CN115927067A - 发酵杆菌、含有其的发酵复合菌剂及复合菌剂的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及发酵杆菌，以及基于该发酵杆菌制备的发酵复合菌剂，和具体发酵复合菌剂的制备方法和应用。所述发酵杆菌选自地衣芽孢杆菌CY‑1和粪产碱菌CY‑2；所述地衣芽孢杆菌CY‑1，保藏单位为：CGMCC，保藏中心保藏编号为：CGMCC No.21241；所述粪产碱菌CY‑2，保藏单位为：CGMCC，保藏中心保藏编号为：CGMCC No.21242。本发明通过特异性的地衣芽孢杆菌CY‑1和粪产碱菌CY‑2配合实现了对易腐垃圾有效的堆肥处理，在堆肥处理过程中能够有效固氮减排，提高处理后易腐垃圾堆肥产品的质量及其经济价值和效用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及发酵杆菌，以及基于该发酵杆菌制备的发酵复合菌剂，和具体发酵复合菌剂的制备方法和应用。
背景技术
近年来随着垃圾分类制度的宣传和推广，我国对易腐垃圾的处置和资源化利用率有了很大的提高，易腐垃圾富含淀粉、纤维素、蛋白质、脂类等有机质，处理后可制成有机肥料或土壤调理剂，从而实现易腐垃圾无害化处理和高效资源化利用。因此，利用微生物好氧发酵生产有机肥、土壤调理剂等资源化产品已经成为国内外易腐垃圾资源化利用的主流方法。
其中易腐垃圾设备发酵是好氧发酵的主要方式之一，但是目前易腐垃圾处理设备得到的有机肥品质不高、能耗太大的问题实际上都是易腐垃圾好氧降解效率偏低造成的。如果处理时间不够，则有机肥品质不达标；如果增加处理时间，能耗就会更大。所以，解决有机肥品质不高和能耗太大的问题关键就是要提高餐厨垃圾的降解效率。
另一方面，近年来，在传统堆肥处理基础之上发展起来的太阳能辅助堆肥发酵技术在国内很多地区开始大规模推广使用，与传统的好氧堆肥处理技术相比，利用太阳能阳光房进行餐厨垃圾好氧堆肥发酵技术增加了环境温度，提高了厨余垃圾的好氧发酵处置效率，特别是在冬季低温季节对于厨余垃圾的快速升温发酵具有一定的优势，但由于餐厨等易腐垃圾的高油、高盐及高含水率的问题，目前大部分太阳能阳光房辅助发酵仍存在处理效率低、有机肥不达标、臭气污染等问题。部分堆肥场地会导致新的水环境或大气污染，对环境造成更大影响，造成更大的处理成本。因此，本发明希望通过制备高效的微生物菌剂及其在易腐垃圾堆肥中的应用方法，从易腐垃圾减量化效果、除臭效果和腐熟度三方面提高堆肥效率、减少臭气污染和氮素损失、改善堆肥品质。
而现有技术中，如CN108148790A公开了一种畜禽生物粪便降解的混合菌种以及其应用的方法，其采用复数种杆菌对易腐垃圾畜禽生物粪便配合对易腐垃圾生物粪便进行处理，能够实现无污染、无臭味排放畜禽粪便，并且处理后能够作为有机肥用于绿化。但是，其存在较为明显的缺陷性，如其使得粪便无臭化实际是通过大量的分解有机物并排放大量的氨气和硫化氢，使其充分排放后实现无臭化的。但是，该处理后实际使得易腐垃圾的氮含量产生非常显著的下降，实际有效价值度显著下降。
因此，如何合理地采用发酵菌配合实现有效地对易腐垃圾进行处理，同时保留易腐垃圾的营养价值以实现有效回收利用，是目前生物发酵技术中重要的研究方向。
发明内容
为解决现有的微生物发酵技术的有效性有限，并且其技术层面还处于垃圾处理方面，尚无法实现垃圾处理的同时实现易腐垃圾的高价值化利用等问题，本发明提供了发酵杆菌，以及基于该发酵杆菌形成的发酵复合菌剂、该发酵复合菌剂的制备方法和应用技术。
本发明的目的在于：
一、通过筛选获得两种具有特定功能性的发酵杆菌；
二、通过具备特定功能性发酵杆菌的协同配合及其配套应用技术实现对易腐垃圾的有效发酵处理；
三、确保发酵处理后的易腐垃圾具备无污染、无臭的特点，同时保留有高营养价值；
四、显著提高发酵降解易腐垃圾的效率。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
发酵杆菌，
所述发酵杆菌选自地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌；
所述地衣芽孢杆菌分类命名为地衣芽孢杆菌（
Bacillus licheniformis）CY-1，保藏单位为：CGMCC，保藏中心保藏编号为：CGMCC No.21241，保藏日期为：2020年11月26日；
所述粪产碱杆菌分类命名为粪产碱杆菌（
Alcaligenes faecalis）CY-2，保藏单位为：CGMCC，保藏中心保藏编号为：CGMCC No.21242，保藏日期为：2020年11月26日；
具体的，所述保藏单位CGMCC全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center），其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
发酵复合菌剂，
所述发酵复合菌剂含有所述地衣芽孢杆菌和所述粪产碱杆菌。
作为优选，
所述发酵复合菌剂中地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌的活菌数≥108CFU/mL。
发酵复合菌剂的制备方法，
所述方法包括：
分别将所述地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌挑菌落于培养基中，于37±1 ℃条件下培育至得到活菌数≥108CFU/mL的菌液，将地衣芽孢杆菌培育所得菌液和粪产碱杆菌培育所得菌液以体积比1：（0.9～1.1）的比例混合，即得到所述发酵复合菌剂。
发酵复合菌剂的应用，
所述发酵复合菌剂用于易腐垃圾堆肥处理。
作为优选，
所述易腐垃圾堆肥处理方法具体为：
按易腐垃圾质量取至少其0.15 wt%的发酵复合菌剂，均匀添加至易腐垃圾中处理至少18 d。
对于本发明技术方案而言，本发明首先提供了两种特异性的发酵杆菌，即所述的地衣芽孢杆菌CY-1和所述的粪产碱杆菌CY-2。所述地衣芽孢杆菌CY-1的全基因测序如序列SEQ ID NO:1所示，所述粪产碱杆菌CY-2的全基因测序如序列SEQ ID NO:2所示。常见的地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌均是较为常见的发酵菌，也有用于易腐垃圾堆肥处理的先例。但是，现有的地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌单一或复合用于堆肥处理时仍然存在着效率不高和/或氨气、硫化氢等臭气排放量较多，氮素营养损失较严重的缺陷，导致实际腐熟周期较长、堆肥产品质量较差，并造成了较大的环境污染和碳排放。
而本发明所用的特异性地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌在堆肥效率方面，相较于常规的地衣芽孢杆菌和/或粪产碱杆菌，以及自然堆肥而言，效率能够提高一倍以上，大大缩短堆肥腐熟所需的时间。而另一方面，本发明所用特异性地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2两者配合下，能够非常有效地抑制堆肥过程中的氨排放。少部分经固氮巨大芽孢杆菌和遗传工程改造后的特定粪产碱杆菌在厌氧且具有硝酸盐的条件下能够产生一定的固氮酶活性，因而具有一定固氮活性，但在通常条件下，垃圾腐熟堆肥是在有氧条件下进行，因为腐解就是氧化自然降解的过程，因而实际粪产碱杆菌在常规的易腐垃圾堆肥处理中并不能产生相应的固氮的技术效果。
而对于本发明技术方案而言，所用特异性芽孢杆菌和粪产碱杆菌本身具有相互促进的作用，在共同扩繁试验中即表明，其具有明显的协同作用。
本发明所用的特异性地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2均采集自浙江省台州市三门县一处阳光房发酵堆体的易腐垃圾物料，其中地衣芽孢杆菌CY-1菌株分离所用的培养基为琼脂平板（成分：20 g/L琼脂；灭菌条件：121 ℃灭菌15 min），粪产碱杆菌CY-2分离所用的培养基为植酸钙平板（成分：30 g/L葡萄糖，25 g/L胰蛋白胨，5 g/L植酸钙，20 g/L琼脂，0.5 g/L硫酸铵，0.5 g/L七水合硫酸镁，0.03 g/L无水硫酸锰，0.5 g/L氯化钾；灭菌条件：121 ℃灭菌15 min），具体的，采集上述易腐垃圾物料装于无菌采样袋中带回实验室粉碎，每份称取5 g后分别每份加入45 mL无菌水、置于锥形瓶中，每个锥形瓶（每份样品）中加入5 粒无菌玻璃珠，在60 ℃条件下摇床培育2 h，分别吸取上清液后以10倍梯度稀释试培，最后取10-4倍浓度稀释液100 μL分别涂布于上述的琼脂平板和植酸钙平板上，37 ℃条件下培养72 h，待平板上长出有明显水解圈的菌落后，接种于新鲜的相同平板上，37±1 ℃条件下纯化培育72 h，则在琼脂平板上分离得到纯化后的地衣芽孢杆菌CY-1，在植酸钙平板上分离得到纯化后的粪产碱杆菌CY-2。进一步进行扩繁试验中，取高温灭菌后的易腐垃圾堆料，打碎为粉末状后，配制为堆料培养基（成分：20 g/L葡萄糖，60 g/L易腐垃圾堆料粉末，2 g/L植酸钙，20 g/L琼脂，0.3 g/L硫酸铵，0.3 g/L七水合硫酸镁，0.01 g/L无水硫酸锰，0.2 g/L氯化钾；灭菌条件：121 ℃灭菌15 min），将分离纯化后的地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2各挑单菌落接种在上述堆料培养基中，37 ℃条件下180 r/min条件培育24h，活菌数≥109CFU/mL，实际可以看出，本发明地衣芽孢杆菌CY-1能够将易腐垃圾堆料中的部分成分分解为粪产碱杆菌CY-2生长所需的有效养分，以此实现对粪产碱杆菌CY-2的有效促进，同时粪产碱杆菌存在的条件下，加快了地衣芽孢杆菌CY-1生长发育效率，因为在分离出地衣芽孢杆菌CY-1后，将地衣芽孢杆菌CY-1置于植酸钙平板上扩繁，繁育效果要弱于分离过程中植酸钙平板上地衣芽孢杆菌CY-1和琼脂平板上地衣芽孢杆菌CY-1的培育效果。因而可以看出，在易腐垃圾物料堆肥过程中，地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2两者实际能够产生相互协同的效果。
本发明的有益效果是：
本发明通过特异性的地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2配合实现了对易腐垃圾有效的堆肥处理，在堆肥处理过程中能够有效固氮，提高处理后易腐垃圾的经济价值和效用价值。
附图说明
图1为发酵复合菌剂用于实际易腐垃圾堆肥处理时堆肥天数和堆温的试验结果图；
图2为发酵复合菌剂用于实际易腐垃圾堆肥处理时易腐垃圾堆体鲜重变化的曲线图；
图3 为发酵复合菌剂用于实际易腐垃圾堆肥处理时氨气排放量变化的曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料；如无特殊说明，本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。
实施例1
地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-1的筛选纯化：
（1）采样
于台州市三门县一处阳光房发酵堆体中采集易腐垃圾堆料作为样本，将样本置于无菌采样袋中保存带回实验室；
（2）分离
将采样所得样本粉碎后每份称取5 g，加入至含45 mL无菌水的锥形瓶中，锥形瓶中加入5 粒无菌的玻璃珠，60 ℃条件下摇床培养2 h，稀释至10-4倍浓度的稀释液，取100 μL涂布于琼脂平板上，取100 μL涂布于植酸钙平板上，均于37 ℃条件下培养72 h；
所述琼脂平板配方为：20 g/L琼脂；琼脂平板于121 ℃条件下高温灭菌15 min；
所述植酸钙平板配方为：30 g/L葡萄糖，25 g/L胰蛋白胨，5 g/L植酸钙，20 g/L琼脂，0.5 g/L硫酸铵，0.5 g/L七水合硫酸镁，0.03 g/L无水硫酸锰，0.5 g/L氯化钾；植酸钙平板于121 ℃条件下高温灭菌15 min；
待平板上长出有明显水解圈的菌落后，琼脂平板上的菌落为地衣芽孢杆菌CY-1菌落，并根据菌落形态，分离出植酸钙平板上与地衣芽孢杆菌CY -1菌落形态不同的菌落，即为粪产碱杆菌CY-2菌落，得到纯化后的地衣芽孢杆菌CY-1菌株和粪产碱杆菌CY-2菌株。
纯化后的地衣芽孢杆菌CY-1菌株和粪产碱杆菌CY-2菌株分别送至中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，其中：
地衣芽孢杆菌（
Bacillus licheniformis）CY-1，保藏中心保藏编号为：CGMCCNo.21241，保藏日期为：2020年11月26日；
粪产碱杆菌（
Alcaligenes faecalis）CY-2，保藏中心保藏编号为：CGMCCNo.21242，保藏日期为：2020年11月26日；
此外对上述纯化后的CY-1菌株和粪产碱杆菌CY-2菌株进行全基因测序，测序结果如下表所示。表中序列编号SEQ ID NO：1为地衣芽孢杆菌CY-1的全基因序列测序结果，序列编号SEQ ID NO：2为粪产碱杆菌CY-2的全基因序列测序结果；
| 序列编号 | 序列 |
| SEQ ID NO:1 | CCTTCGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTATTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCTAAAAGCCACCTTTTATGATTGAACCATGCGGTTCAATCAAGCATCCGGTGTTAACCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACCGGCAGGTTACCCACGTGGTACTCACCCGTCCGCCGCTGAACTAAGGGAGCAAGCTCCCGTCGGTCCGCTCGACTTGGATGTATTAAGCACGCCGGCAGCGTTCGTCCTGA |
| SEQ ID NO:2 | GTTTCTGAGATTGGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCGACCCTCTGTCCCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCTCTTGCGTAGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCCGGTTCTCTTGCGAGCACGGCCAAATCTCTTCGGCTTTCCAGACATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTGCGCTACTAAGGCCTAACGGCCCCAACAGCTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGTCTGAGCGTCAGTATTATCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATATCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGACATACTCTAGCTCGGCAGTTAAAAATGCAGTTCCAAGGTTGAGCCCTGGGATTTCACATCTTTCTTTCCGAACCGCCTACACACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCAGATACCGTCAGCAGTATCCCGTATTAGGGGATACCTTTTCTTCTCTGCCAAAAGTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCATCATACACGCGGGATGGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAAACCAGCTACGGATCGTTGCCTTGGTGAGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGATATCGGCCGCTCCAATAGTGAGAGGTCTTGCGATCCCCCCCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAGCCACTCTTTCGAGTAGTTATCCCCCGCTACTGGGCACGTTCCGATATATTACTCACCCGTCCGCCACTCGCCGCCAAGAGAGCAAGCTCTCTCGCGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAAAGCATCCCGCTAGCGTTCAATCTGAGCCA |
。
实施例2
发酵复合菌剂的制备：
分别取实施例1中分离纯化后的地衣芽孢杆菌CY-1挑单菌落于实施例1所记载的琼脂平板培养基中，粪产碱杆菌CY-2挑单菌落于实施例1所记载的植酸钙平板培养基中，于37±1 ℃条件下培育至得到活菌数≥108CFU/mL的菌液，将地衣芽孢杆菌CY-1培育所得菌液和粪产碱杆菌CY-2培育所得菌液以体积比1：1的比例混合，即得到所述发酵复合菌剂。
本例所制得的发酵复合菌剂标记为FCba-1。
实施例3
发酵复合菌剂的制备：
分别取实施例1中分离纯化后的地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2挑单菌落于堆料培养基（成分：20 g/L葡萄糖，60 g/L易腐垃圾堆料粉末，2 g/L植酸钙，20 g/L琼脂，0.3 g/L硫酸铵，0.3 g/L七水合硫酸镁，0.01 g/L无水硫酸锰，0.2 g/L氯化钾；灭菌条件：121 ℃灭菌15 min）中共同培养，于37±1 ℃条件下培育至得到活菌数≥108CFU/mL的菌液，即得到所述发酵复合菌剂。
本例所制得的发酵复合菌剂标记为FCba-2。
对比例1
发酵菌剂的制备：
取实施例1中分离纯化后的地衣芽孢杆菌CY-1挑单菌落于实施例1所记载的琼脂平板培养基中，于37±1 ℃条件下培育至得到活菌数≥108CFU/mL的菌液，即得到发酵菌剂。
本例所制得的发酵菌剂标记为Fa-1。
对比例2
发酵菌剂的制备：
取实施例1中分离纯化后的粪产碱杆菌CY-2挑单菌落于实施例1所记载的植酸钙平板培养基中，于37±1 ℃条件下培育至得到活菌数≥108CFU/mL的菌液，即得到发酵菌剂。
本例所制得的发酵菌剂标记为Fa-2。
对比例3
发酵复合菌剂的制备：
分别取实施例1中分离纯化后的地衣芽孢杆菌CY-1挑单菌落于实施例1所记载的琼脂平板培养基中，粪产碱杆菌CY-2挑单菌落于实施例1所记载的植酸钙平板培养基中，于37±1 ℃条件下培育至得到活菌数≥108CFU/mL的菌液，将地衣芽孢杆菌CY-1培育所得菌液和粪产碱杆菌CY-2培育所得菌液下表的比例混合，即得到所述发酵复合菌剂。
| 菌剂标记 | 体积比 |
| FCba-31 | 地衣芽孢杆菌CY-1菌液和粪产碱杆菌CY-2菌液体积比1：0.8 |
| FCba-32 | 地衣芽孢杆菌CY-1菌液和粪产碱杆菌CY-2菌液体积比1：0.9 |
| FCba-33 | 地衣芽孢杆菌CY-1菌液和粪产碱杆菌CY-2菌液体积比1：1.1 |
| FCba-34 | 地衣芽孢杆菌CY-1菌液和粪产碱杆菌CY-2菌液体积比1：1.2 |
对比例4
从浙江省农业科学院试验田土壤采样采集，从土壤中以实施例1所记载的方式分离纯化得到土壤地衣芽孢杆菌和土壤粪产碱杆菌，通过常规形态学表征、核酸表征和光学表征等微生物种类检测表征方法，验证确认为分离后所得的菌株分别为常见的土壤地衣芽孢杆菌（
Bacillus licheniformis）和土壤粪产碱杆菌（
Alcaligenes faecalis）；
以上述土壤地衣芽孢杆菌和土壤粪产碱杆菌通过实施2所述方法制备为发酵复合菌剂。
本例所制得菌剂标记为FCba-4。
对比例5
市购CICC中心地衣芽孢杆菌菌株（
Bacillus licheniformis，编号：CICC 10037）和粪产碱杆菌菌株（
Alcaligenes faecalis，编号：CICC 20141），以实施例2所述方法制备为发酵复合菌剂。
本例所制得菌剂标记为FCba-5。
对比例6
市购CICC中心地衣芽孢杆菌菌株（
Bacillus licheniformis，编号：CICC 10037）和粪产碱杆菌菌株（
Alcaligenes faecalis，编号：CICC 20141），以实施例3所述方法制备为发酵复合菌剂。但该试验过程中，实际表明最终所得发酵复合菌剂中粪产碱杆菌（
Alcaligenes faecalis，编号：CICC 20141）活菌数显著低于实施例3，表明常规的地衣芽孢杆菌菌株（
Bacillus licheniformis，编号：CICC 10037）和粪产碱杆菌菌株（
Alcaligenes faecalis，编号：CICC 20141）并不适合直接进行联合扩繁。所得菌剂活菌比例显著失衡，因而不再进行后续的应用试验。
应用实施例
按照0.002：1的质量比将菌剂均匀喷洒至易腐垃圾堆体中，即每1000 g易腐垃圾堆体喷洒2 g菌剂。以菌剂标记作为试验组标记，并以不喷洒菌剂的易腐垃圾堆体作为空白对照（CK）进行对比试验。
其中实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例4和对比例5的堆温检测试验如下：
从图1中可以看出，本发明实施例2和实施例3所制得的复合菌剂能够快速提高堆肥温度，反应出了复合菌剂添加后易腐垃圾好氧发酵堆体温度的动态变化，从图上可以看出，添加复合菌剂后，易腐垃圾堆体在第二天后就迅速升温并持续上升，最高达到了75 ℃左右，55 ℃的堆温持续了14 d后堆体温度迅速降低；而对照组（CK）不添加任何菌剂的易腐垃圾堆体温度升温明显缓慢，且最高温度仅达到了约58 ℃左右，可见易腐垃圾中添加筛选出来的复合功能菌剂对于促进易腐垃圾好氧堆体快速升温发酵具有明显的效果。而对比实施例2和实施例3的FCba-1和FCba-2菌剂，可以看出FCba-2菌剂明显升温更快，升温发酵更快达到效率峰值，经研究发现实际实施例3中在堆料培养基中培育后的菌剂比例更加接近于地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2比例为1：0.96，表明该比例的菌剂可能更有利于易腐垃圾堆体堆肥发酵，且本身在堆料培养基中培育后再或可能促进菌剂某一功能性的强化并使其在实际的易腐垃圾堆肥过程中表现出来。而对比例1和对比例2所用的Fa-1菌剂和Fa-2菌剂，表明本发明特异性地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2在单独作为发酵菌剂使用时，表现效果不佳，实际两者的发酵能力是协同产生的。
而对比FCba-1、FCba-4和FCba-5则可以看出，在相同培养条件、使用条件的情况下，本发明的特异性地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2，与常规的土壤地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌以及常规市售的用于发酵的地衣芽孢杆菌CICC10037和粪产碱杆菌CICC20141均有着显著的区别，表现出明显的特异性，对于易腐垃圾的堆肥处理具有更强的作用效果。
此外，对上述实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例4和对比例5试验组的易腐垃圾堆体鲜重进行记录。如图2所示。图2趋势可以看出大多较为接近，但最终鲜重差距相对较大，表明腐熟程度有所区别。对腐熟程度进行检测，腐熟程度以发芽指数作为主要的参考指标，记录20 d后各试验组堆肥所得产物的发芽指数如下表所示。
| 试验组 | 发芽指数 | 试验组 | 发芽指数 |
| FCba-1 | 112 % | Fa-2 | 89 % |
| FCba-2 | 117 % | FCba-4 | 98 % |
| Fa-1 | 93 % | FCba-5 | 102 % |
| / | / | CK | 70 % |
从上表可以看出，本发明特异性地衣芽孢杆菌试验组（FCba-1和FCba-2）明显优于其他试验组，结合图2记录结果，可以看出本发明处理后的易腐垃圾堆体腐熟程度更高。而另一方面，发芽指数达到50 %时即可判定易腐垃圾堆体达到腐熟标准，因而在快速腐熟方面，记录达到50 %发芽指数的最低时间。其中FCba-1和FCba-试验组在第7天达到腐熟标准，Fa-1试验组在第11天达到腐熟标准，Fa-2试验组在第12天达到腐熟标准，FCba-4试验组在第9天达到腐熟标准，FCba-5试验组在第9天达到腐熟标准，CK试验组在第15天达到腐熟标准。因而可以看出，本发明特异性地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2也能够有效用于快速的腐熟发酵。
此外，易腐垃圾堆肥过程中会产生氨气、硫化氢等难闻的气体，这不仅造成周边空气的污染，还会导致堆体物料中氮（以及伴随流失的硫）的损失，因此，如何减少易腐垃圾堆肥中氨气排放，降低堆体物料中的氮素损失是易腐垃圾好氧发酵处置过程中的关键技术，本研究通过向易腐垃圾堆体中添加复合菌剂，观测不同时间堆体的氨气累计排放量。
其中实施例2、实施例3、对比例4和对比例5的测试对比结果如图3所示。从图3中可以看出，随着堆肥时间的延长，刚开始1周内，本发明FCba-1和FCba-2试验组堆体中氨气排放量持续上升，在堆肥的前8d之内，添加FCba-1和FCba-2复合菌剂的堆体物料中氨气排放量高于对照，这主要是由于添加复合菌剂后堆体升温发酵快，导致大量有机氮迅速矿化成氨气挥发到空气中，而随着堆肥时间的进一步延长，添加复合菌剂的堆体物料中氨气排放逐渐趋于平稳，而未添加菌剂的对照中的氨气排放量快速上升，这说明本发明FCba-1和FCba-2发酵复合菌剂的添加总体上对于易腐垃圾好氧堆肥发酵具有保氮除臭的作用。
而对比FCba-1、FCba-2、FCba-4和FCba-5可以看出，本发明特异性地衣芽孢杆菌CY-1、粪产碱杆菌CY-2相较于常见的土壤地衣芽孢杆菌（
Bacillus licheniformis）和土壤粪产碱杆菌（
Alcaligenes faecalis），以及相较于常规市售的用于发酵的地衣芽孢杆菌CICC10037和粪产碱杆菌CICC20141均具有良好的保氮除臭效果，能够有效减少氮损失，提高堆肥处理后的效用价值和经济价值，保留更多的营养成分，这与发芽指数测试结果也趋于接近。
此外，对实施例2的FCba-1试验组和对比例3的FCba-3（1～4）试验组进行横向对比试验。记录20 d后各试验组堆肥所得产物的发芽指数如下表所示。
| 试验组 | 发芽指数 | 试验组 | 发芽指数 |
| FCba-1 | 112 % | CK | 70 % |
| FCba-31 | 97 % | FCba-33 | 107 % |
| FCba-32 | 111 % | FCba-34 | 91 % |
从上表可以看出，为保持本发明发酵复合菌剂能够产生相对较优的堆肥发酵效果，应当合理控制地衣芽孢杆菌CY-1菌液和粪产碱杆菌CY-2菌液以比例1：（0.9～1.1）的比例混合。同时在同样的氨挥发试验中，FCba-31试验组要明显劣于其他试验组，表明仅存在地衣芽孢杆菌CY-1的情况下并不能产生良好的固氮效果，而FCba-34试验组虽要略优于FCba-34试验组，但也仅是接近于FCba-5试验组，表明实际固氮除臭效果是本发明特异性地衣芽孢杆菌CY-1和粪产碱杆菌CY-2共同产生且独有的。
Claims (6)
1.发酵杆菌，其特征在于，
所述发酵杆菌选自地衣芽孢杆菌和粪产碱菌；
所述地衣芽孢杆菌分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CY-1，保藏单位为：CGMCC，保藏中心保藏编号为：CGMCC No.21241，保藏日期为：2020年11月26日；
所述粪产碱菌分类命名为粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）CY-2，保藏单位为：CGMCC，保藏中心保藏编号为：CGMCC No.21242，保藏日期为：2020年11月26日。
2.发酵复合菌剂，其特征在于，
所述发酵复合菌剂含有所述地衣芽孢杆菌和所述粪产碱菌。
3.根据权利要求2所述的发酵复合菌剂，其特征在于，
所述发酵复合菌剂中地衣芽孢杆菌和粪产碱菌的活菌数≥108 CFU/mL。
4.发酵复合菌剂的制备方法，其特征在于，
所述方法包括：
分别将所述地衣芽孢杆菌和粪产碱菌挑菌落于培养基中，于37±1 ℃条件下培育至得到活菌数≥108 CFU/mL的菌液，将地衣芽孢杆菌培育所得菌液和粪产碱菌培育所得菌液以体积比1：（0.9～1.1）的比例混合，即得到所述发酵复合菌剂。
5.发酵复合菌剂的应用，其特征在于，
所述发酵复合菌剂用于易腐垃圾堆肥处理。
6.根据权利要求5所述的发酵复合菌剂的应用，其特征在于，
所述易腐垃圾堆肥处理方法具体为：
按易腐垃圾质量取至少其0.15 wt%的发酵复合菌剂，均匀添加至易腐垃圾中处理至少18 d。
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