CN116144506B - 土曲霉dk3-18及其在提取柿叶总黄酮中的应用 - Google Patents

土曲霉dk3-18及其在提取柿叶总黄酮中的应用

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Abstract

本发明公开了一种土曲霉DK3‑18及在提取柿叶总黄酮中的应用，本发明在柿叶乙醇超声提取总黄酮前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解。所用的产酶微生物土曲霉DK3‑18，是针对能够水解柿叶植物组织而有目的分离和筛选得到，经产酶发酵制备的粗酶液中含有多种水解酶，能够协同水解柿叶中的纤维素和果胶等物质，使细胞壁破损，有助于黄酮类物质溶出，使得总黄酮提取得率显著提高。本发明提供的柿叶微生物酶解方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从柿叶中提取总黄酮的得率可以提高38.4％。

Description

土曲霉DK3-18及其在提取柿叶总黄酮中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株土曲霉DK3-18及其在提取柿叶总黄酮中的应用。
(二)背景技术
柿叶为柿树科植物柿(Diospyros kaki)的叶片，《中华草本》(宋立人主编)记载，其具有止咳定喘、生津止渴、活血止血、疗疮等功效，主治咳喘、消渴及各种内出血、镰疮等。现代药理研究表明，柿叶具有抗氧化、降血糖、抑制特异性皮炎、增强免疫功能、减肥降脂、抗癌、抗菌等功效。柿叶中含有黄酮、三萜、香豆素和多糖等生物活性物质，其中黄酮类为其主要成分，包括目前已发现的黄芪素、紫云苷、槲皮素、异槲皮素、山柰酚、芦丁、金丝桃苷等。近年来，黄酮类化合物因有降脂、抗血栓、抗心律失常等药理作用，而且具有毒性低、资源丰富、易于工业化提取等优点，被广泛地用于医药和食品等行业，极具开发价值。柿叶中的黄酮含量比较高，不同产地的柿叶黄酮含量在1.092％–9.428％之间[孙化鹏,张珉,钟晓红.柿叶总黄酮超声辅助提取工艺研究.湖南林业科技,2014,41(5):18-21]，所以，柿叶是提取黄酮的良好原料。
目前，关于从柿叶中提取总黄酮的研究有较多报道，方法主要有热水提取法、有机溶剂提取法和CO2超临界提取法等，在前2种方法的基础上，有辅以超声波、微波、表面活性剂和酶解等强化提取的方法。不同提取方法有各自的优缺点，总黄酮得率也差异较大。如热水提取法成本低，但总黄酮得率差，提取物中多糖和蛋白质的含量高；有机溶剂提取法多用乙醇提取，优点是提取得率和产物纯度较高；超声或微波辅助提取法在水提或乙醇提取法的基础上，增加超声或微波处理，促进总黄酮溶出，提取得率有一定提高；CO2超临界萃取法提取的总黄酮纯度较高，但提取得率往往不高，而且设备要求比较高；酶辅助提取法的提取条件温和，对黄酮类物质结构破坏小，但对提高提取得率的效果往往不是很理想，且商品化纯酶成本较高。上述几种提取方法，相比之下，超声辅助乙醇提取有一定的优势，提取得率和产品纯度相对较高，乙醇可以回收重复利用，超声波的使用成本也较低。
近些年来，酶解辅助提取技术已广泛应用于植物有效成分的提取，也有应用于柿叶总黄酮提取的研究报道，都能显著提高总黄酮提取得率，如袁秀平等用复合酶(包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和β-葡聚糖酶)协同超声波辅助提取柿叶总黄酮，提取率为7.16％，比不加酶的对照组提高了24.5％[袁秀平,华燕青,王云云.复合酶协同超声法提取柿叶总黄酮的工艺优化.中国食品添加剂,2019,30(8):103-108]；在薛璇玑等的研究中，用复合酶辅助乙醇回流提取，黄酮提取得率由3.40％提高到5.70％，提高了67.6％[薛璇玑,罗俊,张新新,等.半仿生酶法提取柿叶中总黄酮的工艺筛选及优化.中国药房,2017,28(13):1813-1816]。植物细胞壁的构成包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等物质，使用复合酶辅助提取植物活性成分的效果往往优于单独使用一种酶，但多种酶的使用，无疑增加了提取成本。
微生物可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等，特别是一些霉菌，如曲霉(Aspergillus spp.)、根霉(Rhizopusspp.)和木霉(Trichoderma spp.)等。因此，如果利用某种微生物在合适的条件下培养，发酵液中就含有大量的水解酶，利用发酵液(粗酶液)直接水解植物原料，这些酶能协同分解细胞壁成分，从而有利于有效成分的释放，从而使提取得率显著提高。
为了提高柿叶总黄酮提取得率，本发明用微生物发酵制备的粗酶液酶解柿叶，可使柿叶总黄酮提取得率大幅度提高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新的微生物菌株—土曲霉(Aspergillus terreus)DK3-18及其在提取柿叶总黄酮中的应用。柿叶经该菌株发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮提取得率可以大幅度提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新的微生物菌株—土曲霉(Aspergillus terreus)DK3-18，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62857，保藏日期2022年10月12日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
本发明所述的土曲霉DK3-18，是从柿叶的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述土曲霉DK3-18的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，30℃培养1d，沿接种线两侧长出放射状灰白色菌丝，之后中心逐渐变土黄色，边缘灰白色；培养3d后，菌落中心呈土黄色，有皱褶，背面呈棕黄色，表面土黄色粉状孢子较多；分生孢子梗较短，直立或弯曲；顶囊半球形，小梗双层，覆盖顶囊上端三分之二，呈扇形；分生孢子球形至近球形，壁光滑，无色，直径约1.5–2.5μm。土曲霉DK3-18划线接种在PDA平板培养基上30℃培养3d的菌落照片见图1。
所述土曲霉DK3-18的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述土曲霉DK3-18在提取柿叶总黄酮中的应用，所述应用的方法为：(1)将土曲霉DK3-18培养获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；(2)将粗酶液与柿叶粉混合，于30–35℃条件酶解6–8h，再往酶解体系中加入无水乙醇后进行超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；(3)总黄酮提取液经减压蒸干，无水乙醇溶解和真空干燥，得总黄酮提取物。
进一步，步骤(1)所述粗酶液制备方法为：将土曲霉DK3-18孢子接种于产酶培养基中，于30℃、180–200r/min振荡培养60–68h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：玉米粉40-50g/L，蛋白胨4–5g/L，(NH4)2SO4 5–6g/L，KH2PO43–5g/L，MgSO4·7H2O 0.5–1.0g/L，CaCl2 0.3–0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5。
进一步，优选所述产酶培养基组成为：玉米粉50g/L，蛋白胨4g/L，(NH4)2SO4 6g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，CaCl2 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH6.0。
本发明所述土曲霉DK3-18在产酶培养前，需要先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得土曲霉DK3-18孢子液，按体积分数4％–5％的量接入产酶培养基进行培养，具体产酶培养方法为：
①孢子液制备：将土曲霉DK3-18接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于30℃培养56–64h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得土曲霉DK3-18孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成小块，加水煮沸20min，去渣留汁)、葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.6)。
②产酶培养：用步骤①制备的土曲霉DK3-18孢子液，按体积分数4％–5％的接种量，接入产酶培养基，于30℃、180–200r/min振荡培养60–68h，获得干菌体浓度为4.37–4.52g/L、纤维素酶活力为85.7–88.2U/mL的发酵液。
进一步，步骤(2)所述粗酶液体积用量以柿叶粉质量计为6–10mL/g[即料酶比为1:6–1:10(g:mL)]，所述柿叶粉是将新鲜柿叶，自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。无水乙醇体积用量为粗酶液体积的1.5–2.0倍。
进一步，步骤(2)所述总黄酮提取液的制备方法为：所述的柿叶酶解结束后，往酶解体系中加入粗酶液体积1.5–2.0倍的无水乙醇，使体系中乙醇体积分数达到60％–66.7％，料液比为1:18–1:25(g:mL)。摇匀后置于水温60–70℃、功率100–200W的超声波清洗机中提取30–40min；超声醇提结束后，趁热抽滤，得总黄酮提取液。
进一步，步骤(3)从总黄酮提取液中回收总黄酮的方法为：总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，加入体积为原料柿叶质量计1–2mL/g的无水乙醇，充分振荡后于8000r/min离心5–10min，上清液于转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在柿叶乙醇超声提取总黄酮前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解。所用的产酶微生物土曲霉DK3-18，是针对能够水解柿叶植物组织而有目的分离和筛选得到，经产酶发酵制备的粗酶液中含有多种水解酶，能够协同水解柿叶中的纤维素和果胶等物质，使细胞壁破损，有助于黄酮类物质溶出，使得总黄酮提取得率显著提高。本发明提供的柿叶微生物酶解方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从柿叶中提取总黄酮的得率可以提高38.4％。
(四)附图说明
图1为土曲霉DK3-18在PDA上30℃培养3d的菌落照片。
图2为分光光度法测定总黄酮的标准曲线。
图3为DNS法测定葡萄糖的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述的柿叶是柿树科植物柿(Diospyros kaki)的叶片，采集自浙江省杭州市。柿叶粉是新鲜柿叶经自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。
实施例1：产酶菌株的分离和筛选
产酶酶解柿叶的微生物菌种，按如下步骤分离和筛选获得：
(1)250-mL三角烧瓶中加入10g柿叶粉，加入15mL无菌生理盐水搅拌均匀，于30℃培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于30℃培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于30℃培养64h，得纯培养菌株7株，各菌株编号见表1。
(2)7个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。
(3)取步骤(2)制备的各菌株孢子液2mL接入50mL产酶培养基中(接种量为4％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下产酶培养68h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液。
(4)7只50-mL离心管中分别加入1g柿叶粉，加入步骤(3)制备的各菌株粗酶液10mL[即料酶比为1:10(g:mL)]，搅拌均匀后于30℃酶解8h，得柿叶酶解物。
(5)步骤(4)经各个菌株粗酶液酶解的全部柿叶酶解物中，分别加入15mL的无水乙醇[1.5倍粗酶液体积，体系乙醇体积分数60％，料液比1:25(g:mL)]。摇匀后置于水温60℃、功率200W的超声清洗机中提取30min，趁热布氏漏斗抽滤，收集滤液，分光光度法测定其总黄酮含量。
从步骤(4)开始，用10mL未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做未酶解的对照；用10mL活力为2000U/mL纤维素酶磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)代替粗酶液做纤维素酶酶解的对照。经不同菌株粗酶液酶解的柿叶及对照的总黄酮提取得率见表1。
表1经不同菌株粗酶液酶解的柿叶及对照的总黄酮提取得率
由表1数据可以看出，柿叶经DK3菌株发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮提取得率为6.74％，较未经酶解的对照5.86％相比，总黄酮提取得率提高了15.0％。用纤维素酶处理柿叶，也能提高总黄酮提取得率，较未酶解的对照提高了9.73％，但远不如DK3菌株发酵制备的粗酶液。柿叶经过有些微生物菌株的粗酶液酶解后，总黄酮提取得率并未提高，甚至有所下降，如DK5菌株。以上结果说明用于酶解柿叶以提高总黄酮提取得率的微生物菌株有选择性，不仅要求能产酶水解柿叶细胞壁成分，还要求不能产酶降解黄酮。本发明选定DK3菌株作为提高柿叶总黄酮提取得率的产酶菌种。
所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角烧瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：玉米粉50g/L，蛋白胨4g/L，(NH4)2SO4 6g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，CaCl2 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的总黄酮含量采用分光光度法测定，具体方法为：2.5mL总黄酮提取液(视样品中总黄酮浓度高低适当调整取样量，控制测定A510＝0.2–0.8之间，固体总黄酮提取物用60％乙醇水溶液溶解)，于10-mL刻度试管中，加入质量浓度5％亚硝酸钠(NaNO2)水溶液0.4mL，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝[Al(NO3)3]水溶液0.6mL，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠(NaOH)水溶液2mL，再用体积分数60％乙醇水溶液定容至10mL，摇匀后放置15min，于分光光度计测定波长510nm处的吸光度(A510)，由芦丁标准曲线计算得样品中总黄酮浓度，再由浓度乘以测定样品的体积得总黄酮质量。
芦丁标准曲线的绘制：用体积分数60％乙醇水溶液配制浓度为0.25g/L的芦丁标准品溶液。分别取芦丁标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于10-mL刻度试管中，用体积分数60％乙醇水溶液补充至2.5mL，加入质量浓度5％亚硝酸钠水溶液0.4mL，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝水溶液0.6mL，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠水溶液2mL，再用体积分数60％乙醇水溶液定容至10mL，摇匀后放置15min，于分光光度计测定波长510nm处的吸光度(A510)。以芦丁浓度为横坐标，A510为纵坐标绘制标准曲线(图2)。
所述的从柿叶中提取总黄酮得率按以下公式计算：
实施例2：发酵菌株DK3的诱变选育
对菌株DK3进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株DK3经PDA平板培养基30℃活化培养56h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团蓬松的脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对孢子液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.43×107个/mL。
(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于30℃培养48h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得40个菌株。各个菌株经30℃培养64h的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液2mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养68h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的纤维素酶活力。选择酶活较野生菌株提高幅度相对较高的菌株13株，按实施例1方法，用这13个菌株发酵的粗酶液酶解柿叶，乙醇超声提取总黄酮，突变菌株粗酶液酶解的柿叶和对照的总黄酮提取得率见表2。
表2突变菌株粗酶液酶解的柿叶和对照的总黄酮提取得率
从表2数据可以看出，在复筛的13个菌株中，编号为DK3-18的菌株，发酵产纤维素酶的活力为87.3U/mL，较野生菌株DK3的58.7U/mL提高了48.7％，用该菌株发酵制备的粗酶液酶解柿叶后，总黄酮提取得率8.02％，较野生菌株DK3的6.74％提高了19.0％，较未经酶解的对照5.86％提高了36.9％。所以，本发明选定DK3-18菌株作为提高柿叶总黄酮提取得率的产酶菌株。
所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。
所述的纤维素酶活力测定：10-mL刻度试管中分别加入1.5mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL的DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，摇匀；用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长540nm处吸光度(A540)，由葡萄糖标准曲线(图3)计算样品中的葡萄糖浓度，再而计算纤维素酶活力(U/mL)。纤维素酶活力的定义：在pH 6.0、50℃条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
纤维素酶活力按以下公式(1)计算。
式(1)中，C：由标准曲线计算得到的葡萄糖浓度(mg/mL)；V1：酶反应体系体积，即2mL；T：反应时间，即30min；V2：粗酶液体积，即0.5mL。
葡萄糖标准曲线的绘制：6支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为1mg/mL的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL，混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，摇匀，于分光光度计测定A540，以葡萄糖浓度为横坐标，A540为纵坐标绘制标准曲线(图3)。
DNS试剂的配制：6.3g的3,5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。
实施例3：菌株DK3-18的分类鉴定
菌株DK3-18划线接种在PDA平板培养基上，30℃培养1d，沿接种线两侧长出放射状灰白色菌丝，之后中心逐渐变土黄色，边缘灰白色；培养3d后，菌落正面呈土黄色，背面呈棕黄色，中心有皱褶，表面土黄色粉状孢子较多；分生孢子梗较短，直立或弯曲；顶囊半球形，小梗双层，覆盖顶囊上端三分之二，呈扇形；分生孢子球形至近球形，壁光滑，无色，直径约1.5–2.5μm。土曲霉DK3-18划线接种在PDA平板培养基上30℃培养3d的菌落照片见图1。
测得菌株DK3-18的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与土曲霉(Aspergillus terreus)典型菌株ATCC1012的rDNA-ITS序列有100％的同源性，菌株DK3-18菌落形态也符合土曲霉的菌落形态特征(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)，所以，可以确定菌株DK3-18的生物学分类位置为：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌亚门(Pezizomycotina)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，曲霉属(Aspergillus)，土曲霉(Aspergillus terreus)。
所述菌株DK3-18的rDNA-ITS序列为：
CTCCCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT。
综上，从柿叶粉微生物富集物中分离到菌株DK3，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株DK3-18，即土曲霉(Aspergillus terreus)DK3-18，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62857，保藏日期2022年10月12日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：利用土曲霉DK3-18酶解辅助提取柿叶总黄酮的应用
利用土曲霉DK3-18酶解辅助提取柿叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：
(1)冻干管保存的土曲霉DK3-18孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养64h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉DK3-18的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)用步骤(1)制备的孢子液4mL接种100mL产酶培养基(接种量为4％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下培养68h，得干菌体浓度为4.56g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为88.2U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，250-mL三角烧瓶装100mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)5g柿叶粉于250-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液50mL[即料酶比为1:10(g:mL)]，搅拌均匀后于30℃酶解8h，得柿叶酶解物。
(4)步骤(3)全部柿叶酶解物中，加入75mL无水乙醇[1.5倍粗酶液体积，体系乙醇体积分数60％，料液比1:25(g:mL)]。摇匀后置于水温60℃、功率200W的超声清洗机中提取30min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加10mL无水乙醇(按原料柿叶粉质量计的2mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物1.02g，总黄酮含量为39.6％，即得到总黄酮0.404g，提取得率为8.08％。
对比例1：未经酶解的柿叶总黄酮提取(与实施例4对比)
(1)5g柿叶粉于250-mL三角烧瓶中，加入125mL的60％乙醇水溶液[体系料液比1:25(g:mL)]。摇匀后置于水温60℃、功率200W的超声清洗机中提取30min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加10mL无水乙醇(按原料柿叶粉质量计的2mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物0.782，总黄酮含量为37.3％，即得到总黄酮0.292g，提取得率为5.84％。
比较实施例1和对比例1的结果可以看出：在提取柿叶总黄酮前，增加了土曲霉DK3-18发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮提取得率由5.84％提高到8.08％，提高了38.4％。
实施例5：利用土曲霉DK3-18酶解辅助提取柿叶总黄酮的应用
利用土曲霉DK3-18酶解提取柿叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的土曲霉DK3-18 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养60h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉DK3-18的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)用步骤(1)制备的孢子液5mL接种100mL产酶培养基(接种量为5％的体积分数)，于30℃、180r/min振荡条件下培养64h，得干菌体浓度为4.47g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为86.8U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。
(3)10g柿叶粉于250-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液80mL[即料酶比为1:8(g:mL)]，搅拌均匀后于35℃酶解7h，得柿叶酶解物。
(4)步骤(3)全部柿叶酶解物中，加入160mL无水乙醇[2倍粗酶液体积，体系乙醇体积分数66.7％，料液比1:24(g:mL)]。摇匀后置于水温65℃、功率150W的超声清洗机中提取35min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加15mL无水乙醇(按原料柿叶粉质量计的1.5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心8min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物1.88g，总黄酮含量为43.1％，即得到总黄酮0.810g，提取得率为8.10％。
对比例2：未经酶解的柿叶总黄酮提取(与实施例5对比)
(1)10g柿叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入240mL的66.7％乙醇水溶液[体系料液比1:24(g:mL)]。摇匀后置于水温65℃、功率150W的超声清洗机中提取35min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加15mL无水乙醇(按原料柿叶粉质量计的1.5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心8min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物1.45g，总黄酮含量为40.6％，即得到总黄酮0.589g，提取得率为5.89％。
比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在提取柿叶总黄酮前，增加了土曲霉DK3-18发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮提取得率由5.89％提高到8.10％，提高了37.5％。
实施例6：利用土曲霉DK3-18酶解辅助提取柿叶总黄酮的应用
利用土曲霉DK3-18酶解提取柿叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的土曲霉DK3-18 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养56h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉DK3-18的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)用步骤(1)制备的孢子液7.5mL接种150mL产酶培养基(接种量为5％的体积分数)，于30℃、180r/min振荡条件下培养60h，得干菌体浓度为4.35g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为85.4U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，500-mL三角烧瓶装150mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)20g柿叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液120mL[即料酶比为1:6(g:mL)]，搅拌均匀后于35℃酶解6h，得柿叶酶解物。
(4)步骤(3)全部柿叶酶解物中，加入240mL无水乙醇[2倍粗酶液体积，体系乙醇体积分数66.7％，料液比1:18(g:mL)]。摇匀后置于水温70℃、功率100W的超声清洗机中提取40min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加20mL无水乙醇(按原料柿叶粉质量计的1mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心10min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物3.72g，总黄酮含量为43.7％，即得到总黄酮1.63g，提取得率为8.15％。
对比例3：未经酶解的柿叶总黄酮提取(与实施例6对比)
(1)20g柿叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入360mL的66.7％乙醇水溶液[体系料液比1:18(g:mL)]。摇匀后置于水温70℃、功率100W的超声清洗机中提取40min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加20mL无水乙醇(按原料柿叶粉质量计的1mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心10min，上清液转入一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物2.94g，总黄酮含量为40.4％，即得到总黄酮1.19g，提取得率为5.95％。
比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在提取柿叶总黄酮前，增加了土曲霉DK3-18发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮提取得率由5.95％提高到8.15％，提高了37.0％。

Claims (10)

1.土曲霉（Aspergillus terreus）DK3-18，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No: 62857，保藏日期2022年10月12日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
2.一种权利要求1所述土曲霉DK3-18在提取柿叶总黄酮中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：（1）将土曲霉DK3-18培养获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；（2）将粗酶液与柿叶粉混合，于30–35℃条件酶解6–8 h，再往酶解体系中加入无水乙醇后进行超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；（3）总黄酮提取液经减压蒸干，无水乙醇溶解和真空干燥，得总黄酮提取物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述粗酶液制备方法为：将土曲霉DK3-18孢子接种于产酶培养基中，于30℃、180–200 r/min振荡培养60–68 h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：玉米粉40-50 g/L，蛋白胨4–5 g/L，(NH4)2SO4 5–6 g/L，KH2PO4 3–5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5–1.0 g/L，CaCl2 0.3–0.5 g/L和FeSO4·7H2O 0.1–0.2 g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产酶培养基终浓度组成为：玉米粉50 g/L，蛋白胨4 g/L，(NH4)2SO4 6 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl2 0.5 g/L和FeSO4·7H2O 0.1 g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述土曲霉DK3-18在产酶培养前，先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得土曲霉DK3-18孢子液，按体积分数4%–5%的量接入产酶培养基进行培养，所述孢子液制备方法为：将土曲霉DK3-18接种于PDA平板培养基，于30℃培养56–64 h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得土曲霉DK3-18孢子液。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述柿叶粉将新鲜柿叶，自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述粗酶液体积用量以柿叶粉质量计为6–10 mL/g，无水乙醇体积用量为粗酶液体积的1.5–2.0倍。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述总黄酮提取液的制备方法为：柿叶酶解结束后，往酶解体系中加入粗酶液体积1.5–2.0倍的无水乙醇，使体系中乙醇体积分数达到60%–66.7%，搅拌均匀后置于水温60–70℃、功率100–200 W的超声波清洗机中提取30–40 min；超声醇提结束后，趁热抽滤，得总黄酮提取液。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）从总黄酮提取液中回收总黄酮的方法为：总黄酮提取液于45℃、–0.1 MPa条件下蒸馏至无液体流出，加入体积为原料柿叶质量计1–2 mL/g的无水乙醇，充分振荡后于8000 r/min离心5–10 min，上清液转入一洁净培养皿中，于50℃、–0.1 MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
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