CN116159100A - 咽舒合剂用于上呼吸道病毒治疗新用途 - Google Patents

咽舒合剂用于上呼吸道病毒治疗新用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药应用技术领域，具体涉及咽舒合剂在上呼吸道病毒治疗中的应用；咽舒合剂用于上呼吸道病毒治疗新用途，所述上呼吸道病毒指甲型流感病毒和鼻病毒。

Description

咽舒合剂用于上呼吸道病毒治疗新用途
技术领域
本发明涉及中药应用技术领域，具体涉及咽舒合剂在上呼吸道病毒治疗中的应用。
背景技术
咽舒合剂来源于彝族医药——老彝医鲁廷凯一九七二年献出的家传验方“二草汤”。该方组方符合彝族医药理论，通过现代药理及药学研究研制而成，其主要成分为虎掌草、午香草、玄参、牛蒡子、射干、桔梗、陈皮、甘草；辅料为蜂蜜、蔗糖。性状为棕褐色的粘稠液体；气微香，味苦，微酸。功能主治：清咽利喉，止咳化痰。用于风热证或痰热证引起的咽喉肿痛，咳嗽、痰多、发热、口苦；急慢性咽炎、扁桃体炎。
咽舒合剂（国药准字Z20025604）的成分为虎掌草、午香草、玄参、牛蒡子、射干、桔梗、陈皮、甘草，是根据“君、臣、佐、使”的配伍原理组合而成，其中，虎掌草具有清热解毒、止咳祛痰，利湿消黄，消痈散结的功能，用于瘰疬结核，痈疽肿毒，咽喉肿痛，其清热解毒疗效显著。午香草属彝族常用植物药，据《丽江中草药》记载，具有祛风解表、消炎止痛的作用，可解风热犯卫之表证，与虎掌草同用，共凑清热解毒，止咳祛痰、祛风解表之效，对风热邪毒侵袭卫表或痰热蕴结所致的咽喉肿痛、咳嗽、痰多、发热有良好的治疗作用，同为君药；射干与牛蒡子可增强虎掌草的宣肺利咽效果，起到协同的作用，同为臣药。玄参、陈皮使咽舒合剂具有养阴生津，和胃止泻的作用，也为咽舒合剂添加了辛温的药性，使得整个处方清热不伤阴，祛火不伤正，同为佐药；桔梗和甘草相配具有宣肺祛痰，润肺祛痰，解毒利咽，消肿排脓，且为舟楫，升载诸药。诸药合用，苦中有辛，寒而不滞，可解风热证或痰热证引起的咽喉肿痛，咳嗽、痰多、发热、口苦等诸症。
感冒属中西医共用的诊断病名，中医包括普通感冒和时行感冒，是感受外邪所导致的常见外感疾病，中医辨证包括风寒证、风热证和暑湿证，在现代医学中属于上呼吸道感染。咽炎为中医的“喉痹”，其中急性咽炎中医称“急喉痹”，也称“风热喉痹”，主要由外感风、寒、热之邪，或肺胃积热所致。风热邪毒或风寒之邪化火传里，内蕴肺胃，使风、热、寒三者搏结于咽喉而发，中医辨证包括风寒证、风热证和肺胃湿热证，以风热证最为多见。可见，感冒和急性咽炎均可由感受外邪所致，有相同的病因，中医辨证均有风寒证和风热证，有相同的证型，同属上呼吸道感染疾病。咽舒合剂对于风热证引起的急慢性咽炎有较好的疗效，所主症状多数与风热感冒症状相同，因此考虑咽舒合剂对感冒及上呼吸道感染病毒同样具有较好的疗效。
流感病毒以及鼻病毒感染，也会出现感冒、上呼吸道感染、扁桃体炎等病症，其表现形式有些也会伴随咽喉肿痛，咳嗽，发热等症状，因此考虑咽舒合剂对于病毒引起的该类症状有效，为说明咽舒合剂对上呼吸道病毒感染有治疗作用，考证与同类治疗风热引起的咽喉肿痛，咳嗽、痰多、发热、口苦；急慢性咽炎、扁桃体炎的药物是否具有相应的优势，特进行了相应的试验证明。
发明内容
本发明的目的是提供上呼吸道病毒抑制和治疗的中药学新途径，具体为咽舒合剂在上呼吸道病毒预防和治疗中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明应用细胞病变效应法（CPE法）评价受试药物咽舒合剂对上呼吸道病毒甲型H1N1流感病毒PR8株和鼻病毒human rhinovirus9在MDCK狗肾细胞和H1Hela人宫颈癌细胞内的体外抗病毒活性，并测试了咽舒合剂在MDCK狗肾细胞和H1Hela人宫颈癌细胞内细胞毒性。试验结果如下：在体外药效试验中，咽舒合剂在体外培养细胞上对甲型流感病毒和鼻病毒有抑制作用，其中对甲型流感病毒的治疗指数为31.27；对鼻病毒的治疗指数为7.94；细胞毒性结果显示咽舒合剂对MDCK细胞毒性浓度TC50为0.0556ml，最大无毒浓度TC0为0.00488ml，咽舒合剂对H1Hela细胞毒性浓度TC50为4.4668ml，最大无毒浓度TC0为0.78125ml。
综上所述，咽舒合剂可以有效抑制上呼吸道病毒，尤其是甲型流感病毒和鼻病毒，咽舒合剂可以用于预防和治疗甲型流感病毒和鼻病毒引起的病毒感染。
本发明的有益技术效果是：在体外药效试验中，咽舒合剂对上呼吸道病毒，尤其是甲型流感病毒和鼻病毒具有明显抑制活性，与同类型药物要比较具有明显的优势。因此咽舒合剂对于预防和治疗甲型流感病毒和鼻病毒引起的病毒感染具有积极的现实价值。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，所用设备及原料均为市售或者第三方保存，其中：
1、受试药物及对照药物
（1）受试药物：咽舒合剂，厂家：云南金碧制药有限公司，批号：210304；生产日期：2021.03.07；有效期至：2024.02；国药准字：H20025601。
成分：虎掌草、午香草、玄参、射干、牛蒡子、桔梗、陈皮、甘草；辅料为蜂蜜、蔗糖。
性状：本品为棕褐色的粘稠液体；气微香，味苦、甜、微酸。
功能主治：中医：清咽利喉，止咳化痰。用于风热证或痰热证引起的咽喉肿痛，咳嗽、痰多、发热、口苦；急慢性咽炎、扁桃体炎。
规格：每支装10ml。
用法用量：口服。一次10ml，一日3次；或遵医嘱。
贮藏：密封，置阴凉处。
浓度：每1000ml含生药1500g。
（2）阳性对照药：夏桑菊颗粒，厂家：广州白云山星群（药业〉股份有限公司，批号：RC9011573；生产日期：2020.07；有限期至：2023.07；国药准字：Z44022217。
成分：夏枯草、野菊花、桑叶，辅料为蔗糖。
性状：本品为黄棕色至棕褐色的颗粒；味甜。
功能主治：清肝明目、疏风散热、除湿痹，解疮毒。用于风热感冒、目赤头痛，头晕耳鸣，咽喉肿痛，疗疮肿痛等症，并可做清凉饮料。
规格：每袋装10克。
用法用量：口服，一次1-2袋(10-20克)，一日三次。
贮藏：密封。
2、实验试剂
试剂名称 批号 生产厂家 用途
DMEM培养基 RNBJ7483 SIGMA 细胞传代培养
L15培养基 2363392 Gibco 细胞传代培养
胎牛血清 35081006 Corning 细胞日常培养
双抗 1989516 Gibco 细胞传代培养
胰酶 2277233 Gibco 细胞传代种板
PBS 8121733 Gibco 细胞日常培养
细胞冻存液 CS-04-001 GCLYMPHOTECInc 细胞冻存
3、实验仪器
仪器名称 型号 生产厂家 用途
CO2培养箱 Thermo-371 美国Thermo 细胞培养
A2型生物安全柜 ThermoMSC1.2 美国Thermo 病毒试验操作
洁净工作台 SW-CJ-2FD 美国AIRTECH 细胞试验操作
eppendorf离心机 5810R 德国Eppendorf 细胞消化离心
倒置显微镜 OLYMPUS CKX41 日本OLYMPUS 细胞形态观察
4、实验用细胞
MDCK狗肾细胞，购自北纳创联生物技术有限公司，资源编号：BNCC100250，中国中医科学院中药研究所中药药理中心传代液氮保存。H1Hela人宫颈癌细胞，购自北纳创联生物技术有限公司，资源编号：101645，中国中医科学院中药研究所中药药理中心传代液氮保存。
敏感细胞的筛选实验：1.适合甲型HINI流感病毒增殖的敏感细胞株包括原代恒河猴肾细胞（pRhMK）、狗肾细胞（MDCK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）；适合鼻病毒增殖的敏感细胞株包括原代人胚肾细胞、人胚肺成纤维细胞、猴肾细胞和H1Hela人宫颈癌细胞。分别在已长成单层的上述培养细胞中接种相应的病毒株，100μl/孔，将培养板置37℃，5%CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变效应，选择敏感细胞。经在实验室条件下试验，甲型HINI性流感病毒适合使用MDCK狗肾细胞进行实验，鼻病毒适合使用H1Hela人宫颈癌细胞进行实验。
5、病毒毒株
甲型H1N1流感病毒PR8株购自美国ATCC菌毒种保藏中心，中国中医科学院中药研究所中药药理中心常规传代，-80℃冰箱保存。鼻病毒human rhinovirus9购自美国ATCC菌种保藏中心，本室常规传代，-80℃冰箱保存。
6、实施例所涉及实验均在中国中医科学院中药研究所ABSL-2生物安全实验室进行。
实施例1：咽舒合剂对MDCK细胞的毒性试验
将夏桑菊颗粒溶解配置为100mg/ml的药液、咽舒合剂稀释10倍备用。
取配好的药液100μL，做1：2～1：8192倍比稀释后，加到已长成单层的MDCK96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度药液做4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃，5%CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数（最大无毒浓度)，按Reed-Muench法计算.50%细胞毒性浓度（TC50）和最大无毒浓度（TC0)。
细胞病变按6级标准判断：
一：细胞生长正常，无病变出现；
±：细胞病变少于整个单层的10%；
+：细胞病变约占整个单层细胞的25%以下；
++：细胞病变约占整个单层细胞的50%以下；
+++：细胞病变约占整个单层细胞的75%以下；
++++：细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
表1药物对MDCK细胞毒性实验细胞病变情况
Figure RE-193630DEST_PATH_IMAGE003
按Reed-Muench法计算得：夏桑菊颗粒对MDCK细胞毒性浓度TC50为8.91mg/ml，最大无毒浓度TC0为3.125g/ml。
咽舒合剂对MDCK细胞毒性浓度TC50为0.0556ml，最大无毒浓度TC0为0.00488ml。
实施例2：咽舒合剂对H1Hela 细胞的毒性试验
将夏桑菊颗粒溶解配置为100mg/ml的药液、咽舒合剂稀释100倍备用。
取配好的药液100μL，做1：2∽1：8192倍比稀释后，加到已长成单层的H1Hela96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度药液做4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃，5%CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数（最大无毒浓度)，按Reed-Muench法计算50%细胞毒性浓度（TC50）和最大无毒浓度（TC0）。
表2药物对H1Hela细胞毒性实验细胞病变情况
Figure RE-907508DEST_PATH_IMAGE004
按Reed-Muench法计算得：夏桑菊颗粒对H1Hela细胞毒性浓度TC50为3.98mg/ml，最大无毒浓度TC0为1.5625g/ml。
咽舒合剂对H1Hela细胞毒性浓度TC50为4.4668ml，最大无毒浓度TC0为0.78125ml。
实施例3：咽舒合剂对流感病毒PR8株、鼻病毒的体外抗病毒作用
取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，分别接种100TCID50的甲型流感病毒PR8株和鼻病毒，100μL/孔，置37℃，5%CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，再分别加入最大无毒浓度的夏桑菊颗粒药液和咽舒合剂药液，100μL/孔，分别向下做8个稀释度，同时设正常细胞对照、病毒对照组。置37℃，5%CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变为++++时记录试验结果。
表3咽舒合剂体外抗病毒作用细胞病变情况
Figure 745395DEST_PATH_IMAGE003
按Reed-Muench计算50%抑制浓度（IC50）和治疗指数（TI)，TI=TC50/IC50。
表4咽舒合剂体外抗病毒作用
Figure 872620DEST_PATH_IMAGE004
本实验通过体外病毒感染细胞模型，评价咽舒合剂的体外抗病毒效果。结果显示，咽舒合剂在体外培养细胞上对甲型流感病毒和鼻病毒有抑制作用，其中对甲型流感病毒的治疗指数为31.27；对鼻病毒的治疗指数为7.94。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.咽舒合剂用于上呼吸道病毒治疗新用途，其特征在于：所述咽舒合剂可以有效抑制上呼吸道病毒。
2.根据权利要求1所述的咽舒合剂用于上呼吸道病毒治疗新用途，其特征在于：所述上呼吸道病毒指甲型流感病毒和鼻病毒。
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