显像剂、多模态显像剂、X射线显像剂或CT显像剂。
44.一种治疗或预防有需要的受试者的病症、疾病或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至43中任一项所述的组合物。
45.根据权利要求44的方法，其中所述皮肤病况选自皮肤脱水、皮肤缺乏弹性、皮肤粗糙、皮肤缺乏紧致度、皮肤拉伸纹、皮肤拉伸痕、皮肤苍白、真皮起皮、面颊凹陷、薄唇、后眼窝缺陷、面部褶皱和皱纹。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者的真皮区域中。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述方法是增大、重建、治疗疾病、治疗病症、矫正身体部分、区域或部位的缺陷或瑕疵。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中所述方法是面部增大、面部重建、治疗面部疾病、治疗面部病症、治疗面部缺陷或治疗面部瑕疵。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中所述方法包括深层皮下和/或深层骨膜上施用。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中所述方法包括脸颊增大、嘴唇增大、真皮植入、口周皱纹矫正和/或鼻唇沟褶皱矫正。
51.根据权利要求44所述的方法，其中将所述组合物注射到组织中。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述组织与所述病症、疾病或病况相关。
53.根据权利要求51或权利要求52所述的方法，其中将所述组合物施用于所述组织的壁中。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述组织包括内脏器官的壁的一部分。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用引起所述组织的膨胀。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述病症、疾病或病况通过所述组织的膨胀来治疗或预防。
57.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况选自尿失禁、胃食管反流病(GERD)、膀胱输尿管反流、大便失禁、牙齿组织缺陷、声带组织缺陷、喉缺陷和其他非真皮软组织缺陷。
58.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是尿失禁。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述尿失禁是压力性尿失禁、固有括约肌缺陷(ISD)、压力性尿失禁、固有括约肌缺陷(ISD)、充溢性尿失禁或遗尿。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述组织是尿道或尿道括约肌的一部分。
61.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是胃食管反流病(GERD)。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述组织是食管下端括约肌或膈的一部分。
63.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是膀胱输尿管反流。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述组织是尿道括约肌的一部分。
65.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是大便失禁。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述组织是直肠的一部分。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中将所述组合物施用于直肠壁的一定区域中。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述直肠壁的区域在肛门括约肌附近。
69.根据权利要求68所述的方法，其中将所述组合物施用于内括约肌中。
70.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述病症、疾病或病况是声带组织缺陷或喉缺陷。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述声带组织缺陷或喉缺陷选自声门闭合不全、单侧声带麻痹、双侧声带麻痹、麻痹性发声障碍、非麻痹性发声障碍、痉挛性发声障碍、声带不全麻痹(“轻瘫”)、声带整体弱化、声带瘢痕化以及它们的任何组合。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述组织是声带或喉的一部分。
73.根据权利要44所述的方法，还包括施用抗癌治疗，其中所述病症、疾病或病况选自宫颈癌、直肠癌、肺肿瘤、纵隔淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、胰腺癌、头颈癌、肺癌、肝癌、阴道癌、良性前列腺增生(BPH)、月经过多、子宫肌瘤、前列腺腺癌、胰腺癌、头颈癌、肺癌、肝癌和阴道癌。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述抗癌治疗包括施用放射治疗(RT)、冷冻治疗、药物治疗、热和/或热消融、射频和/或微波或冷冻治疗中的一种或多种。
75.根据权利要求74所述的方法，其中放射治疗包括外射束放射治疗、3D适形调强放射治疗、调强放射治疗、间质前列腺近距离治疗、使用永久性种子的间质前列腺近距离治疗、使用临时性种子的间质前列腺近距离治疗、使用高剂量率遥控后装的间质前列腺近距离治疗、使用伽马照射的外部放射治疗、高能光子射束治疗、质子射束治疗、中子射束治疗、重粒子射束治疗、近距离治疗、热辐射中的一种或多种或它们的任何组合。
76.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述第一组织与所述第二组织之间施用，或施用于所述第一组织与所述第二组织之间的空间或虚拟空间中。
77.根据权利要求76所述的方法，其中在施用所述组合物时，所述第一组织相对于所述第二组织移位。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述空间或虚拟空间是迪氏空间或与迪氏筋膜相邻的空间或虚拟空间。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中所述第一组织在施用所述组合物之后接受所述抗癌治疗。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述第一组织接受与所述第一组织在不存在所述组合物的情况下将接受的抗癌治疗剂量相比基本上相同的抗癌治疗剂量。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的方法，其中所述第二组织接受所述抗癌治疗。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述第二组织接受与所述第二组织在不存在所述组合物的情况下将接受的抗癌治疗剂量相比较低的抗癌治疗剂量。
83.根据权利要求76至82中任一项所述的方法，其中所述第二组织基本上不接受抗癌治疗剂量。
84.根据权利要求76至83中任一项所述的方法，其中所述第一组织和所述第二组织各自独立地包括肿瘤组织、细胞群、细胞群和间质、器官、器官的一部分或身体的解剖部分。
85.根据权利要求76至83中任一项所述的方法，其中所述第一组织包括肿瘤组织，并且所述第二组织包括器官。
86.根据权利要求76至83中任一项所述的方法，其中所述第一组织包括器官，并且所述第二组织包括器官。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述第一组织包括前列腺的一部分，并且所述第二组织包括直肠的一部分。
88.根据权利要求44至86中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用麻醉剂。
89.根据权利要求44至87中任一项所述的方法，其还包括使所述组合物在所述受试者中生物降解。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述生物降解是水解、蛋白水解、酶降解、体内细胞作用或它们的组合。
91.根据权利要求88所述的方法，其中所述组合物通过透明质酸酶酶促降解而生物降解。
CN202180050630.8A 2020-06-19 2021-06-19 用于组织填充、组织间隔和组织膨胀的丝-透明质酸组合物 Pending CN116507315A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063041616P 2020-06-19 2020-06-19
US63/041581 2020-06-19
US63/041616 2020-06-19
US63/041678 2020-06-19
PCT/US2021/038157 WO2021258030A1 (en) 2020-06-19 2021-06-19 Silk-hyaluronic acid compositions for tissue filling, tissue spacing, and tissue bulking

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116507315A true CN116507315A (zh) 2023-07-28

Family

ID=87320666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180050630.8A Pending CN116507315A (zh) 2020-06-19 2021-06-19 用于组织填充、组织间隔和组织膨胀的丝-透明质酸组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116507315A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018290810B2 (en) Silk-hyaluronic acid based tissue fillers and methods of using the same
ES2745222T3 (es) Composición reticulada de seda-ácido hialurónico
US8288347B2 (en) Dermal fillers comprising silk fibroin hydrogels and uses thereof
ES2414879T4 (es) Hidrogeles de fibroína de seda y usos de éstos
EP2892575B1 (en) Hyaluronic acid/collagen- based dermal filler compositions and methods for making same
CN113677320A (zh) 丝-透明质酸组织填充物及其制备和使用方法
JP2023530484A (ja) 組織充填、組織間隔、及び組織バルキング用の絹－ヒアルロン酸組成物
US11660372B2 (en) Silk-hyaluronic acid based tissue fillers and methods of using the same
CN116507315A (zh) 用于组织填充、组织间隔和组织膨胀的丝-透明质酸组合物
EA045185B1 (ru) Тканевые филлеры на основе шелка и гиалуроновой кислоты и способы их применения

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40097849

Country of ref document: HK