CN116429925A - 一种测定动物组织中肌肽含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含量测定技术领域，尤其涉及一种测定动物组织中肌肽含量的方法。该方法使用甲醇与三氯乙酸的混合溶液作为样品前处理过程的提取溶液，使用同位素内标法定量，以超高效液相色谱‑四极杆串联质谱联用方法建立了动物组织中肌肽含量的检测方法。此方法的前处理条件简单，灵敏度高，定量准确，为动物组织中肌肽含量的准确测定提供了新的参考技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及含量测定技术领域，尤其涉及动物组织中肌肽含量的测定。
背景技术
肌肽是一种可以在动物体内合成的由β-丙氨酸和组氨酸组成的二肽，具有很强的抗氧化能力，自由基和金属离子引起的脂质氧化具有显著的抑制作用，具有延缓细胞衰老和功能衰竭等生物学作用。还有研究报道指出肌肽能够捕捉肝毒素和酒精作用过程产生的自由基，避免出现肝硬化；以游离态存在于动物组织中具有抗炎、抗氧化和清除自由基的特性。
近年来，肌肽的生理活性引起了人们的广泛关注，针对肌肽的研究也逐渐深入。很多研究者需要测量动物组织中的肌肽含量用来研究肌肉代谢和品质变化规律或者通过测量不同物种之间的肌肽含量差异来间接鉴定一些肉制品中所用原料。
目前，肌肽含量的测定方法有液相色谱法、毛细管电泳法和液相色谱串联质谱法，但是使用液相色谱法进行测定时，因为基线较高，测定结果易受到干扰的问题，所以液相色谱法测定准确度尚需考察。而毛细管电泳法对样品分离纯化度的要求较高，成本高。而液相色谱串联质谱法在动物组织肌肽含量的测定中不管是灵敏度还是抗干扰性上都具有无可比拟的优势，但是目前研究报道中所采用的液相色谱串联质谱法均采用外标法定量，其检测结果易受基质效应和进样稳定性的干扰。可见，本领域缺乏一种低成本、简单、快速、准确测定动物组织中肌肽含量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种内标法测定肌肽含量的方法，该方法适用于准确快速测定动物组织中的肌肽含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种测定动物组织中肌肽含量的方法，包括以下步骤：
(1)、配置肌肽标准溶液及同位素内标液；
(2)、制备样品溶液：将试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液后顺次进行均质、离心，取上清液加入乙腈-水的混合溶液和同位素内标液混匀，经滤膜过滤后进样测定；
(3)、使用液相色谱-串联质谱仪测定肌肽含量；
所述液相色谱-串联质谱仪在测定肌肽含量时，以含0.08％～0.12％体积浓度甲酸的水溶液为流动相A，乙腈作为流动相B，液相色谱检测的洗脱条件如下：
在＜0.5min范围内，19％～21％流动相A，81％～79％流动相B；
在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相A，80％→50％流动相B；
在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相A，50％流动相B；
在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；
在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
质谱部分的检测条件为：
电喷雾化学电离源ESI，采用多反应监测模式，离子源温度为349℃～351℃，毛细管温度为239℃～241℃，加热模块温度为299℃～301℃，氮气流速2.9L/min～3.1L/min，干燥气流速9.9L/min～10.1L/min，加热气流速9.9L/min～10.1L/min。
优选的，所述液相色谱-串联质谱仪在测定肌肽含量时，以含0.1％体积浓度甲酸的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，液相色谱检测的洗脱条件如下：
在＜0.5min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相A，80％→50％流动相B；
在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相A，50％流动相B；
在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；
在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
质谱部分的检测条件为：
电喷雾化学电离源ESI，采用多反应监测模式，离子源温度为350℃，毛细管温度为240℃，加热模块温度为300℃，氮气流速3.0L/min，干燥气流速10.0L/min，加热气流速10.0L/min。
优选的，所述甲醇-三氯乙酸混合溶液由甲醇和体积浓度为2％的三氯乙酸以1:0.9～1.1的体积比混合而成；
所述乙腈-水的混合溶液由乙腈与水以0.9～1.1：1的体积比混合而成；
所述试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液时，试样与甲醇-三氯乙酸混合溶液的比例为1g：9.9ml～10.1ml，所述上清液与乙腈-水混合溶液及同位素内标液的体积比为1：88～90：9～11。
优选的，所述甲醇-三氯乙酸混合溶液由甲醇和体积浓度为2％的三氯乙酸以1：1的体积比混合而成；
所述乙腈-水的混合溶液由乙腈与水以1：1的体积比混合而成；
所述试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液时，试样与甲醇-三氯乙酸混合溶液的比例为1g：10ml，所述上清液与乙腈-水混合溶液及同位素内标液的体积比为1：89：10。
优选的，所述同位素内标液为1μg/mL的D4-肌肽溶液；
所述肌肽标准溶液中肌肽浓度为1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的系列肌肽标准溶液；
所述肌肽标准工作溶液中，D4-肌肽的浓度为100ng/mL。
优选的，所述肌肽标准溶液需要先使用水配置出1mg/mL的肌肽标准储备液并继续用水稀释得到10μg/mL的肌肽标准中间工作液，再使用乙腈-水的混合溶液稀释得到；
所述同位素内标液需要先使用水配置出D4-肌肽浓度为100μg/mL的内标标准储备液，再使用水稀释得到D4-肌肽浓度为1μg/mL的同位素内标液。
优选的，过滤使用的滤膜为0.21μL～0.23μL。
优选的，过滤使用的滤膜为0.22μL。
优选的，步骤(2)所述均质时间为0.5min～1.5min；所述离心，其离心速度为9000r/min～11000r/min，离心时间为4min～6min。
优选的，液相色谱使用的色谱柱为Waters ACQUITY BEH Amide柱，2.1mm×100mm，1.7μm。
肌肽(L-Carnosine)，学名β-丙氨酰-L-组氨酸，是一种由β-丙氨酸和L-组氨酸两种氨基酸组成的二肽，其结构式为：
本发明使用甲醇与三氯乙酸的混合溶液作为样品前处理过程的提取溶液，使用同位素内标法定量，以超高效液相色谱-四极杆串联质谱联用方法建立了动物组织中肌肽含量的检测方法。
因为肌肽易溶于水不易溶于有机溶剂，现有技术中多采用水作为提取溶液，但在实验过程中发现，使用水作为肌肽提取溶液时，虽然提取效果较好，但其前处理过长时，在大批量处理样品时，肌肽在基质提取液中存在一定降解现象。为保证检测数据的稳定性，本发明对提取溶液进行了优化，最终选取甲醇与三氯乙酸的混合溶液作为样品前处理过程的提取溶液。
与外标法相比，内标法将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，消除了操作条件的波动对分析结果产生的影响，准确度更高。
在色谱中，流动相的种类及比例影响着待测组分的分离机色谱图基线形状，选择合适的流动相，使色谱峰响应度更好，会对检测准确度及灵敏性产生影响。本发明选择乙腈和甲酸作为流动相，获得更好的色谱峰形及更高的准确度。
综上所述，本发明所述方法的前处理条件简单，还具有灵敏度高，定量准确的特点，为动物组织中肌肽含量的准确测定提供了新的参考技术手段
附图说明
图1为甲醇与体积浓度2％三氯乙酸以体积比1：1混合得到的混合溶液作为提取溶液时，经检测得到的峰形；
图2为体积浓度为10％的三氯乙酸溶液作为提取溶液时，经检测得到的峰形；
图3为甲醇作为提取溶液时，经检测得到的峰形；
图4为以10ng/mL的肌肽标准溶液作为待检测溶液，流动相为乙腈和体积浓度为0.1％甲酸时的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种测定动物组织中肌肽含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)、配置肌肽标准溶液及同位素内标液；
(2)、制备样品溶液：将试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液后顺次进行均质、离心，取上清液加入乙腈-水的混合溶液和同位素内标液混匀，经滤膜过滤后进样测定；
(3)、使用液相色谱-串联质谱仪测定肌肽含量；
在本发明中，所述液相色谱-串联质谱仪在测定肌肽含量时，流动相A为0.08％～0.12％体积浓度甲酸的水溶液，优选为含0.09～0.11％体积浓度甲酸的水溶液，进一步优选为含0.1％体积浓度甲酸的水溶液；乙腈作为流动相B，液相色谱检测的洗脱条件如下：
在＜0.5min范围内，19％～21％流动相A，81％～79％流动相B，优选为20％流动相A，80％流动相B；
在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相A，80％→50％流动相B；
在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相A，50％流动相B；
在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；
在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相A，80％流动相B。
在本发明中，质谱部分的检测条件为：
电喷雾化学电离源ESI(+)，采用多反应监测模式，离子源温度为349℃～351℃，优选为350℃；毛细管温度为239℃～241℃，优选为240℃；加热模块温度为299℃～301℃，优选为300℃；氮气流速2.9L/min～3.1L/min，优选为3.0L/min；干燥气流速9.9L/min～10.1L/min，优选为10.0L/min；加热气流速9.9L/min～10.1L/min，优选为10.0L/min。
在本发明中，所述甲醇-三氯乙酸混合溶液中甲醇和体积浓度为2％的三氯乙酸的体积比为1：0.9～1.1，优选为1：1。
在本发明中，所述乙腈-水的混合溶液由乙腈与水以0.9～1.1：1的体积比混合而成，优选为乙腈与水以1：1的体积比混合而成。
在本发明中，所述试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液时，试样与甲醇-三氯乙酸混合溶液的比例为1g：9.9ml～10.1ml，优选为1g：10ml；所述上清液与乙腈-水混合溶液及同位素内标液的体积比为1：88～90：9～11，优选为1：89：10。
在本发明中，所述同位素内标液为1μg/mL的D4-肌肽溶液。
在本发明中，所述肌肽标准溶液中肌肽浓度为500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL的系列肌肽标准溶液。
在本发明中，所述肌肽标准工作溶液中，D4-肌肽的浓度为100ng/mL。
在本发明中，所述肌肽标准溶液需要先使用水配置出1mg/mL的肌肽标准储备液并继续用水稀释得到10μg/mL的肌肽标准中间工作液，再使用乙腈-水的混合溶液稀释得到。
在本发明中，所述同位素内标液需要先使用水配置出D4-肌肽浓度为100μg/mL的内标标准储备液，再使用水稀释得到D4-肌肽浓度为1μg/mL的同位素内标液。
在本发明中，过滤使用的滤膜为0.21μL～0.23μL，优选为0.22μL。
在本发明中，步骤(2)所述均质时间为1min，所述离心，其离心速度为10000r/min，离心时间为5min。
在本发明中，液相色谱使用的色谱柱为Waters ACQUITY BEH Amide柱，2.1mm×100mm，1.7μm。
在本发明中，以信噪比S/N≥3和S/N≥10确定检出限(LOD)和定量限(LOQ)为0.3ng/mL和1ng/mL。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明各实施例中，所用仪器与试剂优选为UPLC 8050超高效液相色谱-串联质谱仪(日本Shimadzu公司)；Sigma 3K-15型离心机(美国Sigma公司)；PT2100型均质器(瑞士Kinematica公司)；N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation公司)；涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)；Milli-Q纯化系统(美国Millipore公司)。乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，德国Fluka公司)；三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，水为Milli-Q高纯水。
肌肽和D4-肌肽购于Sigma公司，纯度大于98％。
以L-肌肽及其对应的同位素内标浓度比值为横坐标，以峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程和相关系数(R)，L-肌肽1～500ng/mL范围内呈良好线性关系，线性方程为Y＝4.18054X+0.201831，相关系数R为0.99989。
实施例1
称取2g均匀试样，置于50mL离心管中，加入20mL甲醇-体积浓度2％三氯乙酸(1:1，V/V)，均质1min后，在10000r/min下离心5min。取10μL上清液加入890μL乙腈-水体积比为1：1的混合溶液混匀后，过0.22μm滤膜进样测定，得到甲醇与体积浓度2％三氯乙酸以体积比1：1混合得到的混合溶液作为提取溶液时的峰形，如图1。
通过图1可以发现，以甲醇与体积浓度2％三氯乙酸以体积比1：1混合得到的混合溶液作为样品前处理过程的提取溶液时，其提取效率较高、数据较稳定并且具有较好的峰形。
实施例2
准确称取肌肽标准品粉末10.0mg，加水溶解，涡旋混匀，定容至10mL，即得1mg/mL的标准储备液；根据需要，移取100μL肌肽标准储备液，定容至10mL，即得10μg/mL的标准中间工作液；标准中间工作液用乙腈-水(1：1，V/V)逐级稀释成500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL的系列标准工作溶液。
称取D4-肌肽标准品粉末1.0mg，加水溶解，涡旋混匀，定容至10mL，即得100μg/mL的内标标准储备液，再使用水稀释得到D4-肌肽浓度为1μg/mL的同位素内标液。
将10μL的10ng/mL肌肽标准溶液加入890μL乙腈与水按照体积比1：1得到的混合溶液中，再加入100μL同位素内标液并混匀。过0.22μm滤膜进样测定。
测定时色谱部分以含0.1％体积浓度甲酸的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，液相色谱检测的洗脱条件如下：
在＜0.5min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相A，80％→50％流动相B；
在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相A，50％流动相B；
在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；
在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相A，80％流动相B，得流动相为乙腈和体积浓度为0.1％甲酸时的色谱图，如图4。
通过图4可以发现，使用乙腈和体积浓度为0.1％甲酸作为色谱流动相时，得到的色谱峰峰形对称，且分离度和灵敏度均能满足测定要求。
实施例3
分别取牛肉和羊肉不同组织部分各30份，分别称取2g(精确到0.01g)均匀试样，置于50mL离心管中，加入20mL甲醇和体积浓度为2％三氯乙酸按照体积比1：1得到的混合溶液，均质1min后，在10000r/min速度下离心5min。取10μL上清液加入890μL乙腈与水按照体积比1：1得到的混合溶液，再加入100μL浓度为1μg/mL的D4-肌肽作为同位素内标液并混匀，过0.22μm滤膜进样测定。
测定时色谱部分以含0.1％体积浓度甲酸的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，液相色谱检测的洗脱条件如下：
在＜0.5min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相A，80％→50％流动相B；
在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相A，50％流动相B；
在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；
在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
质谱部分的检测条件为：
电喷雾化学电离源ESI，采用多反应监测模式，离子源温度为350℃，毛细管温度为240℃，加热模块温度为300℃，氮气流速3.0L/min，干燥气流速10.0L/min，加热气流速10.0L/min。
对结果进行汇总分析，得到牛肉羊肉不同部位的肌肽含量见表1：
表1：肌肽含量测定结果
实施例4
分别取已知含量的牛肉、羊肉后臀尖精瘦肉部分各8份，按照1000mg/kg的标准在上述羊肉、牛肉中加入肌肽对照品，按照实施例3所述方法测定肌肽含量并计算加标回收率。
回收率P＝(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100％
测定结果见表2。
表2：方法的的加标回收率及相对标准偏差
由表2可知，方法的回收率为76.2％～115.1％之间，相对标准偏差(RSD)为10.0％～11.2％。
对比例1
称取2g均匀试样，置于50mL离心管中，加入20mL体积浓度为10％的三氯乙酸，均质1min后，在10000r/min下离心5min。取10μL上清液加入890μL乙腈-水体积比为1：1的混合溶液混匀后，过0.22μm滤膜进样测定，得到体积浓度为10％的三氯乙酸溶液作为提取溶液时的峰形，如图2。
通过图2可以发现，以体积浓度为10％的三氯乙酸溶液作为样品前处理过程的提取溶液时，提取率尚可，但峰形存在分叉现象，不易作为分析使用。
对比例2
称取2g均匀试样，置于50mL离心管中，加入20mL甲醇，均质1min后，在10000r/min下离心5min。取10μL上清液加入890μL乙腈-水体积比为1：1的混合溶液混匀后，过0.22μm滤膜进样测定，得到甲醇作为提取溶液时的峰形，如图3。
通过图3可以发现，使用甲醇作为样品前处理过程的提取溶液时，虽然峰形较好，但是提取率较低。
通过图1～3可以发现，采用10％三氯乙酸进行提取时，峰形存在分叉；采用甲醇提取时，提取率只有水提取率的60％，提取效率较低。采用甲醇-2％三氯乙酸(1:1，V/V)作为提取溶剂时，提取效率较高的同时还具有良好的峰形，有利于获得稳定的数据。
通过图4可以看出，加入0.1％甲酸时的色谱峰响应较高，并且其峰形对称性好，分离度和灵敏度能满足测定要求。
本发明使用甲醇与三氯乙酸的混合溶液作为样品前处理过程的提取溶液，使用同位素内标法定量，以超高效液相色谱-四极杆串联质谱联用方法建立了动物组织中肌肽含量的检测方法。测定牛羊不同部位组织肌肽含量，此方法的前处理条件简单，灵敏度高，定量准确，为动物组织中肌肽含量的准确测定提供了新的参考技术手段。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种测定动物组织中肌肽含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、配置肌肽标准溶液及同位素内标液；
(2)、制备样品溶液：将试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液后顺次进行均质、离心，取上清液加入乙腈-水的混合溶液和同位素内标液混匀，经滤膜过滤后进样测定；
(3)、使用液相色谱-串联质谱仪测定肌肽含量；
所述液相色谱-串联质谱仪在测定肌肽含量时，以含0.08％～0.12％体积浓度甲酸的水溶液为流动相A，乙腈作为流动相B，液相色谱检测的洗脱条件如下：
在＜0.5min范围内，19％～21％流动相A，81％～79％流动相B；
在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相A，80％→50％流动相B；
在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相A，50％流动相B；
在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；
在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
质谱部分的检测条件为：
电喷雾化学电离源ESI，采用多反应监测模式，离子源温度为349℃～351℃，毛细管温度为239℃～241℃，加热模块温度为299℃～301℃，氮气流速2.9L/min～3.1L/min，干燥气流速9.9L/min～10.1L/min，加热气流速9.9L/min～10.1L/min。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱仪在测定肌肽含量时，以含0.1％体积浓度甲酸的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，液相色谱检测的洗脱条件如下：
在＜0.5min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
在≥0.5min且＜3.0min范围内，20％→50％流动相A，80％→50％流动相B；
在≥3.0min且＜5.0min范围内，50％流动相A，50％流动相B；
在≥5.0min且＜5.1min范围内，50％→20％流动相A，50％→80％流动相B；
在≥5.1min且≤7.0min范围内，20％流动相A，80％流动相B；
质谱部分的检测条件为：
电喷雾化学电离源ESI，采用多反应监测模式，离子源温度为350℃，毛细管温度为240℃，加热模块温度为300℃，氮气流速3.0L/min，干燥气流速10.0L/min，加热气流速10.0L/min。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述甲醇-三氯乙酸混合溶液由甲醇和体积浓度为2％的三氯乙酸以1:0.9～1.1的体积比混合而成；
所述乙腈-水的混合溶液由乙腈与水以0.9～1.1：1的体积比混合而成；
所述试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液时，试样与甲醇-三氯乙酸混合溶液的比例为1g：9.9ml～10.1ml，所述上清液与乙腈-水混合溶液及同位素内标液的体积比为1：88～90：9～11。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述甲醇-三氯乙酸混合溶液由甲醇和体积浓度为2％的三氯乙酸以1：1的体积比混合而成；
所述乙腈-水的混合溶液由乙腈与水以1：1的体积比混合而成；
所述试样加入甲醇-三氯乙酸混合溶液时，试样与甲醇-三氯乙酸混合溶液的比例为1g：10ml，所述上清液与乙腈-水混合溶液及同位素内标液的体积比为1：89：10。
5.根据权利要求1或2或4所述的测定方法，其特征在于，所述同位素内标液为1μg/mL的D4-肌肽溶液；
所述肌肽标准溶液中肌肽浓度为1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的系列肌肽标准溶液；
所述肌肽标准工作溶液中，D4-肌肽的浓度为100ng/mL。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述肌肽标准溶液需要先使用水配置出1mg/mL的肌肽标准储备液并继续用水稀释得到10μg/mL的肌肽标准中间工作液，再使用乙腈-水的混合溶液稀释得到；
所述同位素内标液需要先使用水配置出D4-肌肽浓度为100μg/mL的内标标准储备液，再使用水稀释得到D4-肌肽浓度为1μg/mL的同位素内标液。
7.根据权利要求1或2或4或6所述的测定方法，其特征在于，过滤使用的滤膜为0.21μL～0.23μL。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于过滤使用的滤膜为0.22μL。
9.根据权利要求1或2或4或6或8所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)所述均质时间为0.5min～1.5min，所述离心，其离心速度为9000r/min～11000r/min，离心时间为4min～6min。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，液相色谱使用的色谱柱为WatersACQUITYBEHAmide柱，2.1mm×100mm，1.7μm。
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