CN116212087A - 一种稀土金属基复合抑菌吸收垫及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稀土金属基复合抑菌吸收垫及其制备方法,该吸收垫通过将无纺布浸泡在复合抑菌剂分散液中得到,其中,复合抑菌剂由包括壳聚糖季铵盐TMCS、EuW10为原料制备而得。该抑菌垫以天然的高分子碱性氨基多糖化合物进一步改性修饰而得到的TMCS和自身具有较强的抑菌效果的一种含有稀土金属铕的多酸EuW10作为原料制备复合型抑菌剂,且对E.coli具有高效抑菌功能,根据培养基涂板结果显示,抑菌吸收垫对E.coli菌落杀死率能够达到100%。
Description
技术领域
本发明属于抑菌吸收垫生产领域,尤其是涉及一种稀土金属基复合抑菌吸收垫及其制备方法。
背景技术
随着生活水平的迅速提高,消费者越来越意识到食品尤其是肉类制品的质量和安全的重要性。因此,越来越多的研究集中在延长冷鲜肉的保质期上。由于其生物成分,鲜肉是一种极易腐烂的食品。微生物的生长通常是其变质的原因,以及生化和酶的恶化(蛋白质水解、脂肪分解和氧化)。肉类在冰箱中的保质期可能短至3 ~ 5天,细菌腐败导致异味、异味、变色、产生气体、产生粘液和降低pH值,导致重大经济损失。为了延长其保质期,需要有效的技术来控制食源性微生物的传播和生长。大肠杆菌(E.coli)就是一类典型的导致人患食源性疾病的微生物,E.coli平时寄存于人和动物的肠道系统中,一般情况下不会发病,但如果使用了沾染了此菌的食物就会使人产生恶心、腹痛、呕吐等症状,严重者还会造成多器官感染等。
许多添加剂(如亚硝酸钠等)被用于延长肉类或肉制品的保质期,这是保存这些商品最常用的方法,而多年来也使用了许多合成添加剂。然而,人们怀疑使用它们会对健康产生负面影响。此外,鉴于社会对绿色消费主义的担忧,对天然化合物作为有效和安全替代品的需求最近飙升。此外还需要天然抑菌剂来增强肉制品的健康特性,从而避免其他抑菌剂的毒性,这促使研究人员研究合成食品添加剂的天然替代品。许多天然抑菌剂在食品安全和保存应用方面的有效性也得到了研究,并被证明它们适合作为肉类和肉制品的防腐剂,特别是作为对抗食源性致病性的有效天然抑菌剂。
虽然这种天然抑菌剂可以有效抑制微生物的生长和繁殖,但其挥发性强,释放速度快。它们通常也只能抑制最初的微生物,因此很难达到抑菌剂所产生的长期效果。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种稀土金属基复合抑菌吸收垫及其制备方法,以解决上述问题。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种稀土金属基复合抑菌吸收垫的制备方法,该方法包括如下步骤:将水刺无纺布浸泡在复合抑菌剂分散液中,30-50℃条件下保持12-14h后取出烘干,即得到复合抑菌吸收垫;其中,复合抑菌剂由包括壳聚糖季铵盐TMCS、EuW10为原料制备而得。
进一步,所述TMCS和EuW10的摩尔比为1:(150-750)。
进一步,所述TMCS和EuW10的摩尔比为1:300。
进一步,所述壳聚糖季铵盐TMCS由包括如下步骤的方法制备得到:
将壳聚糖溶于N-甲基吡咯烷酮中,然后加入碘甲烷和DIEA,反应过程中N2气保护,反应在室温条件下持续搅拌12h后用乙酸乙酯和水萃取3-4次,然后保留有机相,浓缩干燥获得壳聚糖季铵盐TMCS。
进一步,复合抑菌剂由包括如下步骤的方法制备得到:
1)将EuW10分别在pH值为6-7的MES-NaOH缓冲液混合搅拌,使其均匀分散;
2)将TMCS加入稀盐酸中混合均匀,然后在室温孵育10-20min;
3)将得到的EuW10和TMCS分散液在pH值为6-7的MES-NaOH缓冲液混合搅拌,然后室温孵育10-20min后,得到复合抑菌剂。
本发明还提供了一种由上述任一项所述的制备方法制备的稀土金属基复合抑菌吸收垫。
相对于现有技术,本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫及其制备方法具有以下优势:
(1)本发明使用Weakley型POM:Na9[EuW10O36]•32H2O (EuW10)和天然的高分子碱性氨基多糖化合物进一步改性修饰而得到的TMCS为原料制备复合型抑菌剂,EuW10是一种含有稀土金属铕的多酸,自身具有较强的抑菌效果,同时TMCS作为天然高分子的改性材料也是具有抑菌性能,本发明将二者优势结合,从而产生协同增强的作用,使其抑菌性能进一步提高。
(2)本发明制备的复合抑菌剂将Na9[EuW10O36]•32H2O与TMCS孵育复合后,复合抑菌剂对E.coli具有高效抑菌功能,抑菌剂对E.coli抑杀率能够达到100%。
(3)本发明制备的复合抑菌剂具有显著的抑菌增强效应,这种复合抑菌剂具有较高的生物膜破坏性、膜渗透性,从而快速破坏生物膜,进而大大提高细菌杀死率。EuW10多酸增强抑菌性能的潜在机制主要是EuW10的过氧化物促进了细菌体内一种会对细菌造成损伤的能量代谢的副产物—活性氧及其衍生物(ROS)过量产生,从而加剧的细菌的死亡。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为不同方法改性壳聚糖的涂板法-抑菌性能测试图;
图2为不同季铵化壳聚糖制备的三元复合抑菌剂对E.coli存活率的影响;
图3为不同季铵化壳聚糖制备的三元复合抑菌剂对LAB存活率的影响;
图4为不同抑菌剂产品对于E.coli的抑菌效果图;
图5为本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫与E.coli孵育时间为20 s的流式细胞分析图;
图6为本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫与E.coli孵育时间为40 s的流式细胞分析图;
图7为本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫与E.coli孵育时间为60 s的流式细胞分析图;
图8为本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫与E.coli不同孵育时间细菌凋亡率的柱状统计图;
图9为本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫与LAB孵育时间为20 s的流式细胞分析图;
图10为本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫与LAB孵育时间为40 s的流式细胞分析图;
图11为本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫与LAB孵育时间为60 s的流式细胞分析图;
图12为实本发明所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫与LAB不同孵育时间细菌凋亡率的柱状统计图。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
壳聚糖CS(分子量为50000)、山梨酸钾、薄荷酯、透明质酸钠、2,3 -环氧丙基三甲基氯化铵、高氯酸、N-甲基吡咯烷酮、碘甲烷、DIEA、三乙胺、酵母提取物、蛋白胨、琼脂购自阿拉丁化学有限公司。
氯化钠、盐酸、氢氧化钠购自天津大茂化学试剂有限公司。
Na9[EuW10O36]·32H2O,以下简称EuW10。
(N-Morpholino)乙磺酸(MES)和氢氧化钠(NaOH)购自北京化工厂(北京,中国),所有的化学物质都未经进一步处理使用,蒸馏水为实验室自制。
此外,以MES和NaOH为原料,用蒸馏水制备了10.0 mM、pH = 6.0的MES-NaOH缓冲液。使用蒸馏水配制浓度为6 mM的EuW10水溶液,浓度为0.6 M的稀HCl溶液,再用配制好的0.6 M稀HCl溶液配制浓度为0.4 mM的CS溶液。并置于黑暗条件下(4 ℃)储存,然后根据不同的实验要求稀释到所需浓度。
大肠杆菌E.coli采购自北京四环生物制药有限公司。
乳酸杆菌LAB采购自北京四环生物制药有限公司。
如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 N,N,N-三甲基壳聚糖(TMCS)的制备合成
称取6 mmol的壳聚糖溶于100 mL的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中,然后加入18mmol碘甲烷和18mmol的DIEA,反应过程中N2气保护,反应在室温条件下持续搅拌12h后用乙酸乙酯和水萃取3-4次,然后保留有机相,浓缩干燥获得最终产物备用。
实施例2 EuW10水溶液的配制
称取6 mM含Eu的多酸Na9[EuW10O36]·32H2O加入100.0 mL二次蒸馏水中,搅拌均匀后获得制备浓度为6 mM 的EuW10水溶液。
实施例3 0.6 M稀HCl溶液的配制
首先使用移液枪吸取5.0 mL 12 M浓HCl加入95.0 mL二次蒸馏水中搅拌均匀直至澄清,即得到0.6 M稀HCl溶液。
实施例4 TMCS溶液的配制
首先称取0.4 mmol的TMCS,将TMCS溶于实施例3中配制的0.6 M稀HCl溶液中,搅拌均匀直至澄清,即得到0.4 mM的TMCS溶液。
实施例5 EuW10@TMCS复合抑菌剂的制备
使用移液枪吸取200μL浓度为6mM的EuW10水溶液和10μL浓度为0.4mM的TMCS溶液在MES-NaOH (10.0 mM,pH=6.5)缓冲液中混合均匀,使得终体积为1.0mL,室温孵育20min后,得到EuW10@TMCS组装体,并将本实施例将得到的复合抑菌剂命名为EuW10@TMCS复合抑菌剂。
实施例6 抑菌吸收垫的制备
采用当前市面上常见的水刺无纺布作为载体,通过原位浸渍法嵌入稀土金属基复合抑菌剂,具体实施方案如下:
将水刺无纺布放置于浓度为100 μM的EuW10@TMCS复合抑菌剂分散液中,40℃条件下保持12 h后取出烘干,即得到高抑菌性能的EuW10@TMCS复合抑菌吸收垫。
实施例7 培养基的制作
液体LB培养基:在1 L纯水中加入171.1 mmol的NaCl、10 g蛋白胨和5 g酵母提取物,搅拌均匀后分装至4个锥形瓶中,放入高压蒸汽灭菌锅中121 °C灭菌25 min后备用。
固体LB培养基:在1 L纯水中加入171.1 mmol的NaCl、10 g蛋白胨、5 g酵母提取物和44.6 mmol琼脂粉,放入高压蒸汽灭菌锅中121 °C灭菌25 min,然后趁热倒入一次性培养皿中,待冷却凝固后,封口膜密封后放入4 °C冰箱中备用。
液体MRS培养基:在1 L纯水中加入10 g的牛肉膏、10 g蛋白胨、10 g酵母提取物、200 g番茄汁、55 mmol葡萄糖、0.5 mL吐温、170 mmol碳酸钙和0.2 mmol溴甲酚绿,搅拌均匀后分装至4个锥形瓶中,放入高压蒸汽灭菌锅中121 °C灭菌25 min后备用。
固体MRS培养基:在1 L纯水中加入10 g的牛肉膏、10 g蛋白胨、10 g酵母提取物、200 g番茄汁、55 mmol葡萄糖、0.5 mL吐温、170 mmol碳酸钙、0.2 mmol溴甲酚绿和44.6mmol琼脂粉,搅拌均匀后分装至4个锥形瓶中,放入高压蒸汽灭菌锅中121 °C灭菌25 min后备用。
实施例8 大肠杆菌(E.coli)和乳酸杆菌(LAB)的复苏和后代的繁育
将购买来的E.coli冻干粉与复苏液混合均匀后,转移至事先配制好LB培养液中,放在恒温摇床培育6 h后,在超净工作台中吸取500 μL培育好的第二代E.coli菌液,再吸取500 μL浓度为5.43 M的甘油,在2 mL EP管中混合均匀,放在-80 °C冰箱中冷冻保存。第三代E.coli菌的繁育方法同第二代。
将购买来的LAB冻干粉与复苏液混合均匀后,转移至事先配制好MRS培养液中,放在恒温摇床培育6 h后,在超净工作台中吸取500 μL培育好的第二代MRS菌液,再吸取500 μL浓度为5.43 M的甘油,在2 mL EP管中混合均匀,放在-80 °C冰箱中冷冻保存。第三代LAB菌种的繁育方法同第二代。
对比例1 N-(2-羟基-3-甲基氯化铵)壳聚糖(HTCS)的制备合成
将100 mmol的2,3 -环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)、6 mmol的CS和160 mmol高氯酸盛装在三口烧瓶中,溶剂采用200 mL异丙醇,在反应温度为80 ℃的条件下磁力搅拌12h。然后向反应液中加入丙酮和乙醇,析出沉淀,经过滤收集沉淀后再次溶解于二次蒸馏水中,然后加入丙酮和乙醇析出沉淀进行二次纯化,收集沉淀并使用烘箱50 ℃浓缩干燥获得最终得到黄色产物为HTCS。
对比例2 N-(2-甲基-氯化铵)壳聚糖(QCS)的制备合成
称取12 mmol的2-氯乙胺盐酸盐和18 mmol的TEA溶于100 mL的二次蒸馏水中,启动磁力搅拌,常温状态搅拌1 h,对成盐状态的2-氯乙胺盐酸盐进行游离,然后在搅拌状态下加入6 mmol的壳聚糖,常温搅拌12 h后将反应液转移至透析袋并放入二次蒸馏水中,透析2 天后进行冷冻干燥,获得最终产物。
对比例3 EuW10@ HTCS复合抑菌剂的制备
使用移液枪吸取200μL浓度为6mM的EuW10水溶液和10μL浓度为0.4mM的HTCS溶液在MES-NaOH (10.0 mM,pH=6.5)缓冲液中混合均匀,使得终体积为1.0mL,室温孵育20min后,得到EuW10@HTCS组装体,即EuW10@HTCS复合抑菌剂。
对比例4 EuW10@ QCS复合抑菌剂的制备
使用移液枪吸取200μL浓度为6mM的EuW10水溶液和10μL浓度为0.4mM的QCS溶液在MES-NaOH (10.0 mM,pH=6.5)缓冲液中混合均匀,使得终体积为1.0mL,室温孵育20min后,得到EuW10@QCS组装体,即EuW10@QCS复合抑菌剂。
实验1 三种改性季铵化壳聚糖的抑菌性能测试
先将冷冻的第三代E.coli转移至配制好LB培养液中,放进恒温摇床培育5h后,在超净工作台中先将E.coli菌液稀释104倍,然后分别称取10 mg的TMCS、10 mg的HTCS、10 mg的QCS溶于10 mL无菌水中并使用超声辅助使其均匀分散。然后吸取100μL稀释后的E.coli菌液和100μL配制好的壳聚糖分散液混合,并使用无菌水定容至1 mL,同时进行空白对照实验,直接吸取100 μL稀释后的E.coli菌液并使用无菌水定容至1 mL即可,放在恒温摇床中孵育2 h。
完成孵育后,每个样品各吸取80 μL进行涂板,在恒温培养箱中培育12 h后固体培养基中菌落生长情况如图1所示。
结果显示未加入任何改性壳聚糖的空白培养基中长满了E.coli菌落,而加入了抑菌剂的培养基中菌落数量都有所减少,而且TMCS对E.coli的抑菌效果为最佳。
实验2 三种季铵化壳聚糖制备的三元复合抑菌剂抑菌性能测试
先将冷冻的第三代E.coli和LAB分别转移至事先配制好的LB培养液和MRS培养液中,放进恒温摇床培育5 h后,在超净工作台中将E.coli菌液和LAB菌液分别稀释104倍;然后将使用无菌水分别配制浓度为100 mg/L的EuW10@TMCS抑菌剂分散液、EuW10@HTCS抑菌剂分散液、EuW10@QCS抑菌剂分散液,然后吸取100 μL抑菌剂分散液分别与100 μL稀释了104倍的E.coli菌液和LAB菌液分别混合,均使用无菌水定容至1 mL,然后送入恒温摇床中孵育2h。空白组直接吸取100 μL稀释的菌液并加入900 μL无菌水放在恒温摇床中孵育2 h。完成孵育后,每个样品各吸取80μL进行涂板,在恒温培养箱中培育12h后观察固体培养基中菌落生长情况,通过标准平板计数法测定细菌的存活率,并绘制柱状统计图,E.coli细菌存活率柱状图结果如图2所示,LAB细菌存活率柱状图结果图3所示。
通过对比E.coli和LAB的细菌存活率柱状图能够知晓,在EuW10@TMCS复合抑菌剂的作用下,对E.coli抑菌效果最好,且抑菌率已经能够达到100%,此时LAB的存活率能够达到73.6%。而EuW10@HTCS复合抑菌剂和EuW10@QCS复合抑菌剂对E.coli的抑菌效果相对来说差一些,而且对LAB生长的抑制作用也较强,靶向作用较差,故选定针对性抑菌性较好的EuW10@TMCS复合抑菌剂为最佳方案。
实验3 不同抑菌产品涂板法-抑菌性能测试
先将冷冻的第三代E.coli转移至配制好LB培养液中,放进恒温摇床培育5 h后,在超净工作台中先将E.coli菌液稀释104倍,然后将使用无菌水分别配制浓度为100 mg/L的EuW10抑菌剂分散液、TMCS抑菌剂分散液、EuW10@TMCS抑菌剂,然后吸取100 μL抑菌剂分散液分别与100 μL稀释了104倍的E.coli菌液混合,并使用无菌水定容至1 mL,然后送入恒温摇床中孵育2 h。空白组直接吸取100 μL稀释的菌液并加入900 μL无菌水放在恒温摇床中孵育2 h。同时再准备一支将E.coli菌液稀释105倍的菌液,并将EuW10@TMCS抑菌吸收垫裁剪为边长为5 mm×5 mm的正方形试样,然后放入1 mL稀释105倍的菌液混合振荡后,放在恒温摇床中孵育2 h。完成孵育后,每个样品各吸取80 μL进行涂板,在恒温培养箱中培育12 h后固体培养基中菌落生长情况如图4所示。
通过对比图4中E.coli培养基照片能够观察到EuW10@TMCS抑菌剂和EuW10@TMCS抑菌吸收垫相比于单一成分的EuW10、TMCS对于E.coli具有更强的抑菌性能。
实验4 流式细胞测试
先将冷冻的第三代大肠杆菌(E.coli)和乳酸杆菌(LAB)分别转移至配制好LB培养液中,放进恒温摇床培育5 h后,在超净工作台中先将E.coli菌液稀释104倍,将EuW10@TMCS抑菌吸收垫裁剪为边长为5 mm×5 mm的正方形试样,然后放入100 μL稀释的菌液混合振荡后,放在37 °C恒温培养箱中孵育20s、40s、60s后立即拿出放入-20 °C保存。然后逐个将上述完成孵育的样品加入900 μL 0.1 M的PBS缓冲溶液,然后吸入5 μL的绿色荧光染料SYTO®9进行染色,孵育10 min后加入5 μL碘化丙啶(PI),使用流式细胞仪测量细胞凋亡率。在激发波长为488nm下,记录535nm下的信号。
抑菌吸收垫与E.coli孵育20s、40s、60s后的流式细胞测试结果如图5-7所示,能够看出在抑菌吸收垫加入进E.coli菌液20s之后,EuW10@TMCS复合抑菌剂已经开始发生作用,且细菌凋亡率是与孵育时间呈现正比的关系,当抑菌吸收垫与E.coli菌液孵育40s时,E.coli的凋亡率已经能够达到30.22%,而当抑菌吸收垫与E.coli菌液孵育60 s时,E.coli的凋亡率大幅上升,能够达到93.70%,如图8所示。因而能够看出EuW10@TMCS复合抑菌吸收垫对于E.coli具有非常好的有杀菌效果。
抑菌吸收垫与LAB孵育20 s、40 s、60 s后的流式细胞测试结果如图9-11所示,可以观察到抑菌吸收垫与LAB菌液孵育20s后,细菌凋亡率为6.11%,如图12所示。
随着孵育时间的延长,孵育时间为40s时的细菌凋亡率为9.80%,虽然随着孵育时间延长,细菌凋亡率也呈现出逐渐上升的态势,但是EuW10@TMCS复合抑菌吸收垫对于LAB菌的抑菌率却并没有大幅增长,而始终保持着较低的细菌凋亡率,在孵育时间为60 s时,细胞凋亡率仅为30.49%,这与孵育时间为60 s时的E.coli凋亡率93.40%相差近三倍。因而能够证明EuW10@TMCS复合抑菌吸收垫对于人有益的益生菌—LAB能够选择性保留,只针对E.coli进行靶向杀菌。
本发明所制备的抑菌垫以天然的高分子碱性氨基多糖化合物进一步改性修饰而得到的TMCS和自身具有较强的抑菌效果的一种含有稀土金属铕的多酸EuW10制备抑菌剂,可结合托盘包装,应用于肉类制品的保鲜,有效杀灭大肠杆菌,保留有益菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种稀土金属基复合抑菌吸收垫的制备方法,其特征在于:该方法包括如下步骤:将水刺无纺布浸泡在复合抑菌剂分散液中,30-50℃条件下保持12-14h后取出烘干,即得到复合抑菌吸收垫;其中,复合抑菌剂由包括壳聚糖季铵盐TMCS、EuW10为原料制备而得。
2.根据权利要求1所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫的制备方法,其特征在于:所述TMCS和EuW10的摩尔比为1:(150-750)。
3.根据权利要求2所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫的制备方法,其特征在于:所述TMCS和EuW10的摩尔比为1:300。
4.根据权利要求1所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫的制备方法,其特征在于:所述壳聚糖季铵盐TMCS由包括如下步骤的方法制备得到:
将壳聚糖溶于N-甲基吡咯烷酮中,然后加入碘甲烷和DIEA,反应过程中N2气保护,反应在室温条件下持续搅拌12h后用乙酸乙酯和水萃取3-4次,然后保留有机相,浓缩干燥获得壳聚糖季铵盐TMCS。
5.根据权利要求1所述的稀土金属基复合抑菌吸收垫的制备方法,其特征在于:复合抑菌剂由包括如下步骤的方法制备得到:
1)将EuW10分别在pH值为6-7的MES-NaOH缓冲液混合搅拌,使其均匀分散;
2)将TMCS加入稀盐酸中混合均匀,然后在室温孵育10-20min;
3)将得到的EuW10和TMCS分散液在pH值为6-7的MES-NaOH缓冲液混合搅拌,然后室温孵育10-20min后,得到复合抑菌剂。
6.一种由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备的稀土金属基复合抑菌吸收垫。
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