CN116063423A - 一种提高单倍体诱导效率的突变型OsPLA1m1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高单倍体诱导效率的突变型OsPLA1m1及其应用。本发明获得的基因突变体OsPLA1m1，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，该突变体可使得水稻具有高效的单倍体诱导效率。本发明还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种提高单倍体诱导效率的基因突变体OsPLA1m1及其应用。
背景技术
单倍体育种一般只需要两代就能获得纯合的自交系，而传统育种技术需要至少6代以上的自交或回交才能获得纯度较高的自交系。因此单倍体育种相比传统育种可大大加快育种进程，具有明显的时间优势。同时，单倍体加倍后均为纯合二倍体，可快速准确筛选各种突变体，其选择效率更高。因此，单倍体育种在植物遗传育种中具有重要意义。
自然界中单倍体发生概率非常低，人工诱导单倍体的方法主要有两大类：体外法和体内法。体外法主要利用组织培养如花药培养或花粉培养等获得单倍体，该法严重依赖组培效率及基因型限制；体内法有远缘杂交、单倍体诱导系等，远缘杂交的效率较低，单倍体诱导系具有效率高，易操作的特点，应用较多。
目前单倍体诱导系在玉米中应用较为成熟，且近年克隆了其主效基因，但水稻中尚无成熟的单倍体诱导系。
发明内容
本发明的目的是获得成熟的水稻单倍体诱导系。
第一方面，本发明提供一种突变体OsPLA1m1，所述突变体OsPLA1m1为水稻野生型OsPLA1基因第一个外显子133位处缺失1个碱基A，导致其氨基酸序列发生移码突变；所述突变体OsPLA1m1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明首先通过生信分析，在水稻中获得玉米单倍体诱导主效基因ZmPLA1的同源基因OsPLA1，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在其第一个外显子区域设计了敲除靶点T1(GATCGACGGCGGCGGCATCAGGG，SEQ ID NO.5，通过农杆菌介导的遗传转化技术转化籼稻93-11。在获得转基因株系后，通过对靶点区域的DNA序列分析，获得了不同的OsPLA1基因突变类型。将不同类型的突变株系授粉给水稻材料，检查其单倍体诱导效率，结果显示，其中一种突变类型(SEQ ID No.1)具有非常高的单倍体诱导效率。本申请提供的水稻基因突变体OsPLA1m1及包含该突变体的水稻株系有望作为单倍体诱导系，应用于水稻的单倍体育种中。
本发明提供的突变体OsPLA1m1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还请求保护含有突变体OsPLA1m1的水稻株系。
本发明通过使水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变，获得突变体OsPLA1m1，更具体地，水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变的方式为CRISPR/Cas9，靶序列为SEQ ID No.5。
第二方面，本发明请求保护含有上述突变体OsPLA1m1的生物材料，所述生物材料为表达载体或宿主细胞。
第三方面，本发明请求保护一种引物对，检测突变体OsPLA1m1；所述引物对的序列如SEQ ID No.3-4所示。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述的突变体OsPLA1m1或上述的生物材料或上述的分子标记或上述的引物对在制备转基因植物中的应用。
以及，上述的突变体OsPLA1m1或上述的生物材料或上述的分子标记或上述的引物对在农作物改良育种中的应用。
以及，上述的突变体OsPLA1m1或上述的生物材料或上述的分子标记或上述的引物对在提高农作物单倍体诱导率中的应用。
第四方面，本发明请求保护一种创制水稻单倍体诱导系的方法，将水稻中的野生型OsPLA1基因改变为上述突变体OsPLA1m1。
本发明的有益效果在于：
(1)含有本发明所提供的突变体OsPLA1m1的水稻具有极高的单倍体诱导效率；
(2)本发明提供一种创制水稻单倍体诱导系的方法，本发明所提的方法中，包含本发明所提供的突变体OsPLA1m1的遗传背景来源于籼稻骨干亲本品种93-11，是一个优良父本材料，花粉量较多，有望作为父本诱导系，应用于水稻单倍体育种中，具有效率高，便于操作的特点，应用价值巨大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明pGE-OsPLA1T1载体图谱，其中，A为重组载体pGE-OsPLA1T1图谱；B为重组载体的T-DNA区域放大示意图。
图2为本发明实施例2中转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，泳道1为H2O、泳道2为93-11非转基因植株基因组DNA，泳道3为质粒阳性对照，泳道4-13为筛选获得的转基因植株基因组DNA。
图3为本发明基因编辑靶点设计及编辑获得的两种主要突变示意图。A为基因结构示意图；B为编辑后基因测序峰图；C为蛋白质序列长度示意图。
图4为本发明OsPLA1三种突变类型93-11HI-2-5、93-11HI-2-21、93-11HI-6与野生型(93-11)氨基酸序列比对结果。方框分别标识了三种突变类型编码氨基酸的长度。
图5为本发明单倍体植株鉴定结果。A为两对SSR标记(A1和B12)区分父本、母本、杂交种和单倍体单株。B为流式细胞仪鉴定单倍体和二倍体单株。C-E分别为幼苗期、灌浆期、收获后二倍体(Diploid)和单倍体(Haploid)的植株和穗子照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1生信分析及OsPLA1基因编辑载体构建
本实施例提供，ZmPLA1在水稻中的同源基因的获得及敲除双元载体的构建，具体步骤如下：
利用同源序列比对，获得ZmPLA1在水稻中的同源基因LOC_Os03g27610，其相似性达75％，推测为水稻中负责单倍体诱导的主效基因。通过预测设计利用CRISPR/Cas9敲除该基因的靶点，靶点序列为(SEQ ID No.5：GATCGACGGCGGCGGCATCAGGG)，通过基因合成及重组方式构建敲除双元载体，并转入大肠杆菌感受态细胞中保存，构建完成的载体命名为pGE-OsPLA1T1，图谱见图1。经测序正确后保存留用。
实施例2农杆菌介导的遗传转化
取实施例1获得的pGE-OsPLA1T1质粒，转化农杆菌EHA105感受态细胞，涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物进行菌液PCR验证，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。
用包含pGE-OsPLA1T1的农杆菌EHA105悬液，侵染93-11愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根获得再生转基因株系10株。通过PCR鉴定转基因植株中转入的潮霉素抗性基因，结果显示，PCR阳性植株10株(图2)，将阳性植株移栽至泥土中，成活10株。
实施例3OsPLA1基因敲除结果分析
针对实施例2得到的阳性成活植株，在苗期取叶片提取基因组DNA，利用引物(SEQID NO.3和4)进行扩增，所得产物进行测序分析。结果发现有6个株系的OsPLA1基因发生突变，突变类型有1bp缺失、2bp缺失、1bp插入和1bp替换。上述四种突变，共产生3种类型的氨基酸变异，其中第一种(93-11HI-2-5为代表，编码132个氨基酸)和第二种(93-11HI-2-21为代表，编码256个氨基酸)差异较大，第二种(93-11HI-2-21为代表)和第三种(93-11HI-6为代表，编码257个氨基酸)差异较小，仅有1个氨基酸差异，但三者相比野生型OsPLA1均为先发生移码突变，并提前终止的氨基酸序列，结果显示见图3和图4。
实施例4单倍体诱导结果分析
由于第二种突变体和第三种突变体差异极小，故后续仅用第一种和第二种突变体的T1后代来进行单倍体诱导率分析(表1中T1代)，后续分别用93-11HI-2-5和93-11HI-2-21来表示。为了方便杂交，选用一些雄性不育系作为母本，以上述两种突变体为父本，分别进行杂交授粉。为了便于后续分析，对93-11和母本材料进行分子标记筛选，最终获得两对SSR标记，可分别标记93-11(较小条带)和母本材料(较大条带)，结果见图5的A。
将获得的杂交种发芽后在苗期和生殖生长期进行形态学观察，诱导出的单倍体材料长势弱小，表现为植株矮化、分蘖少、分蘖纤细、穗子短小及不结实等特点，结果见图5的C-E。对获得的杂交种幼苗进行SSR标记进一步验证，PCR反应后的电泳结果中，若为一条较小电泳条带，则表示来源于父本；若为一条较大电泳条带，则表示来源于母本，为单倍体；若两条电泳条带均有，则表示来源于母本和父本，为真杂交种。
在两个组合中(广8A×93-11HI2-5)和(玖香A×93-11HI2-5)分别鉴定获得3株和2株单倍体幼苗，结果见图5的A。其单倍体诱导效率分别为10.34％和4.87％，结果见表1。同时对上述单倍体材料在流式细胞仪中进行测试，其结果进一步验证了表型和SSR标记的结果，见图5的B。
非常令人惊讶的是，尽管也发生了基因突变，但93-11HI-2-21的杂交种中，并未获得一株单倍体材料，结果见表1。该结果表明并非所有的OsPLA1基因突变都能使得基因编辑材料作为单倍体诱导系使用。而本申请提供的OsPLA1突变类型(SEQ ID NO.1)及包含其的水稻株系93-11HI-2-5，由于具有极高的诱导效率，故有望作为单倍体诱导系，应用于水稻中，显著提高水稻的育种效率并缩短育种进程。
表1 单倍体诱导效率统计表
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种突变体OsPLA1m1，其特征在于，所述突变体OsPLA1m1为水稻野生型OsPLA1基因第一个外显子133位处缺失1个碱基A，导致其氨基酸序列发生移码突变；所述突变体OsPLA1m1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的突变体OsPLA1m1，其特征在于，所述突变体OsPLA1m1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述的突变体OsPLA1m1，其特征在于，使水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变，获得突变体OsPLA1m1。
4.根据权利要求3所述的突变体OsPLA1m1，其特征在于，水稻基因组中OsPLA基因第一外显子发生缺失突变或发生插入突变的方式为CRISPR/Cas9，靶序列为SEQ ID No.5。
5.含有权利要求2所述突变体OsPLA1m1的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达载体或宿主细胞。
6.一种引物对，其特征在于，检测突变体OsPLA1m1，所述引物对的序列如SEQ ID No.3-4所示。
7.权利要求1-4任一项所述的突变体OsPLA1m1或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的引物对在制备转基因植物中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述的突变体OsPLA1m1或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的引物对在农作物改良育种中的应用。
9.权利要求1-4任一项所述的突变体OsPLA1m1或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的引物对在提高农作物单倍体诱导率中的应用。
10.一种创制水稻单倍体诱导系的方法，其特征在于，将水稻中的野生型OsPLA1基因改变为权利要求1所述突变体OsPLA1m1。
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