CN116083287A - 一株多粘类芽孢杆菌及其在农业领域的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292及其在农业领域的应用，其分类命名：Paenibacillus polymyxa，被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M2022873，保藏时间为：2022年06月13日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。本发明多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292可有效拮抗大丽轮枝菌，可应用于对棉花生产形成行之有效的可持续防控体系中。其也可广谱拮抗植物病原菌，具有固氮和溶磷活性，可用于农业病害防治、供应植物的氮需求和溶解有机磷需求，促进植物生长。

Description

一株多粘类芽孢杆菌及其在农业领域的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，主要涉及一株多粘类芽孢杆菌及其在农业领域的应用。
背景技术
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一类能够产生内生孢子的革兰氏阳性细菌，可以产生多种具有抑菌活性的物质，如多肽抗生素类和拮抗蛋白质类等。此外，多粘类芽孢杆菌能够通过固氮和溶磷作用加强宿主植株对氮、磷等营养元素的吸收，促进植物的生长，提高作物的产量。由于多粘类芽孢在植物抗病、促生方面的良好作用，以及对环境友好无污染的特点，美国环境保护署(EPA)将其作为可商业化的微生物菌种，中国也将其列为免做毒理学实验的第一级菌种。
我国是全球最大的棉花生产国(25.6％)，而新疆地区棉花产量占国内产量比重接近90％。目前棉花黄萎病是新疆棉花生产上最重要的病害之一，被称为棉花“癌症”，会严重降低棉花的品质，造成不同程度的减产，严重时出现绝收。新疆棉花黄萎病的发病面积超过播种面积的50％，其中重病田面积超过100万亩，近年来出现了加重的趋势。棉花黄萎病主要由大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)引起，大丽轮枝菌侵入植株体内后，会产生毒素，同时菌丝体会堵塞导管，影响植株体内水分和养分运输造成棉花萎蔫症状。大丽轮枝菌可引起660多种植物患病，并且目前还没有行之有效的可持续防控体系。
我国农业绿色发展仍处于起步阶段，其中微生物在推进化肥农药减量增效中具有巨大的潜力，通过微生物肥料进行有机肥替代，推行微生物防治等绿色防控技术，对农业的健康可持续发展具有重要意义。目前国内对多粘类芽孢杆菌主要集中于筛选、分离鉴定、抑菌效果和发酵培养方面的研究，对兼具抗病、促生效果多粘类芽孢杆菌报道相对较少，介于此特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292。
本发明再有一个目的是提供所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292于广谱拮抗植物病原菌、供应植物的氮需求和溶解有机磷需求中的应用。
为此，本发明提供的技术方案为：
多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292，其分类命名：Paenibacillus polymyxa，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa 2022TIBBST292被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2022873，保藏时间为：2022年06月13日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。
多粘类芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：
将所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292菌株接种于PDB培养基或LB培养基中进行培养。
优选的是，所述的多粘类芽孢杆菌的培养方法中，所述多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292于温度20～30℃下培养1～10天。
用于供应植物的氮需求的组合物，所述组合物包含所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292。
所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292于农业领域广谱拮抗植物病原菌、供应植物的氮需求和溶解有机磷需求中的应用。
优选的是，所述的应用中，所述广谱拮抗植物病原菌包括于拮抗大丽轮枝菌。
优选的是，所述的应用中，所述植物为棉花。
优选的是，所述的应用中，所述大丽轮枝菌包括大丽轮枝菌Vd080和大丽轮枝菌Vd991菌株。
优选的是，所述的应用中，所述广谱拮抗植物病原菌包括还拮抗如下病原菌的生长：青枯雷尔氏菌、野油菜黄单胞菌、茄病狄科氏菌、尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、长柄链格孢、链格孢、番茄匍柄霉、囊状匍柄霉和黄褐孢霉菌。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明公开了一株多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292及其应用。该多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa 2022TIBBST292被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2022873。该多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292可有效拮抗大丽轮枝菌，可应用于对棉花生产形成行之有效的可持续防控体系中。同时，该多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292还拮抗青枯雷尔氏菌、野油菜黄单胞菌、茄病狄科氏菌、尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、长柄链格孢、链格孢、番茄匍柄霉、囊状匍柄霉和黄褐孢霉菌等病原菌的生长，可广谱拮抗植物病原菌，在农业病害防治中具有良好的应用前景。并且，多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292固氮活性和溶磷活性都很高，可用于供应植物的氮需求和溶解有机磷需求，促进植物生长。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292拮抗大丽轮枝菌效果图。
图2为本发明中的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292形态特征图，其中左上和右上分别展示LB和PDA培养基上的菌落形态，下面展示显微结构。
图3为本发明其中一个实施例中的基于16S rDNA构建的系统发育树。
图4为本发明其中一个实施例中的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292对病原细菌的拮抗效果图。
图5为本发明其中一个实施例中的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292对病原真菌的拮抗效果图。
图6为本发明其中一个实施例中的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292固氮效果图，其中，A展示BST292在无氮固体培养基上生长的形态特征，B展示BST292在无氮液体培养基中的生长曲线。
图7为本发明其中一个实施例中多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292解磷效果图，其中，A展示BST292在有机磷培养基上产生的解磷圈，B展示磷含量的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供一株多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292，其分类命名：Paenibacilluspolymyxa，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa 2022TIBBST292被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2022873，保藏时间为：2022年06月13日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。
本发明提供一种多粘类芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：
将所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292菌株接种于PDB培养基或LB培养基中进行培养。
在上述方案中，作为优选，所述的多粘类芽孢杆菌的培养方法中，所述多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292于温度20～30℃下培养1～10天。
用于供应植物的氮需求的组合物，所述组合物包含所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292。多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292可作为非致病性固氮细菌，用于供应植物的氮需求。
所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292于广谱拮抗植物病原菌或供应植物的氮和有机磷溶解需求中的应用。
在上述方案中，作为优选，所述广谱拮抗植物病原菌包括于拮抗大丽轮枝菌。
在上述方案中，作为优选，所述植物为棉花。目前棉花黄萎病是新疆棉花生产上最重要的病害之一，棉花黄萎病主要由大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)引起，本发明的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292能有效拮抗大丽轮枝菌，可应用于对棉花生产形成行之有效的可持续防控体系中。
在上述方案中，作为优选，所述大丽轮枝菌包括大丽轮枝菌Vd080和大丽轮枝菌Vd991菌株。
在本发明的其中一些技术方案中，作为优选，所述广谱拮抗植物病原菌包括还拮抗如下病原菌的生长：青枯雷尔氏菌、野油菜黄单胞菌、茄病狄科氏菌、尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、长柄链格孢、链格孢、番茄匍柄霉、囊状匍柄霉和黄褐孢霉菌。可用于多种农作物的生物防治中。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
表1病原菌及其来源
注：本申请后续实施例中采用的病原菌仅以病原菌分类号说明，未写菌株号。
实施例1菌株2022TIBBST292的分离及鉴定
1.1菌株的分离
供试土样采自新疆自治区石河子市惠远种业公司病圃地和新疆农垦科学院棉花研究所试验地。取1g土壤与99mL 1×PBS缓冲液混匀(稀释倍数102)，200rpm、28℃摇培30min。静置20min后，取土壤悬浊液上清液进行梯度稀释，并分别取稀释倍数102、103、104的稀释液100μL均匀涂布于LB固体培养基(酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L)平板上，28℃培养箱倒置培养24h-48h，用无菌移液枪头挑取形态不一的细菌单菌落在LB固体培养基平板上划线纯化后，于LB液体培养基中扩繁，混合灭菌甘油(工作浓度25％)保存于-80℃冰箱备用。
1.2拮抗菌株的筛选
采用打孔抑菌圈法筛选拮抗细菌，在PDA培养基(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L)上喷洒两种类型大丽轮枝菌(Vd080，Vd991)孢子悬浮液(1×106个/mL)，晾干后用5mm打孔器在培养基上打三个孔。打完孔后用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出。向其中加入30μL活化后的菌液，以实验室前期筛选得到的高效拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌2021TIBBST23(后文简称BST23)以及拜耳商品化微生物菌剂“卓润”活性菌株QST713作为对照，28℃培养箱培养3-5天，得到具有明显拮抗效果的菌株2022TIBBST292(以下简称BST292，图1，表2)
表2拮抗细菌对大丽轮枝菌的抑制效果
病原菌 BST292 BST23 QST713
大丽轮枝菌Vd080 2.97±0.06a 2.50±0.20b 2.63±0.06b
大丽轮枝菌Vd991 3.00±0.20a 2.87±0.12a 2.83±0.29a
注：各项测量值后面的不同字母，表示不同处理间差异达到显著水平(LSD，P＜0.05)1.3菌株2022TIBBST292的鉴定
该菌株形态特征如图所示(图2)，在LB固体培养基上呈薄层，菌落圆形、边缘不整齐、表面光滑或成细颗粒、乳白色、不透明。在PDA固体培养基上，菌落较小、稍突起、边缘整齐、表面光泽、半透明。菌体杆状、产芽孢、芽孢椭圆形。
通过使用细菌通用引物对27F/1492R(表3)扩增其16S rDNA序列进行初步的鉴定。25μL反应体系如表4。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min.
表3菌株鉴定所用引物
引物名称 序列
27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′(SEQ ID NO:1)
1492R 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′(SEQ ID NO:2)
表4聚合酶链式反应体系
组分 体积(μL)
2×TaqMix 12.5
正向引物(10pmol) 1
反向引物(10pmol) 1
DNA模板 1
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 9.5
将扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳检测目的条带后送北京擎科生物科技有限公司测序，获得的测序结果(如SEQ ID NO:3所示的序列)使用Chromas进行分析，同时在NCBI网站上进行BLAST比对，确定菌株分类，结果显示菌株BST292与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)相似性高达99％，同时从NCBI下载得到近缘种数据，利用MEGA7.0，采用NJ(neighbor-joining)构建系统发育树。系统发育结果见图3，确定该菌株属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292已于2022年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No.M2022873。
实施例2菌株2022TIBBST292的抑菌活性
2.1多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292的拮抗植物病原细菌活性
采用打孔抑菌圈法检测BST292拮抗植物病原细菌的效果。将植物病原细菌(表1)摇培过夜的菌悬液按1：100比例加入50℃左右的LB固体培养基中，充分混匀后倒板，做成带菌培养基。琼脂平板凝固后用5mm打孔器在培养基上打三个孔。打完孔后用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出。每个孔加入BST292菌悬液30μL，以液体LB作为对照。将培养皿转移至28℃恒温培养箱，24h后，测量抑菌圈直径大小。每个处理重复3次。
结果表明BST292能够有效抑制青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、茄病狄科氏菌(Dickeya solani)的生长(表5，图4)。
表5多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292对病原细菌的抑制效果
病原细菌 青枯雷尔氏菌 野油菜黄单胞菌 茄病狄科氏菌
抑制效果/cm 1.38±0.08 1.43±0.06 1.25±0.05
2.2多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292的拮抗植物病原真菌的活性
采用对峙培养法检测BST292拮抗病原真菌的效果。从活化3天的病原真菌菌落边缘打取菌饼(5mm)，将其接种于PDA平皿中央，用移液枪分别移取2μL菌株BST292菌悬液于病原菌两侧，以只接病原真菌不接BST292为对照，每个处理三次重复，28℃培养7-12天，分别测量对照组和处理组病原菌直径，按照公式计算抑制率。
抑制率＝(对照病原菌菌落直径-对峙培养的病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径*100％
结果表明BST292能够有效抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大丽轮枝菌Vd080(Verticillium dahlia)、大丽轮枝菌Vd991(Verticillium dahlia)、长柄链格孢(Alternaria longipes)、链格孢(Alternaria alternata)、番茄匍柄霉(Stemphyliumlycopersici)、囊状匍柄霉(Stemphylium vesicarium)、黄褐孢霉菌(Cladosporiumfulvum)的生长(表6，图5)，具有广谱拮抗植物病原真菌的效果。
表6多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292对病原真菌的抑制效果
病原菌 对照菌落直径/cm 处理菌落直径/cm 抑制率/％
尖孢镰刀菌 8.50±0.00 2.53±0.06 70.20％
灰葡萄孢菌 6.60±0.10 2.20±0.61 66.67％
立枯丝核菌 8.50±0.00 2.53±0.06 70.20％
大丽轮枝菌Vd080 4.03±0.06 1.03±0.15 74.38％
大丽轮枝菌Vd991 4.80±0.01 1.00±0.05 79.17％
长柄链格孢 8.50±0.00 3.27±0.12 61.57％
链格孢 6.60±0.26 1.87±0.06 71.72％
番茄匍柄霉 5.50±0.10 1.73±0.23 68.48％
囊状匍柄霉 4.77±0.15 1.20±0.28 74.83％
黄褐孢霉菌 2.77±0.15 1.22±0.08 56.02％
实施例3菌株2022TIBBST292的固氮活性测定
3.1无氮固体培养基：葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钠0.2g/L，二水硫酸钙0.1g/L，碳酸钙5g/L，琼脂20g/L。
3.2划线培养：从纯化的LB培养基上挑取单菌落，于LB液体培养基中扩繁后，将其接种至无氮固体培养基，28℃恒温静置培养72h，观察平板上的生长状况。
3.3无氮液体培养基生长情况：从纯化的LB培养基上挑取单菌落，接种至5mL无氮液体培养基，28℃，200rpm培养72h，分别在24h、48h和72h取样测定其600nm的吸光度值。
结果如图6中A所示，菌株BST292可以在无氮固体培养基上生长。在无氮液体培养基中，随着培养时间的延长，其菌液吸光度出现明显增加，显著高于对照(图6中B)，证明其具有一定的固氮能力。
实施例4菌株2022TIBBST292的溶磷活性测定
4.1有机磷固体培养基：葡萄糖10g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母浸粉0.5g/L，氯化钠0.3g/L，氯化钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.023g/L，卵磷脂0.2g/L，碳酸钙1g/L，琼脂15g/L；解有机磷液体培养基：卵磷脂5g/L，葡萄糖10g/L，六水氯化镁5g/L，七水硫酸镁0.25g/L，氯化钾0.2g/L，硫酸铵0.1g/L；钼酸铵溶液：钼酸铵100g/L；标准磷溶液：称取439.4mg于110℃干燥2h的磷酸二氢钾，溶于400mL蒸馏水中，再加入5mL浓硫酸，搅拌后移至1L容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。此为100mg/L浓度的磷标准贮备溶液，取此溶液准确稀释20倍即为磷标准液5mg/L；钼锑抗贮存液：称量酒石酸氧锑钾K(SbO)C4H4O6 500mg，加入到100mL蒸馏水中，即制成0.5％的溶液。另称量钼酸铵(NH4)6Mo7O24·4H2O 10g，溶于450mL水中后，慢慢加入153mL的浓硫酸，再将0.5％酒石酸氧锑钾溶液100mL加至钼酸铵溶液中，最后加水定容至1L。充分摇匀，避光保存，此即钼锑混合液；钼锑抗显色剂：将1.5g左旋抗坏血酸溶于100mL钼锑贮存液中，此试剂24h内有效，必须用前配制。
4.2有机磷溶解能力的定性：取2μL菌株BST292菌悬液于有机磷固体平板上，将平板置于28℃下恒温培养3-7d，观察菌落周围是否出现解磷圈，并统计。
4.3有机磷溶解能力的定量：
标准曲线的绘制：分别准确吸取5mg/L磷酸二氢钾标准液0、2、4、6、8、10mL于100mL容量瓶中，加入0.5mol/L碳酸氢钠10.0mL，加水使各瓶的总体积达到30mL，摇匀；最后加入钼锑抗试剂5.0mL混匀显色，定容至100mL，室温静置30min。以OD值为纵坐标，相应的磷含量为横坐标，在720nm波长下进行比色，绘成磷含量标准曲线(图7B)。
吸取800μL BST292菌液接种到40mL有机磷液体培养基中，以接种无菌水作为对照，每份样品三个重复；摇床转速为180rpm，28℃培养，共培养7d，分别在72h和168h时取样。吸取20mL超声破碎10min后，加入活性碳1g，摇培15min，10000rpm离心5min，过0.22μm滤器后，吸取5mL，加入5mL钼锑抗显色剂，定容至50mL，静置30min后，测720nm下的吸光度值。
结果如图7中A所示，BST292在有机磷固体培养平板上生长较好，解磷直径达到1.57±0.06cm。结合磷含量标准曲线，扣除对照影响，其第七天有机磷降解达到3mg/L(表7)。
表7多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292的溶磷效果
处理 第三天(mg/L) 第七天(mg/L)
CK 4.02±0.37 5.11±0.28
BST292 5.91±0.23 8.14±0.84
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292，其分类命名：Paenibacillus polymyxa，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa 2022TIBBST292被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2022873，保藏时间为：2022年06月13日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。
2.多粘类芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292菌株接种于PDB培养基或LB培养基中进行培养。
3.如权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292于温度20～30℃下培养1～10天。
4.用于供应植物的氮需求的组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292。
5.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌2022TIBBST292于广谱拮抗植物病原菌、供应植物的氮需求和溶解有机磷需求中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述广谱拮抗植物病原菌包括拮抗大丽轮枝菌。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为棉花。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述大丽轮枝菌包括大丽轮枝菌Vd080和大丽轮枝菌Vd991菌株。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述广谱拮抗植物病原菌包括还拮抗如下病原菌的生长：青枯雷尔氏菌、野油菜黄单胞菌、茄病狄科氏菌、尖孢镰孢菌、灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、长柄链格孢、链格孢、番茄匍柄霉、囊状匍柄霉和黄褐孢霉菌。
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